CN112226504B

CN112226504B - BuChE基因SNP位点的用途及新烟碱农药接触人群高TG血症易感性分析检测试剂盒

Info

Publication number: CN112226504B
Application number: CN202011132712.0A
Authority: CN
Inventors: 周兴藩; 余珉; 唐仕川; 王煜倩
Original assignee: Hangzhou Medical College; Beijing Municipal Institute of Labour Protection
Current assignee: Hangzhou Medical College; Beijing Municipal Institute of Labour Protection
Priority date: 2020-10-21
Filing date: 2020-10-21
Publication date: 2021-06-08
Anticipated expiration: 2040-10-21
Also published as: CN112226504A

Abstract

本申请公开一种BuChE基因SNP位点的用途及新烟碱农药接触人群高TG血症易感性分析检测试剂盒；还公开一种用于新烟碱农药接触人群高TG血症易感性分析的检测引物。本申请发现新烟碱农药接触人群BuChE基因rs1803274变异位点特征及其与高TG血症风险的关联。并由此提供新烟碱农药接触人群高TG血症易感性分析的检测试剂盒及引物。

Description

BuChE基因SNP位点的用途及新烟碱农药接触人群高TG血症易感性分析检测试剂盒

技术领域

本发明涉及分子标记研究领域，具体涉及BuChE基因SNP位点在制备新烟碱农药接触人群高TG血症易感性分析检测试剂盒及引物中的应用。

背景技术

新烟碱类农药应用范围广泛，占全球农药市场份额的5.3％，2014年至2019年间的复合年增长率为4.1％～9.6％，造成了不容忽视的农药残留问题。新烟碱类农药按其化学结构可大致分为3类，即N-硝基胍类、硝基亚甲基类和N-氰基脒类。其中，N-硝基胍类的吡虫啉在我国农业领域的应用量最大，经皮肤和呼吸道进入机体的含量约占使用总量的0.21％，内暴露水平可达14.71μg/g肌酐，产生的公众健康危害问题亟待重视。

新烟碱类农药不仅造成肝脏器质性和功能性损害效应，还存在干扰机体正常代谢功能的潜在风险。在不引起肝脏病理形态学改变的情况下，低剂量新烟碱类农药既可改变脂质、氨基酸、核苷酸和糖类等多种代谢途径，引发早期代谢紊乱相关分子生物学事件。其中，甘油三酯(triglycerides,TG)及其相关产物水平的脂质代谢调控主要由肝脏负责，而TG水平的升高是诱发心血管事件的重要危险因子。

丁酰胆碱酯酶(butyrylcholinesterase,BuChE)基因位于人类第3号染色体的q26.1～q26.2区域，其4个外显子转录生成BuChE mRNA，翻译产物为含602个氨基酸序列的丝氨酸水解酶，借助丝氨酸、谷氨酸和组氨酸3个氨基酸序列构成的三级结构域而发挥催化作用，具有解毒、水解乙酰胆碱、参与脂肪代谢和降解富含聚脯氨酸的多肽类物质等功能，广泛分布于外周血、肝、皮肤、肌肉、肺等十余种组织器官。BuChE是一类反映职业性农药接触的重要生物监测指标，在农药中毒程度、早期病情和治疗愈后评估方面具有临床意义。

发明内容

本申请发现新烟碱农药接触人群BuChE基因rs1803274变异位点的特征及其与高TG血症风险的关联以及易感性检测方法，基于此提供一种BuChE基因rs1803274SNP位点在制备新烟碱农药接触人群高TG血症易感性分析检测试剂盒或引物中的应用以及对应的试剂盒和特异性引物。

本申请提供一种BuChE基因rs1803274SNP位点在制备新烟碱农药接触人群高TG血症易感性检测的试剂盒中的应用。

本申请还提供一种用于新烟碱农药接触人群高TG血症易感性分析的检测试剂盒，包括针对BuChE基因rs1803274SNP位点设计的特异性引物。

一种可选的技术方案，所述特异性引物包括rs1803274FP通用引物序列和一对引物对，其特征在于，所述引物对包括：

rs1803274FC引物序列：

TCTCTCGGGTCAATTCGTCCTTTCCTGCTTTCCACTCCCATTCAGC(SEQ ID NO：1)；

rs1803274FT引物序列：

TGTTCGTGGGCCGGATTAGTTCCTGCTTTCCACTCCCATTCAGT(SEQ ID NO：2)。

一种可选的技术方案，所述rs1803274FP通用引物序列为：

TTCATCAATATTTCCTGTAAAATATGGAATAAGT(SEQ ID NO：3)。

一种可选的技术方案，所述试剂盒还包括：10x连接缓冲液、高温连接酶、ddH₂O、DNA染料和DNA溶解液。可选的，所述DNA染料为SIZE STANDARD；所述DNA溶解液为Hi-Di。

本申请还提供一种BuChE基因rs1803274SNP位点在制备新烟碱农药接触人群高TG血症易感性分析检测引物中的应用。

本申请还提供一种用于新烟碱农药接触人群高TG血症易感性分析的检测引物，包括rs1803274FP通用引物序列和一对引物对，包括rs1803274FP通用引物序列和一对引物对，所述引物对包括：

rs1803274FC引物序列：

TCTCTCGGGTCAATTCGTCCTTTCCTGCTTTCCACTCCCATTCAGC(SEQ ID NO：1)；

rs1803274FT引物序列：

TGTTCGTGGGCCGGATTAGTTCCTGCTTTCCACTCCCATTCAGT(SEQ ID NO：2)。

可选的，所述rs1803274FP通用引物序列为：

TTCATCAATATTTCCTGTAAAATATGGAATAAGT(SEQ ID NO：3)。

附图说明

图1为BuChE基因rs1803274位点分型检测原理示意图；

图2为实施例的电泳峰型图。

具体实施方式

下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本申请。

根据研究发现，BuChE基因变异及其编码蛋白功能特征改变与高脂血症密切相关。其中，rs1803274位点的功能变异可能是影响TG代谢途径的重要内在因素。本申请发现新烟碱农药接触人群BuChE基因rs1803274变异位点特征及其与高TG血症风险的关联，并由此提供新烟碱农药接触人群高TG血症易感性分析的检测试剂盒及引物。经对现有技术的国内外文献检索，至今未见有新烟碱农药接触人群BuChE基因rs1803274变异位点对高TG血症风险影响的研究报道。

一种实施方式中，所述检测引物包括：

rs1803274FC引物序列：

TCTCTCGGGTCAATTCGTCCTTTCCTGCTTTCCACTCCCATTCAGC(SEQ ID NO：1)；

rs1803274FT引物序列：

TGTTCGTGGGCCGGATTAGTTCCTGCTTTCCACTCCCATTCAGT(SEQ ID NO：2)。

rs1803274FP通用引物序列为：

TTCATCAATATTTCCTGTAAAATATGGAATAAGT(SEQ ID NO：3)。

检测试剂盒中，关键在于针对BuChE基因rs1803274变异位点的特异性引物序列，原则上，只要能完成rs1803274变异位点分型的引物均满足本申请试剂盒要求，一种具体的实施方式中，试剂盒中所用引物采用如前所述的引物序列。

一种具体的检测试剂盒中，包括：

10x连接缓冲液、高温连接酶、5’连接引物混合液(1μM)，3’连接引物混合液(2μM)、ddH₂O、Liz500 SIZE STANDARD、Hi-Di。

BuChE基因rs1803274位点分型检测原理如图1所示。

以下以实施例将进行具体说明。

实施例1

材料与方法

1.研究对象

本实验纳入72名新烟碱农药接触者和78名非新烟碱农药接触对照者。所有研究对象均签署知情同意书，完成相应流行病学调查，并提供1-3mL外周血标本。

2.外周血基因组DNA提取与检测

采用基因组DNA柱式小量提取试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)提取外周血中基因组DNA。随后，使用NanoDrop微量核酸浓度定量仪(Fisher公司)进行DNA样本浓度测定，以琼脂糖凝胶电泳法进行DNA样本质量检查。

3.PCR反应

3.1 PCR引物设计与合成

采用Primer3引物设计软件(https://primer3.ut.ee/)进行rs1803274位点PCR扩增引物设计。其中：Primer Size：18-25；Product Size Ranges：100-300；其他参数为软件默认值。

最终选定的引物序列为：

rs1803274上游引物序列：GATGGAATCCTGCTTTCCACTCC，rs1803274R下游引物序列：TCTCTTTTCAGGCAAAGCGAGCTA，上述合成引物经PAGE纯化。

3.2 PCR条件(GC)

反应体系(10μl)包含2x GC buffer，3.0mM Mg²⁺，0.3mM dNTP，1U HotStarTaqpolymerase(Qiagen公司)，1μl DNA样本和1μl(1uM)PCR引物。

3.3 PCR循环程序(表1)

表1

3.4 PCR产物纯化

在10μl PCR产物中加入5U SAP酶和2U Exonuclease I酶(SAP(虾碱酶)和外切酶混合，降解PCR混合物中的dNTP和引物)，37℃温浴1小时，经75℃灭活15分钟。

扩增出的PCR产物的DNA片段序列如下所示：

GATGGAATCCTGCTTTCCACTCCCATTCAG[Y]TTCATCAATATTTCctgtaaaatatggaataagttgtattaatcaaaatttttatctgtttcattaactgaaaaataatttcgaatacaaaagccattttctctaactacacagtacagcattattttctttatttattctttattatttgttattagctcgctttgcctgaaaagaga(SEQ IDNO：4)。备注：Y＝C/T(rs1803274)。

3.5连接反应

3.5.1连接引物设计与合成

采用Primer3引物设计软件(https://primer3.ut.ee/)进行rs1803274位点连接引物设计。其中：Primer Size：18-25；Product Size Ranges：100-300；其他参数为软件默认值。

选出的引物序列如下：

rs1803274FC引物序列(加粗字体代表与PCR产物互补配对的序列)：

rs1803274FT引物序列(加粗字体代表与PCR产物互补配对的序列)：

rs1803274FP通用引物序列：

TTCATCAATATTTCCTGTAAAATATGGAATAAGT(SEQ ID NO：3)。

上述合成引物经PAGE纯化。

3.5.2连接反应

原理如图1所示；反应体系包括：10x连接缓冲液1ul、高温连接酶0.25ul、5’连接引物混合液(1μM)0.4ul，3’连接引物混合液(2μM)0.4ul、纯化后PCR产物(由步骤3.4所得)2ul、ddH₂O 6ul混匀。

反应体系的连接程序如表2：

表2

0.5μl稀释后的上述连接产物与0.5μl Liz500 SIZE STANDARD、9μl Hi-Di混匀，经95℃变性5分钟后，上ABI3730XL测序仪。测序数据由GeneMapper 4.1软件(AppliedBiosystems公司)分析。

其中，Liz500 SIZE STANDARD为DNA染料，用于标定大小在35～500个核苷酸范围的片段。每个DNA片段都由LIZ@荧光团标记，因此在变性条件下可形成单峰；Hi-Di为高度去离子甲酰胺，用于测序上测序仪前溶解DNA。

C等位基因连接产物序列(82bp)：

TCTCTCGGGTCAATTCGTCCTTTCCTGCTTTCCACTCCCATTCAG[Y]TTCATCAATATTTCctgtaa aatatggaataagt(SEQ ID NO：5)。

T等位基因连接产物序列(80bp)：

TGTTCGTGGGCCGGATTAGTTCCTGCTTTCCACTCCCATTCAG[Y]TTCATCAATATTTCctgtaaaa tatggaataagt(SEQ ID NO：6)。

备注：Y＝C/T(rs1803274)

电泳峰型图如图2所示。

三、结果

(1)新烟碱类农药接触者和非新烟碱类农药接触者BuChE基因rs1803274变异位点特征如表3所示，无论新烟碱类农药接触与否，BuChE rs1803274变异位点的基因型符合Hardy-Weinberg equilibrium(哈迪-温伯格平衡：没有进化影响下当基因一代一代传递时，群体的基因频率和基因型频率将保持不变)，且以纯和型BuChE基因型(CC/TT)为主(表3)。

表3

	非接触者			接触者
								基因型	N	频率	p<sup>a</sup>	N	频率	p<sup>a</sup>	p<sup>b</sup>
纯和型	57	0.72	0.531	56	0.778	0.289	0.505
								杂合型	21	0.269		16	0.222
等位基因
								C	133	0.852		128	0.889
T	23	0.147		16	0.111

a.Hardy-Weinberg equilibrium检验非接触者和接触者；b.非接触者和接触者间的纯和型和杂合型比较

(2)在杂合型BuChE基因型(CT)人群中，新烟碱类农药接触者和非新烟碱类农药接触者的TG水平分别为1.14±0.49mmol/L和1.20±0.73mmol/L(p＝0.757)；在纯合型BuChE基因型(CC/TT)人群中，新烟碱类农药接触者和非新烟碱类农药接触者的TG水平分别为1.50±1.15mmol/L和1.00±0.58mmol/L(p＝0.004)。

(3)进一步以TG≥1.7mmol/L作为高TG血症的判定依据，在纯合型BuChE基因型(CC/TT)人群中，新烟碱类农药接触者和非新烟碱类农药接触者的高TG血症检出比例分别为28.6％和8.8％(p＝0.007)。

(4)多因素Logistic回归分析表明(表4)，在矫正年龄、性别、高血压和糖尿病等因素的条件下，纯合型BuChE基因型(CC/TT)新烟碱类农药接触者罹患高TG血症的风险是非接触者的5.54倍(95％置信区间:1.40-21.90)。

表4纯合型BuChE基因型(CC/TT)人群中农药接触对高TG血症风险的影响

以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京市劳动保护科学研究所杭州医学院

<120> BuChE基因SNP位点的用途及新烟碱农药接触人群高TG血症易感性分析检测试

剂盒

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

tctctcgggt caattcgtcc tttcctgctt tccactccca ttcagc 46

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

tgttcgtggg ccggattagt tcctgctttc cactcccatt cagt 44

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

ttcatcaata tttcctgtaa aatatggaat aagt 34

<210> 4

<211> 210

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

gatggaatcc tgctttccac tcccattcag yttcatcaat atttcctgta aaatatggaa 60

taagttgtat taatcaaaat ttttatctgt ttcattaact gaaaaataat ttcgaataca 120

aaagccattt tctctaacta cacagtacag cattattttc tttatttatt ctttattatt 180

tgttattagc tcgctttgcc tgaaaagaga 210

<210> 5

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

tctctcgggt caattcgtcc tttcctgctt tccactccca ttcagyttca tcaatatttc 60

ctgtaaaata tggaataagt 80

<210> 6

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

tgttcgtggg ccggattagt tcctgctttc cactcccatt cagyttcatc aatatttcct 60

gtaaaatatg gaataagt 78

Claims

1.BuChE基因rs1803274SNP位点的特异性引物在制备新烟碱农药接触人群高TG血症易感性分析检测试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述特异性引物包括rs1803274FP通用引物序列和一对引物对，所述引物对包括：

rs1803274FC引物序列：

TCTCTCGGGTCAATTCGTCCTTTCCTGCTTTCCACTCCCATTCAGC；

rs1803274FT引物序列：

TGTTCGTGGGCCGGATTAGTTCCTGCTTTCCACTCCCATTCAGT；

所述rs1803274FP通用引物序列为：

TTCATCAATATTTCCTGTAAAATATGGAATAAGT。