CN112220815A - 一种鸦胆子油乳浊液及其在抑制乙肝病毒方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物学领域，涉及一种鸦胆子油乳浊液及其在抑制乙肝病毒方面的应用，提供了鸭胆子油乳浊液的制备方法，以及其在乙肝病毒的抑制应用。本发明利用鸭胆子油对免疫调节分子的显著性促进作用，对乙肝病毒形成靶向性抑制效果，从复制、表面抗原和e抗原角度实现稳定的抑制，增加其实用性。

Description

一种鸦胆子油乳浊液及其在抑制乙肝病毒方面的应用
技术领域
本发明属于生物学领域，具体涉及一种鸦胆子油乳浊液及其在抑制乙肝病毒方面的应用。
背景技术
乙肝病毒感染是导致慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌的重要原因，严重威胁人类健康。近年来，核苷类似物抗HBV的研究进展迅速，临床上抑制HBV有确切的疗效，耐药性突变的产生是目前此类药物的主要问题。可选择药物的增加对耐药问题有一定帮助，但该类药物只能抑制HBV复制，对共价闭合环状DNA无效，无法彻底清除、治愈HBV。目前尚无有效清除cccDNA的药物和方法。探索可彻底清除HBV的治疗策略意义重大。
HBV在全球及我国流行和发病情况。全球约一半人口处于HBV高发区，20亿人曾感染HBV，约3.5亿为慢性感染者，每年约100万死于HBV感染，位列全球十大致死疾病第七位。我国1至59岁人群表面抗原携带率为7.18％，慢性感染者约9300万人，其中仅18.6％得到诊断，4.1％接受过治疗。HBV隐秘感染现象非常普遍，亚洲人群中高达7.5-16％。我国HBV疫苗覆盖率90％以上，母婴成功阻断率高达95％，感染人数明显下降，但2017年仍有100万新发感染。2016年世卫组织首次提出2030年前全球范围消除病毒性肝炎的远大目标。我国HBV感染率高、基数大、治疗率低、治疗效果欠佳，诊疗现状不容乐观，造成了沉重的疾病和经济负担。规范治疗是提高诊断率和治疗率的关键，而研发更有效的抗HBV治疗方法又是重中之重，也是能否实现WHO提出的2030年消除乙肝目标的重要前提。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明提供了一种鸭胆子油乳浊液，并以该乳浊液进行靶向抑制效果，达到抑制乙肝病毒的效果。
为实现以上技术目的，本发明的技术方案是：
一种鸭胆子油乳浊液，采用如下步骤制备：
步骤1，将甘油和吐温-80加入至鸭胆子油溶液中，搅拌均匀，且在搅拌过程中加入无菌水，过滤得到鸦胆子油药液；
步骤2，将鸭胆子油药液经微孔滤膜灭菌后得到鸭胆子油乳剂成品，经DMEM培养基稀释，得到鸦胆子油乳浊液。
进一步的，所述鸭胆子油乳浊液在4℃下保存备用。
所述鸭胆子油乳浊液以HepG2.215/HepG2/Huh7细胞悬液为细胞液，以比对的方式进行细胞毒性测试。所述HepG2.215：野生型HBV的2倍体基因组(5'-3'-3'-5'，共4个5'-3'串联拷贝)插入HepG2基因组中，HBV可以稳定的在细胞中复制、抗原表达，可产生22nm的球形及管型颗粒和42nm的Dane氏颗粒。所述HepG2和Huh7：人肝癌细胞系，细胞本身均为HBV阴性，转染野生型或突变型HBV的复制子质粒(包含1.3倍HBV基因组，保证高度重叠的HBV的S、C、P、X四个ORF的完整性)后，HBV可以稳定的在细胞中复制、转录、表达抗原，产生22nm的球形及管型颗粒和42nm的Dane氏颗粒。HepG2：人肝癌细胞系，来源于一个15岁男性白人的肝癌组织。该细胞分泌多种血浆蛋白：清蛋白、α2-巨球蛋白、血纤维蛋白溶酶原、铁传递蛋白等，HBV阴性。Huh7：人肝癌细胞系，是由Naka-bayashi等人建立的，细胞源自一个日本男性高分化肝细胞肝癌，HBV阴性。
所述鸭胆子油乳浊液在靶向抑制乙肝病毒领域的应用。
进一步的，所述鸦胆子油乳浊液在HBsAg和HBeAg的抑制的应用。
进一步的，所述鸭胆子油乳浊液用于乙肝病毒复制的靶向抑制。
进一步的，所述鸭胆子油乳浊用于乙肝突变株的靶向抑制。
更进一步的，所述鸭胆子油乳浊靶向抑制效果的验证方法。
从以上描述可以看出，本发明具备以下优点：
1，本发明利用鸭胆子油本身的溶解性，利用甘油与吐温-80将鸭胆子油的分子结构充分释放。
2.本发明利用鸭胆子油对免疫调节分子的显著性促进作用，对乙肝病毒形成靶向性抑制效果，从复制、表面抗原和e抗原角度实现稳定的抑制，增加其实用性。
3.本发明针对鸦胆子油对乙肝病毒的抑制提供了验证方法。
附图说明
图1是本发明实施例2中的鸦胆子油对肝源细胞系的细胞毒性。
图2是本发明实施例3中的鸦胆子油有效抑制HBsAg和HBeAg的对照图。
图3是本发明实施例3中的鸦胆子油显著性抑制HBcAg的表达的对照图。
图4是本发明实施例3中的鸦胆子油显著性抑制HBV复制的对照图。
图5是本发明实施例3中的鸦胆子油显著性抑制拉米夫定耐药HBV毒株的复制及抗原表达的对照图。
图6是本发明实施例3中的鸦胆子油处理肝癌细胞系后，检测了细胞上清中的六种细胞因子含量的检测图。
具体实施方式
结合图1至图6，详细说明本发明的一个具体实施例，但不对本发明的权利要求做任何限定。
实施例1
鸦胆子油乳浊液的制备：
鸦胆子油(0.9g/ml)0.5ml中加入吐温-80 0.12ml、甘油0.125mL，搅拌均匀后，再逐渐加入无菌水至5mL，搅拌均匀经过滤后分装于10ml离心管中，封口。待用时经微孔滤膜灭菌即得10％鸦胆子油(mL/mL：1mL药液溶于1mL无菌蒸馏水中))油乳剂成品(90mg/ml)，然后用DMEM培养基稀释成50mg/ml母液，4℃保存备用。
实施例2
鸭胆子油乳浊液的细胞毒性检测，以HepG2.215/HepG2/Huh7细胞悬液为培养细胞，进行比对测试，具体步骤如下：
先用细胞计数板计算所制备的HepG2.215/HepG2/Huh7细胞悬液中的细胞数量，将细胞浓度调整至500000/ml，接种到96孔培养板内，(100μL/孔，50000个/孔)。将培养板放置培养箱(37℃,5％CO2)中预培养24小时。每孔加入10μl不同浓度的鸦胆子油乳浊液，每个浓度三个复孔，将培养板在培养箱孵育24小时。然后每孔加入10μL CCK-8溶液，将培养板放置培养箱内孵育1-4小时。用酶标仪测定在450nm处的吸光度，利用公式细胞活力(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100计算鸦胆子油的细胞毒性。如图1所示，结果表明处理24和48小时候，5.0mg/ml鸦胆子油乳浊液对HepG2.215/HepG2/Huh7三种细胞系细胞活力均无显著性影响，故，以用5.0mg/ml作为实验添加量。
实施例3
鸭胆子油对乙肝病毒的抑制效果
细胞准备：
HepG2.215细胞接种六孔细胞培养板，约106/孔，HepG2.215接种后6小时待细胞贴壁后，吸弃培养基后每孔重新加入1ml培养基，然后分别加入40μl、80μl、200μl(终浓度分别为1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml)鸦胆子油乳浊液(50mg/ml)至细胞培养孔中，然后用培养基补至2ml每孔，同时设不加药物的空白对照，每种处理做三个细胞复孔。
HepG2和Huh7细胞接种六孔细胞培养板，约106/孔，接种后16-24小时内转染pBSK-HBV1.3质粒，转染6小时后，吸弃培养基后每孔重新加入1ml培养基，然后分别加入40μl、80μl、200μl(终浓度分别为1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml)鸦胆子油乳浊液(50mg/ml)至细胞培养孔中，然后用培养基补至2ml每孔，同时设不加药物的空白对照，每种处理做三个细胞复孔。
鸦胆子油药物加入细胞孔孵育48小时后，收取细胞培养上清以及细胞裂解液并提取HBV core-associated DNA，样本均使用DNase I消化处理去除Input DNA，排除检测干扰。
化学发光微粒子免疫分析(CMIA)法定量检测HBsAg和HBeAg。收取不同浓度鸦胆子油处理及对照组的细胞培养上清，检测其中的HBsAg和HBeAg的表达，评估鸦胆子油的对HBsAg和HBeAg的影响。如图2所示，结果表明鸦胆子油可以抑制HBsAg和HBeAg的表达分泌，且呈剂量依赖。而在细胞水平10mM拉米夫定(Lamivudine，LMV，核苷类似物药物)虽然可以有效抑制HBV的复制，但是对HBsAg和HBeAg的表达分泌无显著性影响。
Western-blot检测HBcAg的表达。收取不同浓度鸦胆子油处理及对照组的细胞裂解液，western-blot检测HBcAg的表达，如图3所示：鸦胆子油的对HBsAg和HBeAg的抑制效果。
real-time PCR检测HBV DNA。收取不同浓度鸦胆子油处理及对照组的细胞培养上清。5μl内标、20μl蛋白酶K和600μl样本加入提取板样本孔，核酸自动提取仪样本中HBV DNA作为模板，进行real-time PCR扩增。如图4所示，结果表明，鸦胆子油显著性抑制了HBV的复制。
鸦胆子油可抑制拉米夫定耐药株的复制及抗原表达。以野生型HBV复制子质粒为骨架，构建rtL180M/M204V拉米夫定耐药株。分别转染肝癌细胞系HepG2或Huh7，转染6小时后换液，设不加药物、鸦胆子油、拉米夫定、鸦胆子油和拉米夫定四组。药物处理48小时后，收取细胞培养上清，检测HBsAg和HBeAg的分泌及表达。收取细胞裂解液，DNaseI处理后提取HBV core-associated DNA，realtime-PCR检测HBV DNA拷贝数。结果如图5所示，细胞水平拉米夫定可有效抑制野生型HBV的复制，但对rtL180M/M204V突变株基本无效，对HBsAg和HBeAg的表达和分泌无效；鸦胆子油对野生型和突变株的HBV DNA的复制、HBsAg和HBeAg的表达和分泌均具有很好的抑制效果。
鸦胆子油处理肝癌细胞系后，检测了细胞上清中的六种细胞因子含量，包括：IL2、IL4、IL6、IL10、TNF-α和INF-γ。如图6所示，其中IL-6被鸦胆子油显著性上调，而其它五种细胞因子出现不同程度的下调。而IL-6具有明确的抑制HBV转录、复制及抗原表达的功能。鸦胆子油是通过显著性上调机体的免疫调节分子IL-6，发挥抗HBV活性，对野生型和拉米夫定耐药突变株均有很好的抑制效果。
可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案。本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种鸭胆子油乳浊液，其特征在于：采用如下步骤制备：
步骤1，将甘油和吐温-80加入至鸭胆子油溶液中，搅拌均匀，且在搅拌过程中加入无菌水，过滤得到鸦胆子油药液；
步骤2，将鸭胆子油药液经微孔滤膜灭菌后得到鸭胆子油乳剂成品，经DMEM培养基稀释，得到鸦胆子油乳浊液。
2.根据权利要求1所述的鸭胆子油乳浊液，其特征在于：所述鸭胆子油乳浊液在4℃下保存备用。
3.根据权利要求1所述的鸭胆子油乳浊液，其特征在于：所述鸭胆子油乳浊液以HepG2.215/HepG2/Huh7细胞悬液为细胞液，以比对的方式进行细胞毒性测试。
4.根据权利要求1所述的鸭胆子油乳浊液，其特征在于：所述鸭胆子油乳浊液在靶向抑制乙肝病毒领域的应用。
5.根据权利要求4所述的鸭胆子油乳浊液，其特征在于：所述鸦胆子油乳浊液在HBsAg和HBeAg的抑制的应用。
6.根据权利要求4所述的鸭胆子油乳浊液，其特征在于：所述鸭胆子油乳浊液用于乙肝病毒复制的靶向抑制。
7.根据权利要求4所述的鸭胆子油乳浊液，其特征在于：所述鸭胆子油乳浊用于乙肝突变株的靶向抑制。
8.根据权利要求4所述的鸭胆子油乳浊液，其特征在于：所述鸭胆子油乳浊靶向抑制效果的验证方法。
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