CN112203654A - 肌聚糖病的联合治疗 - Google Patents

Abstract

肌聚糖病是常染色体隐性疾病，由编码任何肌聚糖蛋白(SG)的基因之一的突变引起。发明人先前表明，被开发用于拯救ΔF508‑CFTR转运的小分子(称为CFTR调节剂)的应用促进了几种α‑肌聚糖蛋白突变体的成熟，这些突变体随后在质膜上被拯救(WO 014086687)。现在，本发明人证明，当联合施用时，一些特定的CFTR调节剂提供了叠加的甚至是协同的作用。

Description

肌聚糖病的联合治疗

技术领域

本发明涉及肌聚糖病的联合治疗。

背景技术

肌聚糖病是常染色体隐性疾病，由编码任何肌聚糖蛋白(SG)的基因之一的突变引起。SG是单次跨膜糖蛋白，其形成位于横纹肌肌膜内的四聚体复合物(1，2)。肌聚糖复合物作为抗肌萎缩蛋白相关蛋白复合物(DAPC)的一部分，在确保肌肉收缩时肌膜的稳定性方面起着关键作用，并且似乎参与了信号传导过程(3)。所有形式的肌聚糖病(LGMD2C、2D、2E和2F)均可归类为功能丧失(LOF)疾病，因为特定肌聚糖蛋白的缺陷通常是导致突变蛋白缺失/强烈减少以及野生型配偶体(partner)继发性缺陷的原因(4)。在过去的几年中，通过研究肌聚糖病的发病机理，已经确定LOF病况是细胞的蛋白质质量控制(QC)系统活性的结果。特别是，大多数肌聚糖病遗传缺陷是源于折叠缺陷蛋白的错义突变，所述折叠缺陷蛋白被内质网-QC识别并递送以通过泛素-蛋白酶体系统降解(5，6)。

此外，通过靶向降解途径，SG的不同错义突变体可以在质膜上适当地被拯救(5-8)。这一证据还表明，尽管发生了突变，但这些蛋白质仍保留其功能，并且旨在减少突变体处置(disposal)的新治疗策略的开发对患者来说将是卓有成效的。基于这一目的，由于在肌聚糖病中作为致病性的主要原因的折叠缺陷SG的存在，可以设想通过小分子的“修复策略”来促进突变体的折叠过程，从而可以通过质量控制，并在适当的作用位点移动。

在此背景下，公开了囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)调节剂(corrector)用于治疗肌聚糖病的用途(WO2014086687)。

发明内容

本发明涉及肌聚糖病的联合治疗。具体而言，本发明由权利要求书限定。

具体实施方式

肌聚糖病是常染色体隐性疾病，由编码任何肌聚糖蛋白(SG)的基因之一的突变引起。例如，肢带型肌营养不良症2D型(LGMD2D)是一种罕见的常染色体隐性疾病，其影响横纹肌，由于编码α-肌聚糖蛋白的基因SGCA的突变而发生。现在已经报道了50多种不同的SGCA错义突变。它们被认为影响α-肌聚糖蛋白的折叠和运输，因为缺陷多肽，尽管可能起作用，但被细胞的质量控制所识别和处理。α-肌聚糖蛋白配偶体β-、γ-和δ-肌聚糖蛋白的继发性减少破坏了与抗肌萎缩蛋白相关的关键膜复合体，有助于确保肌肉收缩期间肌膜的稳定性。这种复杂的缺陷导致肌肉萎缩和严重型营养不良的发展。发明人先前表明，被开发用于拯救ΔF508-CFTR转运的小分子(又被称为CFTR调节剂)的应用，促进了几种α-肌聚糖蛋白突变体的成熟，这些突变体随后在质膜上被拯救(WO014086687)。现在，本发明人证明，当联合施用时，一些特定的CFTR调节剂提供了叠加的甚至是协同的作用。

根据本发明的第一个目的，涉及一种在有需要的患者中治疗肌聚糖病的方法，其包括向该患者施用N-(2-(5-氯-2-甲氧基苯基氨基)-4'-甲基-4,5'-二噻唑基-2'-基)新戊酰胺(C17)和其他化合物的治疗有效组合，所述其他化合物即N-[2-(5-氯-2-甲氧基-苯基氨基)-4'-甲基-[4,5']二噻唑基-2'-基]-苯甲酰胺(C4)、4,5,7-三甲基-N-苯基喹啉-2-胺(C5)、N-(4-溴苯基)-4-甲基喹啉-2-胺(C6)或N-(2-(3-乙酰基苯基氨基)-4'-甲基-4,5'-二噻唑基-2'-基)苯甲酰胺(C13)。

如本文所用，术语“肌聚糖病”具有其在本领域中的一般含义，指由任何肌聚糖基因蛋白基因突变引起的肌营养不良。特别地，肌聚糖病包括LGMD-2C、LGMD-2D、LGMD-2E和LGMD-2F。

如本文所用，术语“LGMD-2C”是指由编码γ-肌聚糖蛋白的SGCG基因的突变引起的肢带型肌营养不良症2C型(肌聚糖病)。

如本文所用，术语“LGMD-2D”是指由编码α-肌聚糖蛋白的SGCA基因的突变引起的肢带型肌营养不良症2D型(肌聚糖病)。LGMD-2D最常见的缺陷是错义突变c.229C>T/p.R77C。

如本文所用，术语“LGMD-2E”是指由编码β-肌聚糖蛋白的SGCB基因的突变引起的肢带型肌营养不良症2E型(肌聚糖病)。

如本文所用，术语“LGMD-2F”是指由编码δ-肌聚糖蛋白的SGCD基因的突变引起的肢带型肌营养不良症2F型(肌聚糖病)。

如本文所用，术语“治疗”是指针对被诊断患有肌聚糖病的患者的治疗。“治疗方案”是指疾病的治疗模式，例如治疗期间使用的剂量模式。治疗方案可以包括诱导方案和维持方案。短语“诱导方案”或“诱导期”是指用于疾病初始治疗的治疗方案(或治疗方案的一部分)。诱导方案的总体目标是在治疗方案的初始阶段向受试者提供高水平的药物。诱导方案可以(部分或全部)采用“加载方案(loadingregimen)”，所述方案可以包括施用比医师在维持方案期间采用的更大的药物剂量，比医师在维持方案期间施用药物更频繁地施用药物，或两者兼而有之。短语“维持方案”或“维持期”是指用于在疾病治疗期间维持受试者的治疗方案(或治疗方案的一部分)，例如，使患者长时间(数月或数年)处于缓解状态。维持方案可以采用连续疗法(例如，定期(例如，每周、每月、每年等)施用药物)或间歇疗法(例如，中断治疗、间歇治疗、复发时治疗或达到特定预定标准[例如，疾病表现等]的治疗)。

这些药物是本领域技术人员已知的。例如，在WO2004111014中充分描述了C17的制剂，在WO2006101740中描述了C4、C5、C6和C13的制剂。

如本文所用，术语“联合”是指提供第一药物和另一种(第二、第三……)药物的所有的施用形式。这些药物可以同时、分开或依次和以任何顺序施用。联合施用的药物在将药物递送到的患者中具有生物活性。在本发明的上下文中，联合因此包括至少两种不同的药物，并且其中一种药物是C17，并且其中另一种药物是C4、C5、C6或C13。根据本发明，如实施例所示，本发明的联合提供了叠加的甚至协同的作用。术语“协同作用”或“协同”包括两种或更多种药剂的联合相对于它们各自的作用的不仅仅是叠加的效果。在一些实施方案中，协同或协同作用是指联合使用两种或更多种药剂的有利作用，例如在药物组合物中或在治疗方法中。

“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效达到所需治疗结果的量。药物的治疗有效量可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及药物在个体中引发所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量也是药物的任何毒性或有害作用被治疗有益作用所抵消的量。药物的有效剂量和给药方案取决于待治疗的疾病或病况，并且可以由本领域技术人员确定。具有本领域普通技能的医师可以容易地确定和开出所需药物组合物的有效量。例如，医师在药物组合物中所使用的药物剂量可以以低于获得所需治疗效果所需水平的剂量开始，并逐渐增加剂量直至获得所需效果。一般来说，本发明组合物的合适剂量将是根据特定给药方案有效产生治疗效果的最低剂量的化合物的量。这种有效剂量通常取决于上述因素。例如，用于治疗用途的治疗有效量可以通过其稳定疾病进展的能力来测量。治疗化合物的治疗有效量通常能改善患者的症状。本领域普通技术人员将能够基于诸如患者的大小、患者症状的严重程度以及所选择的特定组合物或施用途径的因素来确定这些量。药物治疗有效量的示例性非限制性范围为约0.1-100mg/kg，例如约0.1-50mg/kg，例如约0.1-20mg/kg，例如约0.1-10mg/kg，例如约0.5mg/kg，例如约0.3mg/kg，约1mg/kg，约3mg/kg，约5mg/kg或约8mg/kg。施用可以是例如静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下，并且例如在目标部位附近施用。调整上述治疗和使用方法中的剂量方案，以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，随着时间的推移，可以分几次施用，也可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。在一些实施方案中，在治疗期间，例如在预定的时间点，监测治疗的疗效。作为非限制性实例，根据本发明的治疗可以以约0.1-100mg/kg的量作为本发明药剂的日剂量提供，例如0.2、0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg每天，在开始治疗后的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天中的至少一天、或者在开始治疗后的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周中的至少一周、或其任意组合，每24、12、8、6、4或2小时使用单剂量或分剂量，或其任意组合。

通常，本发明的药物以包含药学上可接受的载体的药物组合物的形式施用于患者。可用于这些组合物的药学上可接受的载体包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(如人血清白蛋白)、缓冲物质(如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。为了用于向受试者施用，将配制组合物用于对患者的施用。本发明的组合物可以口服、胃肠外、通过吸入喷雾或通过植入的贮库施用。本文使用的包括皮下，静脉内，肌内或输注技术。本发明组合物的无菌注射形式可以是水性或油性悬浮液。这些悬浮液可以根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制。所述无菌注射制剂也可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的媒介物(vehicle)和溶剂包括水、林格氏(Ringer's)溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。脂肪酸(例如油酸)及其甘油酯衍生物可用于制备注射剂，天然药学上可接受的油(例如橄榄油或蓖麻油)，特别是其聚氧乙烯化形式也可用于制备注射剂。这些油溶液或悬浮液也可以含有长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素或类似的分散剂，其通常用于配制药学上可接受的剂型(包乳液和悬浮液)。其它常用的表面活性剂(如吐温、司盘)和其它乳化剂或生物利用度增强剂，它们通常用于制备药学上可接受的固体、液体或其它剂型，也可用于制剂的目的。本发明的组合物可以任何口服可接受的剂型口服施用，包括但不限于胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液。就口服片剂而言，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还添加润滑剂，例如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂包括例如乳糖。当需要水性悬浮液以口服施用时，活性成分与乳化剂和悬浮剂组合。如果需要，也可以加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。或者，本发明的组合物可以直肠施用的栓剂形式施用。这些可以通过将药剂与合适的非刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂在室温下为固体，但在直肠温度下为液体，因此将在直肠中熔化以释放药物。这些材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。该组合物可以配制成含有悬浮或溶解在一种或多种药学上可接受的载体中的活性成分的合适的洗剂或霜剂。合适的载体包括但不限于矿物油、单硬脂酸山梨醇酯、聚山梨醇酯60、十六醇酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。下肠道的局部应用可以直肠栓剂(见上文)或以合适的灌肠剂形式进行。也可以使用贴剂。本发明的组合物也可以通过鼻气雾剂或吸入施用。此类组合物是根据药物制剂领域中众所周知的技术制备的，并且可以使用苯甲醇或其他合适的防腐剂，增强生物利用度的吸收促进剂，碳氟化合物和/或其他常规的增溶剂或分散剂制备成盐水中的溶液。

本发明将通过以下附图和实施例进一步说明。然而，这些实施例和附图不应该以任何方式解释为限制本发明的范围。

附图说明

图1:通过施用CFTR调节剂挽救折叠缺陷的R77C-α-SG。

A,来自瞬时表达R77C-α-SG并用调节剂C17 10μM、C4 5μM或调节剂C17+C4的组合(各一半剂量，即分别为5μM和2.5μM)处理24小时的βγδ细胞的蛋白质裂解物的蛋白质印迹。表达野生型-α-SG的细胞被用作阳性对照。用针对α-SG和α-辅肌动蛋白的抗体探测膜，用作加载对照。

B,在至少三个独立的蛋白质印迹实验中，通过对α-SG蛋白条带的光密度分析进行定量。α-SG(+/-SEM)的平均量显示为表达野生型形式的细胞中蛋白质含量的百分比。统计学分析采用单因素方差分析-多重比较Dunnet检验进行**，P≤0.01；****P≤0.0001。

图2:C17+C4联合施用对有缺陷的R77C-α-SG的协同作用

A,表达R77C-α-SG并用媒介物或指定的调节剂处理24小时的βγδ细胞的IF共聚焦分析。完整细胞(未透化的)用抗α-SG抗体进行免疫修饰，抗α-SG抗体识别细胞外表位，由Alexa Fluor 594缀合的抗小鼠二抗显示。表达野生型-α-SG的细胞作为阳性对照显示。在每张图像的右边都报道了同一个区域，其中细胞核被DAPI染色。用徕卡SP5激光扫描共聚焦显微镜在相同的设置条件和放大倍数下记录图像。

B,表达R77C-α-SG并用媒介物(阴性对照)或指定的调节剂处理24小时的βγδ细胞的膜染色的平均荧光强度；表达WT-α-SG的βγδ细胞用作阳性对照。使用ImageXpress显微镜系统记录至少三个独立实验(一式三份进行)的荧光值。在透化条件下，将α-SG和DAPI阳性细胞数的平均值(+/-SEM)标准化，以考虑转染效率。统计学分析采用单因素方差分析-多重比较Bonferroni检验进行；n.s.,P>0.05；**,P≤0.01；***P≤0.001；****,P≤0.0001。

图3 C17+C5联合施用对有缺陷的R77C-α-SG的叠加作用。表达R77C-α-SG并用媒介物(阴性对照)、C17 10μM、C5 5μM或C17+C5(各一半剂量，即分别为5μM和2.5μM)处理24小时的βγδ细胞的膜染色的平均荧光强度。使用ImageXpress显微镜系统记录至少三个独立实验(一式三份进行)的荧光值。在透化条件下，将α-SG和DAPI阳性细胞数的平均值(+/-SEM)标准化，以考虑转染效率。统计学分析采用单因素方差分析-多重比较Bonferroni检验进行；n.s.,P>0.05；**,P≤0.01；***P≤0.001。

图4:C17+C13联合施用对LGMD2D患者肌管中有缺陷的α-SG的叠加效应。在SGCA等位基因上携带L31P和V247M突变的LGMD2D患者的肌源性细胞被分化7天。在最后4天中，用媒介物(阴性对照)、C17 5μM、C13 5μM或C17+C13(各5μM)处理细胞。在处理结束时，肌管被溶解，并且通过至少3个独立实验的蛋白质印迹和光密度分析来评估α-SG的含量。α-SG(+/-SEM)的平均量表示为阴性对照(媒介物)的蛋白质含量的增加倍数。统计学分析采用单因素方差分析-随后采用Tukey HSD Post-hoc检验进行；n.s.,P>0.05；*,P≤0.05；***,P≤0.001。

图5:C17+C6联合施用对LGMD2D患者肌管中有缺陷的α-SG的叠加效应。在SGCA等位基因上携带L31P和V247M突变的LGMD2D患者的肌源性细胞被分化7天。在最后4天中，用媒介物(阴性对照)、C17 5μM、C6 15μM或C17+C6(5μM+15μM)处理细胞。在处理结束时，肌管被溶解，并且通过至少3个独立实验的蛋白质印迹和光密度分析来评估α-SG的含量。α-SG(+/-SEM)的平均量表示为阴性对照(媒介物)的蛋白质含量的增加倍数。统计学分析采用单因素方差分析-随后采用Tukey HSD Post-hoc检验进行；n.s.,P>0.05；*,P≤0.05；**,P≤0.01。

实施例:

化学品和处理

环己酰亚胺、格拉非宁和MG132来自Sigma-Aldrich,VX809和VX770来自SelleckChemicals，C4和C17由囊性纤维化基金会(the Cystic Fibrosis Foundation)惠赠，C4、C5、C6和C13来自Exclusive Chemistry。将所有化合物溶解在DMSO中，并将工作溶液制备为1000X，以在每次处理中具有相同的媒介物含量(1‰)。

质粒、细胞培养、转染和处理

编码人α-肌聚糖蛋白的全长cDNA克隆在pcDNA3哺乳动物表达载体中之前已有描述(11)。表达α-肌聚糖蛋白的错义突变体的质粒先前已有描述(6，7)。

HEK-293、V247M细胞(8)、HER-911和βγδ-HER在补充有10％胎牛血清(FBS)(Gibco)的Dulbecco’s改良的Eagle’s培养基(Sigma)中生长，并在37℃下、在含5％CO2的潮湿气氛中维持。

永生化的人类成肌细胞(12)来自巴黎Myology研究所的“人类细胞培养平台”。来自LGMD2D患者的原代人类肌源性细胞是从来自Telethon Genetic Bio-Bank facility的活检碎片中分离的(8)。肌源性细胞在补充有15％FBS(Gibco)的Skeletal Muscle CellGrowth Medium(Promocell)(称为骨骼生长培养基(SGM))中生长。为了起始分化，融合生长的成肌细胞与补充有2％Horse Serum(Euroclone)、10μg/ml人重组胰岛素(Sigma)、100μg/ml人脱铁转铁蛋白(Sigma-Aldrich)的DMEM(称为骨骼分化培养基(SDM))孵育。分化进行了7天。

对于瞬时表达，将HEK 293细胞以50,000个细胞/cm2接种，并根据制造商的说明在第二天用Transit293(MirusBio)转染。转染后24小时，用补充有2％FBS的、含指定浓度的调节剂(溶于DMSO中)的DMEM或单独用DMSO(最终DMSO浓度0.1％)替换培养基。HER911或βγδ-细胞以50,000个细胞/cm2接种，并在第二天用9μl Fugene HD转染试剂(Promega的E2312)和3μg编码野生型或突变的α-SG的质粒转染。在细胞裂解前8小时加入MG132，在细胞裂解或IF测定(转染的HEK293、V247M细胞、HER911和βγδ细胞)前24小时并且在肌管裂解、用CHX处理或IF测定前24-96小时，加入CFTR调节剂。

处理后，将细胞用冰冷的PBS洗涤两次，并用补充有完全蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich)的5％脱氧胆酸钠裂解。

稳定表达β-、γ-和δ-肌聚糖蛋白的HER911细胞系的建立

通过使用慢病毒载体在HER911细胞中整合β-SG、γ-SG和δ-SG cDNA，获得稳定表达的βγδ-SG克隆细胞系。在6孔板中铺板细胞后的第二天，将适当体积的表达β-、γ-和δ-SG的慢病毒载体直接加入到含有1ml培养基的每个孔中，以100感染复数(MOI)感染细胞。在37℃下孵育3小时后，向每个孔中加入1ml培养基，细胞在37℃下再培养48小时。每个孔在6孔板中再次传代培养，如上所述，转导再重复两次。在三次转导后，将细胞在T-75培养瓶中传代培养，并在37℃维持，直至100％融合。然后，收集细胞，离心，并以5×10⁵个细胞/ml的密度重悬于培养基中。为了获得克隆细胞系，通过Astrios Beckman Coulter(Brea,CA)从细胞悬浮液中分选单个细胞，并将其接种在96孔板中的培养基中。10天后，总共选择30个克隆细胞系，并在较大的培养板中传代培养。对所有30个克隆进行qPCR分析，以确定每一个SG的拷贝数/基因组，并进行RT-qPCR分析，以监测SG的表达。选择一个表达SG的阳性细胞克隆，用于下一步。

免疫印迹分析

根据制造商的说明，蛋白质裂解物通过二辛可宁酸蛋白质测定试剂盒(ThermoScientific)进行定量。按照制造商的说明，将蛋白质裂解物溶解在

4-12％Bis-Tris蛋白质凝胶(Thermo Fisher Scientific)上，并转移到硝酸纤维素膜(iBlot,Thermo Fisher Scientific)上。膜在室温下在Odyssey封闭缓冲液(Li-Cor)中封闭1小时。在Odyssey封闭缓冲液中，在4℃下过夜进行一级抗体孵育(见下文)。按照制造商的说明，在室温下用驴抗兔IRDye680和抗小鼠IRDye800抗体(EuroBio)孵育1小时后，在Odissey成像系统(Li-Cor)中通过荧光检测蛋白质。

用ImageJ软件进行光密度测定。将α-肌聚糖蛋白带的强度相对于α-辅肌动蛋白的强度进行标准化。

共聚焦免疫荧光

免疫荧光共聚焦分析在完整细胞(未透化的)或透化细胞中进行。对于前一种情况，在处理结束时，使在聚赖氨酸处理的玻璃上生长的细胞在4℃下孵育30分钟，然后用冰冷的PBS温和洗涤两次，并在4℃下与一级抗体孵育5小时。在用冰冷的PBS温和洗涤三次后，细胞与荧光标记的二级抗体在4℃下孵育2小时。一级抗体和二级抗体在补充有0.5％BSA的PBS中稀释。二级抗体孵育后，细胞用PBS洗涤，然后用含4％多聚甲醛的PBS溶液(PFA)固定15分钟。用50mmol/L NH₄Cl孵育15分钟并用PBS洗涤后，细胞核用Hoechst或DAPI染色。为了在透化细胞中进行分析，将如上生长和处理的细胞用PBS洗涤，在室温下在含3.7％甲醛(Sigma-Aldrich)的PBS中固定15分钟。载玻片在PBS中冲洗，用含0.5％Triton X-100(Sigma-Aldrich)的PBS透化5分钟，然后用含10％SVF的PBS封闭30分钟，以防非特异性染色。与一级抗体和二级抗体的孵育如上所述进行。用徕卡SP5共聚焦激光扫描显微镜检查细胞。

用ImageXpress显微镜系统(Molecular Devices)对转染了R77C-α-SG的βγδ细胞的膜染色的平均荧光强度进行定量。通过在透化条件下计数DAPI和α-SG阳性的细胞数进行标准化，以考虑可能的转染效率的差异。

抗体

对α-SG特异的小鼠单克隆抗体(NCL-a-SARC)来自Leica Biosystem；对α-辅肌动蛋白特异的兔多克隆抗体来自Santa Cruz。Alexa fluor 488、Alexa fluor 594和DyLight488缀合的山羊抗小鼠和山羊抗兔抗体来自Life Technologies。

统计学分析

数据表示为平均值+/-SEM。组间的统计学差异通过以下来确定：单向方差分析检验，然后通过Dunnett检验以与对照组同时进行多重比较，或者通过Bonferroni检验以与所有可能的对比(对)同时进行比较。统计学显著性采用P<0.05的置信水平。

结果

R77C氨基酸取代是最常报道的、导致LGMD2D的突变[http://www.dmd.nl]。该突变体在单独表达时倾向于聚集，因此建立了一个细胞系，此后命名为βγδ细胞，其中编码野生型β-、γ-、δ-SG的cDNA通过慢病毒转导稳定地整合到HER911细胞的基因组中(数据未显示)。随后用野生型或R77C-α-SG转染，导致最终细胞模型的产生。在βγδ细胞(未经处理的或仅用媒介物处理的)中转染的R77C-α-SG的水平非常低，与野生型(图1A和B)相比约为20％，并且在质膜(图2A，媒介物)上几乎检测不到该蛋白，这很好地模拟了患者肌肉细胞中存在的状况(9，10)。该模型被用于评估CFTR调节剂C17和C4的功效，其以单个分子施用或组合施用。用C17和C4处理诱导R77C-α-SG蛋白含量增加3至4倍(图1A和图B)。值得注意的是，被拯救的蛋白质定位在质膜上，如由未透化细胞的强烈的细胞表面染色所证明的(图2A)。值得注意的是，C17+C4联合施用(每种调节剂以半剂量单次施用)，导致更强的效果，因为总突变体含量达到野生型的(图1B)。此外，如通过使用ImageXpress显微镜系统评估的，质膜处的荧光信号强度明显高于调节剂单独应用获得的信号强度(图2B)。然后，我们测试了调节剂C5和调节剂C17的联合施用，再次以与单次施用相比减半的剂量施用。此外，在这种情况下，与单一化合物施用相比，调节剂的联合导致细胞表面α-SG拯救的额外增加(图3)。我们还测试了调节剂C6与调节剂C17,以及调节剂C13与调节剂C17的联合施用(图4和5)。此外，在这些情况下，与单一化合物施用相比，调节剂的联合导致细胞表面α-SG拯救的额外增加。综上所述，我们得出结论，肌聚糖蛋白的突变体(如R77C-α-SG)，可以通过CFTR调节剂处理在体外被成功拯救，并且调节剂在联合施用时可能具有叠加的甚至协同的作用。

参考文献:

在整个本申请中，各种参考文献描述了本发明所属的技术水平。这些参考文献的公开内容通过引用结合到本公开中。

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7.Soheili,T.,Gicquel,E.,Poupiot,J.,N'Guyen,L.,Le Roy,F.,Bartoli,M.andRichard,I.(2012)Rescue of sarcoglycan mutations by inhibition of endoplasmicreticulum quality control is associated with minimal structuralmodifications.Hum.Mutat.33,429-439

8.Bianchini,E.,Fanin,M.,Mamchaoui,K.,Betto,R.and Sandona,D.(2014)Unveiling the degradative route of the V247Mα-sarcoglycan mutant responsiblefor LGMD-2D.Hum.Mol.Genet.23,3746–3758

9.Carrié,A.,Piccolo,F.,Leturcq,F.,de Toma,C.,Azibi,K.,Beldjord,C.,Vallat,J.M.,Merlini,L.,Voit,T.,Sewry,C.,et al(1997)Mutational diversity andhot spots in the alpha-sarcoglycan gene in autosomal recessive musculardystrophy (LGMD2D).J.Med.Genet.34,470-475

10.Duggan,D.J.,Gorospe,J.R.,Fanin,M.,Hoffman,E.P.and Angelini,C.(1997)Mutations in the sarcoglycan genes in patients withmyopathy.N.Engl.J.Med.336,618-624

11.van der Woerd,W.L.,Wichers,C.G.,Vestergaard,A.L.,Andersen,J.P.,Paulusma,C.C.,Houwen,R.H.and van de Graaf,S.F.(2016)Rescue of defectiveATP8B1 trafficking by CFTR correctors as a therapeutic strategy for familialintrahepatic cholestasis.J.Hepatol.64,1339-1347

12.Zhu,C.H.,Mouly,V.,Cooper,R.N.,Mamchaoui,K.,Bigot,A.,Shay,J.W.,DiSanto,J.P.,Butler-Browne,G.S.and Wright,W.E.(2007)Cellular senescence inhuman myoblasts is overcome by human telomerase reverse transcriptase andcyclin-dependent kinase 4:consequences in aging muscle and therapeuticstrategies for muscular dystrophies.Aging Cell 6,515-523

Claims (4)

1.一种在有需要的患者中治疗肌聚糖病的方法，其包括向所述患者施用N-(2-(5-氯-2-甲氧基苯基氨基)-4'-甲基-4,5'-二噻唑基-2'-基)新戊酰胺(C17)和其他化合物的治疗有效组合，所述其他化合物即N-[2-(5-氯-2-甲氧基-苯基氨基)-4'-甲基-[4,5']二噻唑基-2'-基]-苯甲酰胺(C4)、4,5,7-三甲基-N-苯基喹啉-2-胺(C5)、N-(4-溴苯基)-4-甲基喹啉-2-胺(C6)或N-(2-(3-乙酰基苯基氨基)-4'-甲基-4,5'-二噻唑基-2'-基)苯甲酰胺(C13)。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者患有LGMD-2D、LGMD-2E、LGMD-2C或LGMD-2F。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者患有LGMD-2D。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者患有由c.229C>T/p.R77C突变引起的LGMD-2D。

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