CN112195114A - 土壤短芽胞杆菌与制剂及制备表面活性剂方法及应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程技术在微生物采油的应用技术领域，公开一种土壤短芽胞杆菌、制剂、产生表面活性剂的方法及其应用，本发明所述土壤短芽胞杆菌由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.9983。本发明中所述土壤短芽胞杆菌及其制剂能够有效提高原油采收率；所述产生表面活性剂的方法能够使脂肽类生物表面活性剂物理性状良好，有效降低表面张力，对石油及多种烃和脂类具有良好的乳化性能。

Description

土壤短芽胞杆菌与制剂及制备表面活性剂方法及应用方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术在微生物采油的应用技术领域，具体涉及一种土壤短芽胞杆菌与制剂及制备表面活性剂方法及应用方法。

背景技术

微生物提高原油采收率(MEOR)技术，因其操作简单，经济性，绿色环保和可持续性发展特点，而被认为是三次采油后的接替技术，也称为第四次采油技术，2017年初曾被中国石油评为2016年度十大世界石油科技进展之一，在中国油田的应用越来越广泛，从中国东部的大庆，胜利，大港，华北，吉林等油田，到西部的新疆，青海，长庆，吐哈等油田都在大量应用，尤其是近年来，在低渗透油藏和稠油油藏成功应用得到新的发展。油藏本源微生物能代谢不同底物，产生物表面活性剂，生物多糖，生物气，生物酸，生物溶剂等，协同作用提高原油采收率，其中产生物表面活性剂分散乳化原油降粘是MEOR的重要机制。

例如，申请号为CN01115920.0的中国发明专利公开了短芽孢杆菌菌株及其在脱除含硫有机化合物中硫的应用，该发明涉及的短芽孢杆菌菌株为：Bacillus brevis R－6菌株，于2001年4月29日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号CGMCCNO.0571；从某炼油厂含油污水处理池中的好氧活性污泥、油井周围被油污染的土壤以及含硫量较高的煤矿矿坑周围土样中分离得到的；该Bacillus brevis R－6菌株及其非生长期静止细胞液、固定化细胞、细胞液体培养物或粗酶萃取液均可通过氧化断裂C －S键途径脱除含硫有机化合物中的硫。

再如，申请号为CN01115920.0的中国发明专利公开了一种微生物降解原油过程控制方法，包括通过研究表面活性剂对微生物生长和原油降解的影响确定所用的表活剂种类、浓度、用量等参数。本发明还提供一种石油污染物降解剂，包括采油菌和确定的表活剂；本发明还提供一种利用微生物对石油污染物的降解方法，其中包括将所确定的石油污染物降解剂注入被污染环境的过程。本发明使微生物降解原油过程得以控制，通过表活剂和降解菌共用的方式减少或消除环境中的石油污染。

但是，现有技术中，并没有关于土壤短芽胞杆菌(Brevibacillus agri.)、其制剂、其代谢产生生物并将之应用于提高原油采收率的报道。

基于现有技术存在的上述技术空白，本发明提出一种土壤短芽胞杆菌与制剂及制备表面活性剂方法及应用方法。

发明内容

本发明提供一种土壤短芽胞杆菌与制剂及制备表面活性剂方法及应用方法。

本发明采用以下技术方案：

一种土壤短芽胞杆菌，所述土壤短芽胞杆菌(Brevibacillus agri.)保藏编号为CGMCC No.9983。

一方面，本发明提供一种土壤短芽胞杆菌制剂，所述土壤短芽胞杆菌制剂中含有保存编号为CGMCC No.9983的土壤短芽胞杆菌，其中，所述土壤短芽胞杆菌为液态菌剂。

另一方面，本发明提供一种制备生物表面活性剂的方法，所述方法包括在营养培养基中发酵所述的土壤短芽胞杆菌或所述的土壤短芽胞杆菌制剂，产脂肽生物表面活性剂。

进一步地，所述营养培养基包括：MgSO₄0.2g/L，K₂HPO₄1.0 g/L，KH₂PO₄1.0 g/L，Na₂HPO₄ 4.0g/L，NaCl 10.0g/L，NaNO₃10.0 g/L，原油10.0g/L，糖蜜2-3g/L，pH值为7.0，发酵培养温度为25-60℃。

进一步地，所述营养培养基包括微量元素溶液1-5ml和复合维生素溶液1-10ml。

进一步地，所述方法还包括发酵后除去菌体的步骤。

进一步地，在营养培养基中发酵土壤短芽胞杆菌包括：

步骤1.1，将斜面保藏菌株用接种环于平板划线活化，于30℃恒温培养20h；

步骤1.2，从平板上挑取三环菌种接入一级种子摇瓶，于30℃，180r/min培养18h；

步骤1.3，取一级种子摇瓶2％的体积接入二级摇瓶，用与步骤1.2中同样条件培养18h；

步骤1.4，取二级摇瓶2％的体积接于发酵摇瓶，于同样条件下培养至芽胞率达到100％。

进一步地，所述方法还包括提取生物表面活性剂的方法，包括：

步骤2.1：获得土壤短芽胞杆菌的发酵液，将发酵液调pH至8，通过9000r/min，4℃，离心20min处理2次除去菌体，将上清液用12mol/L的盐酸调至为pH 2.0，出现絮状沉淀， 4℃静置过夜；

步骤2.2：再次通过9000r/min，30min，4℃的条件离心处理发酵液，倒掉上清液，采用pH为2.0的盐酸溶液将离心管中的沉淀洗下，用1mol/L的NaOH将沉淀的pH调至7.0，冷冻干燥，得到黄褐色疏松状的固体，制得表面活性剂粗产品；

步骤2.3：将表面活性剂粗产品用铝泊包装，放入索氏抽提器，用150mL二氯甲烷抽提10h，有机溶剂回滴速率控制在每秒钟1-2滴，抽提后再旋转蒸发除去溶剂，固体用3 倍体积的正己烷清洗出去烷烃，制得棕黄色沉淀，冷冻干燥即为纯化的生物表面活性剂。

又一方面，本发明提供一种生物表面活性剂。

再一方面，本发明提供一种制备脂肽类生物表面活性剂的方法，其中，土壤短芽胞杆菌代谢产生脂肽类生物表面活性剂。

再一方面，本发明提供一种土壤短芽胞杆菌在提高原油采收率中的应用。

再一方面，本发明提供一种土壤短芽胞杆菌制剂在提高原油采收率中的应用。

再一方面，本发明提供一种生物表面活性剂在提高原油采收率中的应用。

与现有技术相比，本发明的优越效果在于：

1、本发明所述的制备生物表面活性剂的方法，所述脂肽类生物表面活性剂物理性状良好，能够有效降低表面张力，对石油及多种烃和脂类具有良好的乳化性能；

2、本发明所述的土壤短芽胞杆菌及其制剂，能够有效提高原油采收率。

保藏说明

保藏地址：中国北京的北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所；

保藏日期：2014年11月18日；

菌种名称：土壤短芽胞杆菌；

拉丁名：Brevibacillus agri.；

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏机构简称：CGMCC；

保藏编号：CGMCC No.9983。

附图说明

图1为本发明实施例1中B5-2菌的菌落的示意图；

图2为本发明实施例1中B5-2菌的革兰氏染色显微镜观察的示意图；

图3为本发明实施例1中B5-2菌的透射电镜图；

图4为本发明实施例3中不同碳源对表面张力的影响的示意图；

图5为本发明实施例3中不同氮源对表面张力的影响；

图6为本发明实施例4中菌株B5-2所产表面活性剂的乳化性能实验的示意图；

图7为本发明实施例5中B5-2菌作用前后原油族组分质量分数变化的示意图；

图8为本发明实施例5中B5-2作用前饱和烃组分含量的色谱-质谱分析的示意图；

图9为本发明实施例5中B5-2作用后饱和烃组分含量的色谱-质谱分析的示意图；

图10为本发明实施例5中TH191原油芳香烃GC/MS谱图；

图11为本发明实施例5中TH191原油B5-2菌作用后芳香烃GC/MS谱图；

图12为本发明实施例5中降解前原油TH191中的基本杂原子类的相对丰度的示意图；

图13为本发明实施例5降解后原油TH191-S-4-OK中的基本杂原子类的相对丰度。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进行进一步说明本发明的土壤短芽胞杆菌(Brevibacillus agri.)及特点和应用中所具有的技术效果，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明提供了一株从油藏极端环境分离得到的一株土壤短芽胞杆菌(Brevibacillus agri.)，研究数据表明，该菌株具有良好的降解原油特性，土壤短芽胞杆菌(Brevibacillus agri.) 及其生物制剂能降解原油高分子烃类和极性化合物，改变原油水界面活性物质的亲水亲油性能，降粘和提高原油采收率。本发明首次提供了一种利用土壤短芽胞杆菌(Brevibacillus agri.)发酵产生脂肽类生物表面活性剂的方法以及提取土壤短芽胞杆菌(Brevibacillus agri)代谢产物的工艺，提供了一种土壤短芽胞杆菌(Brevibacillus agri)的制剂并将之应用于提高原油采收率。

实施例1：产生物表面活性剂菌种的分离、鉴定及保藏

1、产表面活性剂菌种的富集培养和分离

按照常规的菌株筛选方法，将从中国西部油田采集的油水样取10mL接入盛有100mL 灭菌原油培养基(2％原油，v：v)中，30℃，180rpm恒温振荡培养96h，再取原油乳化分散程度高的实验组的富集培养液5％转接到新鲜的培养基，30℃，180rpm恒温振荡培养96h。如此反复富集培养10轮次，然后选取原油乳化分散最好的实验组，取100μL发酵液涂布于LB琼脂平板培养基，30℃培养48h；挑取不同形态单菌落，在LB琼脂平板培养基上划线纯化，30℃，48h培养。挑取单菌落经过富集培养接种入以原油为碳源的原有无机盐培养基中，30℃，180rpm培养96h，观察原油乳化分散程度和测定发酵液表面张力选取表面张力降低幅度最大的菌株。

本实施例中，通过初步筛选，发现样品中有能够很好乳化分散原油、降低培养液表面张力的微生物。经过上述培养、驯化，分离出1株产生物表面活性剂菌株，命名为B5-2，其排油圈直径为6.65cm，发酵液表面张力降低至30.68mN/m。其代谢产物具有优异的表面活性，可应用于微生物提高原油采收率。

表1产表面活性剂微生物的确定

2、菌种生理生化鉴定及保存依据《常见细菌系统鉴定手册》，对本发明分离出的菌株B5-2进行鉴定，主要从菌株个体形态特征、菌落特征、染色反应、生理生化反应等鉴定到属，内容包括形态观察、革兰氏染色、过氧化氢接触酶反应、氧化酶实验、葡萄糖氧化发酵实验、甲基红实验等，鉴定结果表2。

表2菌株B5-2生理生化特征鉴定结果

菌落呈圆形，表面凸起，乳白色，表面光滑湿润，B5-2菌为杆状，产芽孢，芽孢端生膨大，显微镜照片如图1，2所示，B5-2菌在中科院微生物所做的电镜照片如图3所示, 电镜型号JEM-1400电镜照片显示，菌有荚膜，并有周生鞭毛。

另外，按照常规菌种鉴定方法，分别提取菌株B5-2的基因组DNA，设计引物进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，选择理想的PCR产物送至上海生工测序进行DNA 测序。B 5-2的PCR扩增产物测序结果提交NCBI用BLAST进行检索和同源性比较，确定菌株B5-2为土壤短芽胞杆菌(Brevibacillus Agri.strain的相似度为99％)。

本实施例的菌株B5-2可以采用如下保存方法：

(1)短期保存：将上述菌株于斜面培养基上划线，经35℃，48h培养后，4℃保藏。

(2)长期保存：可采用甘油冷冻保存法：从新鲜的斜面培养基上刮取几环菌，转入到已装有1.5mL 30％灭菌甘油甘油管中，-80℃冷冻保存，或采用脱脂牛奶冷冻保藏法：从新鲜的斜面培养基上刮取2环菌，转入到已装有灭菌脱脂牛奶的甘油管中，-80℃冷冻保存。

本实施例所筛选到的土壤短芽胞杆菌(Brevibacillus Agri.)B5-2于2014年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号：CGMCC No.9983。

实施例2：B5-2代谢产物的提取

1、B5-2的发酵

本实施例所提供的土壤短芽胞杆菌(Brevibacillus Agri.)B5-2，发酵培养基包括：MgSO₄ 0.2g/L，K₂HPO₄1.0 g/L，KH₂PO₄1.0 g/L，Na₂HPO₄4.0 g/L，NaCl 10.0g/L，NaNO₃10.0 g/L，原油(稠油)10.0g/L,糖蜜2-3g/L，pH 7.0，微量元素和复合维生素溶液适量，pH 6-8， 115℃灭菌30min,发酵培养温度30℃。

将斜面保藏菌株用接种环于平板划线活化，于30℃恒温培养20h，然后从平板上挑取三环(每接种环菌种包含3个以上特征明显的单菌落)菌种接入一级种子摇瓶(250mL三角瓶，装液量为50mL)，于30℃，180r/min培养18h，2％的体积接入二级摇瓶(250mL锥形瓶，装液l00 mL)，用同样条件培养18h，以2％的体积接于发酵摇瓶(500mL锥形瓶，装液150mL)，于同样条件下培养至芽胞率达到100％。

2、B 5-2产脂肽的提取及初步鉴定

将发酵液调pH至8，9000r/min，4℃离心20min处理2次除去菌体，将上清液用12mol/L 的盐酸调至为pH 2.0，出现絮状沉淀，4℃静置过夜；再离心处理(9000r/min，30min，4℃)，倒掉上清液，用尽量少的pH为2.0的盐酸溶液将离心管中的沉淀洗下，用1mol/L的NaOH 将沉淀的pH调至7.0，冷冻干燥，得到黄褐色疏松状的固体，即得表面活性剂粗产品，将粗产品用铝泊包好，放入索氏抽提器，用150mL二氯甲烷抽提10h，有机溶剂回滴速率控制在每秒钟1-2滴，抽提后再旋转蒸发除去溶剂，固体用3倍体积的正己烷清洗出去烷烃，得棕黄色沉淀，冷冻干燥即为纯化的生物表面活性剂。

经酸沉淀法提取后得到从褐色沉淀物，已经鉴定出该菌株为土壤短芽孢杆菌，通常土壤短芽孢杆菌产生的表面活性剂主要是脂肽，它是一种带电荷的生物表面活性剂，所以采用等电荷酸沉淀法提取的效果较好。

3、薄层层析法定性分析

实验采用的薄层板是硅胶板，即吸附剂是硅胶，因此薄层层析结果好否，主要是受到展开剂的影响。

(1)展开剂的配制：展层剂为氯仿/甲醇/水(65/15/2，V/V/V)。

(2)层析缸空间最好先用展开剂蒸汽饱和，为了加速饱和过程，可在缸内悬浸有展开剂的滤纸。

(3)将点样后的薄层板浸入0.5～1.0cm深的展开剂中。

(4)当展开剂的前缘移至薄板上缘约0.5～1.0cm处，停止展层，将薄板迅速取出放平，并用铅笔记下溶剂的前缘位置。

(5)显色：将显色剂装入喷雾器中，采用洗耳球吹气的方式使显色剂均匀喷洒在薄层上，放入110℃烘箱中烘10min。

TLC分析并染色发现,直接用茚三酮进行染色不显色,将薄层板放入到装有浓盐酸的密封瓶内于150℃原位水解后,再用茚三酮进行染色,发现显红色斑点,表明不含有游离氨基酸,酸解后可产生游离氨基,表明该物质本身不含有游离氨基，验证为脂肽表面活性剂。

实施例3：B5-2产脂肽培养体系的优化

培养基包括种子培养基、发酵培养基和斜面培养基，其中：

种子培养基(g/L)：MgSO₄0.2，K₂HPO₄1.0，KH₂PO₄1.0，NH₄NO₃1.0，酵母膏1.0，CaCL₂·2H₂O 0.02，FeCl₃0.05，蒸馏水1000ml，PH 7.2；

发酵培养基(g/L)：MgSO₄0.2，K₂HPO₄1.0，KH₂PO₄1.0，Na₂HPO₄4.0，NaCl 10.0，蛋白胨10.0，原油20.0,糖蜜10.0,蒸馏水1000ml，PH 7.0；

斜面培养基(g/L)：牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，琼脂20.0，蒸馏水1000ml，PH 7.0。

1、碳源优化

凡可以作为微生物细胞结构或代谢产物中碳元素来源的营养物，称为碳源(Carbon source)，可作为微生物营养的碳源物质种类及其广泛，从简单的无机物(CO₂、碳酸盐) 到复杂有机含碳化合物(糖、糖的衍生物、脂类、醇类、有机酸、烃类、芳香族化合物等)。但不同微生物利用碳源的能力不同，有的能广泛地利用不同类型的碳源，如假单孢菌属的有些种可利用90种以上的碳源，但有的微生物能利用的碳源范围及其狭窄，如甲烷氧化菌仅能利用两种有机物，甲烷和甲醇：某些纤维素分解菌只能利用纤维素。

在微生物采油过程中选择适当的碳源是MEOR设计中的最主要步骤之一，考虑到油田应用以及成本需要，通常我们用重蜡油、植物油、原油、液体石蜡、原油和糖蜜的混合物作为碳源筛选。

按质量计碳源的加量按2％，B5-2接种量按5％，培养温度25℃，培养时间为4d，摇床转速为180r/min，所筛选的碳源及试验结果如图4，经过对不同碳源的筛选，结果表明菌株B5-2产脂肽的较适宜碳源是原油和糖蜜的混合物，原油和糖蜜比其它碳源能更好的促进脂肽生物表面活性剂的产生。

2、氮源优化

凡是构成微生物细胞物质或代谢产物中氮元素来源的营养物质，称为氮源(Nitrogen source)，它在细胞的干物质中含量仅次于碳和氧，氮是组成核酸和蛋白质的重要元素，所以，对微生物的生长生育有着重要的作用，从分子态的N2到复杂的含氮化合物都能被不同的微生物所利用，而不同类型的微生物能利用的氮源差异较大，氮是构成重要生命物质蛋白质和核酸等的主要元素，氮占细胞干重的12％－15％，故与碳源相似，氮源也是微生物的主要营养物，通常我们用酵母膏、蛋白胨、磷酸氢二氨、硝酸钠、尿素作为氮源筛选。

以酵母膏、蛋白胨、磷酸氢二胺、硝酸钠、尿素、硫酸铵为氮源，按质量计氮源的加入量都为1％，碳源原油和糖蜜混合物的加量为2％，种子液B5-2菌接种量为5％，培养温度25℃，培养时间为4d，摇床转速为180r/min。

氮源是合成细胞物质的基本营养源，其种类和浓度决定了菌体的生长情况，从而影响着脂肽生物表面活性剂的产量，经过筛选发现，如图5所示，菌株生产脂肽时，无机氮优于有机氮，无机氮中以硝酸钠为最佳。

3、正交实验优化培养基

利用单因素实验，对发酵培养基的碳源、氮、矿化度，以及对培养过程的种龄和接种量，温度、需氧情况和pH进行优化，另对培养基中其它成分进行优化调整，采用L₁₆(4⁵) 正交实验以减少实验次数如表3和表4所示。

表3正交实验因素与水平表

表4 L₁₆(4⁵)正交实验结果

正交试验的实验结果采用直观分析法，直观分析的结果见表3和表4，从表4的计算结果和图4、图5可以看出：A₄B₄C₂D₁为最优水平组合，即碳源浓度为12.0g/L，硝酸钠浓度为20.0g/L，氯化钠浓度为10.0g/L,培养温度为25℃时，级差分析结果为R_D>R_B>R_A>R_C。即培养温度对脂肽产量的影响最大。

实施例4：对原油(稠油)作用效果

1、乳化性能

乳化即水或有机溶剂以微小液滴形式分散于有机相或水相中的现象，也就是当某一液相以微滴分散于另一连续的液相时便形成了乳化液，取一试管，加5mL液体石蜡和5mL表面活性剂溶液，用漩涡振荡器振荡1min后静置，在不同时间测量水相、乳化相和油相体积，以乳化相的体积与总体积之比表示乳化能力。

B5-2菌产脂肽生物表面活性剂，对煤油、液体石蜡乳化稳定性实验结果如图6所示，从图6可以看出脂肽生物表面活性剂有良好的乳化能力，96小时后的对煤油的油水乳化能力仍能保持在72％以上，因此是一种良好的乳化剂，这是由于该生物表面活性剂为含有多种组分的脂肽混合物，结构多样，对油/水界面的亲和力强，使乳化相得以稳定，证明该脂肽有着良好的应用前景。

2、排油活性结果

取培养皿加水，并滴加200微升正十二烷，待形成油膜后，将10微升发酵液滴加到油膜中心，观察排油圈直径大小及稳定性，做三个平行样偏差在5％以内，取平均值作为样品的排油圈直径。

B5-2菌产生的脂肽生物表面活性剂对正十二烷的排油圈直径达到6.6cm，具有很好的排油性能。

3、生物表面活性剂带电性检测结果

(1)阴离子表面活性剂测定方法用亚甲基蓝-氯仿测定法：

把5mL样品加入到25mL试管里，接着加10mL亚甲基蓝溶液和5mL氯仿，用力振荡数分钟，如果溶液中含有阴离子表面活性剂，则氯仿层变成蓝色；

(2)阳离子表面活性剂测定方法用溴酚蓝测定方法：

将样品溶液的pH值调到7.0，取5mL加入到25mL试管里，接着加2～5滴配制好的溴酚蓝溶液到上述试管里，如果溶液中含有阳离子表面活性剂，则变成深蓝色。

根据阴离子表面活性剂测定方法(亚甲基蓝-氯仿测定法)和阳离子表面活性剂测定方法(溴酚蓝测定方法)，结果为氯仿层变为蓝色，可得知该样品中的生物表面活性剂为阴离子表面活性剂。

4、B5-2菌作用前后原油表面张力、pH值和原油粘度的变化

表面张力是液体的一个重要参数，通常情况下用它来反映液体的表面性质也就是液体中活性物质的多少，表面张力越低，表明液体中表面活性物质含量越高。微生物采油过程中，有些微生物代谢产物中含有一定的表面活性物质，一般称之为生物表面活性剂，生物表面活性剂具有降低水/油/岩石界面张力、乳化原油、改变油藏孔隙表面润湿性，但直接测量微生物菌液中生物表面活性剂含量比较困难，常通过测量表面张力的方法来评价微生物菌液活性，微生物的代谢产物如产酸产表面活性物质是微生物提高采油的重要机理，菌液降低表面张力能力和pH变化是评价菌种性能的基本指标，微生物有产表面活性剂能力，可使油水界面张力降低，使驱油毛管力减小，从而提高采收率，通过微生物降低油水界面能力实验可以确定筛选菌株产活性剂能力大小。

(1)表面张力和pH值的研究

在500mL三角瓶中装入200mL发酵培养基，在油田实际温度条件下于回旋摇床上(频率为180r/min)培养4天，培养4天后发酵液离心除去菌体，再用滤纸过滤上清液，尽量除去上清液中的残余油。

实验中表面张力的测量采用美国CAHN公司的DCA322型接触角分析仪，采用吊片法来测量微生物菌液的表面张力，该仪器全部的测量过程都是在计算机程序控制下自动完成的。

实验中，用蒸馏水配制营养液，所以以蒸馏水作为参照样，测定的空白培养基表面张力为64.38mN/m。

B5-2菌液对五种原油分别在各自的温度矿化度条件下培养4天，然后将油水分离，测量菌液pH和表面张力，实验数据见表5。培养结果来看：

1)B5-2菌使西部某油田3个油井油样表面张力都有所降低，但对不同原油，表面张力降低程度不同。B5-2菌使TH191原油、TH291原油、TH222原油表面张力分别降低 50.26％,45.46％，47.91％。

2)pH值下降，pH值都由7.2变成酸性，说明在降解过程中产酸。

表5 B5-2菌作用原油后表面张力及PH值变化

(2)原油粘度的变化

在采油工程中，原油粘度是影响原油产量的一个关键因素，油品粘度越低，流动性越好，越容易被采出地面，因此，在采油技术发展过程中，人们一直都在研究各种降低原油粘度的方法，以前的许多研究结果表明，有些微生物与原油作用后会降低原油的粘度，这可能有三个方面的原因，一是微生物对原油的降解作用，破坏了原油中胶质、沥青质等作为质点形成的网状结构，也就是降低了原油中重质组分的相对含量，改善了原油的流动性，第二个原因可能是微生物在繁殖代谢过程中产生一些有机溶剂，对原油产生稀释作用，第三个原因可能是微生物代谢产生的表面活性物质对原油产生了乳化作用，形成水包油性型乳状液，从而降低原油粘度，在筛选和评价采油微生物菌种时也将微生物降低油品粘度能力作为一个重要参数进行考察。

实验中采用从美国引进的BROOK FIELDⅡ转筒式粘度计测量。在500mL三角瓶中盛200mL发酵培养基，在油田实际温度条件下于回旋摇床上(频率为180r/min)培养4天， 4天以后将菌液与油分离，用高速离心机上以9000转/分离心10分钟，对油进行脱水处理。将脱水后的油样倒入粘度计转筒内，将粘度计循环水浴温度设为65℃，在粘度计上装上U2转子，粘度计内样品温度达到稳定后，在1.5RPM的速度下测量油样粘度，通过油品与菌液作用前后粘度变化即来通过降粘率来比较各种菌液的降粘能力。

降粘率＝(η前-η后)/η前*100％；

其中，η前为微生物作用前的原油粘度，η后为微生物作用后的原油粘度。

本源菌B5-2对各原油降粘实验结果见表6。

表6 B5-2菌作用后原油粘度的变化

从表6降粘实验结果表明，B5-2菌对三种原油都产生了良好的降粘效果，综合来看， B5-2对TH191原油、TH291原油、TH222原油的降粘率分别为33.3％、28.8％、32.6％。

实施例5：原油B5-2菌降解前后组分变化

1、原油组分分析

室内评价了本源细菌对新疆油田原油作用前后组分的变化，四组分是指原油中的饱和烃、芳香烃、胶质沥青质和非烃组分。

25℃，空气摇床培养，转速为180r/min，培养7天后，原油发生一定程度的降解，并且被乳化，将原油收集于样品瓶中，于高速离心机上离心(8000r/min，离心时间为1 分钟)，用5ml注射器吸去样品瓶底的水。放于4℃冰箱中，准备四组分和质谱分析，四组分分析,原油各族分含量发生变化，见表7和图7。

表7 B5-2作用前后原油族组分相对含量

通过对西部油田原油进行B5-2菌降解试验，结果表明，其饱和烃、芳香烃、非烃和沥青质的相对含量都发生了很显著的变化：饱和烃和沥青质的相对含量升高，芳香烃、非烃的相对含量不同程度的降低，说明微生物优先降解高碳链组分，从而造成了饱和烃相对含量的升高，B5-2菌降解芳香烃和非烃组分，从而使沥青质的相对含量升高。

2、色质结果及分析

执行标准：GB/T 18606-2001《气相色谱质谱法测定沉积物和原油中生物标志物》

使用仪器：Agilent7890-5975c气相色谱质谱联用仪

测试条件：色谱；载气：99.999％氦气；进样口：300℃；传输线：300℃；色谱柱： HP-5MS弹性石英毛细柱(60m×0.25mm×0.25m)；柱温：初温50℃1min；20℃/min 升温至120℃，以4℃/min升温至250℃，再以3℃/min升至310℃，保持30min；载气流速：1mL/min.质谱EI源，绝对电压：1047V；全扫描。

如图8和图9所示，B5-2菌作用后，Pr和Ph，正构十九烷和正构二十烷比例发生了一定的变化，C27和C28的相对含量降低，碳数小于16的烷烃比例增加，说明本源菌将高碳链组分变成低碳链组分，从而轻质组分增加，GC/MS分析表明B5-2菌对低碳数饱和烃的降解作用不明显，主要降解了一些高碳链烷烃类。

如图10和图11所示，芳香烃发生了明显的降解，尤其是C₂₀以下的芳香烃变化最为显著，三甲基萘显著被降解，菲类降解明显，二甲基萘/三甲基萘和菲类所占的比例发生明显变化，GC/MS分析表明B5-2菌优先降解萘和菲类，主要降解C₂₀以下的芳香烃类，结果表明B5-2菌能有效降解C₂₀以下的芳香烃类，使原油降解前后组分发生明显变化。

3、极性杂原子化合物变化

通过傅立叶变换离子回旋共振质谱仪(FT-ICR MS)分析了TH191稠油B5-2菌作用前后的组成变化，微生物降解后，原油中的N类化合物大幅度减少，从70％左右降低至不到20％，O₂类化合物含量从超过20％降低到不到5％，NO、NO₂类所占比率均有不同程度的减小，NO₃类和NS类的化合物可能被微生物分解了，而O₃类有明显的升高，所占比率超过70％。

相对丰度定义为质谱中每个峰的强度除以所有鉴定出峰的强度的总和(同位素峰除外)，即使两个样品中给定类的相对丰度相同，它的绝对丰度也不一定相同，因为它取决于其他类的丰度，如图12和图13所示，原油TH191和经B5-2菌培养作用后的杂原子类的相对丰度图，图12中N类化合物占据了杂原子类的大部分，超过70％，其他类杂原子所占比例比较低：O₂的含量次之，超过了20％，NO、NO₂、O都小于5％，含有微量的NO₃和NS，都可忽略不计。经过微生物降解后，如图12所示，N类化合物含量大幅度减少，低于20％。NO、NO₂类所占比率均有的减小，微生物降解作用后，NO₃类和NS类的化合物经过微生物分解掉了，在图13中均没有显示出来，而O₃类有明显的升高，所占比率超过70％，可能是生成了大量的含氧酸类物质。说明原油被B5-2菌降解后，油水界面极性化合物中的中性含氮杂原子化合物被明显降解，产生亲水性强的含氧酸性化合物，从而导致原油界面物质的亲水亲油性能发生变化，即原油水界面活性物质亲油性降低，亲水性增强，最终导致原油乳液发生转向，刑成水包油乳状液，粘度大幅度降低，流动性增强，采收率提高。

实施例6：驱油模拟试验

1、驱油菌液的准备

制备150ml表面活性剂菌发酵培养基，3L无机盐培养基。121℃，20min高压蒸汽灭菌。将B5-2菌株活化后转接到发酵培养基中，25℃，180r/min摇床培养，24h后将发酵液按10％的加入量加入到3L驱油培养基中，25℃，180r/min摇床培养，4天后取出放入 4℃冰箱待用。

实验2、岩心驱油物模试验

接好驱油流程，流程由微量值速泵(恒压驱替的压力源用气瓶)、高压容器、岩心模型和油水分离计量管组成，以上四部分用管线和阀门联接，按要求装压力表显示压力值，将需要保持实验温度部件装入恒温箱中。

选用气测渗透率在100-200md的TH121和TH122两块人造岩心，注入B5-2菌液2PV，关井4天，分别测出其驱油效果。

(1)岩心饱和水

将气测渗透率在200md左右的人造岩心称干重后放入广口瓶中，用真空泵抽空三个小时，再加入模拟地层水，使岩心完全浸入水中，开启真空泵直到真空表读数为零，然后取出称湿重，得到岩心孔隙体积。

(2)饱和油

将岩心装入岩心夹持器中，放入40℃恒温箱，将脱水原油加入钢制容器，接好管路，开动平流泵将原油压入岩心，当岩心夹持器出口端流出3－4mL原油时，饱和油结束，根据驱出水的体积得到原油饱和度。

(3)水驱

将模拟地层水装入钢制容器，接好驱油管路，开动平流泵驱油，在岩心夹持器出口端用5mL试管接原油，每隔10分钟左右计一次数，直到含水率达95％为止。

(4)微生物驱

将B5-2菌液装入钢制容器，接好管线驱油，记下驱出的原油量，达到规定的PV数后关闭平流泵，按计划在50℃下关井4天。

(5)后续水驱

到规定的关井时间后，对岩心进行后续水驱，记下驱出的原油量，算出提高原油采收率的值。

产生物表面活性剂菌B5-2所使用岩心为TH121和TH122，二块均质人造岩心物理性质测定结果如表8示。两块岩心饱和油后水驱至含水95％时，注入产生物表面活性剂B5-2菌液，关井4天，后续水驱，求出采收率，结果见表8。

表8均质岩心的物理性质测定结果

由表8知TH121和TH122的物理性质测定结果知两块岩心的物理参数大致相同，气测渗透率在160md左右，孔隙体积25％左右，含油饱和度82％左右，由B5-2驱油实验数据，对于TH121和TH122两组岩芯，采用120mg/L B5-2生物表面活性剂菌溶液驱替后对原油采收率提高幅度分别为10-12％，驱油效果明显。

本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书界定。

Claims (11)

1.一种土壤短芽胞杆菌，其特征在于，所述土壤短芽胞杆菌(Brevibacillus agri.)保藏编号为CGMCC No.9983。

2.一种土壤短芽胞杆菌制剂，其特征在于，所述土壤短芽胞杆菌制剂中含有保存编号为CGMCC No.9983的土壤短芽胞杆菌，其中，所述土壤短芽胞杆菌为液态菌剂。

3.一种制备生物表面活性剂的方法，其特征在于，所述方法包括在营养培养基中发酵权利要求1所述的土壤短芽胞杆菌或权利要求2所述的土壤短芽胞杆菌制剂，产脂肽生物表面活性剂。

4.根据权利要求3所述的制备生物表面活性剂的方法，其特征在于，所述营养培养基包括：MgSO₄ 0.2g/L，K₂HPO₄ 1.0 g/L，KH₂PO₄ 1.0 g/L，Na₂HPO₄ 4.0 g/L，NaCl 10.0g/L，NaNO₃10.0g/L，原油10.0g/L，糖蜜2-3g/L，pH值为7.0，发酵培养温度为25-60℃。

5.根据权利要求4所述的制备生物表面活性剂的方法，其特征在于，所述营养培养基还包括微量元素1-5ml和复合维生素溶液1-10ml。

6.根据权利要求3所述的制备生物表面活性剂的方法，其特征在于，所述方法还包括发酵后除去菌体的步骤。

7.一种生物表面活性剂，其特征在于，根据权力要求3-6任一项中的制备方法制得。

8.一种制备脂肽类生物表面活性剂的方法，其特征在于，土壤短芽胞杆菌代谢产生脂肽类生物表面活性剂。

9.权力要求1中的土壤短芽胞杆菌在提高原油采收率中的应用。

10.权力要求2中的土壤短芽胞杆菌制剂在提高原油采收率中的应用。

11.权利要求3中的生物表面活性剂在提高原油采收率中的应用。

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