CN112189475A

CN112189475A - 化学诱导子在促进檀香幼苗茎生长发育中的应用

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Publication number: CN112189475A
Application number: CN202010963148.0A
Authority: CN
Inventors: 李媛; 马国华; 金峰; 程庆伟; 张新华
Original assignee: South China Botanical Garden of CAS
Current assignee: South China Botanical Garden of CAS
Priority date: 2020-09-14
Filing date: 2020-09-14
Publication date: 2021-01-08
Anticipated expiration: 2040-09-14
Also published as: CN112189475B

Abstract

本发明公开了化学诱导子在促进檀香幼苗茎生长发育中的应用。本研究探讨了BA、ETH、MeJA、H₂O₂和CaCl₂对1年生檀香木生长发育及精油合成关键基因表达的影响。这些诱导剂在促进檀香幼苗，尤其是1年生檀香茎生长发育、木材形成及檀香烯合成酶基因SaSSY表达方面具有积极作用；BA、ETH、MeJA和H₂O₂在诱导SaCYP736A167基因(调控檀香醇合成关键基因)表达方面具有积极作用。上述研究结果为研究檀香木材及心材形成、檀香烯醇生物合成分子机制研究提供理论基础，也为利用化学诱导子(最佳诱导剂BA和H₂O₂)科学指导檀香人工栽培提供实践依据。

Description

化学诱导子在促进檀香幼苗茎生长发育中的应用

技术领域：

本发明属于檀香产业领域，具体涉及化学诱导子在促进檀香幼苗茎生长发育中的应用。

背景技术：

檀香(Santalum album L.)因其质地坚硬、纹理美观的心材及心材中提取的气味芳香、成分上等的檀香醇等化合物而闻名，具有巨大的商业价值。然而，与其它短轮伐期的产材树种不同，檀香生长速度缓慢，心材形成周期长。在印度天然林分中，生长10年至13年的檀香逐渐形成心材，长至20年的檀香，其心材发育速度达到最高。檀香产品所得高额利益是造成其过度开采的主要原因，严重阻碍其生产力的可持续发展。自1980年以来，全球檀香木原生资源锐减，现为世界濒危珍贵树种。檀香产品供不应求，人们对其需求量很大。从长远来看，开展大规模人工种植可以减轻对自然种群的采伐需求，同时也能维持优良性状品种的可持续发展。如何通过加快檀香发育和心材形成来提高人工林生产力是建立可持续檀香资源的一个重要方面。生物技术的使用是提高檀香人工林生产力和可持续性的重要措施。

许多化学诱导子对植物生长和发育至关重要，在通过调节转运蛋白和生化反应控制信号及其引起的下游反应中发挥重要作用。一些早期的研究报告显示植物萜烯可由各诱导子和信号刺激诱导产生，如：钙离子、脱落酸、多胺、茉莉酸甲酯(MeJA)、一氧化氮、除草剂和伤害等(Dixon and Paiva 1995，Tuteja and sopoly 2008)。在檀香属植物心材发生方面已开展一些田间试验。较早的研究表明单独机械损伤树干对心材的形成没有明显的作用，而机械损伤和诱导子联合使用可以少量诱导心材或精油产生。据报道，在12年生檀香树茎部注射硫酸铜和硫酸锌溶液以及植物激素(吲哚-3-丁酸)可诱导心材发生，但该研究缺乏对精油含量和成分的定性和定量分析(Kadambi 1954)。将乙烯利(ethephon,ETH)通过注射或环剥树干方式输入树体，研究结果表明ETH可促进其心材的形成(Deng 2012)。此外，树干注入99.999％的纯二氧化碳、0.6％的6-苄基腺嘌呤(BA)、0.3％的MeJA和0.3％的甲基紫精也可诱导7年生檀香心材的精油产生(Liu et al.2013)。尽管上述研究已描述一些化学诱导子对檀香心材形成的影响，但研究材料多为6年生及以上的檀香，缺少对幼龄檀香的研究。特别是结合解剖学、形态学及分子生物学多种手段研究叶面喷施多种化学诱导子对1年生檀香生长、木材形成和精油合成转录调控的影响，在前人研究中无可利用信息。

参考文献：

Deng RY(2012)Study on the mechanism of forming aromatic heartwood inSantalum album L.by ethephon stimulation.Master Dissertation,GuangzhouUniversity of Chinese Medicine.

Dixon RA,Paiva NL(1995)Stress-induced phenylpropanoidmetabolism.Plant Cell 7:1085-1097.

Kadambi K(1954)Inducing heartwood formation in the Indian sandalwoodtree,Santalum album Linn.Indian For 80:659-662.

Liu XJ,Xu DP,Yang ZJ,Zhang NN(2013)Effects of plant growth regulatorson growth,heartwood formation and oil composition of young Santalum album.SciSilvae Sin 49:143-149.

Tuteja N,Sopory SK(2008)Chemical signaling under abiotic stressenvironment in plants.Plant Signaling Behav 3:525-536.

发明内容：

本发明的第一个目的是提供化学诱导子在促进檀香幼苗，尤其是1年生檀香茎生长发育的应用。

本发明的第二个目的是提供一种促进檀香幼苗，尤其是1年生檀香茎生长发育的制剂，其含有化学诱导子作为活性成分。

所述的化学诱导子是BA或H₂O₂。

本发明研究了BA(6-苄基嘌呤)、ETH(乙烯利)、MeJA(茉莉酸甲酯)、H₂O₂(过氧化氢)和CaCl₂(氯化钙)对1年生檀香木生长发育及精油合成关键基因表达的影响。结果表明，H₂O₂和BA是诱导1年生檀香生长最有效的2种化学诱导子。

因此，本发明的第三个目的是提供化学诱导子在调节檀香的檀香烯合成酶和/或SaCYP736A167基因，进而分别促进催化法尼基焦磷酸合成檀香烯及催化檀香烯合成檀香醇中的应用。

所述的化学诱导子是BA或H₂O₂。

本研究探讨了BA、ETH、MeJA、H₂O₂和CaCl₂对1年生檀香木生长发育及精油合成关键基因表达的影响。这些诱导剂在促进檀香幼苗，尤其是1年生檀香茎生长发育、木材形成和诱导合成重要檀香倍半萜类关键基因表达的积极作用，可为研究檀香心材形成及檀香烯醇生物合成分子机制提供依据。

附图说明：

图1表示在3个对照组(水、Tween-20和NaOH处理的1年生檀香)之间，其株高和茎结构没有差异。此举排除上述助溶剂对檀香发育的影响。水、Tween-20和NaOH处理的树木的株高(a)、成熟茎直径(b)、木质部宽度(c)和横切茎表型(d)。木质部的宽度用黑色线标记。标尺(d)：250μm。误差线代表标准偏差。Pxy代表初生木质部；Sxy代表次生木质部，Duncan多重极差检验样品间是否存在显著性差异(p<0.05，n＝5)。

图2表示外源施加化学诱导子促进1年生檀香株高及茎部木质部发育。BA、ETH、MeJA、H₂O₂和CaCl₂处理植株茎高(a)、成熟茎直径(b)、木质部宽度(c)和第20节间茎横截面表型(d)。木质部的宽度(蓝色)标记。标尺(d):250μm。误差线代表标准偏差。Pxy代表初生木质部；Sxy代表次生木质部。Duncan多重极差检验样品间是否存在显著性差异(p<0.05，n＝5)。

图3表示施加化学物质改变檀香烯醇合成途径关键基因SaSSY(a)和SaCYP736A167(b)的表达。显著性用星号表示。**代表p<0.005时样品间显著性，*代表p<0.05时样品间显著性，采用student’s t检验方法。

图4表示不同外源物质处理5年生檀香树高的变化情况，数据使用柱状图展示。每组数据上面柱子为处理后檀香树高，下面柱子为处理前檀香树高。误差线代表标准偏差。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

一、材料与方法

1、植物生长条件与材料选择

首先将檀香(Santalum album L.)饱满的种子(去除假种皮后)浸泡在2mM赤霉素溶液中12小时，再用3％次氯酸钠溶液对种子表面消毒5分钟，用蒸馏水冲洗3次后，播种在苗圃(环境温度：27-32℃)盆中的无菌砂中。待种子发芽，幼苗长出至少4片叶后(大约需要1月至1个半月)，将10cm高的幼苗移入14cm×11cm、填充黄土和腐殖质的混合物(5:1，v/v)的塑料盆，放置在阴凉的棚内。1个月后，将幼苗与寄主假蒿伴生培养。当幼苗长到30厘米以上时，将幼苗及其寄主假蒿共同转移至25厘米×30厘米、填充黄土和腐殖质的混合物(5:1，v/v)的布袋中继续培养。约栽培10月后，随机选择生长速度一致且健康的40株檀香(此时为1年生)进行试验。

2、外源施加化学诱导子

实验地点在中国科学院华南植物园温室内(北纬23°10′，东经113°21′)，实验材料为1年生檀香栽培树木。

本研究选择了5种化学诱导子：BA(>99％，6-苄氨基嘌呤)(EKEAR Bio，上海，中国)，ETH(>85％，乙烯利)(Solarbio，北京，中国)，MeJA(>95％，茉莉酸甲酯)(阿拉丁，上海，中国)，30％H₂O₂(分析试剂)(国药化学试剂有限公司，上海，中国)和CaCl₂(>99％)(Chembase，北京，中国)。

2mM工作液的配制：

A、称取0.1445g乙烯利药品，加水定量至500mL；

B、称取0.111g氯化钙颗粒，加水定量至500mL；

C、称取0.2253g BA粉末，1M的NaOH逐渐溶解，加水定量至500mL；

D、用移液器吸取0.115mL 30％H₂O₂溶液，加水定量至500mL；

E、吸取0.2243g(即0.2292mL)MeJA溶于等体积Tween-20(Macklin，中国上海)中，加水定量至500mL。

工作液是用水稀释。

由于1年生檀香树干较薄，在树干上钻洞会对树体发育造成严重的损害，所以本方法采用叶面喷施法将这些化学诱导子喷洒至檀香叶子上。将100毫升2mM BA、ETH、MeJ A、H₂O₂或CaCl₂分别喷洒在1年生檀香树的叶片上(远轴面和近轴面)。将等量的水、NaOH和Tween-20水溶液(与配制诱导剂时使用量相同)采用相同喷施方法加入1年生树木中作为对照。共处理1次，喷施2月后进行后续观察。

3、解剖学观察

为研究诱导剂对茎微观结构的影响，我们取2mM上述5种化学诱导子和3种对照试剂(水、Tween-20和NaOH)处理的1年生檀香植株成熟茎(即选取第20个节间，距地面约30cm处)约1cm长的茎固定于70％FAA中。徒手切片方法，各处理茎切片厚度约100μm，经逐级酒精(70％酒精，90％酒精)替换FAA后，使用伊红金橙染液(95％乙醇：5％伊红B：5％金橙G＝96:3:1，v/v)染色24小时。经清洗、脱水和透明后，将切片添加至纯水杨酸甲酯(AR，>99％)溶液中(Macklin，上海，中国)，并在Leica DVM6 3D数字显微镜(Leica microsystem，Wetzlar，Germany)下观察并拍照。

4、株高、直径以及木质部宽度的测量

使用最大量程为3m的遥测杆记录化学诱导子和所有对照处理1年生檀香的高度。使用游标卡尺记录各处理檀香第20个节间的直径(距地面约30cm)大小。使用Digim izer软件(5.4版)对1年生檀香树的木质部宽度进行测定，每个样品切片沿不同方向测定10组数据，每种处理5次生物学重复。数据分析采用统计软件sSPSS 20.0(SPSS in c.，USA)进行计算。采用Duncan多重极差检验样品间是否存在显著性差异(p<0.05，n＝5)。

5、实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)

为分析檀香烯醇生物合成途径关键基因SaSSY和SaCYP736A167的表达模式，我们利用ABI7500快速实时PCR系统(Life Technologies,CA,USA)对其表达量进行检测。在此之前，需要提取待测样本总RNA。利用环剥法取各诱导剂及对照处理1年生檀香木质部组织，标记好后迅速置于液氮中。称取0.1g研磨成粉的各木质部样品，参照说明书，使用Biozol试剂(中国杭州生物能源公司)提取总RNA。使用Nanodrop 2000(Thermo Fisher，Waltha m，MA，USA)测定RNA浓度，并利用1.2％琼脂糖凝胶跑胶检测RNA的完整性。利用基因组DNA(gDNA)去除剂消化2μg RNA中残留的基因组DNA，按照说明书，利用Trans

-Uni RT/RI酶混合系统(TransGen Biotech，北京，中国)和锚定寡核苷酸(dT)引物合成木质部cDNA。以稀释5倍的木质部cDNA(加2μl)为模板，参照说明书(20μl体系)，使用

Tip GreenqPCR SuperMix(TransGen Biotech，北京，中国)(10μl 2×Green qPCR SuperMix，0.4μl50×passive Reference Dye)和特异性引物(0.4μl 10μM特异引物F/R)进行扩增(无核酶水补足至20μl)。特异性引物序列如下：SaSSY(F:5′-GCTTGTGGATGTGGTTCAAAG-3′；R:5′-CACTGTCGTAGCAGCCTAAA-3′),SaCYP736A167(F:5′-TGTTAGCGCAGCTCATTCA-3′；R:5′-GGTTTAGGACTCCAAGCGATAG-3′),和内参基因Santalum album coatomer subunit alpha-1(SaCSA)(F:5′-GCCAATATACCGAGGACAGAAG-3′；R:5′-CAACCGCAAGATCACAAACAG-3′).qRT-PCR程序如下：94℃激活30s；然后94℃5s，60℃30s，72℃10s进行40次循环。每个实验包括3次生物重复和2次技术重复。用2^-△△Ct法对qRT-PCR所得数据进行处理。

二、实验结果

1、外源施加化学诱导子可提高1年生檀香茎形成层活性

外源信号，包括化学诱导子，在心材中萜烯的产生和诱导中发挥重要作用。然而，目前还缺乏更全面的证据解释哪些外源性化学诱导子能引起幼龄檀香生长和心材形成的改变并对其潜在的作用机理进行研究。为了更好地解决这个问题，我们研究外源施用化学诱导子BA、ETH、MeJA、H₂O₂和CaCl₂是否对1年生檀香的生长有影响(图1和图2)。

由于这些诱导剂分别使用水、NaOH或Tween-20作为助溶剂，我们首先比较了水、NaOH或Tween-20对树木生长发育的影响。如图1所示，经水、NaOH或Ween-20水溶液处理的树木在株高、茎木质部宽度、成熟茎直径和茎组织结构方面没有差异(图1)，排除助溶剂对处理株系发育的影响。在后续的研究中，我们选择水处理的树木作为所有处理植株统一的对照。

如图2所示，与水处理的树木相比，所有5种化学诱导子处理的树木在株高、木质部宽度和成熟茎直径方面存在显著差异(图2a-c)。与水处理的树木相比，使用H₂O₂、BA和ETH等(包括ETH、MeJA和CaCl₂)处理的树木高度分别增加26.1％、16.4％和8.91％；而用ETH、MeJA和CaCl₂处理的各树之间株高没有显著差异(图2a)。与水处理的树木相比，各处理茎直径明显增大，尤其是BA和H₂O₂处理的树，直径约为水处理直径1.5倍，(图2b)。为探究各处理树木茎直径增加的原因，接下来，我们制作一系列的茎段切片对其解剖结构进行分析。初步观察结果显示：与茎直径增大一致，由形成层衍生的木质部区域也明显变宽，统计学结果显示木质部组织细胞层的增加是茎宽增加的主要原因(图2c和d)。从茎段横切表型(图2d)可以看出，5种化学诱导子均可不同程度提高次生木质部的分化能力，这表明BA、ETH、MeJA、H₂O₂和CaCl₂具有促进幼龄檀香木材提早形成的作用。解剖结果结合形态、株高等结果表明在我们使用的5种试剂中，H₂O₂和BA是诱导1年生檀香生长最有效的2种化学诱导子。

2、外源化学物质改变了檀香烯醇生物合成途径关键基因SaSSY和SaCYP736A167的表达

既然我们发现BA、ETH、MeJA、H₂O₂和CaCl₂的应用对木材形成有潜在的积极影响(图1)，接下来，我们进一步研究这些诱导剂在檀香倍半萜生物合成中的作用。在檀香木中，檀香烯合成酶(SaSSY)和细胞色素P450(CYP450)分别在催化法尼基焦磷酸(FPP)合成檀香烯及催化檀香烯合成檀香醇代谢过程中发挥重要作用。在催化因此，我们检测上述诱导剂对木质部中SaSSY和依赖CYP450的单加氧酶成员SaCYP736A167基因表达的影响。由图3可知，与水对照相比，5种诱导剂均能不同程度增加SaSSY基因的转录丰度，其中ETH、BA、MeJA和CaCl₂处理效果较好(图3a)。SaCYP736A167基因作为心材中直接调控檀香烯合成檀香醇关键基因，其表达模式与SaSSY基因略有不同。qRT-PCR结果显示除CaCl₂外的其余4种诱导剂均能不同程度诱导SaCYP736A167基因表达，其中H₂O₂、BA和ETH的作用最明显。这3种诱导剂的施加将SaCYP736A167基因的转录丰度提高至对照组的6倍以上(图3b)。然而，CaCl₂的施加下调了SaCYP736A167基因的表达(图3b)。结合前述株高和茎的解剖结构看(图1和图2)，综合比较认为ETH虽能促进这2个基因表达量上调(图3)，但对幼苗茎生长促进效果一般。从而得出BA和H₂O₂对幼苗茎发育和檀香烯醇合成诱导效果最佳的结论。

实施例2：

一、材料与方法

1、试验材料与药品

供试檀香种植时间为2010年，早期寄主主要为美蕊花、九里香、麻楝等檀香株行距约2m×2m，试验小区为排水良好的平坦地形。

2015年10月，在试验地内随机选取44株长势相近，胸径6-7cm，尚未形成心材的檀香进行试验。

供试药品分别为：6-苄基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine，BA)(～99％)，上海伊卡生物技术有限公司；乙烯利(Ethephon，ETH)(≥85％)，北京索莱宝科技有限公司；30％H₂O₂(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；氯化钙(>99％)，北京康倍斯科技有限公司；茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJ)(95％)，阿拉丁试剂(上海)有限公司。各药品均为两种浓度2mM和4mM，用量约400ml/次，每年4次。试剂配制方法见表1。

表1溶液配制

2、试验方法

心材有无的确定方法：参考刘小金(2012)和Radomijac(1998)所用方法并略作改进，在距地面30cm处用装有5mm直径钻头的电钻(欧力普12V锂电钻,型号1001C，上海，中国)斜向下钻孔取样，通过观察木屑有无变色、有无檀香特有香气来判断是否有心材形成。此取样孔可作为外源物质的注药口，避免树体多次损伤。

施药方法：采用大树输液袋(1000ml容量)向树体施药，每次400ml。分别于2015年10月、2016年3、5月以及7月各进行一次输液处理。

3、试验设计

试验包括5种药品，2种处理浓度，以及一个只加等量水处理的对照，每种处理4株，共44株，试验植株随机选定。

4、生长指标测定

分别于试验前(2015年10月)和试验后(2016年11月)对处理植株的树高进行测量，其中树高采用7m塔尺进行测量。

二、结果与分析

1、外源物质对幼龄檀香生长的影响

乙烯利(2mM和4mM)处理1-2d后，树体开始大量落叶，半个月后开始长出新叶，新叶较小且黄，再次处理时，仍有落叶情况。这可能是由于树干输液法给药持续时间长，树体再次受持续胁迫而落叶。BA处理的植株树干上有嫩枝发出，其它处理植株表型没有明显的变化。

处理前后树高的变化如图4所示，各处理对树高变化影响差异不显著(p＝0.552)。

Claims

1.化学诱导子在促进檀香幼苗茎生长发育中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的檀香幼苗是1年生檀香。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的化学诱导子是BA或H₂O₂。

4.一种促进檀香幼苗茎生长发育的制剂，其特征在于，含有化学诱导子作为活性成分。

5.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于，所述的檀香幼苗是1年生檀香。

6.根据权利要求4或5所述的制剂，其特征在于，所述的化学诱导子是BA或H₂O₂。

7.化学诱导子在调节檀香烯合成酶和/或SaCYP736A167基因，进而分别促进催化法尼基焦磷酸合成檀香烯及催化檀香烯合成檀香醇中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的化学诱导子是BA或H₂O₂。