CN112176050A - HuR基因在制备抗高血压药物中的应用 - Google Patents

HuR基因在制备抗高血压药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及HuR基因在制备抗高血压药物中的应用。本发明通过构建平滑肌特异性敲除HuR的基因敲除小鼠，公开了HuR基因在调节血管平滑肌收缩功能和维持血压中的重要作用，G蛋白信号转导调节蛋白(RGS)是G蛋白偶联受体的负向调控因子，HuR蛋白通过与RGSmRNA结合，增加RGS基因表达，进一步抑制G蛋白偶联受体信号通路，导致血管平滑肌细胞内钙离子释放减少，平滑肌收缩能力下降，血压降低。本发明利用自发性高血压大鼠尾静脉注射过表达HuR的腺病毒，发现过表达HuR基因能够显著降低血压；本发明以HuR基因为作用靶标，制备或筛选抗高血压的药物，在高血压的治疗中具有重要意义。

Description

HuR基因在制备抗高血压药物中的应用
技术领域
本发明涉及HuR基因在制备抗高血压药物中的应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
高血压是指以体循环动脉血压(收缩压和/或舒张压)增高为主要特征的临床综合征。在未用抗高血压药物的情况下，三次非同日测得收缩压≥140mmHg和(或)舒张压≥90mmHg即可被定义为高血压。高血压在心血管疾病的发生发展中起重要作用，它是导致疾病死亡的第一位危险因素和疾病负担的第三位因素，长期发展可导致心、脑、肾等靶器官严重损坏，具有高致残率和高死亡率。高血压的发病机制极为复杂，包括交感神经活动亢进、肾素-血管紧张素系统激活、肾钠潴存、血管重构、内皮细胞功能受损、胰岛素抵抗等。它们最终是通过改变血容量、心输出量和外周阻力从而影响血压。
外周阻力指小动脉和微动脉对血流的阻力，它在血压的维持上起重要作用。外周阻力依赖于血管平滑肌细胞收缩和舒张之间的平衡。血管平滑肌细胞在生物学应力和血管活性刺激下，通过控制血管直径，直接驱动血管壁的收缩。有证据表明血管平滑肌收缩状态异常足以引起包括高血压在内的血压紊乱，从而阐明了血管收缩力在调节血压中的重要作用。然而，调节血管收缩力的机制与血压的关系尚未明确。
条件性基因敲除是指在特定的组织细胞或者细胞发育的特定阶段敲除某一特定基因的实验技术。条件性基因敲除一般采用Cre/loxP重组系统，Cre重组酶是一种位点特异性重组酶，能介导两个loxP位点之间的特异性重组，使loxP位点间的基因序列被删除或重组，Cre重组酶介导两个loxP位点间的重组是一个动态、可逆的过程，可以分为三种情况：1)如果两个loxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个loxP位点间的序列；2)如果两个loxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个loxP位点间的序列倒位；3)如果两个loxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre重组酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。条件性基因敲除对于在特定的组织细胞和/或特定的时间研究特定基因的功能，以及更好地建立人类疾病的动物模型都具有十分重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了HuR基因在制备抗高血压药物中的应用。本发明通过构建敲除HuR基因的高血压模型小鼠，验证了HuR基因在调节血管平滑肌收缩功能和维持血压中的重要作用，为抗高血压药物的制备奠定了基础。
本发明的技术方案如下：
HuR基因在制备抗高血压药物中的应用，所述HuR基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
根据本发明优选的，所述HuR基因在制备抗高血压药物中的应用，包括以下两个方面：
(1)将HuR基因作为作用靶标应用于抗高血压药物的制备；
(2)将HuR基因作为作用靶标应用于抗高血压药物的筛选。
根据本发明优选的，所述HuR基因作为作用靶标应用于抗高血压药物的制备是指：将HuR基因作为药物或制剂的作用靶标，以此为基础制备抗高血压的药物或制剂，制备的药物或制剂能够高效特异性促进平滑肌细胞HuR基因的转录或翻译，或者能够高效特异性提高平滑肌细胞HuR蛋白的表达或活性，从而降低平滑肌的收缩能力，降低血压。
根据本发明优选的，所述HuR基因作为作用靶标应用于抗高血压药物的筛选是指：将HuR基因作为药物或制剂的作用靶标，以此为基础筛选抗高血压的药物或者制剂，筛选的药物或者制剂能够高效特异性促进平滑肌细胞HuR基因的转录或翻译，或者能够高效特异性提高平滑肌细胞HuR蛋白的表达或活性，从而降低平滑肌的收缩能力，降低血压。
根据本发明优选的，所述抗高血压药物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白质或过表达腺病毒。
当所述抗高血压药物为核酸分子时，所述核酸分子含有如SEQ ID No.1所示的HuR基因的核苷酸序列；进一步优选的，所述核酸分子还含有HuR基因启动子或强启动子，其中强启动子为CMV、SV40、EF1a、Ubc、human beta actin或CAG。该核酸分子可正常表达或过表达HuR基因，提高平滑肌细胞中HuR蛋白的活性，降低平滑肌细胞的收缩能力，降低血压。
当所述抗高血压药物为过表达腺病毒时，所述过表达腺病毒含有如SEQ ID No.1所示的HuR基因的核苷酸序列，进一步优选的，所述核苷酸序列的上游含有HuR基因启动子或强启动子，其中强启动子为CMV、SV40、EF1a、Ubc、human beta actin或CAG。该过表达腺病毒可正常表达或过表达HuR基因，提高平滑肌细胞中HuR蛋白的活性，降低平滑肌细胞的收缩能力，降低血压。
根据本发明优选的，所述抗高血压药物还含有药学上可接受的赋形剂；进一步优选的，所述赋形剂为葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露糖、淀粉、微晶纤维素素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水中的一种或两种以上。
根据本发明优选的，所述抗高血压药物为片剂、丸剂、粉剂或针剂。
本发明的技术特点和有益效果：
人类抗原R(HuR)是一种RNA结合蛋白，它通过与靶mRNA的3＇非编码区富含腺苷酸/尿苷酸元件(AREs)特异性结合，增强其mRNA稳定性，从而增加靶基因的翻译。G蛋白信号转导调节蛋白(RGS)是G蛋白偶联受体的负向调控因子，HuR通过与RGSmRNA结合，增加RGS基因表达，进一步抑制G蛋白偶联受体信号通路，导致血管平滑肌细胞内钙离子释放减少，平滑肌收缩能力下降，血压降低。
本发明通过构建平滑肌特异性敲除HuR的基因敲除小鼠，公开了HuR基因在调节血管平滑肌收缩功能和维持血压中的重要作用；同时利用自发性高血压大鼠尾静脉注射过表达HuR的腺病毒，发现过表达HuR基因能够显著降低血压；本发明以HuR基因为作用靶标，制备或筛选抗高血压的药物，在高血压的治疗中具有重要意义。
附图说明
图1为条件性敲除HuR基因的策略流程图；
图2为小鼠肠系膜动脉平滑肌细胞中HuR蛋白的表达情况；图中，A为小鼠肠系膜动脉平滑肌细胞中HuR蛋白western blot验证图，B为小鼠肠系膜动脉平滑肌细胞中HuR蛋白的表达量柱状图，CTR代表对照鼠，HuRSMKO代表基因敲除鼠，Tubulin为α微管蛋白，为蛋白内参；
图3为不同年龄段小鼠的血压曲线图；图中，CTR代表对照鼠，HuRSMKO代表基因敲除鼠，sBP为收缩压；
图4为三个月龄不同性别小鼠的血压柱状图；图中，CTR代表对照鼠，HuRSMKO代表基因敲除鼠，sBP为收缩压；
图5为小鼠心脏重量与胫骨长度的比值柱状图；图中，CTR代表对照鼠，HuRSMKO代表基因敲除鼠；
图6为HuRSMKO小鼠心脏重量与体重的比值柱状图；图中，CTR代表对照鼠，HuRSMKO代表基因敲除鼠；
图7为小鼠肠系膜动脉对10μM NE的收缩反应曲线；图中A为对照鼠的收缩反应曲线，B为HuRSMKO小鼠的收缩反应曲线，NE为去甲肾上腺素；
图8为小鼠肠系膜动脉对不同血管收缩剂的收缩反应柱状图；图中，CTR代表对照鼠，HuRSMKO代表基因敲除鼠，NE为去甲肾上腺素，AngII为血管紧张素II，ET-1为内皮素-1；
图9为大鼠主动脉平滑肌细胞中HuR蛋白的表达情况；图中，A为大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞中HuR蛋白western blot验证图，B为大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞中HuR蛋白的表达量柱状图，Wistar代表Wistar大鼠，为对照鼠，SHR代表自发性高血压大鼠，Tubulin为α微管蛋白，为蛋白内参；
图10为大鼠尾静脉注射过表达HuR腺病毒后血压变化曲线图；图中，Wistar代表Wistar大鼠，为对照鼠；SHR代表自发性高血压大鼠；SHR+GFP代表自发性高血压大鼠尾静脉注射绿色荧光蛋白GFP腺病毒；SHR+HuR代表自发性高血压大鼠尾静脉注射过表达HuR腺病毒，sBP为收缩压。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的保护范围。
HuRflox/flox小鼠美国Jacksonlab公司有售，SMA-Cre小鼠南京大学模式动物研究所有售，Wistar大鼠和SHR大鼠北京维通利华实验动物技术有限公司有售，GFP腺病毒山东维真生物科技有限公司有售。
实施例中涉及药品及试剂，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中涉及实验操作，若无特殊说明，均按照本领域常规操作进行。
实施例1小鼠高血压模型的构建
将HuRflox/flox小鼠与平滑肌特异表达Cre重组酶的小鼠SMA-Cre交配，获得SMA-Cre/HuRflox/+小鼠，并进一步杂交产生HuRflox/flox/Cre+小鼠，HuRflox/flox/Cre+小鼠将loxP位点之间的序列重组掉，即将HuRflox/flox/Cre+小鼠平滑肌内的HuR基因敲除掉，抑制了HuR基因的功能，从而得到平滑肌特异性敲除HuR基因的小鼠，该小鼠用HuRSMKO表示。图1为条件性敲除HuR基因的策略流程图。
肠系膜动脉是影响血压变化的主要阻力血管。将HuRSMKO小鼠的肠系膜动脉取出，同时取对照鼠(同窝出生的HuRflox/flox/Cre-小鼠)的肠系膜动脉，分别除去周围脂肪组织，加蛋白裂解液研磨样品，各取10微克蛋白上样做Western blot验证，用HuR蛋白的抗体检测，结果如图2所示，发现HuRSMKO小鼠的肠系膜动脉中大部分HuR基因被去除，无法表达HuR蛋白，从而为后续的研究提供了很好的动物模型。
实施例2平滑肌HuR基因在小鼠高血压中的作用
检测不同年龄段的实施例1得到HuRSMKO小鼠与对照鼠(同窝出生的HuRflox/flox/Cre-小鼠)的血压情况，结果如图3所示，发现HuRSMKO小鼠在三个月后表现出稳定的高血压。同时检测三个月龄的不同性别的HuRSMKO小鼠与对照鼠的血压情况，结果如图4所示，发现无论是雄性还是雌性小鼠与对照鼠相比血压均明显增高。
比较HuRSMKO小鼠与对照鼠的心脏重量与胫骨长度的比值，结果如图5所示，发现心脏重量与胫骨长度比值明显增大。将HuRSMKO小鼠与对照鼠心脏重量与体重的比值进行比较，结果如图6所示，发现心脏重量与体重的比值增大。以上结果证实了敲除HuR基因可以引起血压增高和心肌肥厚。
实施例3平滑肌HuR基因在维持血管收缩功能中的作用
取出实施例1得到HuRSMKO小鼠与对照鼠(同窝出生的HuRflox/flox/Cre-小鼠)的肠系膜动脉的次级分支，清除结缔组织和脂肪，切成约2mm长度的血管段，用PowerLab记录设备(ADInstruments)记录加入不同血管收缩剂后的血管反应活性。图7为HuRSMKO小鼠与对照鼠的肠系膜动脉在去甲肾上腺素(NE)刺激后的血管张力变化图，可以发现在NE刺激下，HuRSMKO小鼠的肠系膜动脉收缩要明显强于对照鼠的肠系膜动脉。图8为HuRSMKO小鼠与对照鼠的肠系膜动脉分别在10μM NE,10μM AngII,0.1μM U46619,0.1μM ET-1刺激下血管张力变化的比较，发现在这四种不同的血管活性药物的刺激下，HuRSMKO小鼠的肠系膜动脉收缩都比对照鼠的肠系膜动脉收缩强烈。因此，可以得出结论，敲除HuR基因增强了血管平滑肌对各种血管收缩剂的收缩反应，对血管收缩剂收缩反应增强可能是HuRSMKO小鼠发生高血压的原因之一。
实施例4过表达HuR腺病毒的制备
过表达HuR腺病毒的制备方法，步骤如下：
1.将pShuttle-CMV载体(Agilent公司购买)经内切酶KpnI和HindIII双酶切，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收；
2.以人平滑肌细胞cDNA为模板，经PCR扩增，纯化，制得HuR基因片段；
PCR扩增的特异引物核苷酸序列如下：
正向引物：5’-GGTACCATGTCTAATGGTTATGAAGACC-3’；
反向引物：5’-AAGCTTTTATTTGTGGGACTTGTTGGTT-3’；
HuR基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
3.将步骤2制得的HuR基因片段经内切酶KpnI和HindIII双酶切，制得HuR基因双酶切产物；
4.将步骤3中HuR基因双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并回收含981bp大小的DNA片段，纯化，得到纯化后的HuR基因双酶切产物；
5.将步骤1回收后的pShuttle-CMV双酶切产物和步骤4纯化后的HuR基因双酶切产物进行连接，制得连接产物；
6.将步骤5制得的连接产物转化大肠杆菌，经抗性筛选和测序验证后，提取阳性质粒pShuttle-HuR；
7.将步骤6中的阳性质粒pShuttle-HuR经内切酶PmeI酶切后，与pAdEasy-1质粒(Agilent公司购买)共同转入大肠杆菌BJ5183中，经同源重组和抗性筛选后，得到pAdEasy-1-HuR质粒；
8.将步骤7的pAdEasy-1-HuR质粒经内切酶PacI酶切线性化后，转入293A细胞，转染后5～7天收集病毒，经超离心纯化，同时测定病毒滴度，制得过表达HuR腺病毒。
实施例5过表达HuR腺病毒在自发性高血压大鼠(SHR)高血压中的作用
与Wistar大鼠相比，SHR大鼠具有稳定遗传性高血压，将SHR大鼠与Wistar大鼠的主动脉取出，加蛋白裂解液研磨样品，各取10微克蛋白上样做Western blot验证，用HuR蛋白的抗体检测，结果如图9所示，发现SHR大鼠主动脉中HuR水平明显减少。
将SHR大鼠与Wistar大鼠分为四组，每组至少5只，在10周龄时进行处理，四组的大鼠及处理情况如下：
第一组：Wistar大鼠，不作任何处理；
第二组：SHR大鼠，不作任何处理；
第三组：SHR大鼠，尾静脉注射GFP腺病毒；
第四组：SHR大鼠，尾静脉注射实施例4制备的过表达HuR腺病毒；
具体的操作流程为：在大鼠尾静脉注射腺病毒量为0.5×1012VP/只，尾静脉注射病毒后连续监测血压变化。如图10所示，与Wistar大鼠相比，SHR大鼠表现出明显的高血压。但与SHR大鼠尾静脉注射GFP腺病毒组相比，SHR大鼠尾静脉注射过表达HuR腺病毒使之过表达HuR后血压明显降低。以上结果证实了HuR基因在维持血压中的关键作用，平滑肌中HuR基因减少能够使血管平滑肌对各种血管收缩剂的收缩反应增强，而通过给自发性高血压大鼠尾静脉注射过表达HuR腺病毒的方法加以治疗，能够降低自发性高血压大鼠的血压，从而为下一步找到可以促进平滑肌细胞HuR基因表达的药物或制剂作为抗高血压的备选药物或制剂有重要意义。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> HuR基因在制备抗高血压药物中的应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 981
<212> DNA
<213> hominis
<400> 1
atgtctaatg gttatgaaga ccacatggcc gaagactgca ggggtgacat cgggagaacg 60
aatttgatcg tcaactacct ccctcagaac atgacccagg atgagttacg aagcctgttc 120
agcagcattg gtgaagttga atctgcaaaa cttattcggg ataaagtagc aggacacagc 180
ttgggctatg gctttgtgaa ctacgtgacc gcgaaggatg cagagagagc gatcaacacg 240
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tggcagatgt ttgggccgtt tggtgccgtc accaatgtga aagtgatccg cgacttcaac 840
accaacaagt gcaaagggtt tggctttgtg accatgacaa actatgaaga agccgcgatg 900
gccatagcca gcctgaacgg ctaccgcctg ggggacaaaa tcttacaggt ttccttcaaa 960
accaacaagt cccacaaata a 981

Claims (10)

1.HuR基因在制备抗高血压药物中的应用，其特征在于，所述HuR基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.如权利要求1所述的HuR基因在制备抗高血压药物中的应用，其特征在于，包括以下两个方面：
(1)将HuR基因作为作用靶标应用于抗高血压药物的制备；
(2)将HuR基因作为作用靶标应用于抗高血压药物的筛选。
3.如权利要求2所述的HuR基因在制备抗高血压药物中的应用，其特征在于，所述HuR基因作为作用靶标应用于抗高血压药物的制备是指：将HuR基因作为药物或制剂的作用靶标，以此为基础制备抗高血压的药物或制剂，制备的药物或制剂能够高效特异性促进平滑肌细胞HuR基因的转录或翻译，或者能够高效特异性提高平滑肌细胞HuR蛋白的表达或活性，从而降低平滑肌的收缩能力，降低血压。
4.如权利要求2所述的HuR基因在制备抗高血压药物中的应用，其特征在于，所述HuR基因作为作用靶标应用于抗高血压药物的筛选是指：将HuR基因作为药物或制剂的作用靶标，以此为基础筛选抗高血压的药物或者制剂，筛选的药物或者制剂能够高效特异性促进平滑肌细胞HuR基因的转录或翻译，或者能够高效特异性提高平滑肌细胞HuR蛋白的表达或活性，从而降低平滑肌的收缩能力，降低血压。
5.如权利要求1所述的HuR基因在制备抗高血压药物中的应用，其特征在于，所述抗高血压药物包括：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白质或过表达腺病毒。
6.如权利要求5所述的HuR基因在制备抗高血压药物中的应用，其特征在于，所述核酸分子含有如SEQ ID No.1所示的HuR基因的核苷酸序列；优选的，所述核酸分子还含有HuR基因启动子或强启动子，其中强启动子为CMV、SV40、EF1a、Ubc、human beta actin或CAG。
7.如权利要求5所述的HuR基因在制备抗高血压药物中的应用，其特征在于，所述过表达腺病毒含有如SEQ ID No.1所示的HuR基因的核苷酸序列；优选的，所述核苷酸序列的上游含有HuR基因启动子或强启动子，其中强启动子为CMV、SV40、EF1a、Ubc、human betaactin或CAG。
8.如权利要求1所述的HuR基因在制备抗高血压药物中的应用，其特征在于，所述抗高血压药物还含有药学上可接受的赋形剂。
9.如权利要求8所述的HuR基因在制备抗高血压药物中的应用，其特征在于，所述赋形剂为葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露糖、淀粉、微晶纤维素素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水中的一种或两种以上。
10.如权利要求1所述的HuR基因在制备抗高血压药物中的应用，其特征在于，所述抗高血压药物为片剂、丸剂、粉剂或针剂。
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