CN112175923B

CN112175923B - 一种生物因子及其在促进内耳毛细胞再生上的应用

Info

Publication number: CN112175923B
Application number: CN202011060861.0A
Authority: CN
Inventors: 柴人杰; 洪国栋; 高下; 唐明亮; 付小龙
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2020-09-30
Filing date: 2020-09-30
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2040-09-30
Also published as: CN112175923A

Abstract

本发明属于生物学内耳研究领域，具体公开了一种生物因子及其在促进内耳毛细胞再生上的应用。所述生物因子为单倍剂量状态下的组蛋白去泛素化酶USP16，所述生物因子具有促进内耳干细胞增殖分化为毛细胞的活性，氨基酸序列如SEQ NO.1所示。本发明人首次在内耳中发现USP16在小鼠内耳中的时空表达模式；后续发现该基因在小鼠毛细胞中敲低之后会导致毛细胞凋亡进而影响正常的听觉功能；最后发现在内耳Lgr5阳性内耳干细胞中敲低USP16基因后促进了内耳干细胞的增殖，导致了毛细胞的增生情况。本发明所述USP16基因为后续小鼠毛细胞再生的研究中奠定了重要基础。

Description

一种生物因子及其在促进内耳毛细胞再生上的应用

技术领域

本发明属于生物学内耳研究领域，涉及一种生物因子及其在促进内耳毛细胞再生上的应用。

背景技术

哺乳动物毛细胞丢失将直接导致听力损失。目前主要的技术是通过人工耳蜗辅助患者恢复一定的听觉功能，但这也只是治标不治本，此外人工耳蜗植入效果因人而异，只有部分人可以达到或者接近正常人听力水平。若能维持毛细胞的稳态以及促进毛细胞的再生具有很大的研究前景。目前已有许多学者研究毛细胞的再生，但是其再生效果并不理想，另外毛细胞再生后是否具备正常的听觉功能就更加的难以掌握。内耳毛细胞的再生过程极其复杂，可能是多基因多信号通路相互作用的结果，未知性强，探究深度较高，需要较长的时间去探究这一复杂过程。

USP16基因早期在唐氏综合征中被报道，该基因过表达会导致干细胞的加速衰老，低表达会促进干细胞的增殖能力。目前该基因在内耳中的作用尚未被报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种生物因子及其在促进内耳干细胞再生为毛细胞上的应用，所述生物因子为组蛋白去泛素化酶USP16，具有促进内耳干细胞再生为毛细胞，促进听力的恢复，具有良好的市场前景。

一种生物因子，所述生物因子为单倍剂量状态下的组蛋白去泛素化酶USP16，所述生物因子具有促进内耳干细胞增殖分化为毛细胞的活性，氨基酸序列如SEQ NO.1所示。

SEQ NO.1：

一种核酸分子，编码上述组蛋白去泛素化酶USP16的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ NO.2所示。

SEQ NO.2：

上述单倍剂量状态组蛋白去泛素化酶USP16在制备促进内耳干细胞再生为毛细胞的药品上的应用。

一种药品组合物，含有上述单倍剂量状态下的组蛋白去泛素化酶USP16。

有益效果：

与现有技术相比，本发明一种生物因子及其在促进内耳干细胞再生为毛细胞上的应用具有如下优势：

1、通过转基因小鼠特异性的在Lgr5阳性内耳干细胞中敲除一个染色体上的Usp16基因至其为单倍剂量，在敲除后的小鼠模型中研究内耳干细胞再生毛细胞的能力及其调控机制，这是常规的药物调控所做不到的。

2、目前国际上内耳干细胞的调控机制研究大多局限于单个信号通路的调控；本项目选题是在现有研究基础上进一步深入探索Wnt信号与Usp16对内耳干细胞的协同调控机制，既有学术理论上的创新和深度，同时为进一步促进内耳干细胞再生有功能的毛细胞提供科学理论依据。

3、通过活体动物实验得到的研究结果具有巨大的临床应用价值，将为在临床治疗上应用内耳干细胞促进毛细胞的再生从而恢复听觉功能奠定实验基础。

附图说明

图1为毛细胞再生的两个途径，一种是支持细胞转分化为毛细胞，另一种为支持细胞增殖后再分化为毛细胞；

图2为Usp16-coxp/loxp小鼠的构建示意图；

图3为USP16在小鼠P30和P90年龄内耳中的蛋白水平，图中GAPDH为蛋白内参，大小为36kDa，USP16为目的蛋白，大小为94kDa；

图4为在不同年龄小鼠内耳毛细胞胞质层Usp16基因的免疫荧光定位图，图中选取P3、P14和P21三个时期，毛细胞被MYO7A标记为红色，USP16被标记为绿色，细胞核被DAPI标记为白色，scale bar＝10μm；

图5为在不同年龄小鼠内耳毛细胞细胞核层Usp16基因的免疫荧光定位图：图中选取P3、P14和P21三个时期，毛细胞被MYO7A标记为红色，USP16被标记为绿色，细胞核被DAPI标记为白色，scale bar＝10μm；

图6为在不同年龄小鼠内耳支持细胞核层Usp16基因的免疫荧光定位图：图中选取P3、P14和P21三个时期，支持细胞被SOX2标记为红色，USP16被标记为绿色，细胞核被DAPI标记为白色，scale bar＝10μm；

图7为在小鼠毛细胞中敲低USP16表达水平后各年龄段的测听图,其中，(a)为P30时期，(b)为P60时期，(c)为P90时期，检测Gfi-cre Usp16-Loxp/Loxp小鼠的听力变化，频率选择4KHz,8KHz,12KHz,16KHz,24KHz,32KHz；

图8为P30时期Gfi-cre Usp16-Loxp/Loxp小鼠与野生型小鼠毛细胞的免疫荧光图，图中APEX指耳蜗顶圈，MID指耳蜗中圈，BASE指耳蜗底圈，毛细胞上纤毛被Phalloidin标记为红色，毛细胞被Myosin7a标记为绿色，细胞核被DAPI标记为白色；

图9为P60时期Gfi-cre Usp16-Loxp/Loxp小鼠与野生型小鼠毛细胞的免疫荧光图，图中APEX指耳蜗顶圈，MID指耳蜗中圈，BASE指耳蜗底圈，毛细胞上纤毛被Phalloidin标记为红色，毛细胞被Myosin7a标记为绿色，细胞核被DAPI标记为白色；

图10为P90时期Gfi-cre Usp16-Loxp/Loxp小鼠与野生型小鼠毛细胞的免疫荧光图，图中APEX指耳蜗顶圈，MID指耳蜗中圈，BASE指耳蜗底圈，毛细胞上纤毛被Phalloidin标记为红色，毛细胞被Myosin7a标记为绿色，细胞核被DAPI标记为白色；

图11为Gfi-cre Usp16-Loxp/Loxp小鼠毛细胞(绿色标记)缺失的趋势变化图，图中选取P60和P90两个时间点；

图12为对P30、P60和P90时期Gfi-cre Usp16-Loxp/Loxp小鼠和野生型小鼠耳蜗各圈毛细胞数量的统计图，图中以耳蜗单位长度(150μm)毛细胞数量进行对比；

图13为在Lgr5阳性内耳干细胞中敲低USP16的表达水平后毛细胞免疫荧光图，图中毛细胞被标记为绿色，细胞核被标记为白色；

图14为Lgr5-CreER USP16-Loxp/+小鼠在注射Tamoxifen后支持细胞的免疫荧光图，检测支持细胞的增值情况；图中毛细胞被Myosin7a标记，支持细胞被Sox2标记，细胞核被DAPI标记。

具体实施方式

为了更好的研究单倍剂量状态下的组蛋白去泛素化酶USP16的作用机制，本发明采用以下步骤进行验证。

具体步骤如下：包括以下步骤：

1、通过免疫荧光、Western Blot等技术探究Usp16在内耳中的时空表达情况；

2、通过Cre-Loxp系统构建条件性Gfi-cre及Lgr5-CreER的Usp16敲除小鼠模型；

3、通过ABR技术检测Usp16对小鼠听觉功能，用免疫荧光技术检测毛细胞的丢失情况；

4、通过给Lgr5-CreER Usp16-/-小鼠打他莫昔芬观察内耳干细胞的增殖和分化情况。

实施例1小鼠内耳中Usp16基因的时空表达模式

以下所用的试剂及抗体等信息见表1、表2。

表1主要试剂与药品

表2抗体与染料信息及稀释比例

1、Usp16基因在内耳中的表达情况：

a)蛋白提取：

选取P30、P60野生型小鼠各三只，断颈后迅速取出颞骨，在预冷的HBSS中解剖组织，解剖完毕后将其放入1.5mL离心管中，离心管中加入300μL RIPA裂解液和相应比例的蛋白酶抑制剂Cocktail(离心管置于冰上)，然后每管加入2颗经过医用酒精浸泡的钢珠，于冰冷的研磨仪中研磨，直至匀浆状态，冰上放置10min后进行4℃离心(12000g，10min)；取上清(约280μL)至一新的1.5mL离心管中，加入70μL 5×loading buffer；夹上防爆夹水浴煮沸5min后用于Western Blot或-20℃冻存。

b)Western Blot实验：

首先清洗玻璃板，烘箱中烘干，根据需要分离的蛋白大小制对应浓度的PAGE胶：将下层分离胶加入玻璃板中，缓缓加入异丙醇封胶，防止气泡产生，室温约20min后凝固。倒去异丙醇，配制上层浓缩胶，插入梳子，室温放置20min。上样：将蛋白样品煮沸5min使之充分变性，用夹板将玻璃板夹好，放入垂直电泳槽内，倒入1×Running Buffer至指示位置，拔掉梳子，蛋白ladder上样6μL，蛋白样品上样8-20μL；上层胶内80V恒压电泳30min左右至样品进入下层胶内，下层胶120V恒压电泳1-2hr，根据蛋白ladder及待测蛋白的大小确定何时结束SDS-PAGE。转印：剪取合适大小的PVDF膜，甲醇中激活5-10min，取出分离好的PAGE胶，切除多余部位，洗净玻璃皿，倒入适量冰冷的1×Transfer Buffer，摆好转印夹，使其黑色一面(负极)在底部，依次放上海绵、三层滤纸、PAGE胶、激活完毕的PVDF膜、三层滤纸、海绵，最后将白色一面(正极)合上扣紧，于装有冰冷1×Transfer Buffer的转印槽内转印。将转印槽置于冰中，300mA恒流转印1.5-2hr。封闭：配制质量体积比为5％的奶粉封闭液，用TBST溶解奶粉，将转印结束的PVDF膜置于封闭液中室温封闭1hr。一抗孵育：用TBST按比例稀释一抗，4℃摇床孵育过夜。次日清洗一抗：用TBST清洗膜上残留的一抗，3次，每次10min。二抗孵育：用TBST按1:2000的比例稀释二抗，室温摇床孵育1hr。清洗二抗：用TBST清洗膜上残留的二抗，3次，每次10min。曝光：将适量化学发光液A、B液等体积混合后加至PVDF膜上，在凝胶成像系统中观察结果并拍照记录。用ImageJ处理实验结果并进行灰度分析，用Excel及Graphpad Prism进行统计与作图。

2、Usp16基因在内耳中的时空定位：

通过免疫荧光技术，使用毛细胞标记物Myosin7a、支持细胞标记物Sox2与Usp16抗体，研究Usp16在P3、P14、P21时期的表达情况。

a)分别在预冷的HBSS中解剖出P3、P14、P21等时间点野生型小鼠基底膜；

b)用分装好的cell tak涂10mm的盖玻片，涂成直径5mm的圆，晾干(新鲜涂制)；

c)涂好的盖玻片放入有耳蜗的培养皿中，把耳蜗粘附在玻片上，粘附时耳蜗正面朝上(正面有突起)，耳蜗粘附时的形状要按照其在temperal bone的自然位置；

d)粘附好的玻片放入4孔培养皿中(提前加入3ml的PBS，置于冰上)，待所有的玻片都粘附好后，在四孔培养皿中加入16％的PFA(新鲜配制)，使溶液最终成为4％的PFA；

e)室温固定1h后用PBST按5mim/3次漂洗；

f)Blocking medium封闭1h后，向PBT-1中加入毛细胞标记物myosin7a、支持细胞标记物sox2和Usp16抗体，置于4℃下孵育过夜；

g)PBST按5mim/3次漂洗后，将对应的二抗按比例加入PBT-2中，室温孵育1h；

h)PBST按5mim/3次漂洗后，在每个玻片上加6μl DAKO，盖上盖玻片，用指甲油封片；

i)利用共聚焦显微镜采集图片；

结果表明：USP16基因在毛细胞和支持细胞中广泛表达，说明Usp16基因在这些细胞中扮演重要的作用。

实施例2敲除小鼠准备及鉴定方法

GFI-cre和Lgr5-CreER小鼠本实验室自行繁殖，USP16-Loxp\Loxp小鼠来源于浙江大学生命科学学院靳津实验室。

1、USP16-Loxp\Loxp小鼠基因型鉴定

(1)剪取小鼠相应编号的脚趾放至200μL离心管中，加入180μL 50mM NaOH溶液，PCR仪98℃消化1hr，结束后每管加入20μL 1M Tris-HCl(pH 6.8)，Vortex震荡，使组织充分混匀。所述引物序列如：

表3 USP1 6-Loxp小鼠鉴定引物

(2)PCR扩增体系

(3)PCR扩增程序

(4)DNA琼脂糖凝胶电泳与成像：DNA Ladder(Vazyme,PM107-02)6μL，扩增产物上样10μL，120V电泳35min，结束后通过凝胶成像系统拍照。

(5)基因型鉴定：USP16-Loxp小鼠鉴定引物有两条，该引物扩增出野生型条带大小为790bp，含有Loxp的条带大小为872bp。

上述USP16-Loxp\Loxp小鼠基因型鉴定为小鼠杂交后，小鼠种类的鉴定提供依据，确保后续试验所用材料无误。

实施例3Usp16基因缺失对小鼠听觉及内耳结构的影响

1、采用Gfi-Cre小鼠与Usp16-loxp/loxp小鼠杂交获得Gfi-Cre，Usp16-loxp/loxp和Gfi-Cre，Usp16-loxp/+两种类型敲除小鼠，该小鼠中Cre酶能够在毛细胞中特异性的敲除两个loxp序列中间的Usp16基因，从而达到敲除效果，遗憾的是Usp16-loxp/loxp小鼠在出生后不久就会死亡，于是我们对Gfi-Cre，Usp16-loxp/+小鼠进行了ABR听力检测及内耳结构的免疫荧光实验。

通过ABR检测听觉反应阈值、潜伏期和波间期等参数，分别用短声(Click)和不同音频的短音(特别是高频和超高频)作为刺激声，分析小鼠的听力敏感性。

其中，

表4 ABR测验主要仪器

ABR听力检测的具体步骤如下：

a)选取同笼的P21、P30等时间点Gfi-Cre，Usp16-loxp/+敲除小鼠和非敲除小鼠，每组至少3只；

b)称取小鼠体重，按照戊巴比妥钠与小鼠体重比(1mg/g)腹腔注射戊巴比妥钠溶液(提前用PBS溶液配置好10mg/ml戊巴比妥钠溶液)；

c)待小鼠麻醉后，放入TDT工作站的隔音箱中，电极的正极插入小鼠大脑中线皮下，负极插入小鼠耳后皮下，地线插入小鼠大腿皮下。检查电极指示灯，确认连接正常；

d)打开电脑以及ABR测试软件，检测频率范围选择4-32kHz，记录噪音之上的临界阈值；

e)绘制听觉曲线图进行比较分析；

f)取两组小鼠耳蜗做成年鼠贴片进行免疫荧光染色观察毛细胞和支持细胞数量的变化。

内耳结构的免疫荧光实验步骤同实施例1中描述，一抗使用Myosin7a(Abcam,Rabbit源),二抗兔源-488，Phalloidin-555进行标记。

结果表明：在P60时期Gfi-Cre，Usp16-loxp/+小鼠与野生型小鼠具有明显的听力差别(如图7所示)，并在P90时期这种差异更为明显，在各个频率下Gfi-Cre，Usp16-loxp/+小鼠的听阈非常高，说明其听觉功能受损严重，也就是说该基因敲低一半后无法维持毛细胞的正常生理功能；然后通过免疫荧光显示P60、P90时期Gfi-Cre，Usp16-loxp/+小鼠大量毛细胞丢失，与野生型小鼠具有明显的差异(如图12所示)。Usp16基因单倍剂量不足导致毛细胞的广泛丢失，说明Usp16基因的剂量效应对毛细胞稳态的维持具有重要的作用，说明该研究方向可行性强。

实施例4 USP16基因缺失促进Lgr5内耳干细胞增殖分化为毛细胞

首先通过杂交获得Lgr5-CreER，USP16-loxp/+小鼠，USP16编码基因两端有两个Loxp位点，当给小鼠注射Tomoxifen后，Lgr5阳性内耳干细胞中Cre重组酶会被激活，从而切除USP16基因，从而达到在Lgr5阳性内耳干细胞敲除USP16基因的效果。具体步骤如下：

a)给P0时期Lgr5-CreER和Lgr5-CreER，USP16-loxp/+小鼠腹腔注射Tomoxifen(按体重比3mg/g注射)；

b)次日再腹腔注射一次Tomoxifen(按体重比3mg/g注射)；

c)P7时期收样，进行免疫荧光染色实验，具体方案同实施例1，然后观察毛细胞和支持细胞增生情况。

结果显示：在Lgr5阳性内耳干细胞中敲低USP16基因的表达量后促进了支持细胞的增殖(如图14所示)，同时也发现了毛细胞大量增生的情况(如图13所示)，说明单倍剂量状态下USP16基因可以促进Lgr5阳性内耳干细胞增殖和毛细胞的再生。

综上所述，本发明生物因子即单倍剂量状态下的组蛋白去泛素化酶USP16，所述生物因子具有促进内耳干细胞增殖分化为毛细胞的活性，该优势在于无需额外添加其他药物，仅仅在体内调控Usp 16基因的表达水平就可以达到促进内耳干细胞增殖分化为毛细胞的目的，这也是常规药物调控做不到的。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 东南大学

<120> 一种生物因子及其在促进内耳毛细胞再生上的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 825

<212> PRT

<213> 氨基酸(Amino Acid)

<400> 1

Met Gly Lys Lys Arg Thr Lys Gly Arg Ser Ala Pro Asp Thr Val Ala

1 5 10 15

Ser Glu Ser Ala Glu Pro Val Cys Arg His Leu Arg Lys Gly Leu Glu

20 25 30

Gln Gly Asn Leu Lys Lys Ala Leu Val Asn Val Glu Trp Asn Ile Cys

35 40 45

Gln Asp Cys Lys Thr Asp Asn Lys Val Lys Asp Lys Pro Glu Glu Glu

50 55 60

Ala Glu Asp Pro Ser Val Trp Leu Cys Leu Lys Cys Gly His Gln Gly

65 70 75 80

Cys Gly Arg Asp Ser Gln Glu Gln His Ala Leu Lys His Tyr Thr Thr

85 90 95

Pro Arg Ser Glu Pro His Tyr Leu Val Leu Ser Leu Asp Asn Trp Ser

100 105 110

Val Trp Cys Tyr Lys Cys Asp Glu Glu Val Lys Tyr Cys Ser Ser Asn

115 120 125

Arg Leu Gly Gln Val Val Asp Tyr Val Arg Lys Gln Ala Gly Val Arg

130 135 140

Thr Ser Lys Pro Ala Glu Lys Asn Asn Gly His Ile Glu Leu Glu Asn

145 150 155 160

Lys Lys Leu Glu Lys Glu Ser Lys Asn Glu Gln Glu Arg Glu Lys Ser

165 170 175

Glu Asn Leu Ala Lys Glu Thr Ile Pro Met Asp Ser Ala Ser Gln Ile

180 185 190

Thr Val Lys Gly Leu Ser Asn Leu Gly Asn Thr Cys Phe Phe Asn Ala

195 200 205

Val Met Gln Asn Leu Ser Gln Thr Pro Val Leu Arg Glu Leu Leu Lys

210 215 220

Glu Val Lys Met Ser Gly Thr Ile Val Lys Ile Glu Pro Pro Asp Leu

225 230 235 240

Ala Leu Thr Glu Pro Leu Glu Val Asn Leu Glu Pro Pro Gly Pro Leu

245 250 255

Thr Leu Ala Met Ser Gln Phe Leu Ser Glu Met Gln Glu Asn Lys Lys

260 265 270

Arg Val Val Thr Pro Lys Glu Leu Phe Ser Gln Val Cys Lys Lys Ala

275 280 285

Thr Arg Phe Lys Gly Tyr Gln Gln Gln Asp Ser Gln Glu Leu Leu Arg

290 295 300

Tyr Leu Leu Asp Gly Met Arg Ala Glu Glu His Gln Arg Val Ser Lys

305 310 315 320

Gly Ile Leu Lys Ala Phe Gly Asn Ser Thr Glu Lys Leu Asp Glu Glu

325 330 335

Val Lys Asn Lys Val Lys Asp Tyr Glu Lys Lys Lys Ala Ile Pro Ser

340 345 350

Phe Val Asp Arg Ile Phe Gly Gly Glu Leu Thr Ser Thr Ile Met Cys

355 360 365

Asp Glu Cys Arg Thr Val Ser Leu Val His Glu Ser Phe Leu Asp Leu

370 375 380

Ser Leu Pro Val Leu Asp Asp Gln Ser Gly Lys Lys Ser Ile Asn Asp

385 390 395 400

Lys Asn Val Lys Met Thr Met Glu Glu Glu Asp Lys Asp Ser Glu Glu

405 410 415

Glu Lys Asp Asp Ser Tyr Met Lys Ser Arg Ser Asp Leu Pro Ser Gly

420 425 430

Thr Ser Lys His Leu Gln Lys Lys Ala Lys Lys Gln Ala Lys Lys Gln

435 440 445

Ala Lys Asn Gln Arg Arg Gln Gln Lys Ile Gln Glu Arg Phe Leu His

450 455 460

Phe Asn Glu Leu Cys Ala Thr Asp Tyr Thr Glu Asp Asn Glu Arg Glu

465 470 475 480

Ala Asp Thr Ala Leu Ala Gly Glu Val Glu Val Asp Thr Asp Ser Thr

485 490 495

His Gly Ser Gln Glu Glu Ala Thr Gln Ile Glu Leu Ser Val Asn Gln

500 505 510

Lys Asp Leu Asp Gly Gln Glu Ser Met Ile Glu Arg Thr Pro Asp Val

515 520 525

Gln Glu Ser Pro Glu Asp Leu Gly Val Lys Ser Ala Asn Thr Glu Ser

530 535 540

Asp Leu Gly Ile Val Thr Pro Ala Pro Glu Cys Pro Arg Asp Phe Asn

545 550 555 560

Gly Ala Phe Leu Glu Glu Arg Thr Ser Gly Glu Leu Asp Ile Ile Asn

565 570 575

Gly Leu Lys Asn Leu Asn Leu Asn Ala Ala Val Asp Pro Asp Glu Ile

580 585 590

Asn Ile Glu Ile Pro Asn Asp Ser His Ser Ala Pro Lys Val Tyr Glu

595 600 605

Val Met Asn Glu Asp Pro Glu Thr Ala Phe Cys Thr Leu Ala Asn Arg

610 615 620

Glu Ala Phe Ser Thr Asp Glu Cys Ser Ile Gln His Cys Leu Tyr Gln

625 630 635 640

Phe Thr Arg Asn Glu Lys Leu Gln Asp Ala Asn Lys Leu Leu Cys Glu

645 650 655

Val Cys Ser Arg Arg Gln Cys Asn Gly Pro Lys Ala Asn Ile Lys Gly

660 665 670

Asp Arg Arg His Val Tyr Thr Asn Ala Lys Lys Gln Met Leu Val Ser

675 680 685

Leu Ala Pro Pro Val Leu Thr Leu His Leu Lys Arg Phe Gln Gln Ala

690 695 700

Gly Phe Asn Leu Arg Lys Val Asn Lys His Ile Lys Phe Pro Glu Ile

705 710 715 720

Leu Asp Leu Ala Pro Phe Cys Thr Leu Lys Cys Lys Asn Val Ala Glu

725 730 735

Glu Ser Thr Arg Val Leu Tyr Ser Leu Tyr Gly Val Val Glu His Ser

740 745 750

Gly Thr Met Arg Ser Gly His Tyr Thr Ala Tyr Ala Lys Glu Arg Thr

755 760 765

Ala Ser Cys His Leu Ser Asn Leu Val Leu His Gly Asp Ile Pro Gln

770 775 780

Asp Cys Glu Met Glu Ser Thr Lys Gly Gln Trp Phe His Ile Ser Asp

785 790 795 800

Thr His Val Gln Ala Val Pro Ile Thr Lys Val Leu Asn Ser Gln Ala

805 810 815

Tyr Leu Leu Phe Tyr Glu Arg Ile Leu

820 825

<210> 2

<211> 2478

<212> DNA

<213> 基因(Gene)

<400> 2

atggggaaga aacggaccaa ggggagaagt gctccagaca cggtggcctc agagtctgca 60

gaaccagtgt gcagacacct tagaaaaggg ttggaacaag gtaatttgaa aaaagcttta 120

gtaaatgtgg agtggaatat ctgccaagac tgtaagactg acaataaagt gaaagataaa 180

cctgaggagg aagcagaaga cccttcggtt tggctctgtc ttaaatgtgg ccatcagggc 240

tgtggcagag attctcagga gcagcatgcc ttgaagcact acacgacacc gagatccgag 300

cctcactacc tggtgctcag tctggacaac tggagcgtct ggtgctacaa gtgtgacgag 360

gaagtcaagt actgtagctc aaaccgattg ggccaagtgg ttgattatgt tagaaaacaa 420

gctggcgtaa gaacttcaaa accagcagag aaaaataatg gacacattga gctcgaaaat 480

aaaaaattgg agaaagagag taaaaatgaa caagagagag agaaatcgga aaacctggct 540

aaagaaacta ttcccatgga ctctgcttcc cagataactg tgaaaggact cagtaatttg 600

gggaatactt gtttcttcaa tgcagttatg cagaacttgt cacaaacgcc agtgcttaga 660

gaactactaa aagaagtgaa gatgtctgga acgattgtaa aaatagagcc acctgatctg 720

gcactaacag aacctttaga agtaaacctc gagcctccag gtcctcttac tttagccatg 780

agccagtttc tcagtgagat gcaagagaac aaaaagcgag ttgtgacacc taaagagctc 840

ttttctcagg tctgtaaaaa agcaacacgt tttaaagggt accagcaaca agacagccag 900

gagctgcttc gctacctact ggatgggatg agagcggaag aacaccaaag agtgagtaaa 960

ggaattctta aagcatttgg taattctact gaaaaattgg atgaagaagt aaaaaataaa 1020

gttaaagatt atgaaaagaa aaaggcaatc ccgagttttg tggaccgcat ctttggtggc 1080

gagctgacta gtacgatcat gtgtgatgaa tgcaggactg tctccttagt gcatgaatcg 1140

ttccttgatt tgtctcttcc agttttagat gatcagagtg gtaagaaaag tataaatgat 1200

aaaaatgtga aaatgacaat ggaggaagaa gataaagaca gtgaggaaga gaaagatgac 1260

agctacatga aatcaaggag cgatcttccg tcagggacaa gcaagcacct acagaaaaag 1320

gcaaagaagc aggccaaaaa gcaggccaag aaccaacgaa ggcaacaaaa aattcaagaa 1380

agatttcttc acttcaatga gctctgcgcc actgactaca cggaagacaa tgaacgtgaa 1440

gctgacacag cacttgcggg agaagtggaa gtggataccg actccaccca tggttctcaa 1500

gaggaggcca cacagataga gctgtctgtt aaccagaagg atttggatgg ccaagagagc 1560

atgatagaaa ggacacctga tgtgcaggaa agcccagagg acctaggagt gaaaagtgct 1620

aacaccgaga gtgatctggg gattgtgacg cctgctcctg aatgtcctag ggatttcaat 1680

ggtgccttcc tggaagaaag gaccagtgga gaactagaca ttatcaatgg tttaaaaaac 1740

cttaatttga atgctgctgt tgatcctgat gaaataaata tagagattcc gaatgacagt 1800

cattctgcac ccaaggtata tgaggtcatg aacgaggacc cagaaactgc tttctgtacc 1860

ctcgcgaacc gagaagcgtt tagtactgat gagtgttcca ttcaacattg cttatatcag 1920

ttcacccgga atgagaaact tcaagatgcc aataaactgc tttgtgaagt gtgttcaaga 1980

cggcagtgta atggaccaaa ggcaaatata aaaggtgaca ggagacatgt ttacaccaat 2040

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tatgagagaa tactgtga 2478

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctagcaccct tcttggcatc cc 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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Claims

1.敲除生物因子的制剂在制备促进内耳干细胞再生为毛细胞的药品中的应用，其特征在于，所述生物因子为单倍剂量状态下的组蛋白去泛素化酶USP16，所述生物因子具有促进内耳干细胞增殖分化为毛细胞的活性，氨基酸序列如SEQ NO.1所示。