CN112143779A - 基于熵驱动放大系统为模板的银纳米簇的多重microRNA检测方法 - Google Patents

基于熵驱动放大系统为模板的银纳米簇的多重microRNA检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出基于熵驱动催化放大系统为模板的银纳米簇的多重microRNA检测方法，属于生命分析化学技术领域。以熵驱动催化反应为放大基元，以催化反应中的三链复合物为模板制备的银纳米簇为光学标签，简单、快速、灵敏的进行多重miRNA检测。miRNA触发已形成发光银纳米簇的三链复合物的分支迁移和链取代，导致银纳米簇结构改变，荧光急剧下降且下降程度与miRNA浓度呈正相关，同时释放miRNA用于新一轮的检测，产生放大荧光信号变化。本发明检测方法经济、高效地实现对miRNA‑141和miRNA‑155的单独检测和同时多重检测。

Description

基于熵驱动放大系统为模板的银纳米簇的多重microRNA检测 方法
技术领域
本发明属于生命分析化学技术领域，具体涉及一种基于熵驱动放大系统为模板的银纳米簇的多重microRNA检测方法。
背景技术
MicroRNA(简称miRNA)是一种短的、非编码的RNA，其长度约为18-25个核苷酸。miRNA在调节各种发育、病理和生理过程中起重要作用。miRNA的异常表达与许多人类疾病密切相关，包括癌症、神经疾病、心血管疾病、肾脏和肝脏疾病等。近年来，miRNA已成为一类非常有价值的生物标志物，在疾病的早期诊断、预后和治疗中具有重要意义。另外，疾病的发生及进展等过程往往与多种miRNA密切相关，检测单个miRNA可能会导致错误结论，甚至在疾病的诊断中导致误诊。因此，对于临床诊断和生命科学研究来说，开发一种操作简单、成本低、高灵敏性、高选择性的多重miRNA检测方法是至关重要的。
目前，已有一些技术用于miRNA的检测，例如表面增强拉曼散射技术、微阵列技术和电化学发光共振能量转移技术等，但这些技术往往需要复杂的制备过程和昂贵的仪器设备，分析成本高，灵敏度差，并且无法实现多重miRNA的检测。由于miRNA的固有性质，miRNA在细胞和血浆中的表达水平非常低，对检测方法的灵敏度提出了更高的要求。核酸扩增放大技术能够实现更灵敏的信号输出，许多核酸扩增放大方法已用于miRNA的检测，包括定量逆转录聚合酶链反应、核酸酶辅助扩增和滚环扩增技术(RCA)，以及无酶辅助的杂化链反应(HCR)和催化发夹组装反应(CHA)，这些放大方法虽然实现了miRNA的灵敏检测，但都需要复杂的设计步骤和多步热循环过程，有时产生假阳性信号，以及难以实现多重miRNA的检测。因此，构建简单、低成本、高灵敏及能够多重检测的信号放大技术是实现多重miRNA检测的一大挑战。
此外，多重miRNA检测对信号转导方式也提出了更高的要求。以核酸为模板的银纳米簇是一类新型的荧光团，具备优异的生物相容性和光学稳定性，免标记且操作简单，是生化传感和生物成像中理想的光学标签。更重要的是，这种银纳米簇的光谱可通过核酸的长度或序列，以及纳米簇的尺寸大小进行灵敏的调节，并且光谱谱带窄，可防止多种银纳米簇的光谱之间产生交叉，非常适合作为多重分析物检测的信号输出。目前已作为信号输出方式实现DNA和磷酸腺苷的多重检测，但是对于指示miRNA的多重检测还有待进一步开发。因此，以免标记、光谱灵活可调的光学标签为信号转导方式是实现多重miRNA检测的另一挑战。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提出了基于熵驱动放大系统为模板的银纳米簇的多重microRNA检测方法。本发明的目的是基于熵驱动的催化放大反应和核酸为模板的银纳米簇提供一种简单的、方便的、低成本的、灵敏的多重 miRNA检测方法。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供的检测方法由两部分组成：(1)miRNA分析物触发的熵驱动催化反应作为放大基质，用于miRNA的再生和检测信号的放大；(2)以熵驱动催化中的三链杂化复合物为模板的银纳米簇作为光学标签，用于检测信号的输出，三链复合物中包含有一个六碱基胞嘧啶环用于稳定发光的银纳米簇。检测原理如下：miRNA分析物在燃料链的辅助下触发已形成发光银纳米簇的三链复合物的分支迁移和链取代，经过系列中间体的快速转变，再次释放miRNA分析物用于新一轮的检测，并导致银纳米簇的结构发生改变，银纳米簇的荧光信号急剧下降，荧光下降的程度与miRNA的浓度呈正相关，据此实现miRNA的放大灵敏检测。多重检测miRNA时，将具有不同发射光谱的银纳米簇体系等比例混合，不同发射波长的荧光信号之间无交互干扰，由不同的miRNA分析物触发反应，分别产生对应的荧光信号变化，依据荧光信号变化和miRNA浓度的关系，实现 miRNA的多重检测。
具体检测步骤如下：
(1)熵驱动催化三链复合物的制备：依据待检测miRNA的序列设计三条单链 DNA，将单链DNA以等浓度混合于磷酸缓冲溶液中，95℃加热15分钟，随后缓慢降温至室温，即得三链复合物，此复合物中包含两个脚链端。
(2)银纳米簇的制备：将上述制备的三链复合物稀释至所需浓度，加入6倍量的硝酸银，混匀后室温避光放置15分钟，再加入与硝酸银等量的硼氢化钠，室温避光反应6小时，即得三链复合物为模板的银纳米簇，根据需要调整三链复合物模板，可制备不同发光的银纳米簇。
(3)外源性DNA分析物的检测：通过miRNA的外源性DNA分析物验证检测方法是否可行。向以熵驱动催化三链复合物为模板制备的银纳米簇溶液中分别加入燃料链和不同浓度的DNA分析物，25℃反应1小时，荧光分光光度计测定体系的荧光。
(4)单个miRNA的检测：向三链复合物为模板制备的银纳米簇溶液中分别加入燃料链和不同浓度的miRNA，25℃反应1小时，荧光分光光度计测定体系的荧光。
(5)多重miRNA的检测：将两种不同发光的三链复合物为模板的银纳米簇溶液等浓度混合，分别加入对应的燃料链和miRNA分析物，25℃反应1小时，荧光分光光度计分别测定两种银纳米簇的荧光。
本发明的优点和有益效果在于：
(1)本发明提出的熵驱动催化放大反应是分析物触发的循环信号放大技术，无需任何酶，具有简单、稳定、高效、无背景信号的特点，并且灵活可调，通过对核酸序列的简单调节即可用于其他分析物的检测。
(2)本发明中所使用的银纳米簇具有优异的生物相容性，光学稳定性，是一种免标记的光学标签，制备方法简单，光谱灵活可调，可通过调整核酸序列和长度以及纳米簇的尺寸来调节光谱，并且谱带范围窄，避免产生谱带交叉干扰，非常适合作为多重目标物检测的信号输出方式。
(3)本发明操作简单，高效，成本低。可扩展到其他生物标志物的检测，为疾病的早期诊断、预后和治疗提供有力的技术保障。
附图说明
图1是基于熵驱动放大系统为模板的银纳米簇对单个miRNA检测的示意图，F141为燃料链：(A)miRNA触发熵催化放大反应。(B)miRNA触发熵催化放大反应的机理。
图2是基于熵驱动放大系统为模板的银纳米簇对多重miRNA检测的示意图：(a)不存在待测物。(b)只存在待测物miRNA-141。(c)只存在待测物 miRNA-155。(d)同时存在待测物miRNA-141和miRNA-155。
图3是基于熵驱动放大系统为模板的黄色银纳米簇(SY-Ag NCs)用于 miRNA-141的外源性DNA(T141)检测：(A)黄色银纳米簇的激发和发射光谱，内插图为黄色银纳米簇溶液在紫外激光下的照片。(B)黄色银纳米簇在不同条件下的荧光谱图。(C)黄色银纳米簇对不同浓度外源性DNA T141的检测，内插图为对应的标准曲线。(D)黄色银纳米簇对不同DNA分析物的选择性，其中T141-1 为单碱基错配，T141-2为双碱基错配，T141-3为三碱基错配。
图4是基于熵驱动放大系统为模板的黄色银纳米簇(SY-Ag NCs)用于 miRNA-141的检测(简写为miR-141)：(A)黄色银纳米簇对不同浓度miR-141 的检测。(B)黄色银纳米簇对miR-141检测的标准曲线。(C)黄色银纳米簇对不同miRNA分析物的选择性。(D)黄色银纳米簇分别在磷酸缓冲溶液和稀释的人血清中检测miR-141。
图5是(A)熵驱动放大系统为模板的红色银纳米簇(SR-Ag NCs)用于miRNA-155检测的示意图，F155为燃料链。(B)红色银纳米簇的激发和发射光谱，内插图为红色银纳米簇溶液在紫外激光下的照片。(C)红色银纳米簇在不同条件下的荧光谱图。
图6是基于熵驱动放大系统为模板的红色银纳米簇(SR-Ag NCs)用于 miRNA-155的检测(简写为miR-155)：(A)红色银纳米簇对不同浓度miR-155 的检测。(B)红色银纳米簇对miR-155检测的标准曲线。(C)红色银纳米簇对不同miRNA分析物的选择性。(D)红色银纳米簇分别在磷酸缓冲溶液和稀释的人血清中检测miR-155。
图7是基于熵驱动放大系统为模板的黄色银纳米簇(SY-Ag NCs)和红色银纳米簇(SR-Ag NCs)的混合溶液用于miRNA-141和miRNA-155的多重检测：(a)不存在待测物。(b)只存在待测物miRNA-141。(c)只存在待测物 miRNA-155。(d)同时存在待测物miRNA-141和miRNA-155。
具体实施方式
下面将结合具体实施例和附图，对本发明进行清楚、完整地描述。显然，本发明并不限于此。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
miRNA检测体系序列的设计：
实施例中所用的DNA和microRNA引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，经高效液相色谱法纯化。引物序列见下表：
Figure BSA0000221192770000051
Figure BSA0000221192770000061
实施例2
熵驱动催化放大系统中三链复合物SY和SR的制备：
将引物SY-1，SY-2和SY-3等浓度(10μM)混合于20mM磷酸缓冲溶液 (包含10mM乙酸镁)中，95℃加热15分钟，缓慢降温至室温，即得三链复合物 SY。
将引物SR-1，SR-2和SR-3等浓度(10μM)混合于20mM磷酸缓冲溶液(包含10mM乙酸镁)中，95℃加热15分钟，缓慢降温至室温，即得三链复合物SR。
实施例3
三链复合物SY和SR为模板的银纳米簇制备：
取80μL制备得到的三链复合物SY和SR溶液用磷酸缓冲稀释(最终反应浓度是2μM)，分别加入4.8μL 1mM的硝酸银溶液，混匀，室温避光放置15分钟。继续分别向反应溶液中加入4.8μL 1mM的硼氢化钠溶液，混匀，室温避光反应6小时，最终得到发黄光的银纳米簇SY-Ag NCs和发红光的银纳米簇SR-Ag NCs。
实施例4
黄色银纳米簇(SY-Ag NCs)用于miRNA-141的外源性DNA(T141)检测：
(1)对T141检测的灵敏度：取一系列SY-Ag NCs溶液用磷酸缓冲稀释(最终SY-AgNCs为0.25μM，乙酸镁为10mM)，分别加入0.25μM燃料链F141，后分别加入不同浓度的T141(0nM，0.01nM，0.05nM，0.1nM，0.5nM，1nM，5 nM，10nM，50nM)，25℃反应1小时，分别测定荧光得图3(C)，进而得到标准曲线，线性范围为10pM-1nM，利用经典的3σ/s法计算得到检测限为3.7pM。
(2)对T141检测的特异性：取一系列SY-Ag NCs溶液用磷酸缓冲稀释(最终SY-AgNCs为0.25μM，乙酸镁为10mM)，分别加入0.25μM燃料链F141，后分别加入50nM不同的分析物(T141，T141-1，T141-2，T141-3)，25℃反应1小时，分别测定荧光得图3(D)，SY-Ag NCs对T141有非常好的特异性。
实施例5
黄色银纳米簇(SY-Ag NCs)用于miRNA-141的检测：
(1)对miRNA-141检测的灵敏度：取一系列SY-Ag NCs溶液用磷酸缓冲稀释(最终SY-Ag NCs为0.25μM，乙酸镁为10mM)，分别加入0.25μM燃料链 F141，后分别加入不同浓度的miRNA-141(0nM，0.01nM，0.05nM，0.1nM，0.5 nM，1nM，5nM，10nM，50nM)，25℃反应1小时，分别测定荧光得图4(A)，进而得到标准曲线图4(B)，线性范围为10pM-1nM，利用经典的3σ/s法计算得到检测限为6.1pM。
(2)对miRNA-141检测的选择性：取一系列SY-Ag NCs溶液用磷酸缓冲稀释(最终SY-Ag NCs为0.25μM，乙酸镁为10mM)，分别加入0.25μM燃料链 F141，后分别加入50nM不同的miRNA(miRNA-141，miRNA-155，miRNA-205， miRNA-21，miRNA-31)，25℃反应1小时，分别测定荧光得图4(C)，SY-Ag NCs 对miRNA-141有非常好的选择性。
(3)在复杂生物样品中检测miRNA-141：取SY-Ag NCs溶液分别用磷酸缓冲和人血清稀释(最终SY-Ag NCs为0.25μM，乙酸镁为10mM)，分别加入0.25 μM燃料链F141，后分别加入50nM的miRNA-141，25℃反应1小时，分别测定荧光得图4(D)，在稀释人血清中SY-Ag NCs对miRNA-141也有非常好的检测效果。
实施例6
红色银纳米簇(SR-Ag NCs)用于miRNA-155的检测：
(1)对miRNA-155检测的灵敏度：取一系列SR-Ag NCs溶液用磷酸缓冲稀释(最终SR-Ag NCs为0.25μM，乙酸镁为10mM)，分别加入0.25μM燃料链 F155，后分别加入不同浓度的miRNA-155(0nM，0.01nM，0.05nM，0.1nM，0.5 nM，1nM，5nM，10nM，50nM)，25℃反应1小时，分别测定荧光得图6(A)，进而得到标准曲线图6(B)，线性范围为10pM-1nM，利用经典的3σ/s法计算得到检测限为8.7pM。
(2)对miRNA-155检测的选择性：取一系列SR-Ag NCs溶液用磷酸缓冲稀释(最终SR-Ag NCs为0.25μM，乙酸镁为10mM)，分别加入0.25μM燃料链F155，后分别加入50nM不同的miRNA(miRNA-155，miRNA-141，miRNA-205， miRNA-21，miRNA-31)，25℃反应1小时，分别测定荧光得图6(C)，SR-Ag NCs 对miRNA-155有非常好的选择性。
(3)在复杂生物样品中检测miRNA-155：取SR-Ag NCs溶液分别用磷酸缓冲和人血清稀释(最终SR-Ag NCs为0.25μM，乙酸镁为10mM)，分别加入0.25 μM燃料链F155，后分别加入50nM的miRNA-141，25℃反应1小时，分别测定荧光得图6(D)，在稀释人血清中SR-Ag NCs对miRNA-155也有非常好的检测效果。
实施例7
黄色银纳米簇(SY-Ag NCs)和红色银纳米簇(SR-Ag NCs)用于 miRNA-141和miRNA-155的多重检测：
取等量的SY-Ag NCs和SR-Ag NCs溶液用磷酸缓冲稀释(最终SY-Ag NCs 和SR-AgNCs均为0.25μM，乙酸镁为10mM)，分别向此混合溶液中加入F141 (0.25μM)/miRNA-141(50nM)，F155(0.25μM)/miRNA-155(50nM)和F141(0.25 μM)/miRNA-141(50nM)/F155(0.25μM)/miRNA-155(50nM)，25℃反应1小时，分别测定荧光得图7，此方法能够简单的、快速的实现miRNA-141和miRNA-155 的同时检测。
以上所述实施例仅用于具体说明本发明而非限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种基于熵驱动放大系统为模板的银纳米簇的多重microRNA检测方法，其特征在于：包括制备检测探针所用核酸的设计，熵驱动催化三链复合物为模板的银纳米簇制备，黄色银纳米簇(SY-Ag NCs)对miRNA-141的检测，红色银纳米簇(SR-Ag NCs)对miRNA-155的检测，SY-Ag NCs和SR-Ag NCs对miRNA-141和miRNA-155的同时多重检测。
2.根据权利要求1所述的基于熵驱动放大系统为模板的银纳米簇的多重microRNA检测方法，其特征在于所用DNA序列设计：
SY-1：5’-TTTTTTTTTTCTTCTCCACA GGAGTCAGGTGCAC-3’
SY-2：5’-CCCTATAACACTGTCTGGT-3’
SY-3：5’-CCATCTTTACCAGACAGTGTTATAGGGGTGCACCTGACTCCTGTGGAGAAG-3’
F141：5’-CTTCTCCACAGGAGTCAGGTGCACCCCTATAACACTGTCTGGT-3’
T141：5’-TAACACTGTCTGGTAAAGATGG-3’
T141-1：5’-TAACACTGTCTGGTAAAGAAGG-3’
T141-2：5’-TAACACTGTCTGGAAAAGAAGG-3’
T141-3：5’-TAACACAGTCTGGAAAAGAAGG-3’
SR-1：5’-TTTTTTTTTTCTTCTCCACCCCCCCAGGAGTCAGGTGCAC-3’
SR-2：5’-CCCTATTAATGCTAATCGTGAT-3’
SR-3：5’-ACCCCTATCACGATTAGCATTAATAGGGGTGCACCTGACTCCTGAGGAGAAG-3’
F155：5’-CTTCTCCTCAGGAGTCAGGTGCACCCCTATTAATGCTAATCGTGAT-3’
T155：5’-TTAATGCTAATCGTGATAGGGGT-3’
T155-1：5’-TTAATGCTAATCGTGATAGGAGT-3’
T155-2：5’-TTAATGCTAATCGTGAAAGGAGT-3’
T155-3：5’-TTAATGCAAATCGTGAAAGGAGT-3’。
3.根据权利要求1所述的基于熵驱动放大系统为模板的银纳米簇的多重microRNA检测方法，其特征在于熵驱动催化三链复合物为模板的银纳米簇制备：
(1)首先制备熵驱动催化三链复合物：将引物SY-1，SY-2和SY-3等浓度混合于磷酸缓冲溶液中，95℃加热15分钟，缓慢降温至室温，即得三链复合物SY。将引物SR-1，SR-2和SR-3等浓度混合于磷酸缓冲溶液中，95℃加热15分钟，缓慢降温至室温，即得三链复合物SR。
(2)取制备得到的三链复合物SY和SR溶液用磷酸缓冲稀释，分别加入6倍量的硝酸银溶液，混匀，室温避光放置15分钟。继续分别向反应溶液中加入与硝酸银等量的硼氢化钠溶液，混匀，室温避光反应6小时，最终得到发黄光的银纳米簇(SY-Ag NCs)和发红光的银纳米簇(SR-Ag NCs)。
4.根据权利要求1所述的基于熵驱动放大系统为模板的银纳米簇的多重microRNA检测方法，其特征在于黄色银纳米簇(SY-Ag NCs)对miRNA-141的检测：SY-Ag NCs在燃料链F141的辅助下完成对miRNA-141的高灵敏性和高选择性检测，同时在稀释的人血清样品中完成对miRNA-141的检测。
5.根据权利要求1所述的基于熵驱动放大系统为模板的银纳米簇的多重microRNA检测方法，其特征在于红色银纳米簇(SR-Ag NCs)对miRNA-155的检测：SR-Ag NCs在燃料链F155的辅助下完成对miRNA-155的高灵敏性和高选择性检测，同时在稀释的人血清样品中完成对miRNA-155的检测。
6.根据权利要求1所述的基于熵驱动放大系统为模板的银纳米簇的多重microRNA检测方法，其特征在于黄色银纳米簇(SY-Ag NCs)和红色银纳米簇(SR-Ag NCs)对miRNA-141和miRNA-155的多重检测：SY-Ag NCs和SR-Ag NCs在燃料链F141和F155的辅助下完成对miRNA-141和miRNA-155的多重检测。
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