CN112138006A - R848在制备抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物制剂领域，公开了R848在制备抑制新型冠状病毒SARS‑CoV‑2药物中的应用，申请人通过体外细胞试验和小鼠实验，发现R848对Caco‑2细胞的毒性作用小，在体外细胞水平能够显著抑制SARS‑CoV‑2对Caco‑2细胞的感染，抑制其在细胞中的增殖，具备安全高效的特点；同时通过构建小鼠SARS‑CoV‑2感染模型，发现R848可以显著降低小鼠体重下降程度，降低小鼠肺组织中的病毒含量，提高小鼠的存活率，这使得R848具有非常大的临床治疗潜力。

Description

R848在制备抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2药物中的应用

技术领域

本发明属于生物制剂领域，具体涉及R848在制备抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2药物中的应用。

背景技术

由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(severe acute respiratory syndromecoronavirus 2,SARS-CoV-2)引起的新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 19,COVID-19)于2019年底出现并呈现全球爆发，严重危害人类健康和公共卫生安全，给世界社会和经济带来巨大负担，已引发全球范围内的高度关注。截止到2020年8月底，全球累计新冠肺炎确诊病例超过2450万例，死亡人数超过83万。许多国内外学者推测新冠病毒或将类似于流感病毒，与人类长期共存。而且现有的研究报道和数据表明SARS-CoV-2的致死率远高于流感，然而到目前为止还没有专门针对新型冠状病毒治疗和预防的药物或商品化疫苗可以使用。因此，研究并开发新型抗SARS-CoV-2的药物具有重要意义。

R848(瑞喹莫德，Resiquimod)是一种免疫反应调节剂，用作有效的TLR7/8激动剂，诱导细胞因子TNF-α、IL-6和IFN-α的上调。R848能够激活免疫细胞，并通过Toll样受体7(TLR7)-MyD88-依赖性信号通路诱导野生型脾细胞的增殖。R848也会调节树突细胞以增加巨细胞病毒和HIV-1特异性T细胞应答。R848诱导髓源性抑制细胞分化为巨噬细胞和树突细胞，并且可以通过减少免疫抑制的MDSCs提高癌症免疫治疗效果。在野生型小鼠中，R848诱导IFN-α，TNF-α和IL-12的血清浓度增加，而TLR7缺失或MyD88缺失的小鼠不会增加其细胞因子。在过敏性哮喘小鼠模型中，R848通过减少Nrf2信号从而减少过敏原诱导的气道反应和炎症。作为免疫佐剂，在体外R848能显著增强IL-12的分泌；在体内，与其他TLR配体佐剂相比，R848更有效地促进DC和NK细胞向小鼠淋巴结中聚集并诱导CD4+和CD8+效应T细胞生成，与其他免疫佐剂相比，R848更具增强Th1细胞免疫作用。

R848可以抑制寨卡病毒、乙肝病毒、艾滋病毒等在细胞上的复制，除此之外，R848还可以作为某些病毒疫苗的佐剂。但目前，尚未发现任何关于R848抗SARS-CoV-2病毒的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于弥补现有技术的不足，提供了一种小分子化合物R848(瑞喹莫德，Resiquimod)在制备治疗或预防新型冠状病毒SARS-CoV-2感染药物中的应用，从而为临床上SARS-CoV-2的治疗提供一种有效的小分子化合物。R848分子式为C₁₇H₂₂N₄O₂，分子量为314.38，具有结构式Ⅰ所示的结构：

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

R848在制备治疗或预防SARS-CoV-2感染药物中的应用，本发明对R848的药效用下述方法进行评价：

1.在体外细胞水平评价R848细胞毒性及R848抗SARS-CoV-2病毒活性，其步骤如下

1)将已长成单层的96孔板中Caco-2细胞用PBS洗一遍，R848用2％血清的DMEM(维持液)倍比稀释成不同浓度，加入96孔板中，每个稀释度平行做3孔，并设置正常细胞对照。

2)37℃、5％CO2培养箱中培养24h，48h后，用CCK8法测定细胞活性，计算出不同浓度的R848的细胞毒性。

3)将已长成单层的12孔板中Caco-2细胞用PBS洗一遍，用维持液将R848稀释合适浓度后孵育细胞。

4)37℃、5％CO2培养箱中孵育24h后，细胞用PBS洗一遍，以MOI为0.1的SARS-CoV-2孵育细胞1小时后，换含有不同浓度的R848维持液继续培养。

5)细胞感染病毒后培养48h，72h，取上清，用VERO细胞测定上清中的病毒滴度。评价R848在细胞水平对病毒增殖的影响。

2.在SARS-CoV-2感染小鼠模型中评价R848在动物活体内的抗病毒效果，其步骤如下：

1)运用小鼠适应毒株WBP-1(CCTCC NO：V202031)，建立SARS-CoV-2感染小鼠模型

2)小鼠腹腔注射R848(1.5mg/kg)，同时设置DMSO对照，药物注射2个小时后滴鼻感染小鼠5LD50病毒。

3)小鼠每天腹腔注射一次药物，连续注射5天。

4)每天观察小鼠状态，称量体重，记录死亡情况，并绘制体重变化曲线和小鼠存活率曲线。

5)比较用药组与未用药组肺脏病理变化。

6)以感染后小鼠体重变化、存活率、肺脏病毒载量来评价R848效果。

本发明的保护范围包括：

R848在制备抑制SARS-CoV-2药物中的应用；

R848在制备治疗或预防SARS-CoV-2感染的药物中的应用；

R848在制备缓解SARS-CoV-2感染后体重降低的药物中的应用；

R848在制备提升SARS-CoV-2感染后机体存活率的药物中的应用；

R848在制备降低SARS-CoV-2感染后机体肺部病毒含量的药物中的应用。

R848在制备治疗或预防小鼠SARS-CoV-2感染的药物中的应用；

R848在制备提高治疗小鼠SARS-CoV-2感染存活率的药物中的应用；

R848在制备缓解小鼠SARS-CoV-2感染后体重降低的药物中的应用；

R848在制备降低小鼠SARS-CoV-2感染后机体肺部病毒含量的药物中的应用。

以上所述的应用中，优选的，所述的小鼠SARS-CoV-2感染中的SARS-CoV-2为新型冠状病毒SARS-CoV-2/WBP-1，保藏编号为CCTCC NO：V202031。

与现有技术相比，本发明优点如下：

1.R848是小分子化合物，对Caco-2细胞的毒性作用小，在体外细胞水平能够显著抑制SARS-CoV-2对Caco-2细胞的感染，抑制其在细胞中的增殖，说明其具有安全高效的特点。

2.R848在小鼠SARS-CoV-2感染模型中有效果，可以显著降低小鼠体重下降程度，降低小鼠肺组织中的病毒含量，提高小鼠的存活率，这使得R848具有非常大的临床治疗潜力。

附图说明

图1 R848对Caco-2细胞的细胞毒性示意图。

图2 R848细胞水平抗SARS-CoV-2的效果示意图。

图3 R848对SARS-CoV-2病毒感染小鼠体重的影响示意图。

图4 R848对SARS-CoV-2病毒感染小鼠存活率的影响示意图。

图5 R848对SARS-CoV-2病毒感染小鼠肺脏组织病毒载量的影响示意图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。本发明实施例中的试验方法和条件如无特殊说明，均为常规方法。本发明所述的技术方案，如无特殊说明，均为领域的常规方案；所述试剂或材料如无特殊说明，均来源于商业渠道。本发明中所有与严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV-2)活病毒相关的试验均在生物安全三级实验室(ABSL3)完成。

目前，抗病毒药物评价模型主要分为体外模型(in vitro model)和体内模型(invivo model)。

体外模型主要使用各种细胞系对药物进行评价，其优点在于可提供大量遗传性状相同的细胞为研究对象，操作方便，可消除其它外界因素的影响，并可以检测药物毒性、有效浓度等，为后期机理研究提供更多基础。体内模型一般使用各种模式动物感染模型，通过药物处理后的各种表型指标来衡量药物在活体动物内的整体效果。其优点是可对候选药物在活体内的效果进行真实、系统的评价。本发明采用人结肠癌细胞系Caco-2对R848的体外抗SARS-CoV-2效果进行测定；采用小鼠适应性毒株WBP-1感染模型，对R848的体内抗SARS-CoV-2效果进行真实系统的评价。

实验材料：

(1)实验所需细胞系、实验动物及病毒

细胞系：Caco-2细胞为华中农业大学实验室保存；

实验动物：SPF级4至6周龄Balb/c小鼠，购自三峡大学实验动物中心；

毒株：新型冠状病毒SARS-CoV-2/WBP-1，保藏编号为CCTCC NO：V202031，在本发明中，将该病毒简称为新型冠状病毒WBP-1或小鼠适应性毒株WBP-1；

(2)实验所需药物

R848(CAS No.:144875-48-90)购自MedChemExpress公司；细胞试验中，R848先用DMSO溶解，后用DMEM稀释成工作浓度，动物试验中，R848先用DMSO溶解，后用用PBS稀释，同时设置DMSO空白对照

(3)实验所需试剂：

DMEM培养基，胎牛血清(FBS)均购自于GIBCO公司；

细胞活性检测试剂盒：TransDetect Cell Counting Kit(CCK)购于北京全式金生物。

实施例1：

R848对细胞的毒性试验

本发明中使用Caco-2细胞，接种96孔板，待细胞密度达80％，用R848(终浓度为：0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM)分别孵育细胞24、48小时。使用TransDetect细胞计数盒测定细胞活性，按试剂盒说明书进行操作，测定OD450nm处的吸光度。具体实施过程如下：

1.细胞培养

取冻存复苏后的Caco-2细胞经过2次传代后，用含10％胎牛血清和双抗(青霉素100U/ml，链霉素100ug/ml)的DMEM培养基扩大培养。

2.R848对细胞的毒性试验

取生长良好的Caco-2细胞进行消化传代，用细胞生长液(DMEM培养基+10％胎牛血清+双抗)调整细胞密度为2×10⁶/ml，接种96孔板，每孔接种100μl；每孔再加入100μl用培养基液(DMEM培养基+10％血清+双抗)配制的R848药物，混匀。药物设定6个浓度梯度，每个梯度浓度设3个复孔，其终浓度为0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM。同时设置细胞对照，放置于37℃，5％CO₂培养箱培养。培养24、48h后，使用TransDetect细胞计数盒测定细胞活性，向处理培养后的96孔板细胞中加入含有CCK试剂10μl，37℃避光孵育2h，酶标仪检测OD450nm读数，计算细胞存活率。

细胞存活率(％)＝药物处理组/未处理对照组*100％

试验结果：

结果如图1，测定细胞存活率能反应R848对Caco-2细胞的毒性作用，从图中可以看出，R848以20μM处理Caco-2细胞24、48h后，细胞活力与对照组相比维持在80％以上，说明R848在此浓度下对细胞毒性较低，其半数细胞毒性浓度CC₅₀大于20μM。

实施例2：

R848在细胞水平对新型冠状病毒的抑制作用

R848细胞水平抗病毒感染作用

采用噬斑形成单位(plaque forming unit)检测R848在细胞水平对SARS-COV-2毒株(wuhan-hu-1，NC_045512.2)增殖的影响，具体步骤如下：

1.R848作用下SARS-COV-2毒株(wuhan-hu-1，NC_045512.2)在细胞上的增殖

1)将生长状态良好的Caco-2细胞进行消化传代，用细胞培养基调整细胞密度为1×10⁵/ml，每孔1ml接种于12孔板长至单层。

2)添加不同含量的R848，R848作用终浓度分别为0Μm、0.2μM、2μM、20Μm。

3)不同浓度R848处理24h后感染新冠病毒，病毒(MOI为0.1)孵育细胞1h，弃去病毒液，用上述含有不同浓度R848的DMEM细胞维持液继续培养细胞。

4)感染病毒后48h、72h收集细胞培养液，测定病毒滴度。

2.噬斑法测定新冠病毒增殖液中的病毒滴度

1)将生长状态良好的Vero细胞传代至12孔细胞培养板，3×10⁵/ml～5×10⁵/ml/孔，第二天长成致密单层。

2)在24孔板内用无血清DMEM培养基连续10倍稀释步骤1中收集的细胞培养病毒液。

3)在每孔加900μl DMEM.

4)加100μl步骤1中收集的细胞培养病毒液至第一列孔内，即每孔内液体的总体积为1000μl，轻轻震荡混匀。

5)用排枪从第一列取100μl至第二列，吹打并震荡混匀；更换枪头，从第二列取100μl至第三列，重复操作直到第六列。

6)吸去Vero细胞培养板中的培养基，加入500μl病毒稀释液；置于培养箱内37℃温育1h，吸去混合液，每孔加入1ml DMEM+2.5％FBS+0.9％甲基纤维素，置于培养箱内3天。

7)每孔加入1ml 8％formaldehyde-PBS，固定1h以上。

8)倒去固定液，用单蒸水清洗一遍。

9)加0.5％结晶紫染色10min，单蒸水清洗三遍，拍照后数噬斑。

试验结果：

结果如图2所示R848明显抑制了新冠病毒的复制。病毒感染后，20μM的R848处理细胞液中病毒含量显著性低于不添加药物的对照组，48h时病毒含量为7375PFU/ml，72h时病毒含量为2387.5PFU/ml；0.2μM的R848处理细胞液中病毒含量也低于对照组，48h时病毒含量为33500PFU/ml，72h时病毒含量为34000PFU/ml；病毒感染细胞72h后，不同浓度R848处理，细胞培养上清中的病毒含量普遍低于感染后48h。并且从图2中可以得知，R848对新型冠状病毒的抑制效果呈剂量依赖性，随着药物浓度的增加，对病毒的抑制效果越好。

实施例3：

R848在小鼠致死性感染模型中的抗病毒效果评价

SARS-CoV-2毒株鼠适应株的获得及小鼠模型构建：

SARS-CoV-2毒株鼠适应株的获得：

将人源样品中分离获得的SARS-CoV-2毒株(wuhan-hu-1，NC_045512.2)滴鼻接种于10月龄雌性BALB/c小鼠，感染剂量为50ul，病毒含量为2.3×10⁵PFU。感染3天后，解剖小鼠收集肺脏组织，匀浆，12000rpm离心5min，收集上清作为鼠适应性传代新冠病毒第1代。第1代肺脏组织匀浆液接种4-6周龄小鼠，3天后收获肺脏并且匀浆，得到第2代病毒液。以此在4-6周龄小鼠连续传代，得到第11代病毒液。在传代过程中，第9代小鼠第一次出现因病毒感染而死亡，连续传至14代，每代都会引起小鼠死亡。

将第11代肺脏组织匀浆上清液稀释10³、10⁴倍接种于VERO细胞，37℃孵育1h，弃去病毒液，对细胞进行冲洗后覆盖1％的琼脂糖凝胶无酚红DMEM培养基，培养2d，用无菌枪头挑取细胞空斑获得纯化的病毒，将纯化的毒株再次接种细胞进行空斑纯化，最终获得了对小鼠稳定致死的鼠适应株WBP-1，将第11代鼠适应性稳定毒株进行保藏。该毒株已于2020年8月17日送至中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，分类命名：新型冠状病毒SARS-CoV-2/WBP-1，保藏编号为CCTCC NO：V202031，地址：中国武汉武汉大学。

将纯化获得的SARS-CoV-2/WBP-1鼠适应毒株进行全基因组测序，其序列为SEQ IDNO.1所示。

新型冠状病毒RT-PCR检测鉴定引物如下：

F：5’-CCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTA-3’

R：5’-TGTCAAGAATCTCAAGTGTCTGTGGATC-3’

扩增产物片段长度为484bp。

将保藏的鼠适应株WBP-1在VERO细胞上纯化3次，之后在VERO细胞上连续传代3次，每代病毒均会对小鼠致死，经PCR未发生突变，传代稳定，在本发明中，将该病毒简称为鼠适应株WBP-1。

SARS-CoV-2鼠适应株WBP-1小鼠模型的构建以及WBP-1的毒力测定：

使用4-6周龄雌性BALB/c小鼠测定鼠适应株WBP-1的半数致死剂量。20只小鼠随机分为4组，每组5只，分别滴鼻感染50ul不同含量的病毒液，4个组中50ul病毒液中WBP-1病毒含量分别为10²、10³、10⁴、10⁵PFU，感染后每天观察并记录小鼠的体重和症状，连续观察10天，计算半数致死剂量LD50。对所有体重下降超过25％并且伴随有严重呼吸窘迫症状的小鼠进行解剖，取肺部组织进行组织切片观察。

结果显示，感染后5天，感染剂量为10²、10³PFU时，小鼠全部死亡；10⁴PFU感染组小鼠60％死亡，10⁵PFU感染组小鼠全部存活，根据计算确定WBP-1对小鼠的半数致死剂量(LD50)为10^3.84PFU。病毒感染后小鼠的体重下降程度和病毒浓度呈正相关，随着病毒含量的的降低，体重下降趋势降低；小鼠感染WBP-1后，肺部组织切片显示肺泡间质增宽，淋巴细胞侵润，肺泡萎缩，有大量纤维素样渗出物。

小鼠实验步骤：

1)将4-6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为2组，药物评价组、对照组(DMSO)，每组3只。

2)感染前2h开始给药，一直持续到感染后第4天，共给药5天。采用腹腔注射给药，剂量为30ug(1.5mg/kg)，每天一次。小鼠注射药物后滴鼻感染5个半数致死量(5LD₅₀)的新型冠状病毒鼠适应株SARS-CoV-2/WBP-1，感染剂量50μl，感染病毒后每天观察并记录小鼠的体重和存活情况，定时更换和添加垫料、饮水和食物，及时取出死亡小鼠，直至实验完成。

3)感染后第4d，药物评价组剩余2只小鼠体重均已下降至原始体重的百分之八十，判为死亡，立即麻醉后解剖，取肺部组织做病毒载量(空斑)检测。

4)根据统计结果，绘制出体重变化曲线、存活率曲线和组织病毒载量图。

试验结果：

小鼠体重变化结果如图3所示，小鼠给药后，对照组小鼠平均体重下降在第3天时开始低于R848处理组，感染后第4天病毒对照组小鼠全部死亡，R848处理组小鼠在感染后第4天开始，体重不在下降，开始恢复，到感染后第8天，体重超过感染前的体重。

小鼠存活率结果如图4所示，病毒对照组于小鼠感染后第4天全部死亡，而R848处理组小鼠感染后第9天仍全部存活。

肺脏组织病毒载量检测结果如图5所示，感染后第4天肺脏组织中，对照组病毒载量为188750PFU/ml，而R848处理组为30250PFU/ml，因此R848可显著降低机体在感染新型冠状病毒SARS-CoV-2后的肺部的病毒含量。

上述结果说明，R848在小鼠体内有明显的抗病毒效果。鉴于上述结果，R848可用于制备治疗SARS-CoV-2感染的药物。

Claims (10)

1.R848在制备治疗或预防SARS-CoV-2感染的药物中的应用。

2.R848在制备抑制SARS-CoV-2药物中的应用。

3.R848在制备缓解SARS-CoV-2感染后体重降低的药物中的应用。

4.R848在制备降低SARS-CoV-2感染后机体肺部病毒含量的药物中的应用。

5.R848在制备提升SARS-CoV-2感染后机体存活率的药物中的应用。

6.R848在制备治疗或预防小鼠SARS-CoV-2感染的药物中的应用。

7.R848在制备提高治疗小鼠SARS-CoV-2感染存活率的药物中的应用。

8.R848在制备缓解小鼠SARS-CoV-2感染后体重降低的药物中的应用。

9.R848在制备降低小鼠SARS-CoV-2感染后机体肺部病毒含量的药物中的应用。

10.根据权利6或7或8或9所述的应用，所述的小鼠SARS-CoV-2感染中的SARS-CoV-2为新型冠状病毒SARS-CoV-2/WBP-1，保藏编号为CCTCC NO：V202031。

Images