CN112135789A - 从柔性一次性袋中分离细胞的刚性腔室 - Google Patents

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Abstract

公开的方法包括将柔性容器放置在刚性框架内，并通过气压或液压使容器膨胀，以使容器的壁与刚性框架的内壁相符合，从而形成界限分明的腔室。公开的系统具有通过调节刚性容器壁之间的距离来减小腔室容积的能力。所述方法和系统适用于采用免疫磁分离或从血液产品中清除成分的封闭无菌系统。通过提供固定的体积和至少一个可以在其上磁性沉积目标实体的表面，可以将目标细胞(在阳性分离的情况下)保持磁性，并在其上用洗涤缓冲液冲洗以去除被包裹的细胞，最后回收高纯度和高产量的产物。

Description

从柔性一次性袋中分离细胞的刚性腔室
Paul A.Liberti博士和Dustin W.Ritter博士
【技术领域】
本发明涉及将柔性容器转变成基本上刚性的容器。更具体地，本发明涉及将封闭系统的一次性袋子套件(bag set)中的柔性袋转换成具有至少有一个平表面的基本上刚性的容器，以可复制的方式收集磁性物体，用于从白细胞分离产物、外周血和骨髓细胞中进行免疫磁性细胞分离。更具体的是，本发明涉及使用这种袋子套件的创新方法，包括在无菌条件下进行这种分离所需的多个步骤。
【背景技术】
免疫磁性细胞分离可使用内部或外部磁性梯度设备进行。内部磁场梯度的形成是通过将铁磁物体(通常是铁或镍的球、棒或纤维)放置在外部磁场中，其物理原理是众所周知的。根据Maxwell方程可以看出，球体、棒或纤维的直径越小，感应磁梯度越大，感应磁梯度的作用范围越小。内部产生的磁梯度容易超过100kGs/cm，因此，当磁性标记的细胞通过装满小钢球(或适当尺寸的棒或纤维)的圆柱，而该圆柱置于外部磁场中时，这些细胞将被磁性吸引到那些物体上。当细胞用较弱磁性胶体标记时，例如由Molday生产的(美国专利4,452,773)并由Miltenyi Biotec GmbH商业化的磁性胶体，通常使用内部梯度设计。
另一方面，当靶细胞用较高磁性的胶体纳米粒子进行免疫磁标记时，如Liberti等所述(美国专利号6,120,856；5,698,271；5,512,332)，则可以在6–10kGs/cm的磁场梯度中分离。通过极片设计和/或磁体相对于彼此的定位可以容易地形成这种梯度，从而产生了所谓的外部或开放磁场的磁性梯度装置，可以将适当的分离室放置在其中或靠在其上。
如Liberti等所发表的用于免疫磁分离的四极开放磁场磁梯度装置(美国专利号5,186,827；5,466,574)在本领域中是众所周知的，容器可方便地放置在具有径向梯度的磁场内，该径向梯度致使磁性标记的实体被径向拉至容器的内壁。反感应磁铁(Buckingmagnet)装置以及许多其他装置也用于产生磁梯度将磁性实体拉向它们的表面，因此磁性标记的实体可被分离在容器的一侧(美国专利号5,536,475)。在同时待审申请PCT/US2016/031528中，稀土块磁体(200 x 5 x 20mm，磁化范围20mm)彼此平行排列，彼此间隔3mm，极性交替，并且于5 x 200mm的侧面固定在一块铁背板上(32 x 22cm)。该排列可产生强大的磁梯度，使得当合适的腔室与由交替磁极组成的平面接触时，磁性实体则聚集在与该磁梯度表面相邻的容器的内壁上。这种类型的磁体排列得益于使用形状为直线的腔室，因为在这种腔室中，磁体阵列上方任何给定平面内的靶细胞都承受大约相同的磁梯度力，从而促进了整个腔室收集表面的均匀收集。
对于用磁性纳米粒子，例如Liberti铁磁流体(115–160nm)，标记的大分子靶标，已证明使用可产生均匀的径向渐变磁梯度的四极磁器件中的圆柱试管，可有利地将靶标收集并形成准单层(美国专利号5,660,990)。在许多情况下，仅通过在磁力收集的目标元素表面流动适当的缓冲液，即可轻易地去除与目标一起收集的不需要的成分。该特征避免了将分离室移出磁场，重新悬浮所有磁性收集的物质以及将分离室移回到磁梯度以进行后续磁分离的麻烦，而通常这也是使用开放磁场磁梯度装置对较大的磁性粒子进行纯化的方法，在随后的每次磁分离中，不需要的成分仍然悬浮在上清液中并被丢弃。显然，纯化细胞靶是更困难过程，因为细胞比美国专利5,660,990中公开的各种免疫测定中涉及的简单大分子复杂得多。从对磁性收集细胞的广泛研究中发现，在收集的细胞层少时，被捕获的非靶细胞或“无关(bystander)”细胞的确可以去除而无需重新悬浮分离。但是，在此类收集的细胞上流动缓冲液，加上使用弯月面(或气泡)在此类收集的细胞上流动，可以提供额外的“清理”效果，从而极大地改善了无关细胞的去除。
为了将患者的细胞进行免疫磁分离，然后将细胞在无菌条件下处理并最终返回患者体内或用于其他需要都要求无菌的操作方式，而且必须在密闭系统中进行。实施免疫磁性选择并收获所需的细胞需要许多程序和步骤，例如1)细胞标记(可以是多步骤过程)；2)磁分离；3)去除非目标成分；4)随后去除在分离过程中可能被无意捕获的无关细胞；5)回收含有所需细胞的阳性部分。使用由塑料管互连的塑料袋状腔室来制做能够执行各种所需步骤的封闭系统是有效的手段。并通过适当的阀和泵，可以执行各个步骤，这一点文献Johnson(欧洲专利号1,058,564)进行了说明。
我们已经发现，一些室条件是理想的用于磁分离的分离室条件，以达到用最少的重新悬浮/重新分离步骤去除夹带的非靶细胞。要有效清除被包裹的细胞，有一些重要的因素需要考虑。其中一个要求是，收集细胞的分离室的表面在整个过程中必须保持与磁体表面非常接近。这是必不可少的，因为此类磁体阵列的有效磁场的“作用(reach)”范围相对较短(通常为7-10mm)，超过此范围磁梯度就会急剧下降。因此如果收集表面与磁性表面相距仅几毫米，靶细胞将会脱落，从而导致在洗涤过程中靶细胞的大量损失。
对于许多使用相对较大的磁性颗粒(>800nm)的免疫磁性细胞分离，可以将装有待分离细胞混合物的柔性袋简单地放在磁性梯度设备上或内部以进行分离，并且由于靶细胞被磁力紧密地固定，柔性袋可以成功地用作分离室。当非靶细胞从袋中泵出或流出后，可以去除磁场，将细胞重新悬浮在缓冲液中；通过重新施加磁场，可以再次分离细胞，并且可以根据需要重复进行此重新悬浮/重新分离的过程，直到将所有非靶细胞从分离袋中清除。
另一方面，对于用磁性纳米粒子标记的细胞和其他靶标，例如Liberti铁磁流体(115–160nm)，每个靶标的磁性质量将明显低于用较大磁性粒子标记的靶标。所以与标记有较大磁性颗粒的细胞相比，铁磁流体标记的细胞将更容易从磁性梯度设备的收集表面脱落。因此，关于收集室的性质和所使用的磁性材料，必须有一些特殊的考虑。尽管存在这种潜在的缺点，但可以将目标细胞分层收集并且无需重新悬浮就可以去除捕获的无关细胞的发现，使得用柔性血袋构建收集室非常理想，因为这样可以避免将收集室移出磁场，重新悬浮细胞，然后将腔室移回到磁场中，以进行后续的磁分离。由于这样的系统也避免了使用苛刻的方法去除杂质，因此理论上会显着提高细胞产品的活性，事实也的确如此。
尽管能够在不重新悬浮的情况下去除被包裹的无关细胞使得磁性装置在整个过程中与收集腔室始终保持接合，但在某些情况下将磁性装置与收集腔室分离可能是有利的。例如，如果先将细胞混合物引入收集室，然后再引入磁性纳米颗粒以标记靶细胞，则磁性装置必须足够远离收集室以允许标记过程的进行。同样，如果需要重新悬浮并随后进行重新分离，则要求磁性装置循环的脱离和重新结合。最后，使磁性梯度装置可与收集腔室脱离也有利于重新悬浮以回收分离的靶细胞。
构建适当大小的腔室以分层收集细胞以及后续的过程并不简单。在典型的白细胞分离产品中，通常有总体5×109的有核细胞(TNC)。在分离T细胞或其亚群时，例如约50％将是CD3+细胞，其中一部分是CD4+和CD8+(约2∶1的比例)。为了使所有收集的CD3+细胞单层化，需要大约1600cm2，这使得构建具有适当收集表面积的腔室有些不切实际。然而，从对含有大量红细胞(血细胞比容高达20％)的铁磁标记的HPB细胞(CD3+细胞系)的研究中可以确定，通过使缓冲液流过，可以从大约五层的磁性收集的靶细胞中非常有效地清除被包裹的红细胞。当收集的细胞在腔室中被磁梯度固定，使用液体的弯月面(由引入洗涤缓冲液中的气泡形成)“擦洗”，会使洗涤过程更有效。基于这一发现，大约320cm2的收集表面即可用于上述的从白细胞分离产物中分离CD3+细胞的例子。在分离CD34+干细胞的情况下，可能希望处理多达5×1010的TNC，并且干细胞数量为2％，上述表面会将这些细胞收集到大约两层中。
柔性袋收集室的另一个限制是，必须保持容器的形状，特别是收集表面(如果在容器的两侧施加磁梯度，则多个表面)，以便在第一次分离后可以将腔室的液体清空和进行洗涤。在这些操作过程中，袋子的任何弯曲都可能会使目标细胞远离最强的磁性梯度区域，从而使其脱离。
理想地，分离室应具有可变的体积，以容纳含有不同数量的TNC和/或不同百分比的靶细胞的样品。例如，对于分离T细胞或其亚群(例如CD4+T细胞)，细胞的含量在起始样品中可能会非常不同(T细胞大约为30–85％，CD4+T细胞大约为25–65％)。在磁性细胞分离中，总细胞和靶细胞的浓度是重要的参数。因此，需要同时考虑总细胞和靶细胞的最佳浓度。
有两种方法可以改变直线腔的体积：改变其表面积或改变其深度。对于一次性直线形袋，可以通过选择固定的深度而改变表面积来改变容积；这些袋子将与能够容纳预期使用的最大袋子的平面磁体阵列结合使用。另一方面，可以改变深度的腔室具有几个优点，其不仅可以通过改变体积以适应不同的TNC含量或靶细胞浓度，而且通过调节深度来改变体积在分离过程中可能是有利的。例如，如果用于磁性分离的TNC的最佳浓度为3×107TNC/mL，需要处理9.6×109TNC，则深度为10mm的矩形袋将容纳320mL，腔室一侧的表面积将为320cm2。如果仅要处理6.7×109个TNC，可以使用同一袋子将深度限制为7mm，从而可以将同一种袋子用于分离不同数量的TNC。
另外，一旦靶细胞被分离，由于以下原因，通过使腔室的壁更接近而减小腔室的深度将是有利的：1)会需要较少的缓冲液来洗涤磁性收集的细胞；2)由于腔室壁彼此靠近产生的较小的接触角，因此弯月面的擦洗效果会更有效；3)如果袋子的壁彼此靠近，则溶液变化时将减少其在边界混合，实际上，在前一种溶液通过腔室之后和下一种溶液进入腔室之前，可以引入气隙(air gap)。在小直径管中的样品或溶液之间放置气隙是本领域众所周知的技巧，用于在泵送溶液的同时并保持它们分开。
【发明内容】
本发明提供了一种用于将柔性容器转换成基本上刚性的容器的方法和设备。
根据一个方面，本发明提供了一种用于将柔性容器转换成基本上刚性的容器的方法。该方法包括将柔性容器放置在刚性框架中，并通过施加正压以使容器膨胀并与框架接合。该柔性容器可以是用于无菌处理细胞的一次性袋。容器可以由气压或液压膨胀。容器的每一端可具有带阀的开口，以控制通过容器的液体流动。框架的壁可以是平坦的或具有表面凸起以引导液体流过容器，并且它们可以是彼此平行。框架两壁之间的间距可以调节。该方法可用于从混合细胞群中分离靶细胞：通过形成基本上刚性的容器，引入混合细胞群和磁性标记试剂，分离磁性标记的靶细胞，并收集磁性标记的靶细胞。框架的壁可包括磁体组件以产生磁场梯度，并且该磁性组件可与框架的壁可逆地脱离，以可逆地衰减磁场梯度。在回收磁性标记的靶细胞之前，洗涤缓冲液可流过容器。混合的细胞群和磁性标记剂可以同时或依次引入容器中。
根据另一方面，本发明提供了一种用于将柔性容器转换成基本上刚性的容器的系统。该系统包括刚性框架和在正压下可膨胀的柔性容器。该系统可以包括压力源以施加正压。框架的壁可以移动以调节其间距。框架的壁可包括磁体组件以产生磁场梯度，并且该磁性组件可与框架的壁可逆地脱离，以可逆地衰减磁场梯度。
【附图说明】
图1示出了具有相互连接的管和阀的一次性袋子套件的示例，其可以用于对源自白细胞分离产品、外周血、骨髓等的细胞的一些亚群进行免疫磁性细胞分离。该套件包括一个装有起始材料(例如血液、白细胞分离产品、洗过的细胞等)的源袋1，一个可以储存用于系统流动、洗除非靶细胞和再悬浮分离的靶细胞的溶液的缓冲液储袋2，废液袋3，和一次性的直线磁分离袋4，阀5和6分别位于分离袋4的入口和出口，阀7在所述废液袋附近，用于控制废液袋的气压和随后分离袋4的加压。
图2描绘了用于磁分离的分离袋4。在所示的实施例中，袋子在其端部具有入口8和出口9，分别用于填充和/或清空。袋子具有部分锥形的端部10、11，并且在部分锥形的区域中是导流器12、13，其与部分锥形的区域一起促进层流。
图3示出了与分离袋4连接的废液袋3，该分离袋4放置在可以旋转的刚性框架14内，其中框架14的一侧或两侧15、16可以是或用作磁体阵列的支撑。磁体阵列可以分别在分离袋4的一侧或两侧17、18施加磁力。连接到废液袋3的还有可用于对废液袋3和分离袋4施加气压的端口19以及与卸压阀21连接的端口20。
图4显示了放置在框架14中的分离袋4，其中框架14的一侧或两侧15、16可以用作或支撑磁体阵列，这些磁体可以在分离袋4的一侧或两侧17或18施加磁力。入口端口8和出口端口9连接到入口泵22和出口泵23，二者可独立或同步地将流体(溶液或气体)泵入或泵出分离袋4中。压力计24通过端口25附接到分离袋4，并且向泵23提供反馈控制。
图5示出了可调节的刚性框架26，其中可以使用机构30来改变框架26的侧面28、29之间的间隔27，该机构使得框架26的一侧29相对于框架26的另一侧28移动。
【具体实施方式】
为了生产满足上述需求的刚性无菌腔室，我们在此公开了方法和装置，由此可以将柔性一次性袋子转换成具有特定的、可复制的形状的和含有收集表面的刚性容器。此外，这些方法使柔性袋在包括填充和排空袋、倾斜分离袋(用于各种处理步骤，特别是在引入气泡和随后弯月面擦洗时的转动时)、以及分离产品的回收等一系列操作中保持预定的形状。我们还公开了用于使不同溶液有效地流过系统，特别是在分离室内移动的装置，该装置促进活塞流并使这些溶液之间在边界处的混合最小化。这是通过采用顺序溶液的不同密度，以及使腔室倾斜以利用重力作用，或通过减小腔室的深度并使用气隙使溶液彼此分离来实现。这些是实现去除非目标成分并由此纯化所需产物的关键考虑因素。
图1示适用于阳性或阴性免疫磁性细胞分离的一次性袋子套件。该套件包括容纳待分离样品的源袋1、缓冲液储袋2、废液袋3、和进行磁分离的分离袋4。阀5和6分别位于分离袋4的入口和出口，并且可以被操作以控制流体流入和流出分离袋4。另一个阀7被用来控制废液袋3和分离袋4的气动加压。这种装置曾由Baxter医疗公司用于其Isolex系统。
图2示分离袋4，其具有入口和出口8、9以及部分锥形的端部10、11，以分别促进填充和清空分离袋4。导流器12、13与部分锥形的端部10、11一起促进层流。
图3描绘了一种设置，其中，分离袋4被限制在可旋转的刚性框架14内。在优选实施例中，框架14的侧面15、16是磁体阵列，其分别在分离袋4的一侧或两侧17、18上施加磁力。在另一实施例中，框架14的侧面15、16是被动容纳壁，其不对分离袋4的一侧或两侧17、18施加磁力。在一个更优选的实施例中，框架14的侧面15、16是被动容纳壁，其可以与磁体阵列接合和脱离，该磁体阵列分别在分离袋4的一侧或两侧17、18上施加磁力。应当注意的是，框架14和分离袋4不是水平的，使得泵入分离袋4中的流体将形成弯液面，该弯液面在填充时将横穿分离袋4的侧面17、18。在填充分离袋4之前，使用无菌过滤气体通过端口19对废液袋3和分离袋4施压。施加的压力应足以使分离袋4膨胀，以使侧面17、18与框架14的侧面15、16接合，但压力不可过度，以致使分离袋4破裂或阻碍流体的引入。已经发现约1.5psi的压力适合于满足这些要求。废液袋3上的端口20连接至减压阀21，以维持分离袋4和废液袋3内的压力。
减压阀21在本发明中起重要作用。例如，在一个实施例中，分离袋4容纳约270–315mL，并与容量为2L的废液袋3配对，其中废液袋3的大小足以容纳最初的磁分离以及后续的洗液。废液的总体积可能高达1.5L，导致废液袋中的压力增加了四倍，有可能威胁到系统的完整性或阻碍流体的泵送。此外，在没有压力释放的情况下，增加的压力可能会影响靶细胞的活性。通过引入减压阀21，可以在引入流体时保持系统内恒定的压力，从而消除了这些问题。
与非加压系统相比，使用上述加压系统将分离袋4保持为刚性形式具有许多优点。尽管可以将分离袋4放置在水平位置来实施本发明，但是有利的是，在填充分离袋4时以最小地产生弯月面的角度旋转框架14。当将要分离的样品泵送到加压系统中时，可以看到清晰且轮廓分明的弯月面，并且其在填充时在分离袋4内上升。在希望将待分离样品放置在分离袋4的某些特定区域内的情况下，弯液面的可见性会非常有用。例如，如果将样品塞放置在分离袋4底部上方有利，则在将适量的样品泵入分离袋4中之后，可以引入密度较高的细胞相容性缓冲液(例如，包含蔗糖或增加密度的某些其他物质)。用这种方法结合弯液面的可见性，可以精确定位要分离的样品。我们发现，含有5％蔗糖的等渗缓冲盐溶液足以将含有多达10％血细胞比容的白细胞分离产品放置于磁场梯度的区域中。
通过引如恒定的压力、不同的密度和可旋转的框架14，可以通过以下步骤创建一种过程以收集高纯度的靶细胞：1)从事先加压的刚性分离袋4的入口端泵入包含磁性标记靶细胞的样品。分离袋4的所处角度足以在引入样品时形成确定的弯月面，并通过在其上加入高密度缓冲液而将样品精确定位在磁梯度内；2)进行磁分离；3)用较高密度的缓冲液通过分离袋4的出口端泵出没有磁性分离的细胞溶液；4)将气泡引入装有较高密度缓冲液的分离袋4中；5)前后倾斜框架14，以使由其中的气泡产生的弯月面“擦洗”收集表面以去除非靶无关细胞；和6)根据需要重复步骤3-5，以获得所需的产品。在步骤中交替改变缓冲液密度以防止溶液混合是有利的，这样可以更有效地去除非靶无关细胞。例如，在用较高密度的缓冲液完成第一次清洗之后，框架14可以向下倾斜，使得出口端低于入口端，并且可以将较低密度的缓冲液泵入分离袋4。
图4所示由柔性一次性袋转化为刚性容器的第二种解决方案。该解决方案的优点与前述方案类似。如图3所示，分离袋4固定在框架14内，分离袋的侧面15、16固定在框架14内，分别与框架14的侧面17、18接合。然而，在这种布置中，分离袋4通过其入口端口8接到入口泵22，并且通过出口端口9接到出口泵23，其中两个泵也可以用作阀(例如，在蠕动泵的情况下)。在图4中还示出了压力计24，其经由端口25附接于分离袋4。在该实施例中，基本上没有任何气体的分离袋4被定位在框架14内。在停止出口泵23的情况下(即，阀关闭)，待分离的样品由入口泵22泵入分离袋4，从而填充分离袋4并使其具有足够的刚性。如前所述，可以使用密度足够大的缓冲液(例如5％的蔗糖)将样品置于合适的位置以实现最佳分离。在分离之后，启动入口泵22以将洗涤缓冲液泵送到分离袋4中，同时与出口泵23从分离袋4中同步地将溶液泵出。这样，分离袋4在整个过程中保持其刚性形状。压力计24在该过程期间监视分离袋4内的压力，并向两个泵22、23提供反馈，以防止过高或过低的压力。利用该实施例，达到了先前的正压实施例的益处。
另一个用于磁性分离目标实体以实现与上述相同目的的替代方法是采用可调节的刚性框架26，其中可以使用机构30改变框架26的侧面28、29之间的间距27。在一个实施例中，机构30将允许框架26的一侧29相对于框架26的另一侧28移动，从而改变框架26的侧面28、29的间距27。在一个实施例中，框架26的两个侧面28、29可通过机构30移动，从而允许框架26的侧面28、29的间距27的变化。
这种可调节的刚性框架26可以在前面的正压实施例或前面的两泵实施例中实施。在一些实施例中，可以在分离之前设置框架26侧面28、29的间距27，以设定腔室体积并且在整个过程中保持该间隔。在其他实施例中，可以在分离之前设置框架26侧面28、29的间距27以设定腔室体积，并且在随后的过程中改变该间隔以增加或减小腔室体积，例如在洗涤或产品回收的步骤中。在其他实施例中，框架26的侧面28、29的间距27可以减小以迫使溶液从分离袋4中出去以进入废液袋3，然后再增加间距以重新进行分离袋4的填充。
为了测试在保持收集表面的完整性的同时改变框架26的侧面28、29间距27的构想，制造了类似于图3中所示的装置，其中框架26侧面28和29的间距27可以在4-14mm之间变化。框架26的侧面28、29的尺寸为19.5×26.5cm。一侧由3/8英寸厚的刚性有机玻璃构成，以便可视化，而另一侧则包含能够产生磁场梯度的磁体阵列。从LOVO Cell WashingDisposable Kit(Fresenius Kabi，伊利诺伊州苏黎世湖)获得约12.5 x 25.5cm的柔性袋。该套件中的袋子称为“工作袋(in-process bag)”，在较长尺寸的两端均具有端口。该袋用作分离袋4，并如图3所示放置，袋的顶部端口连接于用作废液袋3的第二柔性袋。废液袋3也是LOVO Cell Washing Disposable Kit的产品，供应商称之为“滤液袋”。如图3所示，此废液袋3还连接至减压阀21。蠕动泵连接到分离袋4的入口8，设计原理上与图4所示的入口泵22相同。这样建立了一个系统，在入口泵22用作截止阀(shutoff valve)的情况下，两个袋子可用合适的流体(例如气体)加压至1.5psi，以使分离袋4的侧面17、18与框架26的侧面28、29紧密接合。由于废液袋3没有被限制，其作用类似于一个气囊并膨胀。对于这种布置，当液体通过蠕动泵被引入到系统中时，它置换了等量的气体，该气体通过减压阀21释放以保持系统内恒定的压力，从而保持系统的完整性。
系统的测试在间距27为4–12mm的范围进行。如所预期的，当间距27为5mm时，腔室的体积为180mL，间距27为10mm时，期望体积大约翻倍。在所有情况下，分离袋4的侧面17、18与框架26的侧面28、29紧密接合并贴靠在框架26的侧面28、29上。该系统在分离性能方面的功能则通过使用外周血单核细胞的实验进行进一步的测试。首先磁性标记CD3+细胞(即T细胞)，并将细胞的混合物(即标记的靶细胞和未标记的非靶细胞)泵入腔室中，其中框架26的侧面28、29的间距27为5mm或10mm。磁分离后，用缓冲液和弯液面擦洗(即整个腔室摇动90°以使弯月面在细胞收集表面流动)，将磁性分离的靶细胞进行数个洗涤循环，以除去非靶细胞。在间距为5mm和10mm的情况下，该系统在靶细胞的产量和纯度方面令人满意。
上述实验证明了本发明的实用性，其中可以将柔性袋转换成可变容积的刚性腔室。本系统对有利于容纳各种变化如总细胞的数量和浓度、靶细胞的数量和浓度以及待处理样品的体积。例如，处理108TNC对于许多应用可能就足够了；然而，白细胞分离产品通常含有109TNC，而干细胞分离通常需要应对1010TNC。当面对足够大的样品体积以至于施加于腔室一侧的磁场梯度不能满足需要的情况时，采用将磁场梯度施加到两侧的设置也是简单易行的。
从本发明的柔性袋获得的可变体积的分离室在其他方面也是有用的。去除非靶细胞所需的操作(参见同时待审申请PCT/US2016/031528)包括将洗涤缓冲液以及通过控制气体的引入而形成的弯月面流过收集的细胞表面。对于需要较大间距(如10–12mm)的分离时，形成的弯月面可能不足以清除收集的细胞中被裹携的非靶细胞。因此，采用可调节的框架是有利的，其可减小框架间距，从而减小腔室的体积。这在至少三个方面可能是有利的：首先，将减少清洗循环时每次填充腔室所需的缓冲液的量；其次，清空腔室所需的时间也将减少；最后，当两个板之间的空间减小时，通过两个板的气泡具有更大的弯月面擦洗效果。通常两板之间存在最佳间距以实现所需目标。
采用由柔性袋形成的可变体积分离室的另一个显著优点是，通过一定程度减小分离室的体积，腔内存在气隙能够防止两种溶液彼此的接触和混合。为了说明这一点，请考虑将需要分离的血液产品引入间距为10mm的分离室中，以容纳大约360mL的样品。分离完成以后，可通过适当的阀门以减小分离室的体积，从而迫使溶液进入废液袋。通过选择适当的间距，可以随后引入气隙，使得当新鲜缓冲液引入分离室中时，将使剩余溶液在几乎没有与新鲜缓冲液混合的情况下排入废液系统。
以下的实施例更详细地解释本发明。
例一
以下步骤用于利用气压、不同密度和重力作用，以从白细胞分离产品中分离出磁性标记的CD3+细胞。
1.首先将废液袋加压至约1.5psi，使其变硬，然后将废液袋与放置在刚性框架内的分离袋连接(刚性框架壁的一侧为平面磁阵列，另一侧为容纳璧)。
2.分离器向上倾斜(出口在顶部)，并且打开入口和出口阀，将样品以高速度(例如150mL/min)泵入分离袋中。
3.当样品完全进入分离袋后，切换到含75mM NaCl的5％蔗糖(“蔗糖溶液”)，直到蔗糖开始进入袋中，致使样品完全置于磁场中。
4.分离10分钟。
5.将蔗糖溶液泵入袋中，同时将非分离溶液或上清液向上推出分离袋。
6.除去非分离的溶液后，向下倾斜分离器并向分离室泵入气体以形成气泡；泵入适量的气体(约占袋体积的10％)后，切换回蔗糖溶液并泵入，直到它开始进入袋中。
7.在入口阀和出口阀均关闭的情况下，来回摇动分离器，直到非靶细胞重新回到悬浮液中。
8.分离器在向上倾斜的位置(气泡在出口附近)，且打开入口和出口阀，泵入蔗糖溶液以除去气泡。
9.等待5–10分钟，以重新捕获所有脱落的靶细胞。
10.向下倾斜分离器，然后开始将不含蔗糖的洗涤液泵入分离室；排出蔗糖洗涤液后，泵入气体以形成气泡。
11.在入口阀和出口阀均关闭的情况下，来回摇动分离器，直到非目标细胞重新分配回悬浮液中。
12.在入口和出口阀均打开的情况下，向上倾斜分离器(气泡在出口附近)，然后泵入不含蔗糖的溶液以去除气体。
13.等待5–10分钟，以重新捕获所脱落的靶细胞。
14.泵送蔗糖溶液，同时将不含蔗糖的洗涤溶液向上排出袋子。
15.如有必要，可以重复步骤6-10，将细胞放回在不含蔗糖的溶液中以进行回收；或者，可以在步骤14之后直接回收分离的细胞产物并从磁场中移出。
例二
以下步骤用于利用气压、不同密度、重力作用和可变体积腔室以从白细胞分离产品中分离磁性标记的CD3+细胞。
1.首先将废液袋加压至约1.5psi，使其变硬，然后将废液袋连接于放置在刚性框架内的分离袋(刚性框架的壁一侧为平面磁阵列，另一侧为可平移的容纳壁)。
2.分离器向上倾斜(出口在顶部)，并且打开入口和出口阀，将样品以高速度(例如150mL/min)泵入袋中。
3.样品完全进入分离室后，切换到含75mM NaCl的5％蔗糖(“蔗糖溶液”)，直到蔗糖开始进入分离室中，致使样品完全置于磁场中。
4.分离10分钟。
5.在入口阀关闭，出口阀打开的情况下，通过平移容纳壁来减小腔室间距，从而迫使非分离溶液从分离袋中进入废液袋。
6.在出口阀关闭，入口阀打开的情况下，然后将蔗糖溶液泵入袋中，同时增加腔室间距。
7.当分离室装满蔗糖溶液时，向下倾斜分离器并开始泵入气体以形成气泡。泵入适量的气体(约占袋体积的10％)后，切换回蔗糖溶液并泵入，直到它开始进入袋中。
8.在入口阀和出口阀均关闭的情况下，来回摇动分离器，直到非靶细胞重新回到悬浮液中。
9.在分离器朝上的位置(气泡在出口附近)，且两个阀都打开的情况下，泵入蔗糖溶液以除去气泡。
10.等待5–10分钟，以重新捕获所脱落的靶细胞。
11.在入口阀关闭且出口阀打开的情况下，通过平移容纳壁来减小腔室间距，从而迫使蔗糖溶液从分离袋中进入废液袋。
12.向下倾斜分离器，关闭出口阀，打开入口阀，然后将不包含蔗糖的洗涤液泵入分离室中，同时增加腔室间距。
13.当分离室充满不含蔗糖的洗涤液后，开始向泵入气体以形成气泡。泵入适量的气体后，切换回不含蔗糖的洗涤液，直至其开始进入分离室。
14.在入口阀和出口阀均关闭的情况下，来回摇动分离器，直到非靶细胞重新回到悬浮液中。
15.在两个阀均打开的情况下，向上倾斜分离器(气泡在出口附近)，然后泵入不含蔗糖的洗涤液以去除气泡。
16.等待5–10分钟，以重新捕获所脱落的靶细胞。
17.在入口阀关闭，出口阀打开的情况下，平移容纳壁以减小腔室间距，从而将不含蔗糖的洗涤溶液从分离室中排入废液袋。
18.关闭出口阀，打开入口阀，然后将蔗糖溶液泵入袋中，同时增加腔室间距。
19.如有必要，可以重复步骤7-12，将细胞收集在不含蔗糖的溶液中以进行回收；或者，可以在步骤18之后直接回收细胞产物并从磁场中移出。
本文公开了一种可以由柔性、理想的一次性袋形成刚性腔室的装置，该袋状腔室可用于和由刚性材料构造的腔室相同的方式来执行多种操作，而没有刚性材料腔室的高成本和需要消毒的困难。本发明还消除了保持袋状分室与磁体的表面和与磁体相配合的容纳壁的表面接合的装置的需要，如果需要是可以通过在袋子的两侧放置设计适当的真空板来实现。
本发明具有比细胞分离更广泛的应用，包括分离各种“生物实体”，本文所用的“生物实体”术语是指各种生物学来源的物质，如细胞，包括真核细胞(如白细胞、红细胞或真菌)和原核生物(如细菌、原生动物或支原体)，病毒，细胞成分(例如细胞器、囊泡、内体、溶酶体或细胞核)以及分子和大分子(例如蛋白质或核酸，后者包括RNA或DNA)。
除了创建用于分离的腔室以外，本发明还具有其他应用。如用于需要精确体积的腔室或需要某些精确的形状而无需平行壁。它也可以用来创建一个腔室，在该腔室内有一个或多个屏障或通道。更具体地，如果在制做袋子的同时将一个或多个表面突起压入袋子的侧面，然后将这种袋子放置在结构与袋子结构成镜像的框架中，可以在给袋子充气时形成复杂的腔室。例如，如果要建造一个类似于Waffle的腔室，则可以按以下步骤完成：1)将两个可变形的薄片压成所需的Waffle结构，例如用于血袋或其他合适材料的薄片；2)将两个压制好的Waffle样薄片对应地放置然后将边缘结合以制成袋子，并在适当的位置做出适当数量的端口；3)将该袋子放入相应的Waffle结构的框架中，并对该袋子施正压以形成腔室。可替代地，如果使用可足够变形的材料制造袋子，则不需要压制成任何结构，因为施加在袋子内的压力将足以使袋子的壁与所期望的框架的结构相符合。
本文引用了多个专利和非专利出版物，以描述本发明所属的技术水平。这些出版物中的每一个的全部公开内容均通过引用并入本文。
尽管上面已经描述和/或举例说明了本发明的某些实施例，但是根据前述公开，各种其他实施例对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，本发明不限于所描述和/或示例的特定实施例，而是能够在不背离所附权利要求的范围和精神的情况下进行相当大的变化和修改。
此外，过渡术语“包括”、“基本上由...组成”和“由...组成”，当在所附权利要求中以原始和修改形式使用时，其定义权利要求范围，用于针对未叙述的附加权利要求原素或步骤，如果存在，则不包含在权利要求的范围内。术语“包括”旨在是包容性的或开放式的，并且不排除任何其他未引用的要素、方法、步骤或材料。术语“由...组成”排除权利要求中所指定的以外的任何元件、步骤或材料，并且在后一种情况下，不包括通常与所指定的一种或多种材料相关联的杂质。术语“基本上由...组成”将权利要求的范围限制为指定的元件、步骤或材料以及不实质性影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的特征。在替代实施例中，本文描述的体现本发明的所有设备、设备组件和方法可以由过渡术语“包括”、“基本上由...组成”和“由...组成”中的任何一个更具体地定义。

Claims (27)

1.一种将柔性容器转变成基本上刚性容器的方法，所述柔性容器具有第一端和第二端以及沿其外围连接的一对可膨胀板，使得所述板的面对的内表面形成收集空间，在所述的第一端和第二端的每一个上均具有开口，所述方法包括：
将所述柔性容器放入刚性框架中，所述刚性框架具有限定出限制间隙的相对的壁构件；和
通过施加正压来使所述柔性容器膨胀，从而促使所述板的外表面在所述限制间隙内与所述相对的壁构件接合，从而使所述容器基本不挠性。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述柔性容器是适用于无菌处理生物实体的无菌、一次性袋子。
3.如权利要求2的方法，其中所述生物实体是活细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其中通过施加气压使所述容器膨胀。
5.如权利要求1所述的方法，其中通过施加液压使所述容器膨胀。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述容器在所述第一端具有带阀的入口，在所述第二端具有带阀的出口，从而允许受控流体流过所述容器。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述刚性框架的相对的壁构件大体是平面的并且彼此基本平行。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述刚性框架的所述相对的壁构件中的至少一个具有至少一个表面突起，所述表面突起引导流体沿着预定流动路径流过所述容器。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述刚性框架的每个所述相对的壁构件具有至少一个表面突起，所述表面突起引导流体流沿着预定的流动路径流过所述容器。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述相对的壁构件之一是大体上平坦的，并且所述相对的壁构件之一具有至少一个表面突起，所述至少一个表面突起引导流体流沿着预定流动路径流过所述容器。
11.如权利要求1所述的方法，其中在所述相对的壁构件之间的所述限制间隙内的距离是可调节的。
12.一种从混合细胞群中分离多个靶细胞的方法，所述方法包括：
a)提供一种根据权利要求1的转换方法形成的基本上刚性的容器；
b)将所述混合细胞群和至少一种有效并选择性地结合并磁性标记所述靶细胞的磁性标记试剂引入所述容器的所述收集空间中；
c)在磁场梯度的影响下从所述混合细胞群中分离出磁性标记的靶细胞；和
d)回收所述磁性标记的靶细胞。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述刚性框架的所述相对的壁构件中至少一个包括磁体部件，所述磁体部件有效地在所述收集空间中产生所述磁场梯度。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述磁体部件可逆地与所述至少一个相对的壁构件脱离，从而使所述收集空间中的所述磁场梯度可逆地衰减。
15.如权利要求12所述的方法，其中所述刚性框架的每个所述相对的壁构件包括磁体部件，所述磁体部件有效地在所述收集空间中产生所述磁场梯度。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述磁体部件可从每个所述相对的壁构件可逆地脱离，使得所述收集空间中的所述磁场梯度可逆地衰减。
17.如权利要求12所述的方法，其中在所述回收步骤之前，使洗涤液至少通过所述容器一次。
18.如权利要求12所述的的方法，其中将所述混合细胞群和所述至少一种磁性标记试剂同时引入所述收集空间。
19.如权利要求12所述的方法，其中将所述混合细胞群和所述至少一种磁性标记试剂依照顺序地加入到所述收集空间中。
20.一种用于将柔性容器转换成基本上刚性的容器的系统，所述系统总体包括：
刚性框架，具有相对的壁构件，所述壁构件限定了限制间隙；
所述柔性容器设置在所述限制间隙中，所述柔性容器具有第一端和第二端以及沿其外围连接的一对可膨胀板，使得所述板的面对的内表面形成收集空间，在所述第一端和第二端的每一个上均具有开口，所述可膨胀板在施加于所述收集空间内的正压作用下膨胀，从而促使所述平面在所述限制间隙内与所述的相对的壁构件接合，并使得所述的柔性容器基本不挠性。
21.如权利要求20所述的系统，还包括压力源，所述压力源可操作地连接到所述容器并且有效地在所述收集空间内施加正压。
22.如权利要求20所述的系统，其中所述刚性框架的所述相对的壁构件之一可以相对于另一壁构件移动，由此所述限制间隙是可调节的。
23.如权利要求20所述的系统，其中所述刚性框架的所述相对的壁构件相对于彼此是可移动的，由此所述限制间隙是可调节的。
24.如权利要求20所述的系统，其中所述刚性框架的所述相对的壁构件中的至少一个包括磁体部件，所述磁体部件有效地在所述收集空间中产生磁场梯度。
25.如权利要求24所述的系统，其中所述磁体部件可逆地从所述至少一个相对的壁构件脱离，从而使得所述收集空间中的所述磁场梯度可逆地衰减。
26.如权利要求20所述的系统，其中所述刚性框架的每个所述相对的壁构件包括磁体部件，所述磁体部件有效地在所述收集空间中产生磁场梯度。
27.如权利要求26所述的系统，其中所述磁体部件可从每个所述相对的壁构件可逆地脱离，使得所述收集空间中的所述磁场梯度可逆地衰减。
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