CN112129747B - 一种电化学发光检测l-半胱氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种电化学发光检测L‑半胱氨酸的方法，采用固态电化学发光传感器对L‑半胱氨酸进行检测，所述固态电化学发光传感器包括电极，所述电极表面具有热活化延迟荧光聚合物的修饰层。本发明的检测方法能够实现L‑半胱氨酸含量的快速高灵敏检测。

Description

一种电化学发光检测L-半胱氨酸的方法
技术领域
本发明属于电化学发光检测技术领域，尤其涉及一种电化学发光检测L-半胱氨酸的方法。
背景技术
L-半胱氨酸(L-Cysteine，L-cys)是一种重要的α-氨基酸，作为细胞内氧化还原的缓冲物质，L-半胱氨酸对维持重要的代谢功能和解毒过程至关重要，异常水平的L-半胱氨酸可导致生长迟缓、神经毒性、阿尔茨海默病和心血管疾病等。到目前为止，已经设计了多种检测L-半胱氨酸的策略，包括质谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法和荧光法等，然而这些方法都存在诸多缺点，如操作繁琐，检测时间长，灵敏度较低等。因此，开发一种操作简单、灵敏度高的L-半胱氨酸痕量检测方法具有重要意义。
电化学发光(Electrochemiluminescence或Electrogeneratedchemiluminescence，简称为ECL)是指通过电激发ECL活性物质，使其在工作电极表面发生电化学氧化还原反应，从而产生自由基离子，随后自由基离子间通过高能电子转移反应产生激发态，跃迁回基态时以光的形式辐射出能量的过程。电化学发光技术是一种结合了电化学方法和化学发光方法的分析技术，具有线性范围宽，灵敏度高，重现性好，操作简单，更易控制等优点。经过近60年的研发，当前ECL理论和技术逐渐被建立起来，成为一种强有力的现代分析传感和检测手段，用于免疫分析、离子分析、核酸检测、水质检测等领域。与化学发光相比，电化学发光通过结合电化学调制手段，获得的背景信号更低、信息更丰富，在获取高灵敏度、高信噪比、特异性识别等方面，具有显著的技术优势。
与液相ECL检测体系相比，基于工作电极表面修饰的固态ECL检测，不依赖于溶剂，结构更简单、更便捷和易实现小型化。此外，基于高效发光材料体系在电极上的稳定固载，ECL发光效率更高，且更稳定。因此，固态ECL检测成为目前ECL应用研究的重点研究领域，备受关注。从发光体系而言，应用于固态ECL的材料体系主要包括有机金属配合物的无机体系、半导体纳米材料体系和有机高分子体系三大类。其中，有机高分子体系以富碳的芳烃为骨架，具有不含贵金属单元，光电性质易调节，易于功能化修饰，成膜性好，廉价低毒等优点，是最早开始进行电化学发光研究的一类材料。目前用于固态ECL研究的有机高分子材料主要包括PPV系列(Chem.Phys.Lett.1994,226,115-120；J.Phys.Chem.B 2006,110,15719-15723.)、P3HT(J.Appl.Phys.1997,82,1847-1852.)、F8BT(J.Am.Chem.Soc.2008,130,8906-8907)，以及近期发展的含噻咯的聚合物点(Anal.Chem.2016,88,845-850)、具有聚集诱导荧光增强效应的D-A型共轭聚合物纳米点(J.Phys.Chem.Lett.2018,9,5296-5302)等材料。相关文献不仅研究了这类材料的电化学和ECL基本行为，还成功开展了它们在生物传感方面的应用研究(Chem.Sci.2019,10,6815-6820)。然而，需要看到，以上报道过的有机高分子固态ECL检测体系均属于传统的荧光体系。根据自旋量子统计理论，在电激发条件下，单重态和三重态上激子的生成比率大约为25％:75％，而传统荧光有机化合物的三重态激子往往是禁阻跃迁的。因此无论是湮灭ECL途径，还是共反应剂ECL途径，在这些发光材料上复合产生的三重态激子均无法得到利用，其ECL效率水平和应用受到理论和实际上的限制。
热活化延迟荧光有机发光材料(Thermally Activated Delayed Fluorescence，TADF)是新一代有机光电材料，当前已广泛应用于有机电致发光二极管领域(Nature 2012,492,234-238)。该类材料最低激发单重态(S1)和最低激发三重态(T1)之间的能级差(ΔEST)十分接近的情形(与环境中热能相相近，通常不大于0.3eV)。通过环境的热活化，这类发光物质中的T1三重态激子将发生反向系间窜越(reverse intersystem crossing，RISC)过程，进而返回到最低激发单重态S1，最后跃迁回基态S0实现辐射出光，进而实现所有单重态和三重态激子的辐射利用。Imato与他的团队首次研究了四种TADF有机化合物的ECL性质，发现其具有非常高的ECL效率，证实了三重态到单重态的自旋上转换可以有效提高ECL效率(Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,6993-6996))。但是他们测的是溶液态的电化学发光，TADF有机化合物作为ECL固态探针的传感应用还未能实现。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种电化学发光检测L-半胱氨酸的方法，实现L-半胱氨酸含量的快速高灵敏检测。
本发明的上述目的是通过以下方案实现的：
一种电化学发光检测L-半胱氨酸的方法，采用固态电化学发光传感器对L-半胱氨酸进行检测；
所述固态电化学发光传感器包括电极，所述电极表面具有热活化延迟荧光聚合物的修饰层；所述热活化延迟荧光聚合物选自选自式(I)所示的侧链含三嗪基团的共轭聚合物：
Figure BDA0002699342510000031
其中，R1、R3独立选自C1～C30的烷基、C1～C30的烷氧基、C6～C35的未取代芳基或C6～C35的取代芳基；
R2选自C1～C30的烷基、C1～C30的烷氧基、C6～C35的未取代芳基、C6～C35的未取代酚基、C6～C35的取代芳基或C6～C35的取代酚基；
0.01≤x≤0.25；
n为2～200间的整数。
优选的地，所述热活化延迟荧光聚合物的结构如下所示：
Figure BDA0002699342510000041
其中，n为2～200间的整数。
更具体地，一种电化学发光检测L-半胱氨酸的方法，包括如下步骤：
(1)以固态电化学发光传感器为工作电极，利用三电极体系检测系列不同浓度的L-半胱氨酸溶液的电化学发光强度，获得电化学发光强度与L-半胱氨酸浓度的关系曲线；
(2)以相同的固态电化学发光传感器为工作电极，检测待测L-半胱氨酸样品的电化学发光强度，根据所述关系曲线计算得到待测L-半胱氨酸样品的含量。
本发明固态电化学发光传感器中的热活化延迟荧光聚合物在电激发下发生电化学氧化还原反应，产生阳离子自由基和阴离子自由基(R·+和R·-)，自由基离子间碰撞发生高能电子转移反应，产生激发态分子。分子的激发态分为单重态激子和三重态激子，由于热活化延迟荧光聚合物的单重态与三重态之间的能级非常小，可以通过环境的热激活使三重态激子反系间窜越到单重态上，再跃迁回基态发光。在电化学氧化还原过程中，L-半胱氨酸中的胺基与硫醇基团参与反应使得生成更多自由基离子，导致发光增强，且发光强度与L-半胱氨酸浓度(含量)具有相关性，因此可以实现L-半胱氨酸的快速高灵敏检测。
所述L-半胱氨酸溶液中含有电化学发光共反应剂。引入电化学发光共反应剂可以大大地提高发光基团的发光效率和固态电化学发光传感器的灵敏度。所述共反应剂选自本领域常用的“氧化-还原性”型共反应剂，所述“氧化-还原性”型共反应剂选自胺类，如三丙胺(TPrA)。胺类是电化学发光里常用的共反应剂，可以被电化学氧化生成强还原性中间体，再与热活化延迟荧光聚合物氧化后的发光物质(阳离子自由基)进行电子转移反应，生成热活化延迟荧光聚合物的激发态，激发态跃迁回基态时辐射出光。当所述“氧化-还原性”型共反应剂采用TPrA时，通过电化学氧化，TADF聚合物失去电子生成自由基阳离子，TPrA失去电子生成一个短寿命的自由基(TPrAH·+)，并失去α-C上的一个质子形成强还原性中间体(TPrA*)，该还原性中间体与氧化后的TADF高分子自由基发生反应，生成TADF材料的激发态分子，并跃迁回基态发光，在加入L-半胱氨酸以后，在氧化过程中，半胱氨酸的胺基与硫醇基团参与反应使得生成更多自由基离子，导致发光增强。
所述L-半胱氨酸溶液中含有支持电解质。在L-半胱氨酸溶液加入支持电解质可以提高电化学检测池中溶液的导电率，而支持电解质本身不参与电化学反应。所述支持电解质采用本领域常用的支持电解质，四丁基高氯酸铵。
所述固态电化学发光传感器中，所述电极采用本领域通用的工作电极，如玻碳电极(GCE)、石墨电极、ITO电极和贵金属电极。
所述固态电化学发光传感器的制备方法包括如下步骤：将热活化延迟荧光聚合物的溶液涂覆到电极表面，干燥后在电极表面形成热活化延迟荧光聚合物的修饰层，得到固态电化学发光传感器。
在一个实施例中，固态电化学发光传感器的制备方法包括以下步骤：
a、配置0.1mg/mL PCzAPT10-氯苯的储备溶液：称量0.010g TADF聚合物PCzAPT10溶在10mL氯苯中，超声分散30分钟至完全溶解，得到1mg/mL的母液，吸取1mL母液加入氯苯稀释至10mL，得到0.1mg/mL PCzAPT10氯苯储备溶液，避光保存；
b、玻碳电极预处理：用0.3μm和0.05μm氧化铝粉末依次打磨玻碳电极表面，再依次用超纯水，乙醇，超纯水进行超声清洗，氮气吹干电极表面；
c、将20μL PCzAPT10氯苯储备溶液涂覆于处理好的玻碳电极表面，37℃下真空干燥成膜，得到PCzAPT10修饰的固态电化学发光传感器。
所述涂覆方法采用本领域常见的涂覆方法，如滴涂、旋涂、刮涂等方法，能够使热活化延迟荧光聚合物成膜即可，对此不做限制。也可以采用纳米包覆的方法对热活化延迟荧光聚合物予以前处理，然后采用滴涂、旋涂、刮涂等方法在电极表面予以成膜制备。
用于配制热活化延迟荧光聚合物的溶液的溶剂采用通用的有机溶剂，只要能够有效溶解热活化延迟荧光聚合物并不与热活化延迟荧光聚合物发生反应即可，例如氯苯等，对此不做限定。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明中所使用的热活化延迟荧光聚合物具有高效且稳定的ECL性能，可提高传感器信号的输出，基于该热活化延迟荧光有机发光分子电化学发光法检测L-半胱氨酸最低检测限可达到0.25nM，且操作简便，实现了L-半胱氨酸的快速高灵敏检测。
附图说明
图1为基于热活化延迟荧光材料电化学发光的发光原理示意图。
图2为以三丙胺为共反应剂检测L-半胱氨酸的电化学发光原理示意图。
图3为实施例1中的PCzAPT10修饰电极的荧光寿命曲线。
图4为实施例1中的湮灭式固态ECL的电化学发光反应测试所得的信号曲线。
图5为实施例1中的“氧化-还原性”型共反应剂固态ECL的电化学发光反应测试所得的信号曲线。
图6为实施例1中的“氧化-还原性”型共反应剂固态ECL的在1.5V正电压下的电化学发光光谱。
图7为实施例1中的“还原-氧化性”型共反应剂固态ECL的电化学发光反应测试所得的信号曲线。
图8为加入不同浓度L-半胱氨酸溶液的电化学发光曲线。
图9为电化学发光反应的稳定性测试所得到的曲线。
图10为电化学发光强度随L-半胱氨酸浓度的线性回归方程曲线图。
图4、5和7中，裸工作电极即裸电极，高分子修饰电极表示PCzAPT10修饰电极。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进行详细说明。应该理解本发明不局限于以下所述的实施方式，下述实施方式仅仅作为本发明的说明性实施方案。
实施例1
本实施例提供一种电化学发光检测L-半胱氨酸的方法，采用三电极工作体系，以固态电化学发光传感器为工作电极，银丝电极为参比电极，铂丝电极为对电极，在支持电解质和共反应剂作用下采集系列不同浓度的L-半胱氨酸标准溶液的电化学发光强度，获得电化学发光强度与L-半胱氨酸浓度的关系曲线，从而可对待测L-半胱氨酸样品进行检测。
具体包括如下步骤：
一、制备固态电化学发光传感器
本实施例的固态电化学发光传感器包括玻碳电极，所述玻碳电极表面具有热活化延迟荧光聚合物的修饰层。所述热活化延迟荧光聚合物为：聚-3,6-咔唑-9,9-二己基-10-(4-(4,6-二叔丁基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基)-9,10-二氢吖啶(poly-3,6-carbazole-9,9-dihexal-10-(4-(4,6-di-tert-butyl-1,3,5-triazin-2-yl)phenyl)-9,10-dihydroacridine,简称PCzAPT)，其中APT单元(9,9-dihexal-10-(4-(4,6-di-tert-butyl-1,3,5-triazin-2-yl)phenyl)-9,10-dihydroacridine)摩尔比为10，因此简称PCzAPT10。该材料是一种不含任何金属元素，材料廉价易得、且毒性低，化学稳定性好的TADF有机高分子材料，成膜型好。配置成溶液后，可以通过刮涂，滴涂、旋涂等方式成膜。到目前为止，没有人研究过PCzAPT10高分子的电化学发光性质。该材料合成已有文献和专利报道(Adv.Opt.Mater.2018,6,1701320；ZL201710115395.3.)，可以参照相应文献和专利予以合成制备。
PCzAPT10的化学结构式如下所示：
Figure BDA0002699342510000071
n为2～200。
固态电化学发光传感器的制备方法包括如下步骤：
(1)储备溶液的配置：称量0.010g PCzAPT10溶在10mL氯苯中，超声分散30min至完全溶解，得到1mg/mL的母液。吸取1mL母液加入氯苯稀释至10mL，得到0.1mg/mL PCzAPT10氯苯储备溶液，避光保存。
(2)玻碳电极预处理：用0.3μm和0.05μm氧化铝粉末打磨玻碳电极，再依次用超纯水、乙醇、超纯水进行超声清洗，氮气吹干电极表面。
(3)PCzAPT10修饰工作电极的制备：通过移液枪每次移5μL PCzAPT10氯苯储备溶液滴于处理好的玻碳电极表面，总共滴加20μL，37℃下真空干燥30min成膜，得到PCzAPT10修饰电极，作为固态电化学发光传感器。
以下以固态电化学发光传感器作为工作电极，组建成湮灭式固态ECL器件、“氧化-还原性”型共反应剂固态ECL器件或“还原-氧化性”型共反应剂固态ECL器件对其进行电化学发光性能测试。
1)湮灭式固态ECL器件：
采用三电极工作体系，PCzAPT10修饰电极为工作电极，银丝电极为参比电极，铂丝电极为对电极，四丁基高氯酸铵(TBAP)为支持电解质，将三电极体系浸入含有0.1M TBAP的乙腈溶液中，在氮气气氛下用MPI-EII型电化学发光分析仪检测其电化学发光性能，初始电压设置为0V，低电压设置为-1.6V，高电压设置为1.4V，扫速为0.1V/s。
图3为PCzAPT10修饰电极的荧光寿命曲线，可以看到，该材料体现典型的热活化延迟荧光特性，除了纳秒级的短寿命区间之外，还存在微妙级的长寿命特征。
图4为PCzAPT10修饰电极的ECL信号曲线，作为比较同时还在相同条件下测试了以裸电极作为工作电极时的ECL信号。如图所示，裸电极没有ECL信号出现，而经PCzAPT10高分子修饰以后，从-1.1V的负向电压开始，出现明显的ECL信号。
2)“氧化-还原性”型共反应剂固态ECL器件：
采用三电极工作体系，PCzAPT10修饰电极为工作电极，银丝电极为参比电极，铂丝电极为对电极，四丁基高氯酸铵(TBAP)为支持电解质，使用三丙胺(TPrA)作为“氧化-还原性”型共反应剂，将三电极体系浸入含有0.1M TBAP和40mM三丙胺的乙腈溶液中，初始电压以及低电压设置为0V，高电压设置为1.7V，扫速为0.1V/s，检测其ECL信号。作为比较，同时还在相同条件下测试了以裸电极作为工作电极时的ECL信号。
图5为本实施例中“氧化-还原性”型共反应剂固态ECL电化学发光反应测试所得的信号曲线，测试结果反映工作电极修饰了PCzAPT10高分子后，自1.2V正电位开始，ECL逐渐出现，并在1.6V左右达到峰值。为此基于热活化延迟荧光材料的“氧化-还原性”型共反应剂固态ECL得以实施。
图6所示为该“氧化-还原性”型共反应剂固态ECL在1.5V电位测试时的ECL发光光谱，其峰位波长位于587nm处，为PCzAPT10的发光，而非测试环境中其他物质的发光。
3)“还原-氧化性”型共反应剂固态ECL器件：
采用三电极工作体系，PCzAPT10修饰电极为工作电极，银丝电极为参比电极，铂丝电极为对电极，四丁基高氯酸铵(TBAP)为支持电解质，使用过硫酸钾(K2S2O8)作为“还原-氧化性”型共反应剂，将三电极体系浸入含有0.1M TBAP和10mM过硫酸盐的乙腈溶液中，初始电压以及高电压设置为0V，低电压设置为-1.6V，扫速为0.1V/s，在氮气气氛下检测其电化学发光强度。作为比较，同时还在相同条件下测试了以裸电极作为工作电极时的ECL信号。
图7所示为PCzAPT10高分子的“还原-氧化性”型共反应剂固态ECL测试所得的信号曲线。如图所示，裸电极仅在电位超过-1.3V以后有微弱的ECL信号。对于PCzAPT10高分子修饰后的工作电极，在电位超过-1.3V后，出现明显增强的ECL信号。为此基于热活化延迟荧光材料的“还原-氧化性”型共反应剂固态ECL，得以实施。
二、获取电化学发光强度与L-半胱氨酸浓度的关系曲线
(1)L-半胱氨酸标准溶液的配置：准确称量L-半胱氨酸粉末溶在超纯水中，配置成浓度为10-4M溶液，再移取0.1mL的10-4M溶液，稀释成10mL，得到10-6M溶液，移取不同体积量的10-6M溶液，加入超纯水稀释为不同浓度的L-半胱氨酸溶液(1nM，3nM，5nM，8nM，10nM，30nM，50nM)。
(2)L-半胱氨酸的电化学发光测试：将含有TBAP的乙腈和水按7:3的体积比进行混合，并加入三丙胺，最终得到含有1M的TBAP和40mM的三丙胺的乙腈:水混合溶液。采用三电极工作体系，PCzAPT10修饰电极为工作电极，银丝电极为参比电极，铂丝电极为对电极，将三电极体系浸入到4mL乙腈:水混合溶液中，加入30μL不同浓度的L-半胱氨酸标准溶液，利用电化学发光法通过循环伏安电化学方式检测电化学发光强度，扫描电位范围为0～1.5V，扫描速率为0.1V/s。
不同浓度下的电化学发光强度如图8所示，图中a→h表示浓度依次为a、b、c、d、e、f、g、h；其中，a：0nM；b：1nM；c：3nM；d：5nM；e：8nM；f：10nM；g：30nM；h：50nM。从图8可以看出，电化学发光强度随着L-半胱氨酸浓度升高而增强。
对浓度为8×10-9M的L-半胱氨酸标准溶液进行循环测试，经过32圈扫描循环后，其发光强度基本保持稳定，相对标准偏差(RSD)为1.20％，如图9所示，说明该传感器具有优异的稳定性和高灵敏度。
(3)建立关系：以加入的L-半胱氨酸浓度c的log值为横坐标，电化学发光强度为纵坐标建立标准线性回归曲线，如附图10所示，其线性回归方程为：I＝3314.3log c+34426.5(相关系数R2＝0.9967)；L-半胱氨酸的最低检测限可达0.25nM(信噪比3:1)。
三、检测待测L-半胱氨酸样品的含量
采用三电极工作体系，PCzAPT10修饰电极为工作电极，银丝电极为参比电极，铂丝电极为对电极，将三电极体系浸入到4mL乙腈:水混合溶液(含有1M的TBAP和40mM的三丙胺)中，加入待测L-半胱氨酸样品，3×10-8M。利用电化学发光法通过循环伏安电化学方式检测电化学发光强度，扫描电位范围为0～1.5V，扫描速率为0.1V/s。
根据所得电化学发光强度和步骤二的标准线性回归曲线即可计算得到待测L-半胱氨酸样品的含量。两次检测结果分别为2.92×10-8M，3.03×10-8M，平均值为2.98×10-8M，标准偏差为5.5％。

Claims (10)

1.一种电化学发光检测L-半胱氨酸的方法，其特征在于：采用固态电化学发光传感器对L-半胱氨酸进行检测；
所述固态电化学发光传感器包括电极，所述电极表面具有热活化延迟荧光聚合物的修饰层；所述热活化延迟荧光聚合物选自式(I)所示的侧链含三嗪基团的共轭聚合物：
Figure FDA0002699342500000011
其中，R1、R3独立选自C1～C30的烷基、C1～C30的烷氧基、C6～C35的未取代芳基或C6～C35的取代芳基；
R2选自C1～C30的烷基、C1～C30的烷氧基、C6～C35的未取代芳基、C6～C35的未取代酚基、C6～C35的取代芳基或C6～C35的取代酚基；
0.01≤x≤0.25；
n为2～200间的整数。
2.根据权利要求1所述电化学发光检测L-半胱氨酸的方法，其特征在于：所述热活化延迟荧光聚合物的结构如下所示：
Figure FDA0002699342500000021
其中，n为2～200间的整数。
3.根据权利要求1或2所述电化学发光检测L-半胱氨酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)以固态电化学发光传感器为工作电极，通过三电极体系检测系列不同浓度的L-半胱氨酸溶液的电化学发光强度，获得电化学发光强度与L-半胱氨酸浓度的关系曲线；
(2)以相同的固态电化学发光传感器为工作电极，检测待测L-半胱氨酸样品的电化学发光强度，根据所述关系曲线计算得到待测L-半胱氨酸样品的含量。
4.根据权利要求3所述电化学发光检测L-半胱氨酸的方法，其特征在于：所述L-半胱氨酸溶液中含有电化学发光共反应剂。
5.根据权利要求4所述电化学发光检测L-半胱氨酸的方法，其特征在于：所述电化学发光共反应剂选自胺类。
6.根据权利要求5所述电化学发光检测L-半胱氨酸的方法，其特征在于：所述胺类选自三丙胺。
7.根据权利要求3所述电化学发光检测L-半胱氨酸的方法，其特征在于：所述L-半胱氨酸溶液中含有支持电解质。
8.根据权利要求7所述电化学发光检测L-半胱氨酸的方法，其特征在于：所述支持电解质选自无机盐和/或四丁基高氯酸铵。
9.根据权利要求1或2所述电化学发光检测L-半胱氨酸的方法，其特征在于：所述固态电化学发光传感器中，所述电极选自玻碳电极、石墨电极、ITO电极和贵金属电极中的任意一种。
10.根据权利要求1或2所述电化学发光检测L-半胱氨酸的方法，其特征在于：所述固态电化学发光传感器的制备方法包括如下步骤：将热活化延迟荧光聚合物的溶液涂覆到电极表面，干燥后在电极表面形成热活化延迟荧光聚合物的修饰层，得到固态电化学发光传感器。
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