CN112107692A - 一种层状双氢氧化物材料体系及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种层状双氢氧化物材料体系及其制备方法和应用，具体涉及NT‑LDH/EDTA层状双氢氧化物材料和NT‑LDH层状双氢氧化物材料，所述NT‑LDH/EDTA层状双氢氧化物材料包括：负载乙二胺四乙酸的锌铝层状双氢氧化物、以及修饰在锌铝层状双氢氧化物的表面的神经降压素抗体NT。

Description

一种层状双氢氧化物材料体系及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种层状双氢氧化物材料体系及其制备方法和应用，具体涉及一种NT-LDH层状双氢氧化物材料和NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料及其制备方法和应用，尤其涉及一种表面靶向改性负载乙二胺四乙酸(EDTA)的锌铝层状双氢氧化合物(LDH)材料体系及其制备方法和利用表面靶向改性后的材料体系在制备治疗膀胱癌药物中的应用，属于医用生物纳米材料技术领域。
背景技术
膀胱癌是世界范围内最常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤之一，其本病发病率在恶性肿瘤中位居第12位，并且近年来呈逐渐升高趋势。在临床中，首次诊断的膀胱癌患者75％～85％都为非肌肉浸润性膀胱癌(NMIBC)，针对其常见的治疗方法主要是经尿道膀胱肿瘤局部切除手术，依据病理分型术后立即进行不同膀胱内化疗药物灌注。但其治疗效果仍存在一定的问题，首先膀胱癌的切除手术是非常危险的，尤其是对于大多数老年患者，并且膀胱癌难以完全切除，术后具有较高的复发率。研究表明一年内术后15％～61％的非肌肉浸润性膀胱癌病患出现复发，甚至五年内复发可能性高达31％～78％且有些患者病情会加快恶化为浸润性或转移性膀胱癌。更为重要的是，术后灌注化疗药物的临床效果也不理想。因膀胱内尿液的产生和排泄会稀释灌注的化疗药物并使其滞留时间较短。此外，灌注的化疗对肿瘤组织无黏附性，无靶向性和低渗透性。这些就导致需要大量多次的药物灌注，从而容易引起耐药性且带来较高毒副作用减少生命质量。因此，开发一种更温和、安全、有前景的治疗策略的需求变得更加紧迫。
发明内容
针对现有技术存在的不足和需求，本发明的目的在于提供一种可负载并释放EDTA、且表面链接靶向膀胱癌抗体(神经降压素NT)的锌铝层状双氢氧化物LDH，并安全有效地开发应用于膀胱癌无创治疗药物的制备中。
第一方面，本发明提供了一种NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料，包括：负载乙二胺四乙酸的锌铝层状双氢氧化物以及修饰在所述锌铝层状双氢氧化物的表面的神经降压素抗体NT。
本发明人基于利用破坏细胞连接导致膀胱肿瘤细胞从组织剥落下来并随着尿液排泄出体外达到安全温和的治疗效果的出发点，考虑到细胞连接主要有紧密连接，黏着连接和桥粒半桥粒结构。在这些连接中表达的一些关键蛋白是钙离子依赖型的，例如典型的粘着连接的E-cadherin，桥粒结构的桥粒芯蛋白和桥粒胶蛋白，其构象只有在钙离子存在时才能稳定。EDTA作为一种经典的金属离子螯合剂，可以螯合钙离子，破坏钙依赖蛋白的表达，相关研究中被用于非酶法温和地破坏细胞间的连接使从组织中分离细胞。然而，由于游离的EDTA与化疗药物存在类似的缺点，针对膀胱癌灌注治疗也不会达到满意的效果。尤其是游离EDTA小分子如果不是被迅速随着尿液排出体外，就很可能进入到细胞内，而不是滞留在细胞膜上螯合钙离子。因此，为了克服这些缺点，有必要设计并制备EDTA的负载传递材料体系；
而且，LDH是一类由表面带正电荷的阴离子型层状双羟基金属氧化物，由于LDH具有很强的阴离子交换能力，可以吸附溶液中的许多无机和有机离子，因此被广泛应用于各个工业领域。此外，LDH具有良好的生物相容性、低毒性等特性，在生物医学领域应用中提供了安全保障。LDH具有高的层间载药能力和对pH响应的药物释放性能。而且LDH的表面悬浮的羟基可以与特定的靶向抗体分子键合，可以识别细胞表面的抗原快速到底病灶区域并减少对正常组织的影响。因此，LDH可作为一种很多功能给药体系具有广泛的应用前景。在此次研究中，本发明人确定了选择LDH作为材料载体；
基于上述内容，本发明人首次以负载乙二胺四乙酸的锌铝层状双氢氧化物为主体，再通过表面氨基化修饰以实现与神经降压素抗体NT的连接，得到NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料。由于该材料体系的大尺寸无法进入细胞，并持续吸附在细胞膜表面，在肿瘤偏酸的微环境中释放EDTA来螯合钙离子，抑制钙离子依赖的相关蛋白表达，从而破坏细胞连接使贴壁细胞呈时间相关性的大量脱落。并且最重要的是，这些脱落的分散细胞依旧被该材料体系紧紧包裹，抑制其着壁转移的能力。
较佳的，以锌铝层状双氢氧化物的质量为100wt％，所述乙二胺四乙酸的含量为≥25wt％，优选为25wt％～40wt％。具体含义为，乙二胺四乙酸负载质量为锌铝层状双氢氧化物质量的25wt％～40wt％之间。
较佳的，以锌铝层状双氢氧化物的质量为100wt％，所述神经降压素抗体NT的含量为3～7wt％，例如3.9wt％。具体含义为，神经降压素抗体NT的负载质量为锌铝层状双氢氧化物质量的3～7wt％。
较佳的，所述锌铝层状双氢氧化物中Zn和Al的摩尔比为2～3：1，例如2：1。
较佳的，所述NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料的颗粒尺寸为700～900nm。
较佳的，所述表面氨基化修饰包括：利用硅烷的Si-OH与负载乙二胺四乙酸的锌铝层状双氢氧化物中锌铝层状双氢氧化物表面的羟基水解，在表面形成悬浮的氨基；所述硅烷选自3-氨丙基三乙氧基硅烷APTES。
较佳的，所述负载乙二胺四乙酸的锌铝层状双氢氧化物中乙二胺四乙酸通过阴离子交换插层入锌铝层状双氢氧化物的层间。
第二方面，本发明还提供了一种如上述的NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料的制备方法，包括：
(1)将负载乙二胺四乙酸的锌铝层状双氢氧化物溶液在70～90℃(例如78℃)下搅拌并在保护气氛中进行回流，加入硅烷溶液后，反应3～10小时(例如4小时)，再经过滤、洗涤和干燥，得到NH2-LDH/EDTA；
(2)将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺加入到神经降压素抗体NT水溶液中并混合，然后加入NH2-LDH/EDTA并在室温(25～35℃)下反应12～24小时(例如12小时)，再经过滤、洗涤和干燥，得到所述NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料。
较佳的，所述负载乙二胺四乙酸的锌铝层状双氢氧化物和硅烷的比为1mg:20μL～1mg:30μL。
较佳的，所述神经降压素抗体NT和NH2-LDH/EDTA的质量比为2:5～4:5，例如2:5。
较佳的，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺和神经降压素抗体NT的质量比为0.153g：0.230g：20mg～0.306g:0.460g:20mg，例如0.153g：0.230g：20mg。
较佳的，所述负载乙二胺四乙酸的锌铝层状双氢氧化物的制备方法包括：
(1)将锌源、铝源、阴离子源和环六亚甲基四胺溶于水中，得到混合溶液；所述阴离子源为硝酸钠、氯化钠和磷酸钠中的至少一种；
(2)将所得混合溶液在100～140℃(例如120℃)下搅拌并在保护气氛中进行冷水回流1～4小时(例如2小时)，再加入Na2H2EDTA溶液反应，在70～100℃(例如80℃)下继续反应20～23小时(例如22h)。再经过滤、清洗和干燥，得到负载乙二胺四乙酸的锌铝层状双氢氧化物。以上所述合成反应中，均需要在氩气保护气氛下进行，避免空气中二氧化碳进入体系中，形成碳酸根离子插入LDH层间并难以置换出。在高温条件下，六亚甲基四胺水解释放出氨气，使溶液呈碱性，供LDH成核生长。
又，较佳的，所述锌源选自硝酸锌和氯化锌中的至少一种；所述铝源选自硝酸铝、和氯化铝中的至少一种；所述锌源和铝源的摩尔比为2～3：1，例如2:1。
又，较佳的，所述锌源和阴离子源(例如，硝酸钠)的质量比为594～891：85～170，例如594:85；所述锌源和环六亚甲基四胺的质量比为99～198：117～234，例如99:117。
又，较佳的，所述Na2H2EDTA和锌源的质量比为0.6～1.2g：0.594～0.891g，例如1.2g：0.594g。
第三方面，本发明提供了一种使用上述的NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料在制备抗肿瘤药物中的应用。在尿液或肿瘤偏酸的微环境中，NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料释放EDTA来螯合钙离子，抑制钙离子依赖的相应蛋白表达，从而破坏肿瘤细胞连接，以使贴壁肿瘤细胞呈时间相关性的脱落；而且，脱落的分散肿瘤细胞被NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料紧密包裹，以抑制其着壁转移的能力。
NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料较佳的，所述肿瘤包括结肠癌和膀胱癌。
较佳的，以作为治疗膀胱癌的药物作为示例，其作业过程可包括：
(1)利用膀胱灌注方法将NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料引入到膀胱之中；
(2)所述NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料快速识别肿瘤区域并靶向富集在肿瘤细胞膜外，开始破坏细胞的连接，促使肿瘤细胞从肿瘤组织中层层剥落；
(3)所述NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料紧密包裹着层层剥落得到的游离的肿瘤细胞，使其无法通过附近淋巴结进行肌理层或远端转移，并随着尿液周期性的生成和排泄带出体外。
第五方面，本发明提供了一种NT-LDH层状双氢氧化物材料，包括：锌铝层状双氢氧化物以及修饰在所述锌铝层状双氢氧化物的表面的神经降压素抗体NT。由于在膀胱癌和结直肠癌中，肿瘤细胞膜表面过表达NTS1受体，可以与NT特异性结合，本发明中所得NT-LDH层状双氢氧化物材料中，选用LDH作为主体，NT表面修饰后可使得材料具有特定靶向功能。
较佳的，以所述锌铝层状双氢氧化物的质量为100wt％，所述神经降压素抗体NT的含量为3～7wt％，例如3.9wt％。
较佳的，所述锌铝层状双氢氧化物中Zn和Al的摩尔比为2～3：1，优选为2:1。
较佳的，所述NT-LDH层状双氢氧化物材料的颗粒尺寸为700-900nm。
第六方面，本发明提供了一种上述的NT-LDH层状双氢氧化物材料的制备方法，包括：
(1)将锌铝层状双氢氧化物溶液在70～90℃(78℃)下搅拌并在保护气氛中进行冷水回流，加入硅烷溶液后，反应3～10小时(4小时)，再经过滤、洗涤和干燥，得到NH2-LDH；
(2)将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺加入到神经降压素抗体NT水溶液中并混合，然后加入NH2-LDH并在室温(25～35℃)下反应12～24小时(12小时)，再经过滤、洗涤和干燥，得到所述NT-LDH层状双氢氧化物材料。
较佳的，所述锌铝层状双氢氧化物和硅烷的比为1mg：20～30μL，优选为50mg：100μL。
较佳的，所述神经降压素抗体NT和NH2/LDH的质量比为2～4：5，优选为2:5。
较佳的，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺和神经降压素抗体NT的质量比为0.153g：0.230g：20mg～0.306g:0.460:20mg，例如0.153g：0.230g：20mg。
有益效果：
本发明提供了一种简单、易行、无创和高效的治疗膀胱癌的新策略。即通过破坏细胞连接，使肿瘤细胞从癌变组织中剥落，并最终随尿液排出体外；
本发明中提供了一种全新的NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料，该材料体系能够高效靶向肿瘤区域，并粘附在肿瘤细胞膜上，随后释放的EDTA獒合细胞间的钙离子，抑制钙离子依赖型的蛋白表达从而破坏细胞连接。此外，该材料体系仍紧紧包围在脱落的细胞表面，避免其发生转移。同时，该材料体系的较为理想的治疗效果。结果也显示NT-LDH/EDTA对正常组织的影响小，全身毒性低，这也为其进一步的临床探究提供了保证。总而言之，本发明提供了一种治疗膀胱癌方便、高效、安全的创新方法，对其他消化道肿瘤如结肠癌的治疗也有一定的借鉴意义；
在本发明中，NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料在保证了较好的细胞脱落效果时并未对细胞有明显的杀伤能力，为较好的生物安全性和较低的毒副作用提供了保障。
附图说明
图1为实施例1所制得的材料体系NT-LDH/EDTA分散于水中的透射电镜(TEM)照片；
图2为实施例1所制得的材料体系NT-LDH/EDTA扫描电镜(SEM)照片；
图3为实施例1所制得的材料体系LDH、LDH/EDTA、NH2-LDH/EDTA和NT-LDH/EDTA的XRD图谱；
图4为实施例1所制得的材料体系LDH、LDH/EDTA、NH2-LDH/EDTA和NT-LDH/EDTA的FI-IR图谱；
图5为实施例1所制得的材料体系NT-LDH/EDTA透射电镜元素mapping图；
图6为实施例1所制得的材料体系NT-LDH/EDTA透射电镜能谱(EDS)和通过ICP-OES测得元素比例；
图7为实施例1所制得的材料体系LDH/EDTA、NH2-LDH/EDTA和NT-LDH/EDTA的Zeta电位分析；
图8为实施例1所制得的材料体系NT-LDH/EDTA，在偏酸的PBS(pH 6.5)中EDTA的释放行为检测。
图9为实施例2所制得的无负载EDTA的材料体系NH2-LDH、NT-LDH针对膀胱癌细胞T24靶向粘附性评价的共聚焦照片；
图10中(a)未处理悬浮T24细胞SEM图，以及用实施例1所制得的材料体系NT-LDH/EDTA使膀胱癌细胞T24脱落，由上清液中脱落的细胞所得SEM图以及相应的(b)元素能谱mapping图，证明脱落的细胞表面依旧被材料包裹
图11为用实施例1所制得的材料体系NT-LDH/EDTA使膀胱癌细胞T24脱落，脱落的细胞比例柱状图；
图12为用实施例1所制得的材料体系NT-LDH/EDTA使结直肠癌细胞CT26脱落，脱落的细胞比例柱状图；
图13为用PBS、EDTA和实施例1所制得的材料体系NH2-LDH/EDTA、NT-LDH/EDTA针对原位膀胱癌SD大鼠膀胱灌注，超声成像检测治疗过程评价，其中黄色实线圈为肿瘤；
图14为用PBS、EDTA和实施例1所制得的材料体系NH2-LDH/EDTA、NT-LDH/EDTA针对原位膀胱癌SD大鼠膀胱灌注，治疗结束后膀胱组织(Opened Bladders)照片，其中蓝色虚线圈为肿瘤；
图15为用PBS和实施例1所制得的材料体系NT-LDH/EDTA针对原位膀胱癌SD大鼠膀胱灌注，治疗结束后，肾脏功能评价以及解剖图；
图16为健康SD大鼠膀胱灌注实施例1所制得的材料体系NT-LDH/EDTA(100mg/kg)后，心(Heart)、肝(Liver)、脾(Splee)、肺(Lung)、肾(Kidney)等各器官的组织切片图。
具体实施方式
以下通过下述实施方式进一步说明本发明，应理解，下述实施方式仅用于说明本发明，而非限制本发明。
在本领域中，发展方便、快捷、特异、无创的治疗膀胱癌新策略，构建一种能够靶向并粘附在肿瘤细胞表面且释放EDTA具有良好生物相容性的LDH材料体系是至关重要的。它可以聚集在膀胱癌区域并破坏细胞连接，使剥落的细胞被材料紧紧包裹阻断了细胞转移能力，并最终随尿液排出体外，具有重要意义和价值。
为此，本公开提供了一种可负载并释放EDTA且表面链接靶向膀胱癌抗体(神经降压素NT)的锌铝层状双氢氧化物LDH材料体系(或称NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料)，并开发应用于膀胱癌无创的安全有效治疗新方法。
在本发明中，NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料可进一步标记为NT-LDH/EDTA，其主要以层间插入乙二胺四乙酸(EDTA)的锌铝层状双氢氧化物(LDH)为主体，并在表面连接具有靶向膀胱癌功能的神经降压素(NT)抗体。以下示例性地说明NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料的制备方法。
在本发明中，主体中LDH材料组成选用对机体相对安全的锌铝离子。为了保证LDH持续粘附在肿瘤细胞表面从而破坏细胞连接，避免LDH被细胞摄取到细胞内发挥螯合作用，本发明制备了颗粒尺寸在0.8μm左右的LDH。实际上，所得NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料的颗粒尺寸也在0.8μm左右。
在可选的实施方式中，采用均相碱液法制备该主体。具体来说，将溶有锌源(锌金属盐)和铝源(铝金属盐)、六次亚甲基四胺(HMT)以及氯化钠的混合溶液置于120℃油浴锅中，于氩气保护气氛下回流油浴2小时后，再加入乙二胺四乙酸二钠盐置换层间阴离子，制备负载EDTA的LDH，标记为LDH/EDTA。其中，油浴锅的温度可为80℃，回流油浴的时间可为12小时。其中，EDTA通过阴离子交换大量地插入LDH层间，后续可在微酸的机体环境下(pH6.5)释放。
在可选的实施方式中，乙二胺四乙酸二钠盐和锌源的质量比可为1.2g：0.594g。锌源优选选自硝酸锌和氯化锌等。铝源优选选自硝酸铝和氯化铝等。其中，锌源和铝源的摩尔比可为2：1。硝酸钠和锌源的质量比可为594:85。环六亚甲基四胺和锌源的质量比可为99:117。
为了链接靶向分子，先对LDH/EDTA表面氨基化，所得产物标记为NH2-LDH/EDTA。具体来说，利用3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)硅烷中的Si-OH与LDH表面的羟基水解，以在主体表面获得悬浮的氨基。
作为一个示例，将负载乙二胺四乙酸的锌铝层状双氢氧化物溶液在78℃下搅拌并在保护气氛中进行冷水回流，加入硅烷溶液后，反应4小时，再经过滤、洗涤和干燥，得到NH2-LDH/EDTA。其中，负载乙二胺四乙酸的锌铝层状双氢氧化物和硅烷的比可为50mg：100μL。
氨基化的LDH表面利用肽键键合NT抗体，标记为NT-LDH/EDTA。具体来说，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺加入到神经降压素抗体NT水溶液中并混合使得氨基活化。再缓慢加入NH2-LDH/EDTA并在室温(25℃)下反应12小时，得到NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料，记为NT-LDH/EDTA。
在可选的实施方式中，神经降压素抗体NT和NH2-LDH/EDTA的质量比可为20mg：50mg。其中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺和神经降压素抗体NT的质量比可为0.153g：0.230g：20mg。
在本发明中，选用NT(QLYENKPRRPYIL)作为靶向抗体，用于靶向细胞膜上NT受体1(NTS1)，该受体在结肠癌、前列腺癌和膀胱癌等肿瘤细胞中过度表达。氨基化的LDH表面利用肽键键合NT抗体，一方面使NT-LDH/EDTA材料体系向癌变组织富集并靶向地粘附在肿瘤细胞表面，另一方面促使LDH表面由正电性转为负电性，减少对正常组织的吸附和影响。
以上所述LDH/EDTA、NH2-LDH/EDTA、NT-LDH/EDTA的合成反应中，均需要在氩气保护气氛下进行，避免空气中二氧化碳进入体系中，形成碳酸根离子插入LDH层间并难以置换出。
本发明中，所有LDH/EDTA、NH2-LDH/EDTA、NT-LDH/EDTA材料体系均制备完后用水过滤清洗三次，并冷干后粉末均保存在4℃冰箱内，后续现用现配置按浓度分散到细胞培养液或生理盐水中。其中，细胞培养液或生理盐水中NT-LDH/EDTA的添加浓度可为60mg/Kg。该材料体系NT-LDH/EDTA对机体的主要组织和血液指标无明显的急性或慢性的病理毒性和异常，具有较好的系统体内安全性。
本发明中，NT-LDH/EDTA材料体系由于大尺寸无法进入细胞并持续吸附在细胞膜表面，在尿液或肿瘤偏酸的微环境中释放EDTA来螯合钙离子，抑制钙离子依赖的相关蛋白表达，从而破坏细胞连接使贴壁细胞呈时间相关性的大量脱落。并且重要的是，这些脱落的分散细胞依旧被材料体系紧紧包裹，抑制其着壁转移的能力。
本发明中，NT-LDH层状双氢氧化物材料的制备过程与NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料基本一致，区别在于反应过程中是否加入乙二胺四乙酸二钠。本发明制备了颗粒尺寸在0.8μm左右的LDH。实际上，所得NT-LDH层状双氢氧化物材料体系的颗粒尺寸也在0.8μm左右。
下面进一步例举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
实施例1
负载EDTA的锌铝层状双氢氧化物(LDH/EDTA)的制备过程如下：称取一定量的Zn(NO3)2·6H2O(0.594g)、Al(NO3)3·9H2O(0.375g)、NaNO3(0.085g)和环六亚甲基四胺(HMT)(0.702g)溶于200mL的去离子水中，在高纯氩气氛保护下磁力搅拌20min排出空气，然后将该溶液移至120℃油浴锅中搅拌，在高纯氩作为保护气的条件下回流，2h后，缓慢加入Na2H2EDTA溶液(1.2mg溶于50mL去离子水中)，80℃继续反应22h，最后将沉淀物过滤收集并用去离子水充分清洗，得到LDH/EDTA。
LDH/EDTA表面氨基化修饰，得到NH2-LDH/EDTA。通过LDH表面悬浮的羟基与APTES中的硅羟基悬键水解键合，将其表面改性为悬浮的氨基。具体过程为将LDH/EDTA(50mg)分散于90mL去离子水中。将该溶液移至78℃油浴锅中搅拌，在高纯氩作为保护气的条件下回流，10ml乙醇溶液中加入100μL APTES，在缓慢加入上述溶液中。反应4h后，对混合物进行过滤并用去离子水和乙醇依次洗涤沉淀，得到NH2-LDH/EDTA。
NH2-LDH/EDTA表面链接神经降压素(NT)靶向抗体(NT-LDH/EDTA)。主要是NT通过酰胺作用与NH2-LDH/EDTA表面的氨基连接。具体过程包括：将NT(20mg)分散在20mL去离子水中，分别加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC,0.153g)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS 0.230g)，获得的混合溶液室温搅拌15min，从而激活NT多肽上的羧基。然后加入30mL NH2-LDH/EDTA(50mg)的水溶液。反应在室温搅拌下进行，并通入高纯氩作为保护器。12小时后，过滤收集NT-LDH/EDTA的沉淀后用去离子水充分清洗，并最终冷冻干燥，获得的粉末保存在4℃冰箱里，得到NT-LDH/EDTA。其中，NT-LDH/EDTA中，乙二胺四乙酸的负载质量大于锌铝层状双氢氧化物质量的25.8wt％，神经降压素的负载质量为锌铝层状双氢氧化物质量的3.9wt％。
实施例2
锌铝层状双氢氧化物(LDH)的制备过程如下：称取一定量的Zn(NO3)2·6H2O(0.594g)、Al(NO3)3·9H2O(0.375g)、NaNO3(0.085g)和环六亚甲基四胺(HMT)(0.702g)溶于200mL的去离子水中，在高纯氩气氛保护下磁力搅拌20min排出空气，然后将该溶液移至120℃油浴锅中搅拌，在高纯氩作为保护气的条件下冷水回流，2h后，温度改为80℃，继续反应22h.最后将沉淀物过滤收集并用去离子水充分清洗，得到LDH。本实施例2中表面氨基化修饰和与NT连接过程和实施例1中基本一致，区别在于：选用无负载EDTA的NT-LDH。其中，NT-LDH中神经降压素的负载质量为锌铝层状双氢氧化物质量的3.9wt％。
图1为实施例1所制得的材料体系NT-LDH/EDTA分散于水中的透射电镜(TEM)照片，由图1可见：所制得的材料形貌为二维片层状，分散均一，尺寸较大直径约0.8μm左右。图2为实施例1所制得的材料体系NT-LDH/EDTA扫描电镜(SEM)照片，由图2可见：所制得的材料形貌为明显层状结构，粒径均一约为0.8μm左右，通过断面图片可知单颗粒的厚度可达0.3μm左右。
图3为实施例1所制得的材料体系LDH、LDH/EDTA、NH2-LDH/EDTA和NT-LDH/EDTA的XRD图谱，由图3可见：LDH的平面(003)、(006)和(009)的基础衍射峰为具有层状结构的特征峰，但在有无EDTA插层的情况下其峰位置存在一定差异。与LDH相比，LDH/EDTA的特征峰向小角度偏移，因为EDTA具有较长的范德华对端长度导致层间距d003增大，证实了Na2H2EDTA成功通过阴离子交换反应插入到LDH的层间。另一方面，NH2-LDH/EDTA和NT-LDH/EDTA的衍射峰位置与LDH/EDTA基本保持一致，说明表面改性不会改变层状结构。
图4为实施例1所制得的材料体系LDH、LDH/EDTA、NH2-LDH/EDTA和NT-LDH/EDTA的FI-IR图谱，由图4可见：在LDH谱图中，3450cm-1和1620cm-1的宽吸收带是LDH中的氢键拉伸振动和水的弯曲振动。在1385cm-1处的锐吸收带是由LDH层间硝酸根离子的拉伸振动模式引起的。在LDH/EDTA谱中，1602cm-1和1390cm-1处的强吸收带是由于EDTA中COO基团的对称和反对称振动引起的，证明了EDTA成插入LDH中。在NH2-LDH/EDTA谱中，约1000-1200cm-1处的两个吸收带是由APTES的-O-Si振动引起的，这证明LDH/EDTA成功的表面氨基化。在NT-LDH/EDTA谱中，1265cm-1处出现了新的酰胺键，这表明NT分子与NH2-LDH/EDTA材料表面的氨基链接成功。
图5和图6为实施例1所制得的材料体系NT-LDH/EDTA透射电镜元素mapping图和相应的能谱EDS图以及ICP-OES元素定量分析，由此图可见：所制得的NT-LDH/EDTA材料体系的框架中，通过投射电镜对应的Zn、Al、O、Si元素点映射和线扫描，可以看到NT-LDH/EDTA表面均匀的Zn、Al、O、Si分布，说明锌铝LDH的成功制备，以及Si元素的存在也表面APTES成功地对LDH进行了表面改性。通过ICP-OES元素定量分析可得，NT-LDH/EDTA该材料中锌铝摩尔比为2:1。
图7为实施例1所制得的材料体系LDH/EDTA、NH2-LDH/EDTA和NT-LDH/EDTA的Zeta电位分析，由图7可见：LDH/EDTA和NH2-LDH/EDTA的表面带有正电性，NT-LDH/EDTA的表面转为负电性，也证明了NT成功的连接到材料体系的表面上；
图8为实施例1所制得的材料体系NT-LDH/EDTA，在偏酸的PBS(pH 6.5)中EDTA的释放行为检测。由图8可知，在一小时内EDTA释放较快，之后持续缓慢释放，16h内共释放了25.8wt％。通过释放曲线可知EDTA最终的负载量超过25.8wt％，但根据释放曲线大概可判断其负载量不会超过40wt％。
A、细胞应用效果实验
1、材料靶向性评价
1.1实验材料及仪器：实施例2所制得的无负载EDTA材料体系NH2-LDH和NT-LDH。罗丹明RITC染料，细胞核DAPI染料，细胞膜DIO染料。
1.2实验方法：将RITC与材料NH2-LDH和NT-LDH搅拌染色。膀胱癌细胞T24接种在共聚焦皿上，之后与浓度为200ppm连接RITC的NH2-LDH和NT-LDH分别共孵育30min，再进行细胞膜细胞核染色，在共聚焦(FluoView FV1000)60倍油镜下进行观察。
1.3实验结果：图9为实施例2所制得的无负载EDTA的材料体系NH2-LDH、NT-LDH针对膀胱癌细胞T24靶向粘附性评价的共聚焦照片。由图9可见，其中红色荧光是RITC染色的材料体系，绿色荧光是DIO染色的细胞膜，蓝色荧光为DAPI染色的细胞核。在相同的材料浓度处理下，同一孵育时间内，NT-LDH比NH2-LDH更多的富集在T24细胞膜表面。材料的主要聚集在细胞膜上而不是细胞内。
2、材料针对脱落的悬浮细胞粘附性评价。
2.1实验材料：实施例1所制得的材料体系NT-LDH/EDTA。
2.2实验方法：将膀胱癌T24细胞接种在六孔板上，贴壁生长24h后，用200ppm分散在培养基里的材料体系NT-LDH/EDTA处理细胞10min，之后收集上悬浮的清液，离心获得的细胞测SEM能谱EDS和元素Mapping。
2.3实验结果：图10为用实施例1所制得的材料体系NT-LDH/EDTA使膀胱癌细胞T24脱落，由悬浮液中脱落的细胞所得SEM图，由图9可见：从电镜形貌分析可知经NT-LDH/EDTA处理过的脱落细胞被材料紧紧包裹。EDS结果也显示细胞膜上中有1.9％的来自NT-LDH/EDTA中的Si，而相应的O、Zn、Al、Si元素在细胞膜上的映射更进一步证实了NT-LDH/EDTA没有从悬浮单细胞的细胞膜上脱落，表明了其较好的粘附性能。
3、材料破坏细胞连接导致细胞脱落的性能评价。
3.1实验材料：实施例1所制得的材料体系NT-LDH/EDTA。
3.2实验方法：将膀胱癌T24细胞和结直肠癌CT26细胞分别接种培养瓶上，数量为1×107，贴壁生长24h后，用200ppm分散在培养基里的材料NT-LDH/EDTA分别处理细胞15min，30min，和60min，无处理的细胞作为对照组。之后分别收集悬浮液中脱落的细胞和依旧贴壁的细胞，用细胞计数器计算细胞数量，从而得出脱落细胞的比例。
3.3实验结果：图11和图12分别为用实施例1所制得的材料体系NT-LDH/EDTA使膀胱癌细胞T24和结直肠癌细胞CT26脱落，脱落的细胞比例柱状图，由图可见：NT-LDH/EDTA可引起膀胱癌和结直肠癌细胞的大量脱落，其脱落比例呈时间相关，经60min处理后，其脱落的细胞比例大于70％；
综上所述，本发明所制得的材料体系NT-LDH/EDTA对膀胱癌T24细胞具有较好的靶向性，粘附性，可以破坏细胞的连接导致细胞从细胞壁面脱落。
B、活体评价实验
1.治疗原位膀胱癌SD大鼠的效果评价。
1.1实验材料：实施例1所制得的材料体系NH2-LDH/EDTA和NT-LDH/EDTA。PBS、EDTA、N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)、异氟烷、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、枸杞酸钠缓冲液。
1.2实验方法：MNU诱导原位膀胱癌大鼠建模：用枸橼酸缓冲液(0.1mmol/L)溶解MNU，配制为10g/L的MNU溶液。采用体重为220g左右的雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，经5％的异氟烷气体麻醉机诱导麻醉，并将其仰卧固定，换1.5％浓度维持麻醉。用1％新洁尔灭擦拭会阴部3次进行消毒，之后用涂有润滑油的导尿管缓慢插入尿道，再进入膀胱内。排出大鼠尿液后，膀胱内灌注0.2mL MNU溶液，完毕后夹闭导尿管和尿道外口20min，再缓慢撤出导尿管。每两周灌注一次，共灌注四次，并灌注结束后等待一个月成瘤。
灌注治疗膀胱癌大鼠的效果评价：建模周期结束后，经过超声成像检测大鼠是否成瘤。将成功的模型随机大鼠分为四组(PBS、EDTA、NH2-LDH/EDTA和NT-LDH/EDTA)。大鼠每次接受治疗前，停止喂食和水12h.采用上述方法气麻大鼠并分别膀胱灌注2mL的PBS，15mg/kg EDTA，60mg/kg的NH2-LDH/EDTA和60mg/kg的NT-LDH/EDTA，之后夹闭导尿管和尿道外口维持4h，再缓慢撤出导尿管。每周灌注一次，共灌注六次。在灌注第三次结束后和治疗结束后分别进行超声成像检测膀胱内肿瘤变化趋势。并在治疗结束后随机从PBS和NT-LDH/EDTA组中各挑选一只，超声成像检测肾脏有无异常。
治疗周期结束后，处死大鼠，并取出所有大鼠的膀胱，打开观察最终肿瘤大小并拍照。同时取出PBS和NT-LDH/EDTA组的肾，肝，脾，肺主要器官观察是否发生转移。
1.3实验结果：图13为用PBS、EDTA和实施例1所制得的材料体系NH2-LDH/EDTA、NT-LDH/EDTA针对原位膀胱癌SD大鼠膀胱灌注，超声成像检测治疗过程评价。从图11中可看出：PBS组大鼠的肿瘤逐渐增大甚至充满整个膀胱。经过EDTA灌注治疗的大鼠，肿瘤有所减小，但是由于游离的EDTA无粘附以及易被尿液稀释和排泄，其并不能很好的控制肿瘤的生长，最终形成多个呈弥散状的小肿瘤。经过NH2-LDH/EDTA灌注治疗的大鼠肿瘤生长明显被抑制，但是，由于较好的靶向富集性，灌注NT-LDH/EDTA的效果更佳，已在超声检测中看不出明显的肿瘤区域。
图14为用PBS、EDTA和实施例1所制得的材料体系NH2-LDH/EDTA、NT-LDH/EDTA针对原位膀胱癌SD大鼠膀胱灌注，治疗结束后膀胱组织照片，从图12中可看出结果与超声检测结果一致。对比其他组的大鼠，灌注NT-LDH/EDTA的大鼠膀胱已无肉眼可见的肿瘤组织，表面光滑与正常健康大鼠的膀胱外形颜色无明显差别。
图15为用PBS和实施例1所制得的材料体系NT-LDH/EDTA针对原位膀胱癌SD大鼠膀胱灌注，治疗结束后，肾脏功能评价以及解剖图；从图15中可以看出：由于PBS组中大鼠的膀胱肿瘤较大，堵塞了输尿管，导致后期出现严重的双肾积水。而治疗组NT-LDH/EDTA的肾脏并没有出现明显的异常。同时解剖出的肾脏图片中，PBS组中有一只大鼠的肾脏已出现明显的肿瘤转移，相应的肿瘤转移相关蛋白MMP-9表达上调。然而，NT-LDH/EDTA中的大鼠没有出现膀胱癌远端转移。
2.体内组织毒性实验。
2.1实验材料：实施例1所制得的材料体系NT-LDH/EDTA。
2.2实验方法：健康的SD雌性大鼠(体重约200g)随机分为三组。然后，将两组大鼠同上述方法膀胱内灌注高剂量120mg/kg的NT-LDH/EDTA，剩余一组未加任何处理的大鼠为对照组。分别于第7天和第30天后处死大鼠并取出主要组织(心、肝、肾、脾、肺)进行苏木精伊红(H&E)染色，进行组织学分析。
2.3实验结果：图14为健康SD大鼠膀胱灌注实施例1所制得的材料体系NT-LDH/EDTA(120mg/kg)后，心、肝、脾、肺、肾等各器官的组织切片图。由图16可见：与对照组的健康大鼠对比，在灌注NT-LDH/EDTA后，心肝脾肺肾各器官均无明显毒性反应；既无应激的急性毒性又无长期的组织毒性，表明该材料在活体水平的具有较好的生物安全性。
综上所述可见，本发明提供的材料体系NT-LDH/EDTA具有较好的靶向性和粘附性，经膀胱灌注后，可富集在肿瘤区域破坏细胞连接，导致肿瘤细胞从组织上剥落，并最终随尿液排出体外，且由于材料依旧紧紧包裹在脱落的细胞膜上，抑制肿瘤细胞的远端转移。此外，该材料还具有较低的毒副作用，对于膀胱癌医学治疗技术的发展和应用具有重要价值和意义。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非实质性的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims (17)

1.一种NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料，其特征在于，包括：负载乙二胺四乙酸的锌铝层状双氢氧化物、以及修饰在锌铝层状双氢氧化物的表面的神经降压素抗体NT。
2.根据权利要求1所述的NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料，其特征在于，以所述锌铝层状双氢氧化物的质量为100wt%，所述乙二胺四乙酸的含量≥25 wt%，优选为25.8 wt%～40 wt%。
3.根据权利要求1或2所述的NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料，其特征在于，以所述锌铝层状双氢氧化物的质量为100wt%，所述神经降压素抗体NT的含量为3～7 wt%。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料，其特征在于，所述锌铝层状双氢氧化物中Zn和Al的摩尔比为2:1～3:1。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料，其特征在于，所述NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料的颗粒尺寸为700～900 nm。
6.一种如权利要求1-5中任一项所述的NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料的制备方法，其特征在于，包括：
（1）将负载乙二胺四乙酸的锌铝层状双氢氧化物溶液在70～90 ℃下搅拌并在保护气氛中进行回流，加入硅烷溶液后，反应3～10小时，再经过滤、洗涤和干燥，得到NH2-LDH/EDTA；
（2）将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺加入到神经降压素抗体NT水溶液中并混合，然后加入NH2-LDH/EDTA 并在室温下反应12～24小时，再经过滤、洗涤和干燥，得到所述NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述负载乙二胺四乙酸的锌铝层状双氢氧化物和硅烷的比为1 mg：20μL～30μL。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述神经降压素抗体NT和NH2-LDH/EDTA的质量比为2～4：5。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺和神经降压素抗体NT的质量比为0.153 g～0.306 g:：0.230 g～0.460 g：20 mg。
10.根据权利要求7-10中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述负载乙二胺四乙酸的锌铝层状双氢氧化物的制备方法包括：
（1）将锌源、铝源、阴离子源和环六亚甲基四胺溶于水中，得到混合溶液，所述阴离子源为硝酸钠、氯化钠和磷酸钠中的至少一种；
（2）将所得混合溶液在100～140 ℃下搅拌并在保护气氛中进行回流1～4小时，再加入Na2H2EDTA溶液，在70～100 ℃下继续反应 20～23小时，再经过滤、清洗和干燥，得到负载乙二胺四乙酸的锌铝层状双氢氧化物。
11.一种权利要求1-5中任一项所述的NT-LDH/EDTA层状双氢氧化物材料在制备抗肿瘤药物中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，所述肿瘤包括结肠癌和膀胱癌。
13.一种NT-LDH层状双氢氧化物材料，其特征在于，包括：锌铝层状双氢氧化物以及修饰在所述锌铝层状双氢氧化物的表面的神经降压素抗体NT。
14.根据权利要求13所述的NT-LDH层状双氢氧化物材料，其特征在于，以所述锌铝层状双氢氧化物的质量为100wt%，所述神经降压素抗体NT的含量为3～7 wt%。
15.根据权利要求13或14所述的NT-LDH层状双氢氧化物材料，其特征在于，所述锌铝层状双氢氧化物中Zn和Al的摩尔比为2～3：1。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的NT-LDH层状双氢氧化物材料，其特征在于，所述NT-LDH层状双氢氧化物材料的颗粒尺寸为700～900 nm。
17.一种如权利要求13-16中任一项所述的NT-LDH层状双氢氧化物材料的制备方法，其特征在于，包括：
（1）将锌铝层状双氢氧化物溶液在70～90℃下搅拌并在保护气氛中进行回流，加入硅烷溶液后，反应3～10小时，再经过滤、洗涤和干燥，得到NH2-LDH；
（2）将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺加入到神经降压素抗体NT水溶液中并混合，然后加入NH2-LDH 并在室温下反应12～24小时，再经过滤、洗涤和干燥，得到所述NT-LDH层状双氢氧化物材料。
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