CN112106650A - 一种利用白榆组织制备植物杂交育种粘合剂的方法及应用 - Google Patents
一种利用白榆组织制备植物杂交育种粘合剂的方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及植物育种技术领域，具体涉及一种利用白榆组织制备植物杂交育种粘合剂的方法及应用。本发明杂交育种粘合剂的制备方法为：(1)将白榆树组织，加入磷酸盐缓冲液，研磨至浆状，得到含有植物杂交育种粘合剂的浆液；(2)将含有植物杂交育种粘合剂的浆液离心，取中层粘稠状物质，得到植物杂交育种粘合剂。采用本发明的方法制备得到的粘合剂用于植物属间杂交育种，可以提高杂交育种的结实率。
Description
技术领域
本发明涉及植物育种技术领域，尤其涉及一种利用白榆组织制备植物杂交育种粘合剂的方法及应用。
背景技术
植物杂交育种是一种传统创制植物新种质的育种技术手段，其中远缘杂交育种更是丰富植物种质资源，填补无法通过种内杂交获得种质空白的重要方法。众所周知植物远缘杂交存在生殖隔离，主要表现为：受精前的不亲和，如花粉落到柱头上之后由于形态或生理或遗传的原因不能萌发，或者即使萌发，由于花粉管在柱头上或在到达子房后的伸长受阻，致使受精不能完成；受精过程中的不亲和性，可以表现在任何部位和任何时间，这可能与某些化学物质有关；受精后的不亲和性，一些杂交虽然勉强进行，但杂种后代会出现许多缺陷如杂种不活、杂种不育和杂种衰败。如果出现生殖隔离会导致结实率低，或者不结实的现象。
受精前的不亲和是出现生殖隔离的主要因素。目前对于受精前的杂交不亲和解决的办法有：进行适时重复授粉，增加机会；蒙导授粉，即将不易杂交的目的花粉和易杂交的花粉混合一起授粉；去除柱头或花柱，直接给子房授粉，绕过障碍；利用正交和反交；采用桥梁亲本；利用生长调节物质，促进生长；改变杂交亲本的倍性，一般是用物理或化学的方法进行加倍；试管授精技术即结合组织培养将柱头在无菌条件下授粉；利用原生质体培养；采用转基因方法，如基因枪等越过生殖障碍。这些都能一定程度的提高植物远缘杂交的结实率。但目前尚未见报道利用白榆组织制备植物杂交育种粘合剂用于提高植物远缘杂交结实率的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用白榆组织制备植物杂交育种粘合剂的方法及应用。本方法步骤简单，易于操作，在不诱发植物遗传物质变异的情况下，用于植物的属间杂交，可以提高结实率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种利用白榆组织制备植物杂交育种粘合剂的方法，包括如下步骤：
(1)将白榆树组织，加入磷酸盐缓冲液，研磨至浆状，得到含有植物杂交育种粘合剂的浆液；
(2)将含有植物杂交育种粘合剂的浆液离心，取中层粘稠状物质，得到植物杂交育种粘合剂。
作为优选，所述白榆树组织与磷酸盐缓冲液的用量比为1g：8～12mL。
作为优选，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.0～7.4。
作为优选，所述白榆树组织为新鲜榆树叶片组织和/或幼茎段组织。
作为优选，所述研磨的条件为冰浴研磨。
作为优选，所述的含有植物杂交育种粘合剂的浆液离心的条件为：离心转速为10000～12000r/min，离心温度为2～6℃，离心时间为4～10min。
本发明还提供了一种利用白榆组织制备植物杂交育种粘合剂的方法制备得到的植物杂交育种粘合剂。
本发明还提供了一种植物杂交育种粘合剂在制备混合液体花粉中的应用。
本发明还提供了一种植物杂交育种粘合剂在榔榆与榉树，青檀与中华金叶榆，木槿与蜀葵杂交中的应用。
本发明提供了一种利用白榆组织制备植物杂交育种粘合剂的方法。本发明的制备方法步骤简单，易于操作，还不会诱发植物遗传物质的变异，可以用于植物的属间杂交，提高结实率。
具体实施方式
本发明提供了一种利用白榆组织制备植物杂交育种粘合剂的方法，包括如下步骤：
(1)将白榆树组织，加入磷酸盐缓冲液，研磨至浆状，得到含有植物杂交育种粘合剂的浆液；
(2)将含有植物杂交育种粘合剂的浆液离心，取中层粘稠状物质，得到植物杂交育种粘合剂。
在本发明中，所述白榆树组织与磷酸盐缓冲液的用量比为1g：8～12mL，优选为1g：9～11mL，进一步优选为1g：10mL。
在本发明中，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.0～7.4，优选为7.1～7.3，进一步优选为7.2。
在本发明中，所述白榆树组织为新鲜榆树叶片组织和/或幼茎段组织。
在本发明中，所述研磨的条件为冰浴研磨。
在本发明中，所述将含有植物杂交育种粘合剂浆液进行离心时的转速为10000～12000r/min，优选为11000r/min。
在本发明中，所述将含有植物杂交育种粘合剂浆液进行离心时的温度为2～6℃，优选为3～5℃，进一步优选为4℃。
在本发明中，所述将含有植物杂交育种粘合剂浆液进行离心时的时间为4～10min，优选为6～8min，进一步优选为7min。
在本发明中，所述获取中层粘稠状物质的方法为用弃去上层清液后，用移液器慢慢吸取中层粘稠物质。
本发明还提供了一种利用白榆组织制备植物杂交育种粘合剂的方法制备得到的植物杂交育种粘合剂。
在本发明中，验证所述粘合剂的方法为采用内参引物进行PCR扩增后得到的扩增产物，经过2％的琼脂糖凝胶电泳进行验证，在126bp处无条带，即为不含遗传物质的粘合剂，可以使用，在126bp有条带则粘合剂含有遗传物质，不能使用。
在本发明中，所述验证粘合剂的内参引物的正向引物为TATAATGAATTGCGTGTAGCCC，反向引物为CATAGCAGGAGTGTTGAAGGTC。
在本发明中，验证所述粘合剂的PCR反应程序为：预变性95℃10min；变性95℃50s、退火55℃50s、延伸72℃60s，循环35次；总延伸72℃10min。
本发明还提供了植物杂交育种粘合剂在制备混合液体花粉中的应用。
在本发明中，所述混合液体花粉的制备步骤包括：
(1)待授粉时，将母本花粉进行灭活，得到灭活的母本花粉；
(2)灭活的母本花粉干燥后与目标花粉按一定比例混合，得到混合花粉；
(3)将混合花粉中加入一定比例的粘合剂，得到混合液体花粉。
在本发明中，所述灭活母本花粉的试剂为70～80％的乙醇，优选为75％的乙醇。
所述灭活母本花粉时，乙醇的用量为将母本花粉打湿即可。
在本发明中，所述混合花粉中，母本花粉与目标花粉的体积比为1:3～5，优选为1:4。
在本发明中，所述混合液体花粉中，混合花粉与粘合剂的体积比为1～3:1，优选为2:1。
在本发明中，所述混合液体花粉优选用旋涡振荡器混匀。
在本发明中，所述混合液体花粉的使用方式为授粉时直接沾取涂抹母本柱头的方式使用。
本发明还提供了一种植物杂交育种粘合剂在榔榆与榉树，青檀与中华金叶榆，木槿与蜀葵杂交中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1含有白榆组织的植物杂交育种粘合剂的制备及验证
称取新鲜白榆树叶片、幼茎段混合组织0.1g，至于研钵中，加入磷酸盐缓冲液(pH7.2)1ml，冰浴研磨成浆状，倒入1.5ml离心管中，10000r/min，4℃离心6min。离心后离心管中出现三层物质，弃掉上层绿色水质液体后，用移液器缓慢吸取中间略带黄色的粘稠状物质得到粘合剂，并进行验证。采用正向引物为TATAATGAATTGCGTGTAGCCC，反向引物为CATAGCAGGAGTGTTGAAGGTC，按照表1的PCR体系中的配比加入各组分，然后分装至PCR板中每孔20μL体系，采用预变性95℃10min；变性95℃50s、退火55℃50s、延伸72℃60s，循环35次；总延伸72℃10min的反应程序进行PCR扩增。得到的扩增产物采用2％的琼脂糖凝胶电泳进行验证。
表1 PCR体系
结果在126bp处并无条带，说明为不含遗传物质的粘合剂，即可以使用。将其得到的粘合剂在4℃保存备用。
实验例1粘合剂在榔榆与榉树中的应用
授粉前5天，用75％的乙醇灭活榔榆的花粉，待自然干燥后，将其与榉树的花粉按体积比1:3的比例混合，得到1ml的混合花粉，将混合花粉平均分成2个管，每管0.5ml混合花粉，并编号1管和2管。将1管的混合花粉加入实施例1的粘合剂0.25ml，用旋涡振荡器将其混匀，制备得到混合液体花粉备用。2管的混合花粉加入等体积清水制成液体花粉为对照。待榔榆授粉时，分别沾取1管和2管的混合液体花粉涂抹于榔榆的柱头上，分别涂抹10个榔榆花序。结果发现1管涂抹的10个榔榆花序结实得到14粒种子，2管涂抹的10个榔榆花序则无结实。
实验例2粘合剂在青檀与中华金叶榆中的应用
授粉前5天，用80％的乙醇灭活青檀的花粉，待自然干燥后，将其与中华金叶榆的花粉按体积比1:4的比例混合，得到1ml的混合花粉，将混合花粉平均分成2个管，每管0.5ml，并编号3管和4管。将3管的混合花粉加入实施例1的粘合剂0.5ml，用旋涡振荡器将其混匀，制备得到混合液体花粉备用。4管的混合花粉加入等体积清水制成液体花粉为对照。
待青檀授粉时，分别沾取3管和4管的混合液体花粉涂抹于青檀的柱头上，分别涂抹10个青檀花序。结果发现3管涂抹的10个青檀花序结实得到3粒种子，4管涂抹的10个青檀花序则无结实。
实验例3粘合剂在木槿与蜀葵中的应用
授粉前5天，用70％的乙醇灭活木槿的花粉，待自然干燥后，将其与蜀葵的花粉按体积比1:5的比例混合，得到1ml的混合花粉，将混合花粉平均分成2个管，每管0.5ml，并编号5管和6管。将5管的混合花粉加入实施例1的粘合剂0.2ml，用旋涡振荡器将其混匀，制备得到混合液体花粉备用。6管的混合花粉加入等体积清水制成液体花粉为对照。
待木槿授粉时，分别沾取5管和6管的混合液体花粉涂抹于木槿的柱头上，分别涂抹10个木槿花。结果发现5管涂抹的10个木槿花结实得到41粒种子，6管涂抹的10个木槿花结实4粒种子，但是4粒种子都未萌发。
综上可以看出，粘合剂用于植物属间杂交育种时，由于不同植物的生长不同，能够不同程度的提高属间杂交的结实率。
由以上实施例可知，本发明提供的了一种利用白榆组织制备得到的植物杂交育种粘合剂方法，此方法简单，易于操作。制备得到的粘合剂用于植物属间杂交时，不仅不会诱发植物遗传物质的变异，还能够不同程度的提高植物的结实率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种利用白榆组织制备植物杂交育种粘合剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将白榆树组织，加入磷酸盐缓冲液，研磨至浆状，得到含有植物杂交育种粘合剂的浆液；
(2)将含有植物杂交育种粘合剂的浆液离心，取中层粘稠状物质，得到植物杂交育种粘合剂。
2.根据权利要求1所述的一种利用白榆组织制备植物杂交育种粘合剂的方法，其特征在于，所述白榆树组织与磷酸盐缓冲液的用量比为1g：8～12mL。
3.根据权利要求2所述的一种利用白榆组织制备植物杂交育种粘合剂的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.0～7.4。
4.根据权利要求1或2或3所述的一种利用白榆组织制备植物杂交育种粘合剂的方法，其特征在于，所述白榆树组织为新鲜榆树叶片组织和/或幼茎段组织。
5.根据权利要求4所述的一种利用白榆组织制备植物杂交育种粘合剂的方法，其特征在于，所述研磨的条件为冰浴研磨。
6.根据权利要求1所述的一种利用白榆组织制备植物杂交育种粘合剂的方法，其特征在于，所述的含有植物杂交育种粘合剂的浆液离心的条件为：离心转速为10000～12000r/min，离心温度为2～6℃，离心时间为4～10min。
7.一种权利要求1～6任意一项所述的利用白榆组织制备植物杂交育种粘合剂的方法制备得到的植物杂交育种粘合剂。
8.权利要求7所述植物杂交育种粘合剂在制备混合液体花粉中的应用。
9.权利要求7所述的植物杂交育种粘合剂在榔榆与榉树，青檀与中华金叶榆，木槿与蜀葵杂交中的应用。
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