CN112105642A - 抗pd-1抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及抗PD‑1(程序性细胞死亡蛋白1)抗体、其抗原结合片段，及其用途。

Description

抗PD-1抗体及其用途
技术领域
本公开内容涉及抗PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)抗体及其用途。
背景技术
癌症是目前人类死亡率最高的疾病之一。根据世界卫生组织的统计数据，2012年全球癌症发病和死亡病例数分别达到1400万和820万。在中国，新诊断的癌症病例为307万，死亡人数为220万。
抗癌抗体的最新临床和商业成功已引起对基于抗体的治疗剂的极大兴趣。需要开发抗癌抗体以用于各种基于抗体的疗法中治疗癌症。
发明内容
本公开内容涉及抗PD-1抗体、其抗原结合片段及其用途。
在一方面，本公开内容涉及结合PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)的抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含互补决定区(CDRs)1、2和3，其中所述VH CDR1区包含与选择的VH CDR1氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，VHCDR2区包含与选择的VH CDR2氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且VH CDR3区包含与选择的VH CDR3氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；以及轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含CDR 1、2和3，其中VL CDR1区包含与选择的VL CDR1氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，VL CDR2区包含与选择的VL CDR2氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且VL CDR3区包含与选择的VL CDR3氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述选择的VH CDR 1、2和3氨基酸序列以及所述选择的VLCDR 1、2和3氨基酸序列是以下之一：
(1)所述选择的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:1、2、3中示出，并且所述选择的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:4、5、6中示出；
(2)所述选择的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:7、8、9中示出，并且所述选择的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:10、11、12中示出；
(3)所述选择的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:7、13、14中示出，并且所述选择的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:10、11、15中示出。
在一些实施方案中，VH包含分别具有SEQ ID NO:1、2和3中所示氨基酸序列的CDR1、2、3，并且VL包含分别具有SEQ ID NO:4、5和6中所示氨基酸序列的CDR 1、2、3。
在一些实施方案中，VH包含分别具有SEQ ID NO:7、8和9中所示氨基酸序列的CDR1、2、3，并且VL包含分别具有SEQ ID NO:10、11和12中所示氨基酸序列的CDR 1、2、3。
在一些实施方案中，VH包含分别具有SEQ ID NO:7、13和14中所示氨基酸序列的CDR 1、2、3，并且VL包含分别具有SEQ ID NO:10、11和15中所示氨基酸序列的CDR 1、2、3。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段与人PD-1特异性结合。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是人源化的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是单链可变片段(scFV)。
在另一方面，本公开内容涉及核酸，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含：
(1)包含重链可变区(VH)的免疫球蛋白重链或其片段，所述重链可变区(VH)包含分别含有SEQ ID NO:1、2和3中所示氨基酸序列的互补决定区(CDR)1、2和3，并且其中所述VH在与包含SEQ ID NO:29、30、31或40中所示氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合PD-1；
(2)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有SEQ ID NO:4、5和6中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含SEQ ID NO:26、27、28或39中所示氨基酸序列的VH配对时结合PD-1；
(3)包含重链可变区(VH)的免疫球蛋白重链或其片段，所述重链可变区(VH)包含分别含有SEQ ID NO:7、8和9中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含SEQ ID NO:36、37、38或42中所示氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合PD-1；
(4)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有SEQ ID NO:10、11和12中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含SEQ ID NO:32、33、34、35或41中所示氨基酸序列的VH配对时结合PD-1；
(5)包含重链可变区(VH)的免疫球蛋白重链或其片段，所述重链可变区(VH)包含分别含有SEQ ID NO:7、13和14中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含SEQ ID NO:44中所示氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合PD-1；
(6)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有SEQ ID NO:10、11和15中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含SEQ ID NO:43中所示氨基酸序列的VH配对时结合PD-1。
在一些实施方案中，所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有SEQ ID NO:1、2和3中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3。
在一些实施方案中，所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有SEQ ID NO:4、5和6中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3。
在一些实施方案中，所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有SEQ ID NO:7、8和9中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3。
在一些实施方案中，所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有SEQ ID NO:10、11和12中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3。
在一些实施方案中，所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有SEQ ID NO:7、13和14中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3。
在一些实施方案中，所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有SEQ ID NO:10、11和15中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3。
在一些实施方案中，所述VH在与VL配对时与人PD-1特异性结合，或者所述VL在与VH配对时与人PD-1特异性结合。
在一些实施方案中，所述免疫球蛋白重链或其片段是人源化的免疫球蛋白重链或其片段，并且所述免疫球蛋白轻链或其片段是人源化的免疫球蛋白轻链或其片段。
在一些实施方案中，所述核酸编码单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，所述核酸是cDNA。
在一方面，本公开内容涉及载体，其包含一种或更多种如本文所述的核酸。在一些实施方案中，所述载体编码VL区和VH区，所述VL区和VH区一起结合PD-1。
在一方面，本公开内容提供了载体对，其中每个载体包含一种如本文所述的核酸，其中所述载体对一起编码VL区和VH区，所述VL区和VH区一起结合PD-1。
在另一方面，本公开内容涉及细胞，其包含如本文所述的载体，或如本文所述的载体对。在一些实施方案中，所述细胞是CHO细胞。
在一方面，本公开内容还提供了包含一种或更多种如本文所述的核酸的细胞。
在另一方面，本公开内容提供了包含两种如本文所述的核酸的细胞。在一些实施方案中，所述两种核酸一起编码VL区和VH区，所述VL区和VH区一起结合PD-1。
在另一方面，本公开内容涉及产生抗体或其抗原结合片段的方法。所述方法包括步骤：
(a)在足以使如本文所述的细胞产生抗体或抗原结合片段的条件下培养所述细胞；以及
(b)收集由所述细胞产生的抗体或抗原结合片段。
在一方面，本公开内容涉及结合PD-1的抗体或其抗原结合片段，其包含：重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含与所选VH序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区(VL)包含与所选VL序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所述选择的VH序列和所述选择的VL序列是以下之一：
(1)所述选择的VH序列是SEQ ID NO:26、27、28或39，并且所述选择的VL序列是SEQID NO:29、30、31或40；
(2)所述选择的VH序列是SEQ ID NO:32、33、34、35或41，并且所述选择的VL序列是SEQ ID NO:36、37、38或42；
(3)所述选择的VH序列是SEQ ID NO:43，并且所述选择的VL序列是SEQ ID NO:44。
在一些实施方案中，所述VH包含SEQ ID NO:26的序列，并且所述VL包含SEQ IDNO:31的序列。
在一些实施方案中，所述VH包含SEQ ID NO:27的序列，并且所述VL包含SEQ IDNO:31的序列。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段与人PD-1特异性结合。
在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是人源化的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段是单链可变片段(scFV)。
在一方面，本公开内容涉及抗体-药物缀合物，其包含与治疗剂共价结合的如本文所述的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，治疗剂是细胞毒性剂或细胞抑制剂。
在另一方面，本公开内容涉及治疗患有癌症的对象的方法。所述方法包括向对象施用治疗有效量的组合物的步骤，所述组合物包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段或如本文所述的抗体-药物缀合物。
在一些实施方案中，所述对象患有实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症是不可切除的黑色素瘤或转移性黑色素瘤。在一些实施方案中，所述癌症是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)、头颈部鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma of thehead and neck，SCCHN)、头颈癌、肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)、黑色素瘤、膀胱癌、胃癌、尿路上皮癌、梅克尔细胞癌、三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)或结直肠癌。
在一方面，本公开内容涉及降低肿瘤生长速率的方法。所述方法包括使肿瘤细胞与有效量的组合物接触的步骤，所述组合物包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段或如本文所述的抗体-药物缀合物。
在另一方面，本公开内容涉及杀伤肿瘤细胞的方法。所述方法包括使肿瘤细胞与有效量的组合物接触的步骤，所述组合物包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段或如本文所述的抗体-药物缀合物。
在一方面，本公开内容涉及药物组合物，其包含如本文所述的抗体或其抗原结合片段，以及可药用载体。
在另一方面，本公开内容涉及药物组合物，其包含如本文所述的抗体药物缀合物，以及可药用载体。
如本文所用，术语“癌症”是指具有自主生长能力的细胞。这样的细胞的实例包括具有以迅速增殖的细胞生长为特征的异常状态或状况的细胞。该术语旨在包括癌性生长物，例如肿瘤；致癌过程、转移性组织以及恶性转化的细胞、组织或器官，无论组织病理类型或浸润程度如何。还包括多种器官系统的恶性病，所述器官系统例如呼吸系统、心血管系统、肾系统、生殖系统、血液系统、神经系统、肝系统、胃肠系统和内分泌系统；以及腺癌，其包括恶性病，例如大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、肺部非小细胞癌和小肠癌。“天然发生的”癌症包括任何不是通过实验诱导将癌细胞植入对象体内的癌症，并且包括例如自发产生的癌症、由患者暴露于致癌物引起的癌症、由癌基因的插入或肿瘤抑制基因的敲除引起的癌症，以及由感染(例如病毒感染)引起的癌症。术语“癌(carcinoma)”是本领域公认的，并且是指上皮或内分泌组织的恶性病。该术语还包括癌肉瘤，其包括由癌性组织和肉瘤性组织构成的恶性肿瘤。“腺癌”是指源自腺组织或其中肿瘤细胞形成可识别的腺结构的癌。术语“肉瘤”是本领域公认的，并且是指间充质来源的恶性肿瘤。术语“造血性肿瘤性疾病”(hematopoietic neoplastic disorder)包括涉及造血起源的增生性细胞/肿瘤细胞的疾病。造血性肿瘤性疾病可由骨髓、淋巴或红系谱系、或其前体细胞引起。
本文所用的术语“抗体”是指包含至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或六个)互补决定区(CDR)(例如，来自免疫球蛋白轻链的三个CDR中的任何一个或者来自免疫球蛋白重链的三个CDR中的任何一个)并且能够与表位特异性结合的任何抗原结合分子。抗体的非限制性实例包括：单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单链抗体、嵌合抗体、人抗体和人源化抗体。在一些实施方案中，抗体可包含人抗体的Fc区。术语抗体还包括衍生物，例如由抗体片段形成的双特异性抗体、单链抗体、双抗体(diabodies)、线性抗体和多特异性抗体。
本文所用的术语“抗原结合片段”是指全长抗体的一部分，其中抗体的该部分能够与抗原特异性结合。在一些实施方案中，抗原结合片段包含至少一个可变结构域(例如，重链的可变结构域或轻链的可变结构域)。抗体片段的非限制性实例包括例如Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段。
本文所用的术语“人抗体”是指由人中存在的内源核酸(例如，重排的人免疫球蛋白重链或轻链基因座)编码的抗体。在一些实施方案中，人抗体是从人收集或在人细胞培养物(例如，人杂交瘤细胞)中产生的。在一些实施方案中，人抗体是在非人细胞(例如，小鼠或仓鼠细胞系)中产生的。在一些实施方案中，人抗体是在细菌或酵母细胞中产生的。在一些实施方案中，人抗体是在含有未重排或重排的人免疫球蛋白基因座(例如，重链或轻链人免疫球蛋白基因座)的转基因非人动物(例如牛)中产生的。
本文所用的术语“嵌合抗体”是指包含存在于至少两种不同抗体(例如，来自两种不同哺乳动物物种的抗体，例如人抗体和小鼠抗体)中的序列的抗体。嵌合抗体的非限制性实例是包含非人(例如小鼠)抗体的可变结构域序列(例如，轻链和/或重链可变结构域序列的全部或一部分)和人抗体的恒定结构域的抗体。嵌合抗体的另外实例在本文中进行了描述并且是本领域已知的。
本文所用的术语“人源化抗体”是指非人抗体，其包含源自非人(例如，小鼠)免疫球蛋白的最小序列并且包含源自人免疫球蛋白的序列。在一些非限制性实例中，人源化抗体是人抗体(接受体抗体)，其中接受体抗体的高变(例如，CDR)区残基被具有期望特异性、亲和力和性能的来自非人抗体(例如，供体抗体)(例如小鼠、大鼠或兔抗体)的高变(例如，CDR)区残基替换。在一些实施方案中，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人(例如，小鼠)免疫球蛋白残基替换。在一些实施方案中，人源化抗体可包含不存在于接受体抗体或供体抗体中的残基。可进行这些修饰以进一步改善抗体性能。在一些实施方案中，人源化抗体包含至少一个并且通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部的高变环(CDR)对应于非人(例如小鼠)免疫球蛋白的那些，并且全部或基本上全部的框架区是人免疫球蛋白的那些。人源化抗体还可包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区(Fc)。可以使用本领域已知的分子生物学方法产生人源化抗体。本文描述了用于产生人源化抗体的方法的非限制性实例。
本文所用的术语“单链抗体”是指能够与抗原特异性结合的包含至少两个免疫球蛋白可变结构域(例如，哺乳动物免疫球蛋白重链或轻链的可变结构域)的单个多肽。单链抗体的非限制性实例在本文中进行了描述。
本文所用的术语“多聚体抗体”是指包含四个或更多个(例如六个、八个或十个)免疫球蛋白可变结构域的抗体。在一些实施方案中，多聚体抗体能够使一个靶分子(例如PD-1)与哺乳动物细胞(例如人T细胞)表面上的至少一个第二靶分子(例如CTLA-4)交联。
本文所用的术语“对象”和“患者”在整个说明书中可互换使用，并且描述了根据本发明的方法提供治疗的人或非人动物。本发明涵盖了兽医和非兽医应用。人患者可以是成人或未成年人(例如小于18岁的人)。除人外，患者还包括但不限于小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、雪貂、猫、狗和灵长类。包括例如非人灵长类(例如猴、黑猩猩、大猩猩等)、啮齿动物(例如大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、雪貂、兔)、兔类动物(lagomorph)、猪类(例如猪、微型猪(miniature pig))、马、犬、猫、牛和其他家养、农场和动物园动物。
如本文所用，当提及抗体时，短语“与…特异性结合”和“特异性结合…”
是指由于相互作用取决于靶分子上特定结构(即抗原决定簇或表位)的存在，抗体相对于其他分子优先与其靶分子(例如，PD-1)相互作用；换句话说，该试剂识别并结合包含特定结构的分子，而不是一般的所有分子。与靶分子特异性结合的抗体可以称为靶标特异性抗体。例如，可将与PD-1分子特异性结合的抗体称为PD-1特异性抗体或抗PD-1抗体。
本文所用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，是指具有至少两个氨基酸的任意长度的氨基酸聚合物。
本文所用的术语“多核苷酸”、“核酸分子”和“核酸序列”在本文可互换使用，是指具有至少两个核苷酸的任意长度的核苷酸聚合物，并且包括但不限于DNA、RNA、DNA/RNA杂交体，及其修饰物。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；但也可以使用本领域已知的其他合适方法和材料。所述材料、方法和实例仅是举例说明性的，并且不旨在限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献均通过引用整体并入。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。
根据以下具体实施方式和附图以及权利要求书，本发明的其他特征和优点将变得明显。
附图说明
图1是显示制备抗hPD-1抗体的示例性方案的第一部分的流程图。
图2是显示制备抗hPD-1抗体的示例性方案的第二部分的流程图。
图3是一组流式细胞术图，显示了抗hPD-1抗体阻断hPD-1与hPD-L1之间的结合。
图4是一组显示分析抗hPD-1抗体与猴PD-1(rmPD-1)、小鼠PD-1(mPD-1)和人-小鼠嵌合PD-1(chiPD-1)的交叉反应性的流式细胞术结果的图。NC代表阴性对照。
图5是显示使用嵌合抗hPD-1抗体1A7-mHvKv-IgG4-S228P和人PD-1的表面等离子体共振(SPR)的结果的图。
图6是显示使用嵌合抗hPD-1抗体3F1-mHvKv-IgG4-S228P和人PD-1的表面等离子体共振(SPR)的结果的图。
图7是显示用小鼠抗hPD-1抗体和可瑞达(Keytruda)处理的具有MC-38肿瘤细胞的人源化PD-1小鼠(B-hPD-1)随时间的体重的图。PS代表生理盐水。
图8是显示用小鼠抗hPD-1抗体和可瑞达(Keytruda)处理的具有MC-38肿瘤细胞的人源化PD-1小鼠(B-hPD-1)随时间的体重百分比变化的图。PS代表生理盐水。
图9是显示用小鼠抗hPD-1抗体和可瑞达(Keytruda)处理的具有MC-38肿瘤细胞的人源化PD-1小鼠(B-hPD-1)中随时间的肿瘤体积的图。PS代表生理盐水。
图10是显示用嵌合抗hPD-1抗体和可瑞达(Keytruda)处理的具有MC-38肿瘤细胞的人源化PD-1小鼠(B-hPD-1)随时间的体重的图。PS代表生理盐水。
图11是显示用嵌合抗hPD-1抗体和可瑞达(Keytruda)处理的具有MC-38肿瘤细胞的人源化PD-1小鼠(B-hPD-1)随时间的体重百分比变化的图。PS代表生理盐水。
图12是显示用嵌合抗hPD-1抗体和可瑞达(Keytruda)处理的具有MC-38肿瘤细胞的人源化PD-1小鼠(B-hPD-1)中随时间的肿瘤体积的图。PS代表生理盐水。
图13是显示用人源化抗hPD-1抗体和可瑞达(Keytruda)处理的具有MC-38肿瘤细胞的人源化PD-1小鼠(B-hPD-1)随时间的体重的图。PS代表生理盐水。
图14是显示用人源化抗hPD-1抗体和可瑞达(Keytruda)处理的具有MC-38肿瘤细胞的人源化PD-1小鼠(B-hPD-1)随时间的体重百分比变化的图。PS代表生理盐水。
图15是显示用人源化抗hPD-1抗体和可瑞达(Keytruda)处理的具有MC-38肿瘤细胞的人源化PD-1小鼠(B-hPD-1)中随时间的肿瘤体积的图。PS代表生理盐水。
图16列出了通过Kabat编号定义的小鼠抗hPD-1抗体(25-1A7、18-3F1、3-6G1)的CDR序列及其人源化抗hPD-1抗体的CDR序列。
图17列出了通过Chothia编号定义的小鼠抗hPD-1抗体(25-1A7、18-3F1、3-6G1)的CDR序列及其人源化抗hPD-1抗体的CDR序列。
图18列出了人PD-1(hPD-1)、小鼠PD-1(mPD-1)、猴PD-1(rmPD-1)和嵌合PD-1(chiPD-1)的氨基酸序列。
图19列出了人源化抗hPD-1抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
图20列出了人源化抗hPD-1抗体25-1A7、18-3F1和3-6G1的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
具体实施方式
本公开内容提供了结合PD-1(程序性细胞死亡蛋白1；也称为CD279)的抗体、其抗原结合片段的一些实例。
PD-1和癌症
免疫系统可以区分体内的正常细胞与其视为“外来”的那些细胞，这使免疫系统能够攻击外来细胞，而正常细胞不受影响。这种机制有时涉及被称为免疫检查点的蛋白质。免疫检查点是免疫系统中调高信号(共刺激分子)或调低信号的分子。
检查点抑制因子可防止免疫系统攻击正常组织，从而防止自身免疫病。许多肿瘤细胞也表达检查点抑制因子。这些肿瘤细胞通过选择某些免疫检查点途径来逃避免疫监视，特别是在对肿瘤抗原具有特异性的T细胞中(Creelan,Benjamin C.“Update on immunecheckpoint inhibitors in lung cancer.”Cancer Control 21.1(2014):80-89)。由于许多免疫检查点是由配体-受体相互作用引发的，因此它们可以容易地被针对配体和/或其受体的抗体所阻断。
PD-1(程序性死亡-1)是一种免疫检查点，通过双机制防止自身免疫：促进淋巴结中抗原特异性T细胞的凋亡(程序性细胞死亡)，同时减少调节性T细胞(抗炎，抑制性T细胞)的细胞凋亡。
PD-1主要表达于T细胞及初级B细胞表面；PD-1的两个配体(PD-L1和PD-L2)广泛表达于抗原呈递细胞(APC)。PD-1及其配体的相互作用在免疫反应的负调控中起着重要作用。抑制PD-1与其配体的结合可以使肿瘤细胞暴露于免疫系统的杀伤作用，从而达到杀伤肿瘤组织和治疗癌症的作用。
PD-L1在许多不同癌症的肿瘤细胞上表达。通过与T细胞上的PD-1结合导致抑制，PD-L1表达是肿瘤细胞逃避免疫攻击的一个主要机制。PD-L1过表达在概念上可能是由于两种机制引起的：固有性和适应性。PD-L1在癌细胞上的固有性表达与这些肿瘤细胞中的细胞/遗传异常有关。包括AKT和STAT途径的细胞信号转导的激活导致PD-L1表达增加。在原发纵隔B细胞淋巴瘤中，发生MHC II类反式激活因子(CIITA)与PD-L1或PD-L2的基因融合，导致这些蛋白的过表达。PD-L1和PD-L2所在的9p23-24染色体的扩增引起两种蛋白在经典霍奇金淋巴瘤中的表达增加。适应性机制与在肿瘤微环境中诱导PD-L1表达有关。PD-L1可响应干扰素γ在肿瘤细胞上被诱导。在微卫星不稳定性结肠癌中，PD-L1主要在肿瘤中的髓样细胞上表达，然后抑制细胞毒性T细胞功能。
应用PD-1阻断来增强抗肿瘤免疫力是源于慢性感染模型中的观察，其中防止PD-1相互作用逆转了T细胞衰竭。类似地，PD-1阻断防止T细胞PD-1/肿瘤细胞PD-L1或T细胞PD-1/肿瘤细胞PD-L2相互作用，引起T细胞介导的抗肿瘤免疫力的恢复。
PD-1的详细描述以及抗PD-1抗体在治疗癌症中的用途描述可见于例如以下中：Topalian,Suzanne L.,et al."Safety,activity,and immune correlates of anti–PD-1antibody in cancer."New England Journal of Medicine 366.26(2012):2443-2454；Hirano,Fumiya,et al."Blockade of B7-H1 and PD-1by monoclonal antibodiespotentiates cancer therapeutic immunity."Cancer research 65.3(2005):1089-1096；Raedler,Lisa A."Keytruda(pembrolizumab):first PD-1inhibitor approved forpreviously treated unresectable or metastatic melanoma."American health&drugbenefits 8.Spec Feature(2015):96；Kwok,Gerry,et al."Pembrolizumab(Keytruda)."(2016):2777-2789；US 20170247454；US 9,834,606B；和US 8,728,474；其各自通过引用整体并入。
本公开内容提供了数种抗PD-1抗体、其抗原结合片段以及使用这些抗PD-1抗体和抗原结合片段来抑制肿瘤生长和治疗癌症的方法。
抗体和抗原结合片段
本公开内容提供了抗PD-1抗体及其抗原结合片段。通常，抗体(也称为免疫球蛋白)由轻链和重链两类多肽链构成。本公开内容的非限制性抗体可以是包含两条重链和两条轻链的完整的四免疫球蛋白链抗体。抗体的重链可以是任何同种型，包括IgM、IgG、IgE、IgA或IgD；或者亚同种型，包括IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4、IgE1、IgE2等。轻链可以是κ轻链或λ轻链。抗体可包含轻链的两个相同拷贝和重链的两个相同拷贝。各自包含一个可变结构域(或可变区，VH)和多个恒定结构域(或恒定区)的重链通过其恒定结构域内的二硫键相互结合以形成抗体的“柄”。各自包含一个可变结构域(或可变区，VL)和一个恒定结构域(或恒定区)的轻链各自通过二硫键结合与一条重链结合。每个轻链的可变区与其所结合的重链的可变区配对。轻链和重链二者的可变区都包含位于更保守的框架区(FR)之间的三个高变区。
这些高变区，称为互补决定区(CDR)，形成包含抗体的主要抗原结合表面的环。四个框架区主要采用β-折叠构象，并且CDR形成环，所述环连接β-折叠结构并且在某些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过框架区保持紧密靠近，并且与来自另一条链的CDR一起有助于形成抗原结合区。
通过分析抗体的氨基酸序列来鉴定抗体的CDR区的方法是公知的，并且CDR的许多定义是常用的。Kabat定义基于序列变异性，Chothia定义基于结构环区域的位置。这些方法和定义在以下中描述：例如Martin,"Protein sequence and structure analysis ofantibody variable domains,"Antibody engineering,Springer Berlin Heidelberg,2001.422-439；Abhinandan,et al."Analysis and improvements to Kabat andstructurally correct numbering of antibody variable domains,"Molecularimmunology 45.14(2008):3832-3839；Wu,T.T.and Kabat,E.A.(1970)J.Exp.Med.132:211-250；Martin et al.,Methods Enzymol.203:121-53(1991)；Morea et al.,BiophysChem.68(1-3):9-16(Oct.1997)；Morea et al.,J Mol Biol.275(2):269-94(Jan.1998)；Chothia et al.,Nature 342(6252):877-83(Dec.1989)；Ponomarenko and Bourne,BMCStructural Biology 7:64(2007)；其各自通过引用整体并入本文。除非在本公开内容中特别指出，否则在本公开内容中默认使用Kabat编号。
CDR对于识别抗原表位是重要的。本文所用的“表位”是靶分子的能够被抗体的抗原结合结构域特异性结合的最小部分。表位的最小尺寸可以为约3、4、5、6或7个氨基酸，但这些氨基酸不必位于抗原一级结构的连续线性序列中，因为表位可依赖于基于抗原的二级和三级结构的抗原的三维构象。
在一些实施方案中，抗体是完整的免疫球蛋白分子(例如，IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgD、IgE、IgA)。IgG亚类(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)是高度保守的，不同之处在于其恒定区，尤其是其铰链和上CH2结构域。IgG亚类的序列和差异是本领域已知的，并且描述在例如以下中：Vidarsson,et al,"IgG subclasses and allotypes:from structure toeffector functions."Frontiers in immunology 5(2014)；Irani,et al."Molecularproperties of human IgG subclasses and their implications for designingtherapeutic monoclonal antibodies against infectious diseases."Molecularimmunology 67.2(2015):171-182；Shakib,Farouk,ed.The human IgGsubclasses:molecular analysis of structure,function and regulation.Elsevier,2016；其各自通过引用整体并入本文。
抗体也可以是来源于任何物种(例如人、啮齿动物、小鼠、骆驼科)的免疫球蛋白分子。本文公开的抗体还包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体以及包含与另一多肽融合的免疫球蛋白结合结构域的嵌合抗体。术语“抗原结合结构域”或“抗原结合片段”是保留了完整抗体的特异性结合活性的抗体部分，即抗体的能够与完整抗体的靶分子上的表位特异性结合的任何部分。其包括例如Fab、Fab'、F(ab')2以及这些片段的变体。因此，在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段可以是例如由抗体片段形成的scFv、Fv、Fd、dAb、双特异性抗体、双特异性scFv、双抗体、线性抗体、单链抗体分子、多特异性抗体，以及包含为抗体结合结构域或与抗体结合结构域同源的结合结构域的任何多肽。抗原结合结构域的非限制性实例包括，例如，完整抗体的重链和/或轻链CDR、完整抗体的重链和/或轻链可变区、完整抗体的全长重链或轻链，或来自完整抗体的重链或轻链的单个CDR。
在一些实施方案中，抗原结合片段可以形成嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptor，CAR)的一部分。在一些实施方案中，嵌合抗原受体是与CD3-ζ跨膜和胞内结构域融合的本文所述的单链可变片段(scFv)的融合体。在一些实施方案中，嵌合抗原受体还包含来自多种共刺激蛋白受体(例如，CD28、41BB、ICOS)的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含多个信号传导结构域，例如CD3z-CD28-41BB或CD3z-CD28-OX40，以提高效力。因此，在一方面，本公开内容还提供了表达如本文所述的嵌合抗原受体的细胞(例如，T细胞)。
在一些实施方案中，scFV具有一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域。抗PD-1抗体和抗原结合片段
本公开内容提供了特异性结合PD-1的抗体及其抗原结合片段。本文所述的抗体和抗原结合片段能够结合PD-1并且可以促进PD-1信号传导途径，从而提高免疫应答。本公开内容提供了例如小鼠抗PD-1抗体25-1A7(“1A7”)、18-3F1(“3F1”)和3-6G1(“6G1”)，其嵌合抗体，以及其人源化抗体(例如，表2中所示的抗体)。
1A7和1A7衍生抗体(例如人源化抗体)的CDR序列包含重链可变结构域的CDR，SEQID NO:1-3，和轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:4-6，如通过Kabat编码定义的。CDR也可以由Chothia系统定义。在Chothia编码下，重链可变结构域的CDR序列在SEQ ID NO:16、17、3中示出，并且轻链可变结构域的CDR序列在SEQ ID NO:4-6中示出。
类似地，3F1和3F1衍生抗体的CDR序列包含重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:7-9，和轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:10-12，如通过Kabat编码定义的。在Chothia编码下，重链可变结构域的CDR序列在SEQ ID NO:18、19、9中示出，并且轻链可变结构域的CDR在SEQ ID NO:10-12中示出。
6G1和6G1衍生抗体的CDR序列包含重链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:7、13、14，和轻链可变结构域的CDR，SEQ ID NO:10、11、15，如通过Kabat编码定义的。在Chothia编码下，重链可变结构域的CDR序列在SEQ ID NO:20、21、14中示出，并且轻链可变结构域的CDR在SEQ ID NO:10、11、15中示出。
还提供了人源化抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。由于存在不同的使小鼠抗体人源化的方法(例如，序列可以通过不同的氨基酸替换进行修饰)，因此抗体的重链和轻链可以具有多于一种形式的人源化序列。人源化1A7抗体的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:26-28中示出。人源化1A7抗体的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:29-31中示出。这些重链可变区序列(SEQ ID NO:26-28)中的任一个可与这些轻链可变区序列(SEQ ID NO:29-31)中的任一个配对。
类似地，人源化3F1抗体的重链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:32-35中示出。人源化3F1抗体的轻链可变区的氨基酸序列在SEQ ID NO:36-38中示出。这些重链可变区序列(SEQ ID NO:32-35)中的任一个可与这些轻链可变区序列(SEQ ID NO:36-38)中的任一个配对。
如图19所示，人源化百分比是指与国际免疫遗传学信息系统(InternationalImmunogenetics Information System，IMGT)数据库中的人抗体序列相比的重链或轻链可变区序列的百分比同一性。最高命中(top hit)是指相对于其他物种，重链或轻链可变区序列更接近特定物种。例如，最高命中于人是指相对于其他物种，序列更接近人。最高命中于人和食蟹猴(Macaca fascicularis)意味着序列与人序列和食蟹猴序列具有相同的百分比同一性，并且与其他物种的序列相比，这些百分比同一性最高。在一些实施方案中，人源化百分比为大于80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％。关于如何确定人源化百分比以及如何确定最高命中的详细描述在本领域中是已知的，并且描述在例如以下中：Jones,Tim D.,et al."The INNs and outs ofantibody nonproprietary names."MAbs.Vol.8.No.1.Taylor&Francis,2016，其通过引用整体并入本文。高的人源化百分比通常具有多个优点，例如，在人中更安全和更有效，更容易被人对象耐受和/或不太可能具有副作用。
此外，在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段还可包含一个、两个或三个重链可变区CDR，其选自SEQ ID NO:1-3、SEQ ID NO:7-9、SEQ ID NO:7、13、14，SEQID NO:16、17、3，SEQ ID NO:18、19、9和SEQ ID NO:20、21、14；和/或一个、两个或三个轻链可变区CDR，其选自SEQ ID NO:4-6、SEQ ID NO 10-12和SEQ ID NO:10、11、15。
在一些实施方案中，所述抗体可具有：包含互补决定区(CDR)1、2、3的重链可变区(VH)，其中所述CDR1区包含与选择的VH CDR1氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成，所述CDR2区包含与选择的VH CDR2氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成，并且所述CDR3区包含与选择的VHCDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成；以及包含CDR1、2、3的轻链可变区(VL)，其中所述CDR1区包含与选择的VL CDR1氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成，所述CDR2区包含与选择的VLCDR2氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成，并且所述CDR3区包含与选择的VL CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成。所述选择的VH CDR 1、2、3氨基酸序列和所述选择的VL CDR 1、2、3氨基酸序列在图16(Kabat CDR)和图17(Chothia CDR)中示出。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:1；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:2；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:3。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:7；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:8；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:9。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:7；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:13；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:14。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:16；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:17；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:3。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:18；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:19；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:9。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:20；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:21；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:14。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:4；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:5；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:6。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:10；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:11；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:12。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含以下CDR中的一个、两个或三个：具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:10；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:11；具有0、1或2个氨基酸插入、缺失或替换的SEQ ID NO:15。
所述插入、缺失和替换可在CDR序列内，或者在CDR序列的一个或两个末端。
本公开内容还提供了结合PD-1的抗体或其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含与选择的VH序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成；以及轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含与选择的VL序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，所述选择的VH序列是SEQ ID NO:26、27、28或39，并且所述选择的VL序列是SEQ ID NO:29、30、31或40。在一些实施方案中，所述选择的VH序列是SEQ ID NO:32、33、34、35或41，并且所述选择的VL序列是SEQ ID NO:36、37、38或42。在一些实施方案中，所述选择的VH序列是SEQ ID NO:43，并且所述选择的VL序列是SEQ ID NO:44。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的百分比同一性，将序列出于最佳比较目的而对齐(例如，可在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入缺口以用于最佳对齐，并且出于比较目的可忽略非同源序列)。出于比较目的而对齐的参考序列的长度为参考序列的长度的至少80％，并且在一些实施方案中为至少90％、95％或100％。然后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被第二序列中相应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置处相同。两个序列之间的百分比同一性是在考虑为两个序列的最佳对齐而需要引入的缺口数目和每个缺口的长度的情况下，序列共有的相同位置的数目的函数。为本公开内容的目的，序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定可以使用Blossum 62评分矩阵来完成，其中空位罚分为12，空位延伸罚分为4并且移码空位罚分为5。
本公开内容还提供了核酸，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链。免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链包含如图16或图17中所示的CDR，或者具有如图19或图20中所示的序列。当多肽与相应的多肽(例如，相应的重链可变区或相应的轻链可变区)配对时，配对的多肽与PD-1(例如人PD-1)结合。
抗PD-1抗体和抗原结合片段也可以是抗体或抗体片段的抗体变体(包括衍生物和缀合物)，和多特异性(例如双特异性)抗体或抗体片段。本文提供的另外的抗体是多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性抗体(多聚体抗体，例如双特异性抗体)、人抗体、嵌合抗体(例如人-小鼠嵌合体)、单链抗体、细胞内产生的抗体(即胞内抗体(intrabody))，及其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是IgG抗体或其抗原结合片段。
抗体的片段适合用于所提供的方法，只要其保留了全长抗体的期望亲和力和特异性即可。因此，结合PD-1的抗体的片段将保留结合PD-1的能力。Fv片段是包含完整抗原识别和结合位点的抗体片段。该区域由紧密缔合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成，所述缔合在性质上可以是共价的，例如在scFv中。以此配置，每个可变结构域的三个CDR相互作用以定义在VH-VL二聚体的表面上的抗原结合位点。六个CDR或其子集共同为抗体赋予抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或Fv的仅包含三个对抗原具有特异性的CDR的一半)也可具有识别和结合抗原的能力，但是通常亲和力低于整个结合位点。
单链Fv或(scFv)抗体片段包含抗体的VH和VL结构域(或区域)，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，scFv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的期望结构。
Fab片段包含轻链的可变结构域和恒定结构域以及重链的可变结构域和第一恒定结构域(CH1)。F(ab')2抗体片段包含一对Fab片段，它们通常在其羧基末端附近通过其之间的铰链半胱氨酸共价连接。抗体片段的其他化学偶联在本领域中也是已知的。
双抗体是具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含在同一条多肽链中的与VL连接的VH(VH和VL)。通过使用太短以至于不允许同一条链上的两个结构域之间配对的接头，这些结构域被迫与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。
线性抗体包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，其与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性或单特异性的。
本公开内容的抗体和抗体片段可在Fc区中进行修饰以提供期望的效应功能或血清半衰期。
抗体的多聚化可通过抗体的天然聚集或通过本领域已知的化学或重组连接技术来实现。例如，一定百分比的纯化的抗体制备物(例如，纯化的IgG1分子)自发形成包含抗体同二聚体和其他更高阶抗体多聚体的蛋白质聚集体。
或者，可通过本领域已知的化学连接技术形成抗体同型二聚体。例如，可使用异型双功能交联剂来形成抗体多聚体，所述交联剂包括但不限于SMCC(琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯)和SATA(N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代-乙酸酯)。Ghetie等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:7509-7514,1997)描述了用于形成抗体同型二聚体的示例性方案。可通过用胃蛋白酶消化将抗体同型二聚体转化为Fab’2同型二聚体。形成抗体同型二聚体的另一种方法是通过使用Zhao等(J.Immunol.25:396-404,2002)中所述的自亲性(autophilic)T15肽。
在一些实施方案中，所述多特异性抗体是双特异性抗体。双特异性抗体可通过改造一对抗体分子之间的界面以使从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化来制备。例如，所述界面可包含抗体恒定结构域的CH3结构域的至少一部分。在该方法中，将来自第一抗体分子的界面的一个或多个小氨基酸侧链替换为较大的侧链(例如，酪氨酸或色氨酸)。针对大侧链的相同或相似尺寸的补偿性“腔”在第二抗体分子的界面上通过将大的氨基酸侧链替换为较小的侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)产生。这提供了一种提高异二聚体相对于其他不需要的最终产物(例如同二聚体)的产量的机制。该方法描述于例如WO 96/27011中，其通过引用整体并入。
双特异性抗体包括交联抗体或“异缀合物”抗体。例如，异缀合物中的一种抗体可与抗生物素蛋白偶联，并且另一种与生物素偶联。异缀合物抗体也可使用任何方便的交联方法制备。合适的交联剂和交联技术在本领域中是公知的，并且公开在美国专利No.4,676,980中，该专利通过引用整体并入本文。
由抗体片段产生双特异性抗体的方法也是本领域已知的。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等(Science 229:81,1985)描述了将完整抗体经蛋白水解切割以产生F(ab’)2片段的方法。在二硫醇络合剂亚砷酸钠的存在下使这些片段还原，以稳定邻位二硫醇并防止分子间二硫化物的形成。然后将产生的Fab’片段转化为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后通过用巯基乙胺将一种Fab’TNB衍生物还原重新转化为Fab’硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab’TNB衍生物混合以形成双特异性抗体。
本文所述的任何抗体或抗原结合片段可与稳定化分子(例如，增加抗体或其抗原结合片段在对象体内或溶液中半衰期的分子)缀合。稳定化分子的非限制性实例包括：聚合物(例如，聚乙二醇)或蛋白质(例如，血清白蛋白，例如人血清白蛋白)。稳定化分子的缀合可延长抗体或抗原结合片段在体外(例如，在组织培养物中或当以药物组合物形式储存时)或在体内(例如，在人中)的半衰期或提高其生物活性。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段可以与治疗剂缀合。包含抗体或其抗原结合片段的抗体-药物缀合物可以与治疗剂共价或非共价结合。在一些实施方案中，所述治疗剂是细胞毒性剂或细胞抑制剂(例如，细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、依米丁、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素、美登素类(例如DM-1和DM-4)、二酮类、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、表柔比星和环磷酰胺，及类似物)。
抗体特性
本文所述的抗体或其抗原结合片段可阻断PD-1与PD-L1之间的结合和/或PD-1与PD-L2之间的结合。
在一些实施方案中，通过结合PD-1，抗体可以抑制PD-1信号传导途径并上调免疫应答。因此，在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段是PD-1拮抗剂。在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是PD-1激动剂。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段可以使免疫应答、T细胞(例如，CD8+和/或CD4+细胞)的活性或数目提高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、5倍、10倍或20倍。在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段可使T细胞的活性或数目降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、5倍、10倍或20倍。
在一些实施方式中，所述抗体(或其抗原结合片段)以以下解离速率(koff)特异性结合PD-1(例如人PD-1、猴PD-1、小鼠PD-1和/或嵌合PD-1)：小于0.1s-1、小于0.01s-1、小于0.001s-1、小于0.0001s-1或小于0.00001s-1。在一些实施方案中，解离速率(koff)大于0.01s-1、大于0.001s-1、大于0.0001s-1、大于0.00001s-1或大于0.000001s-1。
在一些实施方案中，动力学缔合速率(kon)大于1x 102/Ms、大于1x 103/Ms、大于1x104/Ms、大于1x 105/Ms或大于1x 106/Ms。在一些实施方案中，动力学缔合速率(kon)小于1x105/Ms、小于1x 106/Ms或小于1x 107/Ms。
可以由动力学速率常数的商(KD＝koff/kon)推导亲和力。在一些实施方案中，KD小于1x 10-6M、小于1x 10-7M、小于1x 10-8M、小于1x 10-9M或小于1x 10-10M。在一些实施方案中，KD为小于50nM、30nM、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM或1nM。在一些实施方案中，KD大于1x 10-7M、大于1x 10-8M、大于1x 10-9M、大于1x 10-10M、大于1x 10-11M或大于1x 10-12M。在一些实施方案中，抗体以小于或等于约3nM的KD与人PD-1结合。
用于测量抗体对抗原的亲和力的一般技术包括例如ELISA、RIA和表面等离子体共振(surface plasmon resonance，SPR)。在一些实施方案中，抗体结合人PD-1(SEQ ID NO:22)、猴PD-1(例如恒河猴PD-1，SEQ ID NO:24)、嵌合PD-1(SEQ ID NO:25)和/或小鼠PD-1(SEQ ID NO:23)。在一些实施方案中，抗体不结合人PD-1(SEQ ID NO:22)、猴PD-1(例如恒河猴PD-1，SEQ ID NO:24；食蟹猴PD-1)、嵌合PD-1(SEQ ID NO:25)和/或小鼠PD-1(SEQ IDNO:23)。
在一些实施方案中，测定热稳定性。本文所述的抗体或抗原结合片段的Tm可以为大于60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95℃。
由于IgG可以被描述为多结构域蛋白，因此熔解曲线有时会显示两次转变，即第一变性温度Tm D1和第二变性温度Tm D2。这两个峰的存在通常分别指示Fc结构域(Tm D1)和Fab结构域(Tm D2)的变性。当存在两个峰时，Tm通常是指Tm D2。因此，在一些实施方案中，如本文所述的抗体或抗原结合片段的Tm D1为大于60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95℃。在一些实施方案中，本文所述的抗体或抗原结合片段的Tm D2为大于60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95℃。
在一些实施方案中，Tm、Tm D1、Tm D2小于60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95℃。
在一些实施方案中，抗体的肿瘤生长抑制百分比(TGI％)大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％。在一些实施方案中，抗体的肿瘤生长抑制百分比小于60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％。TGI％可例如在治疗开始之后3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天时或者在治疗开始之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月时确定。如本文所用，使用下式计算肿瘤生长抑制百分比(TGI％)：
TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100
Ti是第i天治疗组的平均肿瘤体积。T0是第0天治疗组的平均肿瘤体积。Vi是第i天对照组的平均肿瘤体积。V0是第0天对照组的平均肿瘤体积。
在一些实施方案中，本文所述的抗体或其抗原结合片段是PD-1拮抗剂。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段在表达PD-1的靶细胞中降低PD-1信号转导。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段例如通过提高CD4+效应T细胞增殖和/或提高CD4+效应T细胞的γ干扰素产生(例如，与用抗体或抗原结合片段治疗之前的增殖和/或细胞因子产生相比)来增强CD4+效应T细胞功能。在一些实施方案中，所述细胞因子是γ干扰素。在一些实施方案中，所述抗体或抗原结合片段提高肿瘤内(浸润)CD4+效应T细胞的数目(例如，CD4+效应T细胞的总数，或例如CD45+细胞中CD4+细胞的百分比)，例如与用抗体或抗原结合片段治疗之前的肿瘤内(浸润)CD4+T细胞的数目相比。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段提高表达γ干扰素的肿瘤内(浸润)CD4+效应T细胞的数目(例如，总的表达γ干扰素的CD4+细胞，或例如总CD4+细胞中表达γ干扰素的CD4+细胞的百分比)，例如与治疗之前的表达γ干扰素的肿瘤内(浸润)CD4+T细胞的数目相比。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段提高肿瘤内(浸润)CD8+效应T细胞的数目(例如，CD8+效应T细胞的总数，或例如CD45+细胞中CD8+细胞的百分比)，例如与治疗之前的肿瘤内(浸润)CD8+T效应细胞的数目相比。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段提高表达γ干扰素的肿瘤内(浸润)CD8+效应T细胞的数目(例如总CD8+细胞中表达γ干扰素的CD8+细胞的百分比)，例如与用抗人PD-1抗体治疗之前的表达γ干扰素的肿瘤内(浸润)CD8+T细胞的数目相比。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段例如通过提高记忆T细胞增殖和/或提高记忆细胞的细胞因子(例如，γ干扰素)产生来增强记忆T细胞功能。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段例如通过降低对效应T细胞功能(例如，效应T细胞增殖和/或效应T细胞细胞因子分泌)的Treg抑制来抑制Treg功能。在一些实施方案中，效应T细胞是CD4+效应T细胞。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段降低肿瘤内(浸润)Treg的数目(例如Treg的总数，或例如CD4+细胞中Fox3p+细胞的百分比)。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段是消耗性抗hPD-1抗体(例如，消耗表达人PD-1的细胞)。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段在体外消耗表达人PD-1的细胞。在一些实施方案中，人PD-1表达细胞是CD4+效应T细胞或Treg细胞。在一些实施方案中，消耗是通过ADCC和/或吞噬作用来进行。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段具有功能性Fc区。在一些实施方案中，功能性Fc区的效应子功能是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一些实施方案中，功能性Fc区的效应子功能是吞噬作用。在一些实施方案中，功能性Fc区的效应子功能是ADCC和吞噬作用。在一些实施方案中，Fc区是人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段在表达PD-1的细胞(例如，Treg)中不诱导凋亡。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段不具有功能性Fc区。例如，抗体或抗原结合片段是Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段。
制备抗PD-1抗体的方法
可使用用于多克隆抗体和单克隆抗体制备的标准技术将人PD-1的分离片段用作免疫原以产生抗体。可通过多次注射(例如皮下或腹腔注射)抗原性肽或蛋白质在动物中产生多克隆抗体。在一些实施方案中，抗原性肽或蛋白质与至少一种佐剂一起注射。在一些实施方案中，抗原性肽或蛋白质可与在待免疫接种的物种中具有免疫原性的试剂缀合。可向动物注射抗原性肽或蛋白质多于一次(例如两次、三次或四次)。
可使用全长多肽或蛋白质，或者替代地，可使用其抗原性肽片段作为免疫原。蛋白质的抗原性肽包含PD-1的氨基酸序列的至少8个(例如，至少10、15、20或30个)氨基酸残基，并且包含蛋白质的表位，使得针对该肽产生的抗体与所述蛋白质形成特异性免疫复合物。如上所述，人PD-1的全长序列是本领域已知的(SEQ ID NO:22)。
免疫原通常用于通过免疫接种合适的对象(例如人或表达至少一个人免疫球蛋白基因座的转基因动物)来制备抗体。合适的免疫原性制备物可包含例如重组表达或化学合成的多肽(例如人PD-1的片段)。该制备物可进一步包含佐剂，例如弗氏完全或不完全佐剂，或类似的免疫刺激剂。
可如上所述通过用PD-1多肽或其抗原性肽(例如，PD-1的一部分)作为免疫原对合适的对象进行免疫接种来制备多克隆抗体。经免疫接种对象中的抗体效价可通过标准技术随时间监测，例如使用固定化PD-1多肽或肽的酶联免疫吸附测定(ELISA)。如果需要，可从哺乳动物中(例如从血液中)分离抗体分子，并通过公知的技术例如蛋白A或蛋白G色谱进一步纯化以获得IgG部分。在免疫接种之后的适当时间，例如，当特异性抗体效价最高时，可从对象获得产生抗体的细胞，并用于通过标准技术制备单克隆抗体，例如Kohler等(Nature256:495-497,1975)最初所述的杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等,Immunol.Today4:72,1983)、EBV-杂交瘤技术(Cole等,Monoclonal Antibodies andCancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96,1985)或三瘤体(trioma)技术。用于产生杂交瘤的技术是公知的(一般参见，Current Protocols in Immunology,1994,Coligan等(Eds.),John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY)。通过例如使用标准ELISA测定筛选杂交瘤培养物上清液中结合目标多肽或表位的抗体来检测产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。
可通过将适当的核苷酸改变引入编码本文所述的人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、或其抗原结合片段的DNA中或通过肽合成来制备本文所述的抗体或抗原结合片段的变体。这类变体包括例如构成抗体或抗原结合结构域的抗原结合位点的氨基酸序列中残基的缺失、插入或替换。在这类变体的群体中，一些抗体或抗原结合片段将对靶蛋白(例如PD-1)具有提高的亲和力。可进行缺失、插入和/或组合的任意组合以获得对靶标具有提高的结合亲和力的抗体或其抗原结合片段。引入抗体或抗原结合片段中的氨基酸变化也可改变抗体或抗原结合片段或向其中引入新的翻译后修饰，例如改变(例如，增加或减少)糖基化位点的数量、改变糖基化位点的类型(例如，改变氨基酸序列以使通过细胞中存在的酶连接不同的糖)，或引入新的糖基化位点。
本文公开的抗体可来源于任何动物物种，包括哺乳动物。天然抗体的非限制性实例包括来源于以下的抗体：人、灵长类(例如猴和猿)、牛、猪、马、绵羊、骆驼科(例如骆驼和美洲驼)、鸡、山羊和啮齿动物(例如大鼠、小鼠、仓鼠和兔)，包括经过基因改造以产生人抗体的转基因啮齿动物。
人抗体和人源化抗体包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列(或与其所来源的那些具有相同的氨基酸序列)的可变区和恒定区的抗体。人抗体可包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中。
人源化抗体通常具有移植非人CDR的人框架(FR)。因此，人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或更多个氨基酸序列。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入(import)”残基，其通常取自“输入”可变结构域。人源化可基本上通过例如用啮齿动物CDR或CDR序列替代人抗体的相应序列来进行。这些方法在例如以下中描述：Jones等,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等.,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等,Science,239:1534-1536(1988)；其各自通过引用整体并入本文。因此，“人源化”抗体是嵌合抗体，其中基本上少于完整的人V结构域已被来自非人物种的相应序列替换。实际上，人源化抗体通常是小鼠抗体，其中一些CDR残基和一些FR残基被来自人抗体中类似位点的残基替换。
用于制备人源化抗体的人VH和VL结构域的选择对于降低免疫原性非常重要。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知人结构域序列的整个文库筛选小鼠抗体的V结构域的序列。然后将最接近小鼠的序列的人序列作为人源化抗体的人FR(Sims等,J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothia等,J.Mol.Biol.,196:901(1987))。
进一步重要的是将抗体进行人源化，同时保留对抗原的高特异性和亲和力以及其他有利的生物学特性。为了实现该目的，可通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型对亲本序列和各种概念性人源化产物进行分析的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是普遍可获得的并且为本领域技术人员所熟悉。说明并展示选择的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可获得的。对这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。以这种方式，可从接受体序列和输入序列中选择FR残基并进行组合，从而获得期望的抗体特征，例如对靶抗原的提高的亲和力。
通常，人、人源化或嵌合抗PD-1抗体的氨基酸序列变体将包含与原始抗体的轻链或重链中存在的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％百分比同一性的氨基酸序列。
相对于原始序列的同一性或同源性通常是在将序列对齐并引入缺口(如果必要的话)以实现最大百分比序列同一性并且不将任何保守替换视为序列同一性的一部分的情况下，候选序列中存在的与人、人源化或嵌合抗PD-1抗体或片段中存在的序列相同的氨基酸残基的百分比。
可以对抗PD-1抗体或抗原结合片段进行另外的修饰。例如，可将半胱氨酸残基引入Fc区域中，从而允许在该区域中形成链间二硫键。由此产生的同型二聚体抗体可具有任何提高的体外和/或体内半衰期。还可使用异双官能交联剂制备具有延长的体外和/或体内半衰期的同二聚体抗体，如例如Wolff等Cancer Res.53:2560-2565,1993)中所述。或者，可以改造具有两个Fc区的抗体(参见，例如Stevenson等Anti-Cancer Drug Design 3:219-230,1989)。
在一些实施方案中，可以对抗PD-1抗体或其抗原结合片段进行共价修饰。这些共价修饰可通过化学合成或酶促合成，或通过酶促裂解或化学裂解来进行。通过使抗体或片段所靶向的氨基酸残基与能够与所述选择的侧链或者N或C末端残基反应的有机衍生剂反应，将抗体或抗体片段的其他类型的共价修饰引入分子中。
在一些实施方案中，提供了具有糖结构的抗体变体，其缺乏连接(直接或间接)于Fc区域的岩藻糖。例如，这样的抗体中岩藻糖的量可以为1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。岩藻糖的量如例如WO 2008/077546中所述如通过MALDI-TOF质谱测量的通过计算相对于连接于Asn297的全部糖结构(例如复杂、杂合和高甘露糖结构)的总和的在Asn297处糖链中岩藻糖的平均量来确定。Asn297是指位于Fc区中约第297位(Fc区残基的Eu编号；或Kabat编号中的第314位)的天冬酰胺残基；然而，由于抗体中的微小序列变化，Asn297也可位于在第297位上游或下游的约±3个氨基酸，即在第294位至第300位之间。这样的岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。在一些实施方案中，为了降低聚糖的异质性，可以进一步改造抗体的Fc区以用丙氨酸代替在第297位的天冬酰胺(N297A)。
在一些实施方案中，为了通过避免Fab臂交换来促进产生效率，将抗体的Fc区进一步改造以用脯氨酸(S228P)替代IgG4的228位(EU编号)的丝氨酸。关于S228突变的详细描述可见于，例如Silva等"The S228P mutation prevents in vivo and in vitro IgG4 Fab-arm exchange as demonstrated using a combination of novel quantitativeimmunoassays and physiological matrix preparation."Journal of BiologicalChemistry 290.9(2015):5462-5469,其通过引用整体并入。
重组载体
本公开内容还提供了包含本文公开的分离的多核苷酸(例如，编码本文公开的多肽的多核苷酸)的重组载体(例如表达载体)，其中引入重组载体的宿主细胞(即，使得宿主细胞包含多核苷酸和/或含有多核苷酸的载体)，以及通过重组技术的重组抗体多肽或其片段的产生。
如本文所用，“载体”是当将其引入宿主细胞中时能够将一种或更多种目的多核苷酸递送至宿主细胞的任何构建体。“表达载体”能够递送一种或更多种目的多核苷酸并且在已引入表达载体的宿主细胞中将一种或更多种目的多核苷酸表达为编码的多肽。因此，在表达载体中，通过与在载体中或在宿主细胞基因组中的调控元件例如启动子、增强子和/或poly-A尾可操作地连接，将目的多核苷酸定位用于在载体中表达，所述调控元件在目的多核苷酸的整合位点处或附近或侧翼，使得目的多核苷酸将在引入了表达载体的宿主细胞中翻译。
可通过本领域已知的方法例如电穿孔、化学转染(例如DEAE-葡聚糖)、转化、转染和感染和/或转导(例如用重组病毒进行)来将载体引入宿主细胞中。因此，载体的非限制性实例包括病毒载体(其可用于产生重组病毒)、裸DNA或RNA、质粒、黏粒、噬菌体载体以及与阳离子凝缩剂缔合的DNA或RNA表达载体。
在一些实施方式中，使用病毒表达系统(例如牛痘病毒或其他痘病毒、逆转录病毒或腺病毒)引入本文公开的多核苷酸(例如，编码本文公开的多肽的多核苷酸)，这可涉及使用非致病性(缺陷型)的可复制型病毒，或可使用复制缺陷型病毒。在后一种情况下，病毒繁殖通常只会在互补的病毒包装细胞中发生。合适的系统公开于例如以下中：Fisher-Hoch等,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:317-321；Flexner等.,1989,Ann.N.Y.AcadSci.569:86-103；Flexner等.,1990,Vaccine,8:17-21；U.S.Pat.No.4,603,112、4,769,330和5,017,487；WO 89/01973；U.S.Pat.No.4,777,127；GB 2,200,651；EP 0,345,242；WO 91/02805；Berkner-Biotechniques,6:616-627,1988；Rosenfeld等,1991,Science,252:431-434；Kolls等,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:215-219；Kass-Eisler等,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:11498-11502；Guzman等,1993,Circulation,88:2838-2848；以及Guzman等,1993,Cir.Res.,73:1202-1207。将DNA并入这样的表达系统中的技术是本领域普通技术人员公知的。DNA也可以是“裸”的，如例如Ulmer等,1993,Science,259:1745-1749和Cohen,1993,Science,259:1691-1692中所述。可通过将DNA包被在生物可降解的珠上来提高裸DNA的摄取，所述珠有效地转运到细胞中。
为了表达，可将包含本文公开的编码抗体或编码多肽的多核苷酸的DNA插入物有效连接至合适的启动子(例如异源启动子)，例如噬菌体λPL启动子，大肠杆菌(E.coli)lac、trp和tac启动子，SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR的启动子等，以命名新的。其他合适的启动子是技术人员已知的。表达构建体可进一步包含用于转录起始、终止的位点，以及在转录区域中的用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录物的编码部分可以包含在起始处的翻译起点和适当地位于待翻译多肽末端的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。
如所示的，表达载体可包含至少一种选择标记。这样的标记包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，以及用于在大肠杆菌和其他细菌中培养的四环素或氨苄青霉素抗性基因。合适宿主的一些代表性实例包括但不限于细菌细胞，例如大肠杆菌、链霉菌(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的细胞；真菌细胞，例如酵母细胞；昆虫细胞，例如果蝇(Drosophila)S2和夜蛾(Spodoptera)Sf9细胞；动物细胞，例如CHO、COS、Bowes黑色素瘤和HK 293细胞；和植物细胞。本文所述宿主细胞的合适培养基和条件是本领域已知的。
用于细菌的非限制性载体包括可获自Qiagen的pQE70、pQE60和pQE-9；可获自Stratagene的pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A；以及可获自Pharmacia的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。非限制性的真核载体包括可获自Stratagene的pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG；以及可获自Pharmacia的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其他合适的载体对于技术人员将是显而易见的。
适合使用的非限制性细菌启动子包括大肠杆菌lacI和lacZ启动子、T3和T7启动子、gpt启动子、λPR和PL启动子以及trp启动子。合适的真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、SV40早期和晚期启动子、逆转录病毒LTR的启动子，例如劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)的启动子，以及金属硫蛋白启动子，例如小鼠金属硫蛋白-I启动子。
在酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，可使用许多含有组成型或诱导型启动子(例如α因子、醇氧化酶和PGH)的载体。综述参见Ausubel等(1989)CurrentProtocols In Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,N.Y,以及Grant等,Methods Enzymol.,153:516-544(1997)。
可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其他方法实现将构建体引入宿主细胞中。在许多标准实验室手册中描述了这样的方法，例如Davis等,Basic Methods In Molecular Biology(1986)，其通过引用整体并入本文。
可通过将增强子序列插入载体中来提高高等真核生物对编码本公开内容的抗体的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10至300bp，其在给定宿主细胞类型中起提高启动子的转录活性的作用。增强子的一些实例包括于碱基对100至270处位于复制起点的后侧的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点的后侧的多瘤病毒增强子，和腺病毒增强子。
为了将翻译的蛋白质分泌到内质网腔中、周质空间中或细胞外环境中，可将合适的分泌信号纳入表达的多肽中。信号可以是对多肽内源性的，或者其可以是异源信号。
多肽(例如抗体)可以以经修饰形式(例如融合蛋白(例如GST-融合体)或具有组氨酸标签)表达，并且可包含不仅分泌信号，而且还可包含另外的异源性功能区。例如，可向多肽的N末端添加另外的氨基酸(特别是带电荷氨基酸)的区域，以改善在宿主细胞中、在纯化期间或在随后的处理和储存期间的稳定性和持久性。另外，可以向多肽添加肽部分以便于纯化。可在最终制备多肽之前除去这些区域。向多肽添加肽部分以引起分泌或排泄、以提高稳定性和便于纯化等是本领域熟知且常规的技术。
治疗方法
本公开内容的抗体或其抗原结合片段可用于多种治疗目的。一方面，本公开内容提供了用于治疗对象中癌症的方法、减小对象中肿瘤体积随时间增大速率的方法、降低发生转移的风险的方法、或降低在对象中发生额外的转移风险的方法。在一些实施方案中，治疗可停止、减慢、延迟或抑制癌症的进展。在一些实施方案中，治疗可导致对象中癌症的一种或更多种症状的数量、严重程度和/或持续时间降低。
在一方面，本公开内容的特征在于方法，所述方法包括将治疗有效量的本文公开的抗体或其抗原结合片段施用于有此需要的对象(例如，患有癌症或被鉴定或诊断为患有癌症的对象)，例如，乳腺癌(例如三阴性乳腺癌)、类癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胶质瘤、头颈癌、肝癌、肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、结直肠癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、膀胱癌、尿道癌或恶性血液病。在一些实施方案中，癌症是不可切除的黑色素瘤或转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、膀胱癌或转移性激素难治性前列腺癌。在一些实施方案中，对象患有实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症是头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、肾细胞癌(RCC)、三阴性乳腺癌(TNBC)或结直肠癌。在一些实施方案中，对象患有霍奇金淋巴瘤。在一些实施方案中，对象患有三阴性乳腺癌(TNBC)、胃癌、尿路上皮癌、梅克尔细胞癌(Merkel-cell carcinoma)或头颈癌。
在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法可以用于治疗有癌症风险的患者。可通过本领域已知的多种方法来鉴定患有癌症的患者。
如本文所用，“有效量”意指足以产生有益或期望结果(包括停止、减慢、延迟或抑制疾病例如癌症的进展)的量或剂量。有效量将根据例如以下而变化：待施用抗体、抗原结合片段、编码抗体的多核苷酸、包含多核苷酸的载体、和/或待施用的组合物、症状的严重程度和施用途径，并且因此可根据个人情况决定施用。
可在一次或更多次施用中施用有效量。举例来说，抗体或抗原结合片段的有效量是足以改善、停止、稳定、逆转、抑制、减慢和/或延迟患者中癌症进展的量，或者是在体外足以改善、停止、稳定、逆转、减慢和/或延迟细胞(例如，活检细胞、本文所述的任何癌细胞、或细胞系(例如，癌细胞系))的增殖的量。如本领域所理解，抗体或抗原结合片段的有效量可以变化，这尤其取决于患者的病史以及其他因素，例如所使用的抗体的类型(和/或剂量)。
可凭经验确定施用本文公开的抗体、编码抗体的多核苷酸和/或组合物的有效量和时间表，并且进行这样的确定在本领域技术范围内。本领域技术人员将理解，必须施用的剂量将根据例如以下而变化：例如，将接受本文公开的抗体、编码抗体的多核苷酸和/或组合物的哺乳动物，施用途径，使用的本文公开的抗体、编码抗体的多核苷酸、抗原结合片段和/或组合物的具体类型，以及哺乳动物施用的其他药物。选择抗体或抗原结合片段的合适剂量的指南可在关于抗体和抗原结合片段的治疗用途的文献中找到，例如，Handbook ofMonoclonal Antibodies,Ferrone等,eds.,Noges Publications,ParkRidge,N.J.,1985,ch.22and pp.303-357；Smith et al.,Antibodies in Human Diagnosis and Therapy,Haber等,eds.,Raven Press,New York,1977,pp.365-389。
抗体的有效量的典型日剂量为0.01mg/kg至100mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以为小于100mg/kg、10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg或0.1mg/kg。在一些实施方案中，剂量可以为大于10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.5mg/kg、0.1mg/kg、0.05mg/kg或0.01mg/kg。在一些实施方案中，剂量为约10mg/kg、9mg/kg、8mg/kg、7mg/kg、6mg/kg、5mg/kg、4mg/kg、3mg/kg、2mg/kg、1mg/kg、0.9mg/kg、0.8mg/kg、0.7mg/kg、0.6mg/kg、0.5mg/kg、0.4mg/kg、0.3mg/kg、0.2mg/kg或0.1mg/kg。
在本文描述的任何方法中，所述至少一种抗体、其抗原结合片段或药物组合物(例如，本文所述的任何抗体、抗原结合片段或药物组合物)和任选地至少一种另外的治疗剂可至少一周一次(例如，一周一次、一周两次、一周三次、一周四次、一天一次、一天两次或一天三次)向对象施用。在一些实施方案中，在相同组合物(例如液体组合物)中施用至少两种不同的抗体和/或抗原结合片段。在一些实施方案中，在相同组合物(例如液体组合物)中施用至少一种抗体或抗原结合片段和至少一种另外的治疗剂。在一些实施方案中，所述至少一种抗体或抗原结合片段和至少一种另外的治疗剂在两种不同的组合物(例如，包含至少一种抗体或抗原结合片段的液体组合物和包含至少一种另外的治疗剂的固体口服组合物)中施用。在一些实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂以丸剂、片剂或胶囊剂施用。在一些实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂为缓释口服制剂。
在一些实施方案中，可在施用至少一种抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物(例如，本文所述的任何抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物)之前或之后向对象施用一种或更多种另外的治疗剂。在一些实施方案中，向对象施用一种或更多种另外的治疗剂和至少一种抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物(例如，本文所述的任何抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物)，使得在对象中一种或更多种另外的治疗剂与至少一种抗体或抗原结合片段(例如，本文所述的任何抗体或抗原结合片段)的生物活性期存在重叠。
在一些实施方案中，可在延长的时间段内(例如，在至少1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、1年、2年、3年、4年或5年的时间段内)向对象施用至少一种抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物(例如，本文所述的任何抗体、抗原结合抗体片段或药物组合物)。熟练的医学专业人员可使用本文所述的用于诊断或追踪治疗的有效性的任何方法(例如，观察癌症的至少一种症状)来确定治疗期的长度。如本文所述，基于对治疗有效性的评估(例如使用本文所述和本领域已知的任何方法)，熟练的医学专业人员还可改变施用于对象的抗体或抗原结合抗体片段(和/或一种或更多种另外的治疗剂)的身份和数量(例如，增加或减少)，并且还可调整(例如，提高或降低)向对象施用至少一种抗体或抗原结合抗体片段(和/或一种或更多种另外的治疗剂)的剂量或频率。
在一些实施方案中，可以将一种或更多种另外的治疗剂施用给对象。所述另外的治疗剂可以包含一种或更多种选自以下的抑制剂：B-Raf抑制剂、EGFR抑制剂、MEK抑制剂、ERK抑制剂、K-Ras抑制剂、c-Met抑制剂、间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphomakinase，ALK)抑制剂、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)抑制剂、Akt抑制剂、mTOR抑制剂、PI3K/mTOR双重抑制剂、Bruton酪氨酸激酶(Bruton's tyrosinekinase，BTK)抑制剂、以及异柠檬酸脱氢酶1(Isocitrate dehydrogenase 1，IDH1)和/或异柠檬酸脱氢酶2(Isocitrate dehydrogenase 2，IDH2)的抑制剂。在一些实施方案中，另外的治疗剂是吲哚胺-2,3-双加氧酶1(IDO1)抑制剂(例如，艾卡哚司他(epacadostat))。
在一些实施方案中，另外的治疗剂可以包含一种或更多种选自以下的抑制剂：HER3抑制剂、LSD1抑制剂、MDM2抑制剂、BCL2抑制剂、CHK1抑制剂、活化hedgehog信号传导途径的抑制剂和选择性降解雌激素受体的药剂。
在一些实施方案中，另外的治疗剂可以包含一种或更多种选自以下的治疗剂：曲贝替定(Trabectedin)、白蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitaxel)、曲巴那尼(Trebananib)、帕唑帕尼(Pazopanib)、西地尼布(Cediranib)、帕博西尼(Palbociclib)、依维莫司(everolimus)、氟嘧啶、IFL、瑞戈非尼(regorafenib)、溶素(Reolysin)、力比泰(Alimta)、赞可达(Zykadia)、索坦(Sutent)、替西罗莫司(temsirolimus)、阿昔替尼(axitinib)、依维莫司、索拉非尼(sorafenib)、维全特(Votrient)、帕唑帕尼、IMA-901、AGS-003、卡博替尼(cabozantinib)、长春氟宁(Vinflunine)、Hsp90抑制剂、Ad-GM-CSF、替莫唑胺(Temazolomide)、IL-2、IFNa、长春碱、反应停(Thalomid)、达卡巴嗪(dacarbazine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、来那度胺(lenalidomide)、阿扎胞苷(azacytidine)、来那度胺、硼替佐米(bortezomid)、氨柔比星(amrubicine)、卡非佐米(carfilzomib)、普拉曲沙(pralatrexate)和恩扎妥林(enzastaurin)。
在一些实施方案中，另外的治疗剂可以包含一种或更多种选自以下的治疗剂：佐剂、TLR激动剂、肿瘤坏死因子(TNF)α、IL-1、HMGB1、IL-10拮抗剂、IL-4拮抗剂、IL-13拮抗剂、IL-17拮抗剂、HVEM拮抗剂、ICOS激动剂、靶向CX3CL1的治疗、靶向CXCL9的治疗、靶向CXCL10的治疗、靶向CCL5的治疗、LFA-1激动剂、ICAM1激动剂和选择素(Selectin)激动剂。
在一些实施方案中，将卡铂、白蛋白结合型紫杉醇、紫杉醇、顺铂、培美曲塞(pemetrexed)、吉西他滨(gemcitabine)、FOLFOX或FOLFIRI施用给对象。
在一些实施方案中，另外的治疗剂是抗OX40抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗LAG-3抗体、抗TIGIT抗体、抗BTLA抗体、抗CTLA-4抗体或抗GITR抗体。
修饰和使用抗PD-1抗体的方法描述于例如US20170247454、US 20170081409A1、US20170044259A1和US 20160159905，其各自通过引用整体并入本文。
药物组合物和施用途径
本文还提供了包含至少一种(例如，一种、两种、三种或四种)本文所述的抗体或抗原结合片段的药物组合物。两种或更多种(例如，两种、三种或四种)本文所述的任何抗体或抗原结合片段可以以任意组合存在于药物组合物中。可以以本领域已知的任何方式配制药物组合物。
将药物组合物配制成与其预期的施用途径(例如静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下或腹腔内)相容。组合物可包含无菌稀释剂(例如无菌水或盐水)、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂或抗真菌剂，例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及等渗剂，例如糖(例如葡萄糖)、多元醇(例如甘露醇或山梨糖醇)或盐(例如氯化钠)；或其任意组合。脂质体悬浮液也可用作可药用载体(参见，例如，美国专利号4,522,811)。可配制组合物的制剂并将其封装在安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。在需要时(如在例如可注射制剂中)，可通过例如使用包衣(例如卵磷脂)或表面活性剂来维持适当的流动性。可通过包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来延长抗体或其抗原结合片段的吸收。或者，可通过植入物和微囊化的递送系统来实现控制释放，该植入物和微囊化的递送系统可包含生物可降解的生物相容性聚合物(例如，乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸；Alza Corporation和NovaPharmaceutical,Inc.)。
包含一种或更多种本文所述的任何抗体或抗原结合片段的组合物可配制成以剂量单位形式(即，包含预定量的活性化合物的物理分散单元，以易于施用和剂量均匀)进行肠胃外(例如静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下或腹腔内)施用。
组合物的毒性和治疗效力可在细胞培养物或实验动物(例如猴)中通过标准药学操作来确定。例如，可以确定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)：治疗指数为LD50:ED50的比率。表现出高治疗指数的药剂是优选的。如果药剂表现出不期望的副作用，则应注意将潜在危害降到最低(即降低不想要的副作用)。毒性和治疗效力可通过其他标准药学操作确定。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制合适剂量的任何给定药剂以用于对象(例如人)。一种或更多种(例如，一种、两种、三种或四种)抗体或其抗原结合片段(例如，本文所述的任何抗体或抗体片段)的治疗有效量是这样的量：其在对象(例如被确定为患有癌症的人对象)中，或者被确定为处于疾病发生风险之中的对象(例如先前曾发生癌症但是现在已经治愈的对象)中治疗对象中的疾病(例如杀伤癌细胞)，降低对象(例如人)中疾病的一种或更多种症状的严重程度、频率和/或持续时间。可以由健康护理专业人员或兽医专业人员使用本领域已知的方法以及通过观察对象(例如，人)中疾病的一种或更多种症状来确定本文所述的任何抗体或抗原结合片段的有效性和剂量。某些因素可影响有效治疗对象所需的剂量和时机(例如，疾病或病症的严重程度、先前的治疗、对象的总体健康和/或年龄以及其他疾病的存在)。
示例性剂量包括每千克对象体重的本文所述的任何抗体或抗原结合片段的毫克或微克量(例如，约1μg/kg至约500mg/kg；约100μg/kg至约500mg/kg；约100μg/kg至约50mg/kg；约10μg/kg至约5mg/kg；约10μg/kg至约0.5mg/kg；或约1μg/kg至约50μg/kg)。尽管这些剂量涵盖了广泛的范围，但是本领域普通技术人员将理解，包括抗体及其抗原结合片段在内的治疗剂的功效不同，并且可通过本领域已知的方法确定有效量。通常，首先施用相对较低的剂量，并且主治健康护理专业人员或兽医专业人员(在治疗应用的情况下)或研究人员(在仍处于研发阶段时)可随后并逐渐增加剂量，直到获得适当的响应。另外，应当理解，任何特定对象的具体剂量水平将取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性，对象的年龄、体重、总体健康、性别和饮食，施用时间、施用途径、排泄速率以及抗体或抗体片段在体内的半衰期。
药物组合物可与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。本公开内容还提供了制造用于本文所述的多种用途的抗体或其抗原结合片段的方法。
实施例
在以下实施例中进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求书中描述的本发明的范围。
实施例1.产生小鼠抗hPD-1抗体
为了产生针对人PD-1(hPD-1；SEQ ID NO:22)的小鼠抗体，用人PD-1免疫接种6-8周大的雌性BALB/c小鼠。通过如下所述和如图1和图2所示的方法收集抗hPD-1抗体。
小鼠的免疫接种
以100μg/ml的浓度以20μg/小鼠用经His标记的人PD-1蛋白免疫接种6-8周大的雌性BALB/c小鼠。将经His标记的人PD-1蛋白用佐剂乳化，并注射在小鼠背部的四个位置。对于第一次皮下(s.c.)注射，将稀释的抗原用等体积的完全弗氏佐剂(CFA)乳化。在随后的皮下注射中，将蛋白质用等体积的不完全弗氏佐剂(IFA)乳化。在第三次注射或加强免疫接种之后三天，收集血液(血清)并使用ELISA分析抗体效价。
在另一个实验中，通过将编码人PD-1的表达质粒注射到小鼠中来免疫接种6-8周大的雌性BALB/c小鼠。通过使用基因枪以1000μg/μl的浓度以每只小鼠60μg将编码抗原的质粒注射到小鼠的胫骨前肌中(肌内注射；i.m.注射)。进行至少四次注射，每两次注射之间间隔至少14天。在最后一次免疫接种之后7天收集血液(血清)，并通过ELISA测试血清的抗体效价。
在前一次免疫接种之后至少十四天还进行了增强免疫接种的程序(通过注射质粒或通过注射蛋白质)。将在表面表达PD-1抗原的CHO细胞通过尾静脉静脉内注射到小鼠体内。然后在注射之后四天收集脾。
SP2/0细胞与脾细胞的融合
研磨脾组织。首先通过CD3ε微珠和抗小鼠IgM微珠选择脾细胞，然后使其与SP2/0细胞融合。然后将细胞平板接种在具有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培养基的96孔板中。
杂交瘤的初步筛选
根据标准程序，使用荧光激活细胞分选(Fluorescence-Activated CellSorting，FACS)对96孔板中的杂交瘤上清液进行初步筛选。在筛选之前，将中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞添加到96孔板中(每孔2×104个细胞)。使用50μl上清液。实验中使用的抗体是：
(1)荧光素(FITC)缀合的AffiniPure F(ab)2片段山羊抗小鼠IgG，Fcγ片段特异性的；和
(2)Alexa
Figure BDA0002627470720000351
647缀合的AffiniPure F(ab)2片段山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性的。
亚克隆
使用ClonePix2进行亚克隆。简单地说，将在初步筛选中鉴定出的阳性孔转移到半固体培养基中，并鉴定和测试IgG阳性克隆。使用FITC抗小鼠IgG Fc抗体。
腹水抗体
将1×106个阳性杂交瘤细胞腹腔内注射至
Figure BDA0002627470720000361
小鼠(北京百奥赛图，中国北京(Beijing Biocytogen,Beijing,China))。通过使杂交瘤细胞在小鼠腹腔内生长来产生单克隆抗体。杂交瘤细胞在小鼠腹部扩增并且产生腹水。腹水含有高浓度的抗体，可将其收获以备后用。
抗体纯化
使用GE AKTA蛋白色谱(GE Healthcare,Chicago,Illinois,United States)纯化腹水中的抗体。25-1A7(“1A7”)、18-3F1(“3F1”)和3-6G1(“6G1”)在通过上述方法产生的小鼠抗体之中。
确定了所述抗体的VH、VL和CDR区。1A7的重链CDR1、CDR2和CDR3和轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列示出在SEQ ID NO:1-6(Kabat编号)或SEQ ID NO:16、17、3、4、5、6(Chothia编号)中。
3F1的重链CDR1、CDR2和CDR3和轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列示出在SEQ IDNO:7-12(Kabat编号)或SEQ ID NO:18、19、9、10、11、12(Chothia编号)中。
6G1的重链CDR1、CDR2和CDR3和轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列示出在SEQ IDNO:7、13、14、10、11、15(Kabat编号)或SEQ ID NO:20、21、14、10、11、15(Chothia编号)中。
实施例2.小鼠抗体的人源化
人源化的起点是小鼠抗体(例如1A7和3F1)。测定了这些小鼠抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
构建了1A7的三种人源化重链可变区变体(SEQ ID NO:26-28)和三种人源化轻链可变区变体(SEQ ID NO:29-31)，其包含不同的修饰或替换。
构建了3F1的四种人源化重链可变区变体(SEQ ID NO:32-35)和三种人源化轻链可变区变体(SEQ ID NO:36-38)，其包含不同的修饰或替换。
这些人源化重链可变区变体可以与基于相同小鼠抗体的任何轻链可变区变体组合。例如，可以将1A7-H1(SEQ ID NO:26)与基于相同小鼠抗体1A7的任何轻链可变区变体(例如1A7-K3(SEQ ID NO:31))组合，并相应地标记抗体(例如1A7-H1K3)。
然后使用BioLuminate 1.0(Schrodinger，中国上海)产生这些人源化抗体。实施例3.小鼠抗hPD-1抗体的体外测试：阻断人PD-1(hPD-1)与人PD-L1(hPD-L1)的结合
进行阻断测定以确定抗hPD-1抗体是否可阻断hPD-1与其配体hPD-L1之间的结合。
从小鼠腹水中收集抗hPD-1抗体，并通过色谱纯化。将25μl用人PD-1瞬时转染的CHO细胞加入板中的每个孔中。将纯化的抗体滴定至终浓度为50、5、0.5、0.05、0.005μg/ml。将滴定的抗体在4℃以每孔25μl添加到每个孔中，并孵育30分钟。
将50μl的Bitoin-hPD-L1添加至每个孔(每个孔中终浓度为2μg/ml)。将细胞与Bitoin-hPD-L1和抗体在4℃孵育15分钟。
在用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤两次之后，将50μl FITC标记的抗小鼠IgG Fc抗体(抗mIgGFc-FITC)以1:100的稀释度以及PE标记的链霉亲和素(链霉亲和素-PE)以1:100的稀释度添加到每个孔中，在4℃孵育30分钟，然后用PBS洗涤。通过流式细胞术确定FITC和PE的信号。
如图3所示，当小鼠抗PD-1抗体25-1A7、18-3F1和03-6G1的浓度提高时，与PD-L1结合的细胞信号降低(y轴)，同时细胞与小鼠抗PD-1抗体结合的信号增加，表明抗hPD-1抗体阻断了人PD-1与PD-L1之间的结合。
实施例4.抗hPD-1抗体针对猴、小鼠和人-小鼠嵌合PD-1的交叉反应性
在每一个实验中，用小鼠PD-1(mPD-1，SEQ ID NO:23)、猴(恒河猴)PD-1(rmPD-1，SEQ ID NO:24)或嵌合(小鼠和人)PD-1(chiPD-1，SEQ ID NO:25)转染CHO细胞。
将25μl CHO细胞添加至每个孔。将25μl纯化的抗hPD-1抗体(1μg/ml)(1A7、3F1或6G1)添加至每个孔，并在4℃孵育30分钟。
在用PBS(1200rmp，5分钟)洗涤两次之后，将50μl FITC标记的抗小鼠IgG Fc抗体(抗mIgG Fc-FITC)以1:500的稀释度添加到每个孔中，并在4℃孵育30分钟，然后用PBS洗涤(1200rmp，5分钟)。通过流式细胞术确定FITC的信号。
如图4所示，1A7、3F1和6G1与小鼠PD-1没有交叉反应，但是与rm PD-1具有强交叉反应性，并且与嵌合PD-1具有一些交叉反应性。在图4中，NC代表阴性对照。
实施例5.抗hPD-1抗体的结合亲和力
抗hPD-1抗体的结合亲和力通过表面等离子体共振(SPR)用装备有预先固定的蛋白A传感器芯片的Biacore(Biacore,INC,Piscataway N.J.)T200生物传感器测量。
将抗hPD-1抗体1A7-mHvKv-IgG4-S228P(1μg/mL)以10μL/分钟进样到BiacoreT200生物传感器中持续30秒，以达到期望的蛋白质密度(约67个响应单位(RU))。然后将浓度为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625nM的组氨酸标记的人PD-1蛋白(hPD-1-His)以30μL/分钟进样100秒。监测解离400秒。在每种滴定度的最后进样之后用甘氨酸(pH 2.0，30μL/分钟持续12秒)将芯片再生。1A7-mHvKv-IgG4-S228P的结果示于图5中。
通过使用Biacore T200评价软件3.0将数据全局拟合于1:1Langmuir结合模型来同时获得动力学缔合速率(kon)和解离速率(koff)(Karlsson,R.Roos,H.Fagerstam,L.Petersson,B.,1994.Methods Enzymology 6.99-110)。由动力学速率常数的商(KD＝koff/kon)推导亲和力。
本领域普通技术人员将理解，对于每一个受试抗体，进行相同的方法并对其参数(例如，抗体浓度)进行适当调整。例如，图6中是显示了3F1-mHvKv-IgG4-S228P的结果的图。下面表1总结了受试抗体的结果。
表1
Figure BDA0002627470720000381
Figure BDA0002627470720000391
在这些受试抗体中，1A7和3F1是实施例1中所述的小鼠抗hPD-1抗体。基于1A7和3F1，产生了包括1A7-mHvKv-IgG4-S228P和3F1-mHvKv-IgG4-S228P在内的嵌合抗hPD-1抗体。这些嵌合抗体具有来自相应的小鼠抗hPD-1抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域，以及来自人IgG4抗体的恒定结构域(包括，例如CL、CH1、CH2和CH3结构域)。
受试抗体还包括人源化抗体，例如1A7-H1K1-IgG4-S228P、1A7-H1K2-IgG4-S228P、1A7-H1K3-IgG4-S228P、1A7-H2K1-IgG4-S228P、1A7-H2K2-IgG4-S228P、1A7-H2K3-IgG4-S228P、1A7-H3K1-IgG4-S228P、1A7-H3K2-IgG4-S228P、1A7-H3K3-IgG4-S228P、3F1-H1K1-IgG4-S228P、3F1-H1K2-IgG4-S228P、3F1-H1K3-IgG4-S228P、3F1-H2K1-IgG4-S228P、3F1-H2K2-IgG4-S228P、3F1-H2K3-IgG4-S228P、3F1-H3K1-IgG4-S228P、3F1-H3K2-IgG4-S228P、3F1-H3K3-IgG4-S228P、3F1-H4K1-IgG4-S228P、3F1-H4K2-IgG4-S228P和3F1-H4K3-IgG4-S228P。人源化抗体具有人IgG4抗体恒定结构域(包括，例如CL,CH1,CH2,和CH3结构域)。重链的人源化可变结构域被编号为H1、H2、H3等；轻链的人源化可变结构域被编号为K1、K2、K3等。图19中总结了人源化可变结构域的序列。例如，1A7-H1K1-IgG4-S228P是基于小鼠抗体1A7并且具有人源化重链可变结构域H1(SEQ ID NO:26)和人源化轻链可变结构域K1(SEQID NO:29)。类似地，3F1-H1K1-IgG4-S228P是基于小鼠抗体3F1并且具有人源化重链可变结构域H1(SEQ ID NO:32)和人源化9H3轻链可变结构域K1(SEQ ID NO:36)。
下面表2总结了嵌合抗PD-1抗体和人源化抗PD-1抗体的名称和序列。为了通过避免Fab臂交换来促进产生效率，将抗体的Fc区进一步改造以用脯氨酸替代228位(EU编号)的丝氨酸(S228P)。
表2
Figure BDA0002627470720000401
Figure BDA0002627470720000411
实施例6.抗hPD-1抗体的热稳定性
使用Protein Thermal ShiftTM染料试剂盒(Thermo Fisher Scientific)和QuantStudioTM5实时PCR系统(Thermo Fisher Scientific)进行了Thermofluor分析。该测定使用与在蛋白质展开时暴露的疏水性补丁结合的荧光染料测量热稳定性。
实验是根据制造商的方案进行的。将2μL抗体、10.5μL水、5μL Protein ThermalShift缓冲液和2.5μL稀释的Protein Thermal Shift染料混合。将样品以1.6℃/秒加热到25℃，然后以0.05℃/秒加热到99℃。
下表总结了四种抗hPD-1抗体的Tm。
表3
Figure BDA0002627470720000412
Figure BDA0002627470720000421
实施例7.小鼠和嵌合抗hPD-1抗体的体内测试
为了在体内测试抗hPD-1抗体并预测这些抗体在人体中的作用，产生了人源化PD-1小鼠模型。人源化PD-1小鼠模型被改造以表达嵌合PD-1蛋白(SEQ ID NO:25)，其中小鼠PD-1蛋白的细胞外区域的一部分被相应的人PD-1细胞外区域替代。小鼠PD-1(SEQ ID NO:23)的第31-141位氨基酸残基被人PD-1(SEQ ID NO:22)的第31-141位氨基酸残基替代。人源化小鼠模型(B-hPD-1)通过显著降低人与表达小鼠PD-1的普通小鼠中临床结局之间的差异来为在临床环境中测试新的治疗性治疗提供新的工具。关于人源化PD-1小鼠模型的详细描述可以在PCT/CN2017/090320中找到，其通过引用整体并入本文。
在结肠癌模型中测试了抗hPD-1抗体对体内肿瘤生长的作用。在B-hPD-1小鼠中皮下注射MC-38肿瘤细胞(结肠腺癌细胞)。当小鼠中的肿瘤达到150±50mm3的体积时，根据肿瘤的体积将小鼠随机分到不同的组(每组5只小鼠)。
然后通过腹腔给药向小鼠注射生理盐水(PS)和抗hPD-1抗体。在每周的第一天和第四天给予抗体，持续3周(共注射6次)。
根据小鼠的体重以1mg/kg计算注射体积。测量肿瘤的长轴和短轴的长度，并且按0.5×(长轴)×(短轴)2计算了肿瘤的体积。还在注射之前在将小鼠分到不同组时(第一次抗体注射之前)、在抗体注射期期间每周两次、以及在实施安乐死之前测量小鼠的体重。
使用下式计算肿瘤生长抑制百分比(TGI％)：TGI(％)＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100。Ti是处理组在第i天的平均肿瘤体积。T0是处理组在第0天的平均肿瘤体积。Vi是对照组在第i天的平均肿瘤体积。V0是对照组在第0天的平均肿瘤体积。
进行t检验以进行统计学分析。TGI％高于60％表明肿瘤生长的显著抑制。p<0.05是指示显著差异的阈值。
小鼠抗hPD-1抗体25-1A7和18-3F1的体内结果
在四组(G1，G2，G3，G4)的每组中，分别向B-hPD-1小鼠注射生理盐水(PS)作为对照(G1)，可瑞达(Keytruda)(G2)，小鼠抗hPD-1抗体25-1A7(G3)，或小鼠抗hPD-1抗体18-3F1(G4)。在整个处理期期间监测小鼠的体重。不同组中小鼠的体重全部增加(图7和图8)。在四组之间未观察到体重的显著差异。结果表明，1A7和3F1被良好耐受，并且对小鼠无毒。
与对照组相比，用可瑞达(Keytruda)、1A7或3F1处理组中的肿瘤体积增加的程度较小(图9)。特别地，G3中的肿瘤体积小于G2；G4中的肿瘤体积小于G2。
如下表所示，还计算了在第24天(分组之后24天)的TGI％。
表4
Figure BDA0002627470720000431
嵌合抗hPD-1抗体的体内结果
通过腹腔给药将嵌合抗hPD-1抗体03-6G1-mHvKv-IgG4-S228P(第2组，G2)、18-3F1-mHvKv-IgG4-S228P(第3组，G3)、25-1A7-mHvKv-IgG4-S228P(第4组，G4)和可瑞达(Keytruda)(第5组)施用给B-hPD-1小鼠(人源化PD-1小鼠)。注射生理盐水作为对照(第1组，G1)。根据小鼠的体重以1mg/kg计算注射量。在每周的第一天和第四天给予抗体(共注射6次)。
在整个处理期期间监测小鼠的体重。不同组中小鼠的体重全部增加(图10和图11)。在不同组之间未观察到体重的显著差异。结果表明，抗hPD-1抗体被良好耐受，并且对小鼠无毒。
与对照组相比，在用嵌合抗体处理的组中肿瘤体积显示出显著差异(图12)。
如下表所示，还计算了每个处理组在第20天(分组之后20天)的TGI％。
表5
Figure BDA0002627470720000441
结果表明，嵌合抗体03-6G1-mHvKv-IgG4-S228P和25-1A7-mHvKv-IgG4-S228P显著抑制了肿瘤的生长。在这三个嵌合抗体中，25-1A7-mHvKv-IgG4-S228P的TGI％最高。
实施例8.人源化抗hPD-1抗体的体内测试
在PD-1人源化小鼠中(B-hPD-1)测试了人源化抗hPD-1抗体，以证实其对体内肿瘤生长的作用。
在B-hPD-1人源化小鼠中皮下注射MC-38肿瘤细胞(结肠腺癌细胞)。当小鼠中的肿瘤达到150±50mm3的体积时，根据肿瘤的体积将小鼠随机分到不同的组中(每组五只小鼠)。
然后向小鼠注射生理盐水作为对照(G1)、人源化抗PD-1抗体1A7-H1K3-IgG4-S228P(G2)、人源化抗PD-1抗体1A7-H2K3-IgG4-S228P(G3)或可瑞达(Keytruda)(G4)。在每周的第二天和第五天通过腹腔内注射以1mg/kg给予抗体，持续3周(共注射6次)。
在整个处理期期间监测小鼠的体重。不同组中小鼠的体重全部增加(图13和图14)。在不同组之间未观察到体重的显著差异。结果表明，小鼠对抗hPD-1抗体耐受良好，并且无毒。
在用抗hPD-1抗体处理的组中的肿瘤体积显示出显著差异(图15)。特别地，G2中的肿瘤体积小于G4；G3中的肿瘤体积小于G4。
如下表所示，还计算了每个处理组在第21天(分组之后21天)的TGI％。
表6
Figure BDA0002627470720000451
上面的结果表明，所有抗hPD-1抗体均可抑制肿瘤生长。其中，1A7-H2K3-IgG4-S228P(1mg/kg)具有最高的肿瘤生长抑制百分比。
其他实施方案
应当理解，尽管已经结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但是前述描述旨在举例说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其他方面、优点和修改方案在所附权利要求书的范围内。
序列表
<110> 祐和医药科技（北京）有限公司
<120> 抗PD-1抗体及其用途
<130> 20180223
<160> 44
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ser Tyr Ser Met Ser
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
His Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Gln Phe Tyr Tyr Gly Ser Ser Phe Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn
1 5 10 15
<210> 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
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1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Ser Tyr Trp Met His
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
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1 5 10 15
Asp
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<212> PRT
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<400> 9
Gly Val Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
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<210> 11
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<212> PRT
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<400> 11
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1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Tyr Ile Asn Pro Asn Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Gly Thr Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
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<212> PRT
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<213> 人工序列
<400> 21
Asn Pro Asn Thr Gly Tyr
1 5
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<211> 288
<212> PRT
<213> 人
<400> 22
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165 170 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
180 185 190
Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro
195 200 205
Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
210 215 220
Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro
225 230 235 240
Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly
245 250 255
Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg
260 265 270
Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
<210> 23
<211> 288
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 23
Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp
20 25 30
Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala
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Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met
50 55 60
Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala
65 70 75 80
Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln
85 90 95
Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp
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Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val
130 135 140
Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly Met Val Ile Gly Ile Met Ser Ala
165 170 175
Leu Val Gly Ile Pro Val Leu Leu Leu Leu Ala Trp Ala Leu Ala Val
180 185 190
Phe Cys Ser Thr Ser Met Ser Glu Ala Arg Gly Ala Gly Ser Lys Asp
195 200 205
Asp Thr Leu Lys Glu Glu Pro Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Val Ala
210 215 220
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Thr Ala Cys Val His Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Thr Glu Gly
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Leu Gly Ala Ser Ala Met Gly Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Leu Gln
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<210> 24
<211> 288
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<213> 猴
<400> 24
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Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Ala Ser Glu Ser Phe Val
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Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
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Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Ala Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165 170 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
180 185 190
Ser Arg Ala Ala Gln Gly Thr Ile Glu Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro
195 200 205
Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
210 215 220
Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Ala Pro
225 230 235 240
Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly
245 250 255
Leu Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg
260 265 270
Ser Pro Arg Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
<210> 25
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 25
Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Val Val
130 135 140
Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly Met Val Ile Gly Ile Met Ser Ala
165 170 175
Leu Val Gly Ile Pro Val Leu Leu Leu Leu Ala Trp Ala Leu Ala Val
180 185 190
Phe Cys Ser Thr Ser Met Ser Glu Ala Arg Gly Ala Gly Ser Lys Asp
195 200 205
Asp Thr Leu Lys Glu Glu Pro Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Val Ala
210 215 220
Tyr Glu Glu Leu Asp Phe Gln Gly Arg Glu Lys Thr Pro Glu Leu Pro
225 230 235 240
Thr Ala Cys Val His Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Thr Glu Gly
245 250 255
Leu Gly Ala Ser Ala Met Gly Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Leu Gln
260 265 270
Gly Pro Arg Pro Pro Arg His Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
<210> 26
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 26
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala His Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gln Phe Tyr Tyr Gly Ser Ser Phe Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 27
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala His Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gln Phe Tyr Tyr Gly Ser Ser Phe Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 28
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 28
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala His Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gln Phe Tyr Tyr Gly Ser Ser Phe Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 29
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 29
Asp Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Pro Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 30
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 30
Asp Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Pro Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 31
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 31
Asp Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Val Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 32
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 32
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Val Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 33
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Val Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 34
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 34
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Val Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 35
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Val Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 36
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 36
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 37
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 37
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 38
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 38
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 39
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 39
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala His Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gln Phe Tyr Tyr Gly Ser Ser Phe Trp Tyr Phe Asp Val Trp
100 105 110
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 40
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 40
Asp Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Phe Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 41
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 41
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Val Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 42
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 43
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 43
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Leu Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Asn Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Ala Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 44
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 44
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110

Claims (43)

1.一种结合PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)的抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区(VH)，所述重链可变区(VH)包含互补决定区(CDRs)1、2和3，其中所述VHCDR1区包含与选择的VH CDR1氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，所述VH CDR2区包含与选择的VH CDR2氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且所述VH CDR3区包含与选择的VH CDR3氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；以及
轻链可变区(VL)，所述轻链可变区(VL)包含CDR 1、2和3，其中所述VL CDR1区包含与选择的VL CDR1氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，所述VL CDR2区包含与选择的VL CDR2氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，并且所述VL CDR3区包含与选择的VL CDR3氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列；
其中所述选择的VH CDR 1、2和3氨基酸序列以及所述选择的VL CDR 1、2和3氨基酸序列是以下之一：
(1)所述选择的选VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:1、2、3中示出，并且所述选择的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:4、5、6中示出；
(2)所述选择的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:7、8、9中示出，并且所述选择的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:10、11、12中示出；
(3)所述选择的VH CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:7、13、14中示出，并且所述选择的VL CDR 1、2、3氨基酸序列分别在SEQ ID NO:10、11、15中示出。
2.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含分别具有SEQ ID NO:1、2和3中所示氨基酸序列的CDR 1、2、3，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:4、5和6中所示氨基酸序列的CDR 1、2、3。
3.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含分别具有SEQ ID NO:7、8和9中所示氨基酸序列的CDR 1、2、3，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:10、11和12中所示氨基酸序列的CDR 1、2、3。
4.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含分别具有SEQ ID NO:7、13和14中所示氨基酸序列的CDR 1、2、3，并且所述VL包含分别具有SEQ ID NO:10、11和15中所示氨基酸序列的CDR 1、2、3。
5.权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与人PD-1特异性结合。
6.权利要求1至5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是人源化的抗体或其抗原结合片段。
7.权利要求1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是单链可变片段(scFV)。
8.一种核酸，其包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含：
(1)包含重链可变区(VH)的免疫球蛋白重链或其片段，所述重链可变区(VH)包含分别含有SEQ ID NO:1、2和3中所示氨基酸序列的互补决定区(CDRs)1、2和3，并且其中所述VH在与包含SEQ ID NO:29、30、31或40中所示氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合PD-1；
(2)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有SEQ ID NO:4、5和6中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含SEQ ID NO:26、27、28或39中所示氨基酸序列的VH配对时结合PD-1；
(3)包含重链可变区(VH)的免疫球蛋白重链或其片段，所述重链可变区(VH)包含分别含有SEQ ID NO:7、8和9中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含SEQ IDNO:36、37、38或42中所示氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合PD-1；
(4)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有SEQ ID NO:10、11和12中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含SEQ ID NO:32、33、34、35或41中所示氨基酸序列的VH配对时结合PD-1；
(5)包含重链可变区(VH)的免疫球蛋白重链或其片段，所述重链可变区(VH)包含分别含有SEQ ID NO:7、13和14中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VH在与包含SEQID NO:44中所示氨基酸序列的轻链可变区(VL)配对时结合PD-1；
(6)包含VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有SEQ ID NO:10、11和15中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3，并且其中所述VL在与包含SEQ ID NO:43中所示氨基酸序列的VH配对时结合PD-1。
9.权利要求8所述的核酸，其中所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有SEQ ID NO:1、2和3中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3。
10.权利要求8所述的核酸，其中所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有SEQ ID NO:4、5和6中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3。
11.权利要求8所述的核酸，其中所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有SEQ ID NO:7、8和9中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3。
12.权利要求8所述的核酸，其中所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有SEQ ID NO:10、11和12中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3。
13.权利要求8所述的核酸，其中所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VH的免疫球蛋白重链或其片段，所述VH包含分别含有SEQ ID NO:7、13和14中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3。
14.权利要求8所述的核酸，其中所述核酸包含编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含含有VL的免疫球蛋白轻链或其片段，所述VL包含分别含有SEQ ID NO:10、11和15中所示氨基酸序列的CDR 1、2和3。
15.权利要求8至14中任一项所述的核酸，其中所述VH在与VL配对时与人PD-1特异性结合，或者所述VL在与VH配对时与人PD-1特异性结合。
16.权利要求8至15中任一项所述的核酸，其中所述免疫球蛋白重链或其片段是人源化的免疫球蛋白重链或其片段，并且所述免疫球蛋白轻链或其片段是人源化的免疫球蛋白轻链或其片段。
17.权利要求8至16中任一项所述的核酸，其中所述核酸编码单链可变片段(scFv)。
18.权利要求8至17中任一项所述的核酸，其中所述核酸是cDNA。
19.一种载体，其包含权利要求8至18中任一项所述的一种或更多种核酸。
20.一种载体，其包含权利要求8至18中任一项所述核酸中的两种，其中所述载体编码VL区和VH区，所述VL区和VH区一起结合PD-1。
21.一种载体对，其中每个载体包含权利要求8至18中任一项所述的一种核酸，其中所述载体对一起编码VL区和VH区，所述VL区和VH区一起结合PD-1。
22.一种细胞，其包含权利要求19或20所述的载体或权利要求21所述的载体对。
23.权利要求22所述的细胞，其中所述细胞是CHO细胞。
24.一种细胞，其包含权利要求8至18中任一项所述的一种或更多种核酸。
25.一种细胞，其包含权利要求8至18中任一项所述核酸中的两种。
26.权利要求25所述的细胞，其中所述两种核酸一起编码VL区和VH区，所述VL区和VH区一起结合PD-1。
27.产生抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括：
(a)在足以使权利要求22至26中任一项所述的细胞产生所述抗体或抗原结合片段的条件下培养所述细胞；以及
(b)收集由所述细胞产生的所述抗体或抗原结合片段。
28.一种结合PD-1的抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区(VH)包含与选择的VH序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区(VL)包含与选择的VL序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所述选择的VH序列和所述选择的VL序列是以下之一：
(1)所述选择的VH序列是SEQ ID NO:26、27、28或39，并且所述选择的VL序列是SEQ IDNO:29、30、31或40；
(2)所述选择的VH序列是SEQ ID NO:32、33、34、35或41，并且所述选择的VL序列是SEQID NO:36、37、38或42；
(3)所述选择的VH序列是SEQ ID NO:43，并且所述选择的VL序列是SEQ ID NO:44。
29.权利要求28所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含SEQ ID NO:26的序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:31的序列。
30.权利要求28所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含SEQ ID NO:27的序列，并且所述VL包含SEQ ID NO:31的序列。
31.权利要求28至31中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与人PD-1特异性结合。
32.权利要求28至32中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是人源化的抗体或其抗原结合片段。
33.权利要求28至30中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是单链可变片段(scFV)。
34.一种抗体-药物缀合物，其包含与治疗剂共价结合的权利要求1至7和28至33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
35.权利要求34所述的抗体药物缀合物，其中所述治疗剂是细胞毒性剂或细胞抑制剂。
36.一种治疗患有癌症的对象的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含权利要求1至7和28至33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或者权利要求34或35所述的抗体-药物缀合物。
37.权利要求36所述的方法，其中所述对象患有实体瘤。
38.权利要求36所述的方法，其中所述癌症是不可切除的黑色素瘤或转移性黑色素瘤。
39.权利要求36所述的方法，其中所述癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈部鳞状细胞癌(SCCHN)、头颈癌、肾细胞癌(RCC)、黑色素瘤、膀胱癌、胃癌、尿路上皮癌、梅克尔细胞癌、三阴性乳腺癌(TNBC)或结直肠癌。
40.一种降低肿瘤生长速率的方法，所述方法包括：
使肿瘤细胞与有效量的组合物接触，所述组合物包含权利要求1至7和28至33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或者权利要求34或35所述的抗体-药物缀合物。
41.一种杀伤肿瘤细胞的方法，所述方法包括：
使肿瘤细胞与有效量的组合物接触，所述组合物包含权利要求1至7和28至33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或者权利要求34或35所述的抗体-药物缀合物。
42.一种药物组合物，其包含权利要求1至7和28至33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，以及可药用载体。
43.一种药物组合物，其包含权利要求34或35所述的抗体药物缀合物，以及可药用载体。
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