CN112099216A - 一种电动荧光显微镜的调焦方法 - Google Patents

一种电动荧光显微镜的调焦方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种电动荧光显微镜的调焦方法，特点是选取已装载的切片为目标物，将载物台沿显微镜Z轴移动，采集目标物的若干幅多焦面图像，构成图像序列；对图像序列中的每一幅图像进行清晰度计算，分别得到每幅图像的清晰度，将所有图像的清晰度生成清晰度序列；遍历清晰度序列，得到清晰度最大的图像，将清晰度最大的图像所对应的位置作为对焦位置；沿显微镜Z轴调整载物台至对焦位置即完成调焦；优点是在对采集的图像进行清晰度计算时，采用阈值分割得到有效图，一方面使得图像的计算目的性更强；另一方面提高了计算的时效性，加快对焦收敛的速度，有效地提高了计算清晰度的性能，使得能更好地适应切片在弱荧光或淬灭快情况下的调焦。

Description

一种电动荧光显微镜的调焦方法
技术领域
本发明涉及一种显微镜调焦方法，尤其是一种电动荧光显微镜的调焦方法。
背景技术
荧光扫描是电动显微镜的重要应用场景，是一种将荧光切片转换成数字化切片的重要方法。但对于荧光切片来说，一方面切片制片工艺的水平参差不齐，另一方面受限于荧光光强较弱，还有一方面当暴露在激发光下时会导致切片淬灭时间较短，从而导致整张切片的焦平面位置不同，若使用定焦面会导致扫描过程中由于焦面不同而产生模糊。因此在扫描过程中，自动对焦是必不可少的过程。由于显微镜式的自动对焦方式一般采用被动对焦的方式，即搜索清晰度最高的位置记录下来，控制执行机构返回到该位置，所以清晰度的计算会直接影响到对焦位置的准确性。
现有的自动对焦中的清晰度计算方法一般采用选择区域计算梯度取平均或者整张图像计算梯度取平均值的方法，来作为整个图像的清晰度，但存在如下问题：在处理纹理信息较丰富的图像时，由于梯度复杂，计算的时间以及取平均的过程效率会很低；在处理纹理信息稀疏的图像时，由于平均值过低会导致计算机无法区分噪声与信号，导致计算错误而最终对焦失败；若使用选择区域统计的计算方法，则在面对离散的荧光切片的环境下，由于采样的区域内没有有效信息，会导致计算错误，同样会最终对焦失败。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种电动荧光显微镜的调焦方法，不但能解决传统自动对焦中的清晰度计算对于弱荧光、淬灭快无法自适应的问题，而且能提升自动调焦过程的稳定性和准确性。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种电动荧光显微镜的调焦方法，包括以下步骤：
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE002
，选取已装载的切片为目标物，将载物台沿显微镜Z轴移动，使用面阵相机拍摄并采集所述的目标物的若干幅多焦面图像，构成图像序列；
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE004
，对所述的图像序列中的每一幅图像进行清晰度计算，分别得到每幅图像的清晰度，将所有图像的清晰度生成清晰度序列，具体的清晰度计算方法为：
Figure 655483DEST_PATH_IMAGE004
-1，卷积运算：利用拉普拉斯梯度算子对每幅图像进行卷积获得梯度强度图，记为
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE006
；
Figure 759575DEST_PATH_IMAGE004
-2，设置梯度阈值
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE008
，根据梯度阈值
Figure 476995DEST_PATH_IMAGE008
对梯度强度图
Figure 872204DEST_PATH_IMAGE006
进行阈值分割，得到梯度强度图
Figure 811210DEST_PATH_IMAGE006
所对应的有效图，记为
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE010
；
Figure 820623DEST_PATH_IMAGE004
-3，统计所述的有效图
Figure 25340DEST_PATH_IMAGE010
中所有像素点的像素值累加和与所述的有效图M中像素值非零的像素点的个数，计算每幅图像的清晰度；
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE012
，遍历所述的清晰度序列，得到清晰度最大的图像，将清晰度最大的图像所对应的位置作为对焦位置；
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE014
，沿显微镜Z轴调整载物台至对焦位置即完成调焦。
所述的步骤
Figure 411191DEST_PATH_IMAGE002
的具体方法为：
Figure 17752DEST_PATH_IMAGE002
-1，选取已装载的切片为目标物，设定沿显微镜Z轴调节载物台的调焦范围，并根据调焦范围设定步长，将载物台调整至初始位置，并使用面阵相机拍摄目标物得到初始位置图像；
Figure 11116DEST_PATH_IMAGE002
-2，调节载物台沿显微镜Z轴移动一个步长，使用面阵相机拍摄目标物得到该位置图像，然后判断载物台是否移动到结束位置，若载物台到达结束位置，则进入下一步骤；若载物台没有到达结束位置，则调节载物台沿显微镜Z轴再移动一个步长，并使用面阵相机拍摄目标物得到该位置图像，直到载物台到达结束位置，并使用面阵相机拍摄目标物得到结束位置图像。
所述的拉普拉斯梯度算子为
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE016
。
所述的步骤
Figure 907657DEST_PATH_IMAGE004
-2中，具体的阈值分割方法为：将梯度强度图
Figure 644669DEST_PATH_IMAGE006
中第
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE018
行第
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE020
列像素点的像素值表示为
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE022
，将第
Figure 292688DEST_PATH_IMAGE018
行第
Figure 909483DEST_PATH_IMAGE020
列像素点对应的有效图
Figure 88792DEST_PATH_IMAGE010
中的像素点的像素值表示为
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE024
，遍历梯度强度图
Figure 550866DEST_PATH_IMAGE006
中所有的像素点，且将每个像素点的像素值
Figure 132020DEST_PATH_IMAGE022
与梯度阈值
Figure 467187DEST_PATH_IMAGE008
进行比较，若
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE026
，则
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE028
；若
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE030
，则
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE032
。
所述的步骤
Figure 507693DEST_PATH_IMAGE004
-3的具体方法为：统计有效图
Figure 586507DEST_PATH_IMAGE010
中所有像素点的像素值累加和
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE034
，统计有效图M中像素值非零的像素点的个数，记为
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE036
，
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE038
，其中
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE040
表示有效图
Figure 146801DEST_PATH_IMAGE010
的宽，
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE042
表示有效图
Figure 105399DEST_PATH_IMAGE010
的高，
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE044
表示有效图
Figure 993721DEST_PATH_IMAGE010
中第
Figure 69036DEST_PATH_IMAGE018
行第
Figure 421520DEST_PATH_IMAGE020
列像素点的像素值，计算每幅图像的清晰度，记为
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE046
，
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE048
。其中，清晰度
Figure 488702DEST_PATH_IMAGE046
越大表示图像越清晰。
所述的梯度阈值TH的取值范围为
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE050
。
所述的梯度阈值
Figure 926637DEST_PATH_IMAGE008
为127。
与现有技术相比，本发明的优点在于在对采集的图像进行清晰度计算时，采用阈值分割得到有效图，一方面弃用了无效数据，使得图像的计算目的性更强，有效地保证了最终结果的合理性；另一方面对于有效图可同时得到有效像素点个数和所有像素点的像素值累加和，提高了计算的时效性，加快对焦收敛的速度，不但在计算清晰度时鲁棒性好，而且有效地提高了计算清晰度的性能，使得能更好地适应切片在弱荧光或淬灭快情况下的调焦。
附图说明
图1为本发明的整体流程示意图；
图2为使用未改进的现有技术对目标物进行检测的结果示意图片；
图3为使用本发明的方法对目标物进行检测的结果示意图片。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
如图1所示，一种电动荧光显微镜的调焦方法，包括以下步骤：
Figure 284937DEST_PATH_IMAGE002
，选取已装载的切片为目标物，将载物台沿显微镜Z轴移动，使用面阵相机拍摄并采集目标物的若干幅多焦面图像，构成图像序列，具体方法为：
Figure 944457DEST_PATH_IMAGE002
-1，选取已装载的切片为目标物，设定沿显微镜Z轴调节载物台的调焦范围，并根据调焦范围设定步长，将载物台调整至初始位置，并使用面阵相机拍摄目标物得到初始位置图像；
Figure 57907DEST_PATH_IMAGE002
-2，调节载物台沿显微镜Z轴移动一个步长，使用面阵相机拍摄目标物得到该位置图像，然后判断载物台是否移动到结束位置，若载物台到达结束位置，则进入下一步骤；若载物台没有到达结束位置，则调节载物台沿显微镜Z轴再移动一个步长，并使用面阵相机拍摄目标物得到该位置图像，直到载物台到达结束位置，并使用面阵相机拍摄目标物得到结束位置图像；
Figure 920820DEST_PATH_IMAGE004
，对图像序列中的每一幅图像进行清晰度计算，分别得到每幅图像的清晰度，将所有图像的清晰度生成清晰度序列，具体的清晰度计算方法为：
Figure 145128DEST_PATH_IMAGE004
-1，卷积运算：利用拉普拉斯梯度算子对每幅图像进行卷积获得梯度强度图，记为
Figure 393576DEST_PATH_IMAGE006
；本发明中拉普拉斯梯度算子为
Figure 677927DEST_PATH_IMAGE016
；
Figure 28137DEST_PATH_IMAGE004
-2，设置梯度阈值
Figure 180769DEST_PATH_IMAGE008
，根据梯度阈值
Figure 362352DEST_PATH_IMAGE008
对梯度强度图
Figure 738975DEST_PATH_IMAGE006
进行阈值分割，得到梯度强度图
Figure 638798DEST_PATH_IMAGE006
所对应的有效图，记为
Figure 267226DEST_PATH_IMAGE010
，具体的阈值分割方法为：
将梯度强度图
Figure 755845DEST_PATH_IMAGE006
中第
Figure 116419DEST_PATH_IMAGE018
行第
Figure 441221DEST_PATH_IMAGE020
列像素点的像素值表示为
Figure 811023DEST_PATH_IMAGE022
，将第
Figure 882709DEST_PATH_IMAGE018
行第
Figure 679764DEST_PATH_IMAGE020
列像素点对应的有效图
Figure 226283DEST_PATH_IMAGE010
中的像素点的像素值表示为
Figure 399776DEST_PATH_IMAGE024
，遍历梯度强度图
Figure 597408DEST_PATH_IMAGE006
中所有的像素点，且将每个像素点的像素值
Figure 565364DEST_PATH_IMAGE022
与梯度阈值
Figure 599179DEST_PATH_IMAGE008
进行比较，若
Figure 310783DEST_PATH_IMAGE026
，则
Figure 362921DEST_PATH_IMAGE028
；若
Figure 501778DEST_PATH_IMAGE030
，则
Figure 22890DEST_PATH_IMAGE032
；梯度阈值TH的取值范围为
Figure 459556DEST_PATH_IMAGE050
；本发明中梯度阈值
Figure 444830DEST_PATH_IMAGE008
为127；
Figure 692271DEST_PATH_IMAGE004
-3，统计有效图
Figure 762996DEST_PATH_IMAGE010
中所有像素点的像素值累加和
Figure 3353DEST_PATH_IMAGE034
，统计有效图M中像素值非零的像素点的个数，记为
Figure 843133DEST_PATH_IMAGE036
，
Figure 261476DEST_PATH_IMAGE038
，其中
Figure 553917DEST_PATH_IMAGE040
表示有效图
Figure 597965DEST_PATH_IMAGE010
的宽，
Figure 292252DEST_PATH_IMAGE042
表示有效图
Figure 881496DEST_PATH_IMAGE010
的高，
Figure 926812DEST_PATH_IMAGE044
表示有效图
Figure 508972DEST_PATH_IMAGE010
中第
Figure 57765DEST_PATH_IMAGE018
行第
Figure 83490DEST_PATH_IMAGE020
列像素点的像素值，计算每幅图像的清晰度，记为
Figure 350524DEST_PATH_IMAGE046
，
Figure 736374DEST_PATH_IMAGE048
；
Figure 77357DEST_PATH_IMAGE012
，遍历清晰度序列，得到清晰度最大的图像，将清晰度最大的图像所对应的位置作为对焦位置；
Figure 336300DEST_PATH_IMAGE014
，沿显微镜Z轴调整载物台至对焦位置即完成调焦。

Claims (7)

1.一种电动荧光显微镜的调焦方法，其特征在于包括以下步骤：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
，选取已装载的切片为目标物，将载物台沿显微镜Z轴移动，使用面阵相机拍摄并采集所述的目标物的若干幅多焦面图像，构成图像序列；
Figure DEST_PATH_IMAGE004
，对所述的图像序列中的每一幅图像进行清晰度计算，分别得到每幅图像的清晰度，将所有图像的清晰度生成清晰度序列，具体的清晰度计算方法为：
Figure 926811DEST_PATH_IMAGE004
-1，卷积运算：利用拉普拉斯梯度算子对每幅图像进行卷积获得梯度强度图，记为
Figure DEST_PATH_IMAGE006
；
Figure 850774DEST_PATH_IMAGE004
-2，设置梯度阈值
Figure DEST_PATH_IMAGE008
，根据梯度阈值
Figure 872694DEST_PATH_IMAGE008
对梯度强度图
Figure 302538DEST_PATH_IMAGE006
进行阈值分割，得到梯度强度图
Figure 216268DEST_PATH_IMAGE006
所对应的有效图，记为
Figure DEST_PATH_IMAGE010
；
Figure 943921DEST_PATH_IMAGE004
-3，统计所述的有效图
Figure 587392DEST_PATH_IMAGE010
中所有像素点的像素值累加和与所述的有效图M中像素值非零的像素点的个数，计算每幅图像的清晰度；
Figure DEST_PATH_IMAGE012
，遍历所述的清晰度序列，得到清晰度最大的图像，将清晰度最大的图像所对应的位置作为对焦位置；
Figure DEST_PATH_IMAGE014
，沿显微镜Z轴调整载物台至对焦位置即完成调焦。
2.根据权利要求1所述的一种电动荧光显微镜的调焦方法，其特征在于所述的步骤
Figure 53052DEST_PATH_IMAGE002
的具体方法为：
Figure 781973DEST_PATH_IMAGE002
-1，选取已装载的切片为目标物，设定沿显微镜Z轴调节载物台的调焦范围，并根据调焦范围设定步长，将载物台调整至初始位置，并使用面阵相机拍摄目标物得到初始位置图像；
Figure 798471DEST_PATH_IMAGE002
-2，调节载物台沿显微镜Z轴移动一个步长，使用面阵相机拍摄目标物得到该位置图像，然后判断载物台是否移动到结束位置，若载物台到达结束位置，则进入下一步骤；若载物台没有到达结束位置，则调节载物台沿显微镜Z轴再移动一个步长，并使用面阵相机拍摄目标物得到该位置图像，直到载物台到达结束位置，并使用面阵相机拍摄目标物得到结束位置图像。
3.根据权利要求1所述的一种电动荧光显微镜的调焦方法，其特征在于所述的拉普拉斯梯度算子为
Figure DEST_PATH_IMAGE016
。
4.根据权利要求1所述的一种电动荧光显微镜的调焦方法，其特征在于所述的步骤
Figure 483399DEST_PATH_IMAGE004
-2中，具体的阈值分割方法为：将梯度强度图
Figure DEST_PATH_IMAGE018
中第
Figure DEST_PATH_IMAGE020
行第
Figure DEST_PATH_IMAGE022
列像素点的像素值表示为
Figure DEST_PATH_IMAGE024
，将第
Figure 114100DEST_PATH_IMAGE020
行第
Figure 268001DEST_PATH_IMAGE022
列像素点对应的有效图
Figure DEST_PATH_IMAGE026
中的像素点的像素值表示为
Figure DEST_PATH_IMAGE028
，遍历梯度强度图
Figure 337457DEST_PATH_IMAGE018
中所有的像素点，且将每个像素点的像素值
Figure 627624DEST_PATH_IMAGE024
与梯度阈值
Figure DEST_PATH_IMAGE030
进行比较，若
Figure DEST_PATH_IMAGE032
，则
Figure DEST_PATH_IMAGE034
；若
Figure DEST_PATH_IMAGE036
，则
Figure DEST_PATH_IMAGE038
。
5.根据权利要求1所述的一种电动荧光显微镜的调焦方法，其特征在于所述的步骤
Figure 6391DEST_PATH_IMAGE004
-3的具体方法为：统计有效图
Figure 444325DEST_PATH_IMAGE026
中所有像素点的像素值累加和
Figure DEST_PATH_IMAGE040
，统计有效图M中像素值非零的像素点的个数，记为
Figure DEST_PATH_IMAGE042
，
Figure DEST_PATH_IMAGE044
，其中
Figure DEST_PATH_IMAGE046
表示有效图
Figure 927259DEST_PATH_IMAGE026
的宽，
Figure DEST_PATH_IMAGE048
表示有效图
Figure 580920DEST_PATH_IMAGE026
的高，
Figure DEST_PATH_IMAGE050
表示有效图
Figure 366474DEST_PATH_IMAGE026
中第
Figure 478655DEST_PATH_IMAGE020
行第
Figure 702963DEST_PATH_IMAGE022
列像素点的像素值，计算每幅图像的清晰度，记为
Figure DEST_PATH_IMAGE052
，
Figure DEST_PATH_IMAGE054
。
6.根据权利要求1所述的一种电动荧光显微镜的调焦方法，其特征在于所述的梯度阈值TH的取值范围为
Figure DEST_PATH_IMAGE056
。
7.根据权利要求6所述的一种电动荧光显微镜的调焦方法，其特征在于所述的梯度阈值
Figure 154673DEST_PATH_IMAGE030
为127。
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