CN112098376A - 磁镊荧光装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种磁镊荧光装置，包括光源，所述光源发射的可见光用于入射至样品以获得样品的衍射光；位于所述光源和样品之间的磁铁；激光组件；电动平台，其用于调节所述激光组件发射的激光的方向并沿着与所述可见光相反的反向入射到所述样品上；明场成像装置，其用于对所述样品的衍射光进行成像；荧光成像装置；以及位于所述样品和电动平台的光路之间的荧光接收装置，其用于将所述样品的衍射光反射到所述明场成像装置中，用于使得所述电动平台出射的激光入射至所述样品，以及用于接收所述样品发射的荧光并反射到所述荧光成像装置中。本发明的磁镊荧光装置能够同时获得生物大分子的动态组装过程和生物大分子之间相互作用的动力学过程。

Description

磁镊荧光装置
技术领域
本发明涉及磁镊领域，具体涉及一种磁镊荧光装置。
背景技术
单分子磁镊操纵技术已经成功应用于解决生物学重大问题，例如利用磁镊操纵生物大分子(例如染色质)，观察其在磁力作用下的动态折叠和展开过程，同时可以追踪染色质在特定的表观遗传因子作用下的动态折叠与展开过程。这种通过施加磁力来主动拆解染色质，并跟踪其在磁力下的形变来获取生物大分子的动态结构的操纵技术，为研究染色质的结构动力学以及不同的表观遗传调控因素对于染色质调控作用提供了有效的研究平台。
然而，现有的磁镊技术只能获得生物大分子的动态结构变化，无法得到动态结构变化发生的具体位点和生物大分子之间相互作用的位点。
发明内容
针对现有技术存在的上述技术问题，本发明提供了一种磁镊荧光装置，包括：
光源，所述光源发射的可见光用于入射至样品以获得样品的衍射光；
位于所述光源和样品之间的磁铁；
激光组件，其用于发射出激光；
电动平台，其用于调节所述激光组件发射的激光的方向并沿着与所述可见光相反的反向入射到所述样品上；
明场成像装置，其用于对所述样品的衍射光进行成像；
荧光成像装置，其用于对荧光进行成像；以及
位于所述样品和电动平台的光路之间的荧光接收装置，其用于将所述样品的衍射光反射到所述明场成像装置中，用于使得所述电动平台出射的激光入射至所述样品，以及用于接收所述样品发射的荧光并反射到所述荧光成像装置中。
优选的，所述荧光接收装置包括沿着所述样品发射的荧光的传播方向依次设置的全内反射荧光显微镜、第一双色镜和第二双色镜，其中所述全内反射荧光显微镜用于接收所述样品发射的荧光和所述样品的衍射光，所述第一双色镜用于透射所述样品发射的荧光且用于将所述样品的衍射光反射到所述明场成像装置中，所述第二双色镜用于将所述样品发射的荧光反射到所述荧光成像装置中。
优选的，所述荧光接收装置包括位于所述第二双色镜和所述电动平台之间的快门。
优选的，所述明场成像装置包括第一透镜和电荷耦合器件图像传感器，所述第一透镜用于将所述样品的衍射光汇聚后透射到所述电荷耦合器件图像传感器。
优选的，所述荧光成像装置包括电子倍增电荷耦合器件图像传感器，以及设置在所述第二双色镜和电子倍增电荷耦合器件图像传感器的光路之间的第二透镜和分屏器。
优选的，所述电动平台包括第一反射镜、第二反射镜和第三透镜，所述第一反射镜用于将所述激光组件发射的激光反射到所述第二反射镜上，所述第二反射镜用于将入射到其上的激光反射到所述第三透镜上，所述第三透镜用于将所述激光汇聚后通过所述荧光接收装置入射到所述样品上。
优选的，所述光源包括：LED，其用于发射可见光；准直透镜，其用于将所述LED发射的可见光汇聚后垂直入射到所述样品上。
优选的，所述光源包括位于所述准直透镜和磁铁之间的第四透镜和滤光片。
优选的，所述激光组件用于发射具有第一波长的第一激光和具有第二波长的第二激光，所述第一波长和第二波长与所述可见光的波长不同。
优选的，所述磁镊荧光装置包括用于容纳所述样品的样品盒，所述样品盒包括相对设置的第一玻片和第二玻片，所述样品包括生物分子和磁球，所述生物分子的一端固定在所述磁球上，其另一端固定在所述第二玻片上。
本发明的磁镊荧光装置同时实现了对生物大分子进行力学操纵和荧光信号检测，实时地对其中的单分子进行精准操纵，并获得生物大分子的组装过程和其中的单分子之间的相互作用过程。
附图说明
以下参照附图对本发明实施例作进一步说明，其中：
图1是根据本发明较佳实施例的磁镊荧光装置的光路图。
图2是在图1所示的染色质上标记荧光染料分子的结构示意图。
图3是图1所示的磁镊荧光装置中的磁球受到的磁力随时间的变化图。
图4是图1所示的磁镊荧光装置测量的供体荧光光强图。
图5是图1所示的磁镊荧光装置测量的受体荧光光强图。
图6是图4和图5所示的荧光光强对应的荧光共振能量转移效率曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图通过具体实施例对本发明进一步详细说明。
图1是根据本发明较佳实施例的磁镊荧光装置的光路图。如图1所示，磁镊荧光装置包括依次布置的光源10、磁铁15、样品盒16、荧光接收装置20和电动平台40，以及激光组件30、明场成像装置60和荧光成像装置70。本领域的技术人员可知，为了清楚地说明本发明的光路原理和工作原理，图1并未示出各种所需的固定装置、调节装置和载物平台等。
光源10包括LED 11、准直透镜12、透镜13和滤光片14。LED 11发射780纳米左右的光线(图1以实心单箭头示出)。准直透镜12将LED11发射的光线进行准直以获得沿直线方向传播的光线，准直透镜12出射的780纳米左右的光线平行于透镜13的光轴。透镜13将入射的780纳米左右的光线进行汇聚后入射到滤光片14上。滤光片14允许780纳米的光线透射，且阻碍其他波长的光线透射。
磁铁15包括两块平行的条形磁铁，其中一块条形磁铁的N极与另一块磁铁的S极靠近样品盒16。磁铁15可操作地靠近样品盒16运动或远离样品盒16运动。从滤光片14透射的780纳米的光线从磁铁15的两块条形磁铁的中间穿过后入射到样品盒16中。
样品盒16包括相对设置的第一玻片161和第二玻片162，第一玻片161靠近磁铁15，第二玻片162靠近荧光接收装置20，第一玻片161和第二玻片162限定了一个容纳空间。染色质164和磁球163位于样品盒16中，其中染色质164的一端固定在第二玻片162上，其另一端连接在磁球163上。通过操控磁铁15以实现对磁球163和染色质164的旋转和拉伸等作用。
荧光接收装置20包括沿直线依次布置的全内反射荧光显微镜(TIRF)21、双色镜22、双色镜23和快门24。从样品盒16透射出来的衍射光入射到全内反射荧光显微镜(TIRF)21，全内反射荧光显微镜21对接收的衍射光进行放大后入射到双色镜22。双色镜22用于将磁球163的衍射光(图1中以空心双箭头示出)反射到明场成像装置60中。
明场成像装置60包括透镜61和电荷耦合器件(CCD)图像传感器62。透镜61将衍射光进行汇聚后透射到CCD图像传感器62上成像。通过调节磁铁15距离第一玻片161的距离，改变磁铁15施加在磁球163上的磁力，进而改变磁球163的位置，最终在CCD图像传感器62获得磁球163在不同位置的衍射环图像。根据磁球163的衍射环图像，可以反过来推导或计算出磁球163的位置以及磁铁15对染色质164的拉伸距离。
激光组件30包括激光器31、滤光片32、双色镜33，以及激光器34、滤光片35和双色镜36，以及反射镜37。激光器31发射的532纳米的激光入射到滤光片32上，滤光片32允许532纳米的光线透射至双色镜33上，双色镜33用于反射532纳米的激光至双色镜36上。双色镜36用于透射532纳米的激光。同时，激光器34发射的656纳米的激光入射到滤光片35上，滤光片35允许656纳米的激光透射至双色镜36上，双色镜36用于反射656纳米的激光，且使得656纳米的激光与532纳米的激光的传播方向相同。反射镜37将532纳米的激光或656纳米的激光(图1以实心双箭头示出)反射到电动平台40中。
电动平台40包括反射镜41、反射镜42和透镜43。其中反射镜37将激光组件30发射的激光反射到反射镜41上，反射镜41将激光反射到反射镜42上，反射镜42将激光沿着透镜43的光轴反射到透镜43上，透镜43对激光进行汇聚后沿着与光源10发射的光线相反的方向入射到荧光接收装置20。
从透镜43出射的激光入射到快门24上，通过调节快门24的开关频率，使得激光以一定的频率间隙性地入射到双色镜23上。双色镜23用于将激光透射至双色镜22，且双色镜22用于将激光透射至TIRF物镜21中。
TIRF物镜21内部的光学元器件和具体结构为本领域技术人员所公知，其原理简述如下。TIRF物镜既作为收集样品荧光信号的接受器，同时又作为发生全反射的光学器件。激光聚焦到TIRF物镜后焦面并经过TIRF物镜边缘入射，TIRF物镜出射光为平行光并斜入射至其盖玻片上。电动平台40被构造为调节反射镜41、反射镜42和透镜43的角度和位置，从而调节透镜434射出的激光的入射位置和角度，以达到全内反射要求。利用全内反射产生的隐失波激发染色质164上标记的荧光染料分子。隐失波所激发的荧光经过TIRF物镜接收，通过其双色镜滤掉除荧光以外的其它波长的光。最终从TIRF物镜21出射荧光。
双色镜22对TIRF物镜21发射的荧光进行透射，且双色镜23将荧光(图1以空心单箭头示出)反射至荧光成像装置70中。
荧光成像装置70包括透镜71、分屏器72和电子倍增CCD图像传感器73。双色镜23反射的荧光入射到透镜71上，透镜71对荧光进行汇聚后入射到分屏器72上。分屏器72用于将供体荧光和受体荧光分开并同时入射到电子倍增CCD图像传感器73上，电子倍增CCD图像传感器73用于观测染色质164发出的荧光信号。
图2是在图1所示的染色质上标记荧光染料分子的结构示意图。如图2所示，为了便于观测染色质164的动态结构变化和分子之间的相互作用过程，利用Cy系列菁染料，例如cyanine3和cyanine5(简称荧光染料分子cy3和荧光染料分子cy5)，对染色质164进行标记。其中荧光染料分子cy3作为供体，荧光染料分子cy5作为受体，即荧光染料分子cy3发射的荧光可激发荧光染料分子cy5发出荧光。通过给磁球163施加磁力F，即可对染色质164进行旋转和拉伸，以及动态地改变荧光染料分子cy3和荧光染料分子cy5的动态结构变化和相互作用。
再次参考图1所示的磁镊荧光装置，结合其使用方法来说明如何对染色质中的单分子进行实时操控并观测单分子的动态结构变化。
首先，将经过荧光标记的样品盒16放置在磁铁15和TIRF物镜21之间。调节磁铁15距离样品盒16的距离以改变施加在磁球163上的磁力，通过CCD图像传感器62观测的磁球163的衍射环图像来计算磁球163的具体位置和所受到的磁力F的大小。
图3是图1所示的磁镊荧光装置中的磁球受到的磁力随时间的变化图。如图3所示，在0-125秒时间段内，施加在磁球163的磁力逐渐减小。在125-300秒时间段内，施加在磁球163上的磁力保持不变。本领域技术人员可知，当磁铁15施加在磁球163的磁力较小时，染色质处于折叠状态或未被拉伸状态。当磁铁15施加在磁球163的磁力较大时，染色质在力的作用下部分结合位点被打开，距离增大，染色质处于未折叠状态。
其次，验证染色质164上是否已经标记了荧光染料分子cy3和荧光染料分子cy5。使得激光组件30中激光器31发出532纳米的激光，该532纳米的激光依次经过滤光片32滤光、双色镜33反射、双色镜36透射和反射镜37反射至电动平台40中。电动平台40对532纳米的激光的方向进行调整后依次经过快门24、双色镜23透射、双色镜22透射后入射至TIRF物镜，激发荧光染料分子cy3产生荧光。发射的荧光依次经过TIRF物镜、双色镜22透射、双色镜23反射、透镜71透射、分屏器72透射后入射到电子倍增CCD图像传感器73上。当电子倍增CCD图像传感器73检测到荧光后，证明染色质164上具有与该荧光对应的荧光染料分子cy3。
同理，激光组件30中的激光器34发出656纳米的激光，激发染色质164中的荧光染料分子cy5产生荧光。当电子倍增CCD图像传感器73检测到荧光后，证明染色质164上具有与该荧光对应的荧光染料分子cy5。
最后，使得激光组件30中的激光器31发射出532纳米的激光，分屏器72同时将荧光染料分子cy3发射的供体荧光和荧光染料分子cy5发射的受体荧光传输至电子倍增CCD图像传感器73。
图4是图1所示的磁镊荧光装置测量的供体荧光光强图。图5是图1所示的磁镊荧光装置测量的受体荧光光强图。图6是图4和图5所示的荧光光强对应的荧光共振能量转移效率曲线。
如图4-6所示，在0-125秒时间段内，荧光染料分子cy3发射的供体荧光光强约为600，荧光染料分子cy5发射的受体荧光光强约为700，荧光染料分子cy3发射的供体荧光传递给荧光染料分子cy5(或被荧光染料分子cy5吸收)的效率，即荧光共振能量转移(FRET)效率，约为0.5。在125-170秒时间段内，荧光染料分子cy3发射的供体荧光光强约为300，荧光染料分子cy5发射的受体荧光光强约为1300，荧光共振能量转移效率约为0.8。在170-300秒时间段内，供体荧光光强约为600，受体荧光光强约为700，FRET效率约为0.5。
基于上述测量结果可推出，在0-125秒时间段内，染色质164上的荧光染料分子cy3和荧光染料分子cy5之间的距离较远。荧光染料分子cy3发射的供体荧光的少部分被荧光染料分子cy5吸收，荧光染料分子cy5发射出较少的受体荧光，荧光共振能量转移效率较小。此时较多的供体荧光和较少的受体荧光传输至电子倍增CCD图像传感器73，探测的供体荧光光强较大且受体荧光光强较弱。在125-170秒时间段内，染色质164上的荧光染料分子cy3和荧光染料分子cy5之间的距离较近。荧光染料分子cy3发射的供体荧光的大部分被荧光染料分子cy5吸收，荧光共振能量转移效率较大。此时较少的供体荧光和较多的受体荧光传输至电子倍增CCD图像传感器73，探测的供体荧光光强较弱且受体荧光光强较强。
结合图4-6可知，荧光染料分子cy3发射的供体荧光光强、荧光染料分子cy5发射的受体荧光光强，以及荧光共振能量转移效率在时刻125秒左右产生阶跃型变化。由此可知此时施加在磁球163上的磁力改变了荧光染料分子cy3和荧光染料分子cy5之间的距离。
本发明通过CCD图像传感器62显示的衍射环实时地反映出磁力对染色质的动态变化，同时通过分屏器72和电子倍增CCD图像传感器73得到供体荧光光强和受体荧光光强，能够实时地操控并观察染色质中的单分子在磁力作用下的动态结构变化，以及生物大分子之间相互作用的动力学过程。
本发明的磁镊荧光装置同时实现了对染色质进行力学操纵和荧光信号检测，实时地对染色质中的单分子进行精准操纵，并获得染色质的动态组装过程和生物大分子之间相互作用的动力学过程。而且本发明的磁镊荧光装置在测量过程中并不会对生物样品造成损伤。
本发明的磁镊荧光装置中的LED 11、激光器31和激光器34发射出不同波长的光线，避免光线之间相互影响并带来干扰。
分屏器72用于同时将荧光染料分子cy3发射的供体荧光和荧光染料分子cy5发射的受体荧光传输至电子倍增CCD图像传感器73中，便于同时观测供体荧光和受体荧光的光强变化。
快门24可用于控制激光入射到样品上的照射时长，延长荧光的寿命，增加了荧光的观察时间，能够持续地获得荧光光强信号随时间变化趋势。
双色镜22将衍射光反射到明场成像装置60，且双色镜23用于将荧光反射到荧光成像装置70，由此通过CCD图像传感器62和电子倍增CCD图像传感器73能够同时观测到磁球的衍射环图像和荧光光强信号。
本发明的磁镊荧光装置中的透镜用于汇聚光线以避免光线发散；且滤光片用于过滤杂光。
在本发明的其他实施例中，磁铁呈圆柱体状、条形或U形等其他各种形状。
在本发明的其他实施例中，激光组件30包括能够发射出其他波长的激光器，例如发射405纳米的激光器，和发射738纳米的激光器，用于激发生物大分子中标记的其他荧光染料分子。
虽然本发明已经通过优选实施例进行了描述，然而本发明并非局限于这里所描述的实施例，在不脱离本发明范围的情况下还包括所作出的各种改变以及变化。

Claims (10)

1.一种磁镊荧光装置，其特征在于，包括：
光源，所述光源发射的可见光用于入射至样品以获得样品的衍射光；
位于所述光源和样品之间的磁铁；
激光组件，其用于发射出激光；
电动平台，其用于调节所述激光组件发射的激光的方向并沿着与所述可见光相反的反向入射到所述样品上；
明场成像装置，其用于对所述样品的衍射光进行成像；
荧光成像装置，其用于对荧光进行成像；以及
位于所述样品和电动平台的光路之间的荧光接收装置，其用于将所述样品的衍射光反射到所述明场成像装置中，用于使得所述电动平台出射的激光入射至所述样品，以及用于接收所述样品发射的荧光并反射到所述荧光成像装置中。
2.根据权利要求1所述的磁镊荧光装置，其特征在于，所述荧光接收装置包括沿着所述样品发射的荧光的传播方向依次设置的全内反射荧光显微镜、第一双色镜和第二双色镜，其中所述全内反射荧光显微镜用于接收所述样品发射的荧光和所述样品的衍射光，所述第一双色镜用于透射所述样品发射的荧光且用于将所述样品的衍射光反射到所述明场成像装置中，所述第二双色镜用于将所述样品发射的荧光反射到所述荧光成像装置中。
3.根据权利要求2所述的磁镊荧光装置，其特征在于，所述荧光接收装置包括位于所述第二双色镜和所述电动平台之间的快门。
4.根据权利要求2所述的磁镊荧光装置，其特征在于，所述明场成像装置包括第一透镜和电荷耦合器件图像传感器，所述第一透镜用于将所述样品的衍射光汇聚后透射到所述电荷耦合器件图像传感器。
5.根据权利要求2所述的磁镊荧光装置，其特征在于，所述荧光成像装置包括电子倍增电荷耦合器件图像传感器，以及设置在所述第二双色镜和电子倍增电荷耦合器件图像传感器的光路之间的第二透镜和分屏器。
6.根据权利要求1所述的磁镊荧光装置，其特征在于，所述电动平台包括第一反射镜、第二反射镜和第三透镜，所述第一反射镜用于将所述激光组件发射的激光反射到所述第二反射镜上，所述第二反射镜用于将入射到其上的激光反射到所述第三透镜上，所述第三透镜用于将所述激光汇聚后通过所述荧光接收装置入射到所述样品上。
7.根据权利要求1所述的磁镊荧光装置，其特征在于，所述光源包括：
LED，其用于发射可见光；
准直透镜，其用于将所述LED发射的可见光汇聚后垂直入射到所述样品上。
8.根据权利要求7所述的磁镊荧光装置，其特征在于，所述光源包括位于所述准直透镜和磁铁之间的第四透镜和滤光片。
9.根据权利要求1所述的磁镊荧光装置，其特征在于，所述激光组件用于发射具有第一波长的第一激光和具有第二波长的第二激光，所述第一波长和第二波长与所述可见光的波长不同。
10.根据权利要求1所述的磁镊荧光装置，其特征在于，所述磁镊荧光装置包括用于容纳所述样品的样品盒，所述样品盒包括相对设置的第一玻片和第二玻片，所述样品包括生物分子和磁球，所述生物分子的一端固定在所述磁球上，其另一端固定在所述第二玻片上。
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