CN112067820A - Cd74蛋白在制备识别缺血损伤后脑中巨噬细胞亚群试剂盒中的应用 - Google Patents

Cd74蛋白在制备识别缺血损伤后脑中巨噬细胞亚群试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了CD74蛋白在制备识别缺血损伤后脑中巨噬细胞亚群试剂盒中的应用。本发明是基于本发明发明人首次发现CD74蛋白可以将巨噬细胞区分为两个亚群：CD74hi和CD74medium。本发明有利于进一步研究缺血脑组织中巨噬细胞所发挥的功能。

Description

CD74蛋白在制备识别缺血损伤后脑中巨噬细胞亚群试剂盒中 的应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，特别涉及CD74蛋白在制备识别缺血损伤后脑中巨噬细胞亚群试剂盒中的应用。
背景技术
2016年的全球疾病负担(Global Burden of Disease，GBD)数据显示脑卒中是全球范围内导致死亡和残疾的第二原因，其中又以东亚的发病率最高(Gorelick,2019)。随着我国人口平均寿命延长和社会的老龄化，过去30年里我国脑卒中疾病负担有爆发式增长的态势，40岁以上脑卒中现患病人数已超过1,200万(中国脑卒中防治报告2018)。脑卒中给个人带来巨大的身心痛苦，给家庭及社会造成沉重的经济负担。
近年随着对炎症在脑缺血损伤和修复中作用认识和研究的深入，炎症被认为是影响脑卒中结局的主要决定因素，也是目前开发新的脑卒中治疗方法的重要靶点(Dziedzic,2015；Lambertsen,Finsen,&Clausen,2019)。参与该炎症应答过程的主要有两类细胞：脑中固有的小胶质细胞和从外周血募集而来的单核细胞/巨噬细胞(Liddelow et al.,2017；Anet al.,2014；Tang et al.,2006)。从外周血募集到脑中巨噬细胞是一个复杂的细胞群体(Mosser&Edwards,2008)。单核细胞来源的巨噬细胞被分为经典活化的促炎(M1-)巨噬细胞和交替活化的抗炎(M2-)巨噬细胞。前者促进炎症反应，后者促进组织再生(Kigerl etal.,2009；Mosser&Edwards,2008)。在不同的组织损伤后，这些单核细胞/巨噬细胞亚群依次被激活，并协调了早期炎症反应以及随后的结构重塑和修复(Planas,2018)。此外还可根据表面分子的差异可以分为两个亚群(Garcia-Bonilla et al.,2016)：表达高水平Ly-6C抗原和C-C趋化因子受体2(CCR2)的促炎单核细胞，通过CCR2，这一类型的细胞被招募到急性炎症部位，释放促炎细胞因子如白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-a(TNF-α)，促进坏死细胞清除；表达低水平Ly-6C抗原和CX3C趋化因子受体(CX3CR1)的抑炎单核细胞，通过fractalkine受体CX3CR1招募ly-6c低表达的单核细胞，释放抗炎介质，如转化生长因子-包裹体、IL-10和VEGF(vascular endothelial growth factor,inhibitor)，从而抑制炎症，增强新生血管生成和组织修复。目前对单核细胞/巨噬细胞在脑缺血损伤中的确切作用还不清楚，发挥保护作用，加重损伤或者没有作用的报道都有(Schmidt et al.,2017)，这可能与其存在着多种不同的亚群有关。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供CD74蛋白在制备识别缺血损伤后脑中巨噬细胞亚群试剂盒中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：CD74蛋白在制备识别缺血损伤后脑中巨噬细胞亚群试剂盒中的应用，是基于本发明发明人首次发现CD74蛋白可以将巨噬细胞区分为两个亚群：CD74hi和CD74medium。
所述的试剂盒包括用于识别CD74蛋白的试剂。
所述的用于识别CD74蛋白的试剂包括CD74蛋白抗体；更优选为荧光标记的CD74蛋白抗体。
所述的荧光标记优选为FITC。
一种识别缺血损伤后脑中细胞亚群的方法，是通过应用上述试剂盒实现，包括如下步骤：
(1)提取动物脑组织单个核细胞；
(2)对单个核细胞中的CD74蛋白进行定量；
(3)通过CD74的荧光强度将巨噬细胞区分为CD74hi和CD74medium两个亚群。
所述的区分优选为通过流式细胞仪分选得到。
所述识别缺血损伤后脑中细胞亚群的方法优选包括如下步骤：
1)提取动物脑组织单个核细胞；
2)用抗CD11b、CD45和CD74的荧光抗体标记单个核细胞；
3)通过CD45荧光强度，将CD11b阳性的单个核细胞区分为小胶质细胞(CD11b+，CD45medium)和巨噬细胞(CD11b+，CD45high)；在此基础上通过CD74将巨噬细胞区分为CD74high和CD74medium两个亚群。
所述识别缺血损伤后脑中细胞亚群的方法有利于进一步研究缺血脑组织中巨噬细胞所发挥的功能。通过用抗CD86的抗体分别标记CD74high和CD74medium两个亚群，初步的研究结果表明，巨噬细胞CD74hi亚群表达更高水平的CD86。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明通过建立小鼠脑缺血损伤模型，利用流式细胞术分选脑内小胶质细胞(ly6g-CD11b+CD45medium)和巨噬细胞(ly6g-CD11b+CD45high)。iTRAQ标记的定量蛋白组学分析结果发现CD74在巨噬细胞的表达水平是小胶质细胞的10倍以上。流式细胞分析结果证实了两群细胞中CD74表达水平的差异，巨噬细胞的平均荧光强度(Median FluorescenceIntensity，MFI)是小胶质细胞的2.79倍。散点图的结果则显示CD74可以将巨噬细胞分为两个亚群：CD74hi和CD74medium。
附图说明
图1是小鼠短暂性缺血再灌注模型的脑冠状切片染色照片图和梗死体积的统计结果图；其中，A为小鼠脑灌注切片的染色结果图，白色部分为缺血坏死组织，红色为正常脑组织；B为小鼠脑梗死体积的统计结果。
图2是流式细胞分选策略图；其中，ly6G-CD11b+CD45medium细胞为小胶质细胞，ly6G-CD11b+CD45high细胞为巨噬细胞。
图3是定量蛋白组学的分析流程图；图中的LG表示左脑的小胶质细胞(microgliafrom the left hemisphere)，LM表示左脑的巨噬细胞(macrophages from the lefthemisphere)。
图4是流式细胞分析结果图；其中，A为使用CD11b结合CD45进行流式分析的结果，B为使用CD74结合CD45进行流式分析的结果，C为小胶质细胞和巨噬细胞表达CD74的平均荧光强度，C中的红色为小胶质细胞(microglia)、蓝色为巨噬细胞(macrophages)。
图5是流式分析的统计结果图；其中，**表示p<0.01。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明，应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，为详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
下面结合具体实施例对本发明进一步说明。
实施例1 CD74在小胶质细胞和巨噬细胞的表达
1.小鼠短暂性缺血再灌注模型的建立
本研究采用10周龄的雄性C57BL/6小鼠，小鼠均购于广州中医药大学动物中心，于到达后一周内开展实验。实验动物饲养于恒温(22±1℃)，规律光照(白天12h，黑夜12h)的动物房内，实验动物可以自由地获取食物和饮水。有关实验动物的实验设计和流程均严格按照国家卫生研究院有关实验动物护理和使用的规定，并经动物实验委员会批准。
将小鼠称重并腹腔注射4％水合氯醛(10μL/g)，麻醉后固定，通过颈总动脉插入线栓(doccol，602356)至大脑中动脉的起始端。缺血1h后，将线栓拔出，完成小鼠大脑中动脉再灌注。在伤口处滴加庆大霉素并缝合，将小鼠放回笼内自然苏醒。假手术组小鼠，只需剪开皮肤并分离出左侧颈总动脉，不进行后续手术处理。结果如图1所示，梗死体积大约在45％。
2.细胞分选
到达设定的时间点后，将小鼠麻醉处死，心脏灌流后解剖出脑组织。使用percoll密度梯度离心法分离脑单个核细胞，然后进行抗体标记，标记过程参考(Li et al.EarlyHistone Deacetylase Inhibition Mitigates Ischemia/Reperfusion Brain Injury byReducing Microglia Activation and Modulating Their Phenotype.Frontiersinneurology,10,893,2019)，抗体包括：Anti-CD45/PE-Cy7，anti-CD11b/FITC，Anti-Ly-6G/Alexa Fluor 647。使用PI(0.2mg/ml)标记死细胞，流式分选的策略如图2所示。分选细胞收集到含0.5％BSA的PBS中重悬。
3.定量蛋白组学分析，实验流程如图3所示：
(1)蛋白质提取
将分选到的小胶质细胞和巨噬细胞分别离心弃上清后，加入RIPA裂解液和浓度为1mM的蛋白酶抑制剂PMSF(phenylmethanesulfonyl fluoride)，体积比为100:1，旋涡震荡混匀，冰上裂解10min后超声裂解。然后12,000g、4℃离心30min，将上清转移到新EP管后，重复离心一次，最后将离心所得上清液保存在-80℃冰箱备用。
(2)胰酶酶解
在500μl蛋白裂解液(即步骤(1)最终得到的上清液)中加入50μl浓度1M的DTT溶液，90℃孵育10min。加入50μl浓度为1M的碘乙酰胺(IAA)(最终浓度约100mmol/L)，涡旋震荡，室温孵育1h。在反应体系中加入500μl浓度为8M尿素，涡旋震荡至无沉淀后转移至10KD超滤管(Millipore)，12500g、24℃离心30-40min，直至超滤管内溶液少于20μl。随后加入500μl浓度为50mM的NH4HCO3，重复三次。加入溶解在200μL浓度为50mM的NH4HCO3的5μg胰蛋白酶，37℃孵育16h后，12500g，24℃离心收集下室溶液。加入200ul浓度为50mM的NH4HCO3，重复离心2次。合并下室溶液，真空离心机上干燥，将获取的肽段用于iTRAQ标记或-20℃保存。
(3)iTRAQ标记和分级
iTRAQ标记所需的试剂和缓冲液均来自AB SCIEX(Foster City,CA)。iTRAQ的标记根据制造商的说明和我们此前的报告(Ji et al.Quantitative proteomics analysis ofchondrogenic differentiation of C3H10T1/2 mesenchymal stem cells by iTRAQlabeling coupled with on-line two-dimensional LC/MS/MS.Molecular&cellularproteomics:MCP,9(3),550-564,2010)进行。将1单位的iTRAQ试剂(标记100μg蛋白所需的试剂量)中加入在70μl无水乙醇。分别用报告基团为116和117的iTRAQ试剂分别标记来自小胶质细胞和巨噬细胞的肽段，混匀后室温避光孵育，1h后混合。
iTRAQ标记后的样本采用高pH反相(Batth,Francavilla,&Olsen,2014)去除样本中的未结合的iTRAQ试剂等可能干扰质谱分析的杂质，并将其进行分级。采用的液相为UltiMate 3000 HPLC(Dionex,Sunnyvale,CA,USA)，分析柱为4.6mm×150mm的C18反相柱(Waters)。A相为10mM甲酸铵水溶液，B相为pH值为10的氨水和90％乙腈的溶液。iTRAQ标记样本真空干燥后用200μl A相溶解，自动进样，流速为1ml/min，100％A相保留5min，然后在40min里从B相从1％增加到30％，洗脱标记的肽段并将每分钟的组分搜集到试管中，一共40份。分析柱用60％的B冲洗10min然后回到起始状态。40个组分合并为10个组分，真空离心干燥。
(4)NanoLC-TripleTOF 5600质谱分析
液相分离采用分流的2D纳流Eksigent HPLC系统(Eksigent,Dublin,CA)。C18的捕获柱和纳流分析柱(粒径3μm,孔径120A)用于在线捕获、脱盐和分析分离。A和B流动相中的水/乙腈/甲酸组成分别为：A流动相的组成为98/2/0.2％，B流动相的组成为2/98/0.2％。标记分级的样本加载，捕获和脱盐的条件为：100％A流动相保持10分钟，流速为2μL/分钟。分析柱的流速为350nL/分钟，分析的条件为：2％的B流动相5分钟；在接下来的2分钟里B相增加到10％，然后是一个线性梯度进行肽洗脱，120分钟里B流动相增加到40％，1分钟后B流动相增加到90％，持续10分钟；2分钟后恢复初始色谱条件并保持持5分钟。
质谱分析采用的是一套安装Nanospray III离子源(AB SCIEX,Concord,ON)的TripleTOF 5600 System(AB SCIEX,Concord,ON)，20μM内径石英喷针(New Objectives,Woburn,MA)。数据采集的仪器参数如下：离子喷雾电压为2.2看V，气帘气(curtain gas)的压力为20PSI，雾化气(nebulizer gas)为6 PSI，接口加热器(interface heater)的温度为150℃，TOF MS扫描的质量分辨力(mass resolving power)大于等于30000半峰全宽(Fullwidth at half maximum，fwhm)对于IDA(information-dependent acquisition)，母离子扫描时间为250ms，母离子的信号强度>200cps，电荷数为2-5，子离子扫描数小于等于40个。通过对40GHz四阳极/通道检测的多通道TDC检测器的监控，每次扫描以11kHz的脉冲频率值合计4个时间箱。对所有母离子碰撞诱导离解的扫描碰撞能设置为35(15ev)。动态排除设置为峰值宽度的1/2(大约为8s)，然后将母离子从排除列表中删除。
利用ProteinPilot Software 5.0.1(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)。参数设置如下：样本类型：iTRAQ 4plex(Peptide Labeled)；Cys.Alkylation：Iodoacetamide；消化方式：Trypsin；仪器：Triple TOF 5600；样本种属：Mus musculus；IDFocus：Biological modifications；利用ProteinPilot内置Paragon和ProgroupAlgorithms算法，参考蛋白数据库为Uniprot小鼠蛋白序列数据库(https://www.uniprot.org/)。结果发现，发现蛋白CD74在巨噬细胞的表达显著高于小胶质细胞(表1)：
表1.定量蛋白组学所检测到的CD74的相关数据
Figure BDA0002557592650000061
4.流式细胞检测CD74在脑单个核细胞上的表达
本部分的方法与上述实施例的第2部分大致相同。脑缺血后3天，将小鼠麻醉处死，心脏灌流后获取脑组织。使用percoll密度梯度离心法分离单个细胞，然后进行抗体标记，使用的抗体包括：Anti-CD45/APC-cy7，Anti-CD11b/eFluor450，Anti-Ly6G/Alexa Fluor647，Anti-CD74/Alexa Fluor 488,Anti-CD86/pacific blue。上机前在细胞悬液中加入2μl PI。流式细胞分析结果如图4所示，CD74可以将目的到脑中的巨噬细胞分为CD74high和CD74medium两个亚群。其中CD74high的亚群表达更高水平的CD86，一种反映巨噬细胞激活状态的表面标志物。(图5)。
本发明通过以上实施例中的小鼠MCAO模型，流式分选和蛋白组学分析，发现一种可以将募集到脑中的巨噬细胞分为CD74high和CD74medium两个亚群的标志物CD74，为分析巨噬细胞的功能提供了新的工具。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.CD74蛋白在制备识别缺血损伤后脑中巨噬细胞亚群试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的CD74蛋白在制备识别缺血损伤后脑中巨噬细胞亚群试剂盒中的应用，其特征在于：所述的试剂盒包括用于识别CD74蛋白的试剂。
3.根据权利要求1所述的CD74蛋白在制备识别缺血损伤后脑中巨噬细胞亚群试剂盒中的应用，其特征在于：所述的用于识别CD74蛋白的试剂包括CD74蛋白抗体。
4.根据权利要求3所述的CD74蛋白在制备识别缺血损伤后脑中巨噬细胞亚群试剂盒中的应用，其特征在于：所述的CD74蛋白抗体为荧光标记的CD74蛋白抗体。
5.根据权利要求4所述的CD74蛋白在制备识别缺血损伤后脑中巨噬细胞亚群试剂盒中的应用，其特征在于：所述的荧光标记为FITC。
6.一种识别缺血损伤后脑中细胞亚群的方法，其特征在于,是通过应用权利要求1～5任一项所述的CD74蛋白在制备识别缺血损伤后脑中巨噬细胞亚群试剂盒实现，包括如下步骤：
(1)提取动物脑组织单个核细胞；
(2)对单个核细胞中的CD74蛋白进行定量；
(3)通过CD74的荧光强度将巨噬细胞区分为CD74hi和CD74medium两个亚群。
7.根据权利要求6所述识别缺血损伤后脑中细胞亚群的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)提取动物脑组织单个核细胞；
2)用抗CD11b、CD45和CD74的荧光抗体标记单个核细胞；
3)通过CD45荧光强度，将CD11b阳性的单个核细胞区分为小胶质细胞和巨噬细胞；在此基础上通过CD74将巨噬细胞区分为CD74high和CD74medium两个亚群。
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