CN112063699B - 一种用于研究hiv感染者免疫衰老机制的系统 - Google Patents

一种用于研究hiv感染者免疫衰老机制的系统 Download PDF

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Abstract

一种用于研究HIV感染者免疫衰老机制的系统，该系统包括：样本采集单元，用于获取HIV感染者的全血样本和血浆样本；第一检测单元，用于检测全血样本中的HIV‑1DNA病毒库的含量；第二检测单元，用于检测与免疫衰老相关的T淋巴细胞亚群的含量；第三检测单元，用于检测血浆样本中与机体炎症和稳态相关的细胞因子含量；分析单元，用于接收并分析HIV‑1DNA、T淋巴细胞亚群和细胞因子之间的相关性以及相互影响程度。本发明建立了涵盖核酸、细胞和细胞因子的检测系统和方法，结合统计分析更加完整地从整体上反映出HIV感染者的免疫衰老的机制与进程，不仅为HIV药物的研发和评估用药效果或其他干预手段的效果提供客观的科学支撑，还有利于HIV感染者免疫功能的重建。

Description

一种用于研究HIV感染者免疫衰老机制的系统
技术领域
本发明涉及医学研究领域，具体涉及一种用于研究HIV感染者的免疫衰老机制的系统及方法。
背景技术
随着医疗水平的发展，高效抗逆转录病毒治疗(Antiretroviraltherapy,ART)的应用能有效地抑制HIV(Human Immunodeficiency Virus,HIV)复制，大大降低艾滋病的患病率和死亡率，但是却无法完全清除体内潜伏的HIV病毒。长期的慢性病毒性感染会损伤机体正常的免疫功能，引发慢性系统性炎症，导致免疫衰老(Immunosenescence)的发生。不同于免疫退化的是，免疫衰老是一个由慢性抗原负荷引起的持续性消耗和重塑的适应过程。免疫衰老并非HIV独有，其他病毒慢性感染例如CMV和中老年人也会出现免疫衰老。
目前，HIV感染者每年会进行HIV RNA的核酸检测和CD4+T淋巴细胞检测，以此评估抗病毒治疗的效果。高病毒核酸载量和低CD4+T淋巴细胞数可以作为反映治疗效果不佳的指标。但是，这两个指标却无法解释HIV感染者体内的免疫衰老过程。
现有技术中，对HIV感染者免疫衰老机制的研究模型停留在对单项指标进行比较和研究，没有同时考虑核酸、细胞、细胞因子三个维度的多项指标之间的关联性和相互影响程度，因此所建立的研究模型的分析结果无法完整、准确地反映出HIV感染者的免疫衰老机制和进程。
发明内容
本发明的目的在于根据HIV感染的特殊性，提供一种用于研究HIV感染者的免疫衰老机制的系统及方法，从核酸、细胞和细胞因子三个维度，结合统计学分析方法研究三者的相互关系及影响，探索和反映HIV感染者体内的免疫衰老机制与进程，为HIV药物的研发和评估用药效果或其他干预手段的效果提供客观的科学支撑。
具体地，本发明目的通过下述技术方案实现：
一种用于研究HIV感染者免疫衰老机制的系统，包括：
样本采集单元，用于获取HIV感染者的全血样本和血浆样本；
第一检测单元，用于检测全血样本中的HIV-1DNA病毒库的含量，得到HIV-1DNA检测数据；
第二检测单元，用于检测与免疫衰老相关的T淋巴细胞亚群的含量，得到T淋巴细胞亚群检测数据；
第三检测单元，用于检测血浆样本中与机体炎症和稳态相关的细胞因子的含量，得到细胞因子检测数据；
分析单元，用于接收并分析HIV-1DNA检测数据、T淋巴细胞亚群检测数据和细胞因子检测数据之间的相关性以及相互影响程度。
本技术方案中，通过样品采集单元获取HIV感染者的全血样本和血浆样本后，利用第一检测单元检测全血样本中的HIV-1DNA病毒库的含量，得到HIV-1DNA检测数据。HIV-1DNA病毒库是指HIV病毒感染进入T淋巴细胞以后逆转录生成的潜伏存在于感染细胞和组织中的HIV-1DNA，在一定条件下能被再度激活形成具有复制能力的病毒。HIV-1DNA病毒库是清除HIV的主要障碍，因此将其作为一项独立的预测疾病进展的指标数据。
第二检测单元用于检测与免疫衰老相关的T淋巴细胞亚群的含量。T淋巴细胞是HIV攻击的细胞，也是HIV病毒库潜伏的细胞，还是免疫衰老出现最多变化的细胞。免疫衰老会造成胸腺输出T淋巴细胞的能力减弱，T淋巴细胞过度消耗，从而降低对病毒的反应，同时HIV主要感染T淋巴细胞，可能会加剧机体的免疫衰老，形成恶性循坏。因此，本系统选择与免疫衰老相关的T淋巴细胞亚群作为研究对象，旨在反映免疫衰老在细胞中出现的异常分化、过度活化、复制衰老、过度耗竭、过度老化和胸腺输出功能减弱的情况。
第三检测单元用于检测与机体炎症和稳态相关的细胞因子的含量，HIV感染会造成机体出现炎症老化，T细胞过度分化为炎症性T细胞，分泌更多炎症因子；此外，IL-7是维持外周T淋巴细胞稳态的关键调节因子。故本系统通过检测血浆中各细胞因子的含量共同反映机体的炎症与稳态。
在得到HIV-1DNA检测数据、T淋巴细胞亚群检测数据、细胞因子检测数据后，分析单元利用统计学方法对各项数据进行分析，判断HIV-1DNA检测数据、T淋巴细胞亚群检测数据和细胞因子检测数据的两两相关性，以及三者间的相互影响程度。
通过上述设置，本系统检测了HIV感染者全血样本中HIV-1DNA病毒库的含量和T淋巴细胞亚群的含量，检测了血浆样本中各细胞因子的分泌情况，建立了涵盖核酸、细胞和细胞因子三个维度的检测系统，将检测结果输出到分析单元后，提取T淋巴细胞亚群和细胞因子的主成分获得其综合评价值，并利用相关回归分析法分析了HIV病毒库、T淋巴细胞亚群、细胞因子的相互关系及相互影响，进而更加完整地从整体上反映出HIV感染者的免疫衰老的机制与进程，不仅为HIV药物的研发和评估用药效果或其他干预手段的效果提供客观的科学支撑，有利于HIV感染者免疫功能的重建，对其他慢性感染性疾病，甚至衰老相关的研究都具有重要作用。
作为第一检测单元的优选实施方案，通过对外周血中HIV-1DNA病毒库进行荧光PCR检测精确量化HIV病毒库的复制潜能。第一检测单元提取全血样本中的所有DNA，通过PCR法检测并计算单位数量的白细胞中HIV-1DNA的拷贝数。具体地，采用人类基因组DNA提取试剂盒提取全血中所有DNA，并使用HIV-1DNA检测试剂盒的特定基因片段进行荧光PCR法检测，计算以每1×106个白细胞中HIV-1DNA的拷贝数表示，即cps/106cells。
在一个或多个实施例中，第一检测单元包括定量标准曲线绘制单元，所述定量标准曲线绘制单元基于人类特异性基因片段的内参基因和HIV-1DNA的特异性基因制定双基因定量标准曲线以用于PCR定量检测。目前所使用的HIV-1DNA定量检测试剂盒在不同的实验环境尤其是不同的荧光PCR仪上进行定量检测时，需要设计出适合当前实验环境的定量标准曲线用以HIV-1DNA的定量检测。本系统的定量标准曲线绘制单元基于人类特异性基因片段的内参基因和HIV-1DNA的特异性基因制定双基因定量标准曲线，进一步地提高了定量检测的准确性。
在一个或多个实施例中，第一检测单元包括有效性验证单元，用于对定性结果进行双重验证。由于定性的判定方式为是以HIV-1DNA基因检测孔Ct值43为界限的划定，而对于阈值线没有特殊的控制，可能会由于人员操作造成Ct值在43附近的样本检测结果产生误差，故本系统对检测孔Ct值在43±1的样本进行复检，以进一步提高结果的准确性。在一个实施例中，复检的方式为将42＜Ct＜43的核酸提取样本进行对倍稀释再重新上机检测；将43＜Ct＜44的样本重新提取，提取时加入的全血量加倍。如果复检结果与初检结果一致，则维持原结果的判断；如果复检结果与初检结果不一致，则判为“不确定”。在一个实施例中，所述有效性验证单元还用于验证试剂盒的有效性和/或样本的有效性。
作为第二检测单元的优选实施方案，所述第二检测单元利用流式细胞术检测全血样本中与免疫衰老相关的T淋巴细胞亚群占CD4+T淋巴细胞的百分比和/或与免疫衰老相关的T淋巴细胞亚群占CD8+T淋巴细胞的百分比。在一个或多个实施例中，每类T淋巴细胞亚群选择两个特定单抗分子来代表，相较于选用单一的特定单抗分子来代表的T淋巴细胞亚群具有更好的特异性。
进一步地，所述与免疫衰老相关的T淋巴细胞亚群包括初始T淋巴细胞(
Figure GDA0003022726040000031
TLymphocytes，Tn)、中心记忆T淋巴细胞(Central Memory T Lymphocytes,Tcm)、效应记忆T淋巴细胞(Effector Memory T Lymphocytes,Tem)、活化T淋巴细胞(Activated TLymphocytes,Ta)、衰老T淋巴细胞(Senescent T lymphocytes,Ts)、老化T淋巴细胞(AgingT lymphocytes,Tagi)、耗竭T淋巴细胞(Exhausted T lymphocytes,Te)和胸腺输出T淋巴细胞(Thymus export T lymphocytes,Tte)中的一种或多种。选择T淋巴细胞亚群作为研究对象，将异常分化、过度活化、过度衰老、过度老化、过度耗竭和胸腺输出功能减弱的细胞亚群代表纳入研究，能更加敏感和全面的反映T淋巴细胞免疫衰老的情况。
在部分实施例中，采用特定荧光素标记的单克隆抗体对各T淋巴细胞亚群进行检测，其中，采用CD45RA+和CD27+标记初始T淋巴细胞，采用CD45RO+和CD27+标记中心记忆T淋巴细胞，采用CD45RO+和CD27-标记效应记忆T淋巴细胞，采用HLA-DR+和CD38+标记活化T淋巴细胞，采用CD57+和CD28+标记衰老T淋巴细胞，采用PD-1和KLRG1标记老化T淋巴细胞和耗竭T淋巴细胞，采用CD31+和CD45RA+标记胸腺输出T淋巴细胞，。之后，利用流式细胞术分别计算CD4+和CD8+T淋巴细胞中各T淋巴细胞亚群目标细胞所占的百分比。
在部分实施例中，第二检测单元采用五通道的流式细胞仪。每类T淋巴细胞亚群采用5种单克隆抗体荧光染料进行染色。具体地，初始T淋巴细胞的荧光单抗为CD3-PC7、CD4-FITC、CD8-PC5.5、CD45RA-PE、CD27-ECD；中心记忆T淋巴细胞和效应记忆T淋巴细胞的荧光单抗为CD3-PC7、CD4-FITC、CD8-PC5.5、CD45RO-PE、CD27-ECD；活化T淋巴细胞的荧光单抗为CD3-PC7、CD4-ECD、CD8-PC5.5、HLA-DR-FITC、CD38-PE；衰老T淋巴细胞的荧光单抗为CD3-PC7、CD4-ECD、CD8-PC5.5、CD57-FITC、CD28-PE；老化T淋巴细胞和耗竭T淋巴细胞的荧光单抗为CD3-PC7、CD4-FITC、CD8-PC5.5、KLRG1-PE、PD-1-ECD；胸腺输出T淋巴细胞的荧光单抗为CD3-PC7、CD4-FITC、CD8-PC5.5、CD45RA-PE、CD31-ECD。通过上述荧光单抗的搭配，可以一次性地检测CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞中T淋巴细胞亚群的含量，显著提高检测效率。
在一个或多个实施例中，流式细胞仪的信号采集的停止条件CD3细胞收集5000个或者信号采集时间达到5min。
作为第三检测单元的优选实施方案，所述第三检测单元采用酶联免疫吸附试验检测血浆样本中与机体炎症和稳态相关的细胞因子含量，所述与机体炎症和稳态相关的细胞因子包括IL-6、IL-7和TNF-α中的一种或多种。HIV感染会造成机体出现炎症老化，T细胞过度分化为炎症性T细胞，分泌更多炎症因子；此外，IL-7是维持外周T淋巴细胞稳态的关键调节因子。因此，故本系统选择IL-6和TNF-α作为炎症的预警因子，选择IL-7作为机体稳态的指示因子，共同反映机体的炎症与稳态。采用酶联免疫吸附试验计算每mL血浆中各细胞因子的含量。
作为分析单元的优选实施方案，所述分析单元对T淋巴细胞亚群检测数据和/或细胞因子检测数据进行主成分分析，得到T淋巴细胞综合评分值和细胞因子综合评分值，将HIV-1DNA检测数据、T淋巴细胞综合评分值和细胞因子综合评分值进行相关性分析，判断HIV-1DNA检测数据、T淋巴细胞亚群检测数据和细胞因子检测数据之间的相关性；根据含量大小，将HIV-1DNA检测数据分为高病毒库组和低病毒库组，T淋巴细胞综合评分值分为高细胞免疫衰老组和低细胞免疫衰老组，细胞因子综合评分值分为高细胞因子组和低细胞因子组，进行logistic回归分析，判断HIV-1DNA检测数据、T淋巴细胞亚群检测数据和细胞因子检测数据之间的影响程度。
在部分实施例中，在采集的数据量较少时，可以仅对T淋巴细胞亚群检测数据或者细胞因子检测数据进行主成分分析，并通过分析T淋巴细胞综合评分值、细胞因子检测数据和HIV-1DNA检测数据，或者T淋巴细胞亚群检测数据、细胞因子综合评分值和HIV-1DNA检测数据判断相关性和影响程度。
由于T淋巴细胞亚群和细胞因子均有多个检测指标，只采用单因素逐个分析检测指标不仅可能出现假阳性结果，也难以对免疫衰老机制进行综合评估，此外，这些检测指标可能会存在多重共线性，不适合采用回归分析。因此本技术方案所采用的分析方式为：对T淋巴细胞亚群和细胞因子的检测数据进行主成分分析，将T淋巴细胞亚群和细胞因子的多个变量结果转化为少数几个综合变量作为主成分，再通过计算主成分得分算出综合评分值，根据综合评分值大小进行排序，可以得到评价对象的T淋巴细胞衰老和细胞因子炎症和机体稳态受影响的程度。对HIV-1DNA病毒库进行标准化处理，得到相应的标准化Z值，在此基础上再对HIV-1DNA检测结果、T淋巴细胞综合评分值和细胞因子综合评分值进行相关性分析；之后对三类指标进行排序，以中位数为分界点，对每类指标转变高值组和低值组，将连续型变量转变为二分类变量，从而对这些变量进行logistic回归分析，进而探讨HIV感染者免疫衰老的机制。
通过上述设置，实现了对T淋巴细胞亚群和细胞因子的综合分析，为HIV免疫衰老机制和进程的实验性研究提供了可靠的统计分析方法。
本发明还提供一种用于研究HIV感染者免疫衰老机制的方法，该方法包括以下步骤：
获取HIV感染者的全血样本和血浆样本；
检测全血样本中的HIV-1DNA病毒库的含量、以及与免疫衰老相关的T淋巴细胞亚群的含量，得到HIV-1DNA检测数据和T淋巴细胞亚群检测数据；
检测血浆样本中与机体炎症和稳态相关的细胞因子含量，得到细胞因子检测数据；
利用主成分分析法分析T淋巴细胞亚群检测数据和/或细胞因子检测数据，得到T淋巴细胞综合评分值和细胞因子综合评分值，对HIV-1DNA检测数据、T淋巴细胞综合评分值和细胞因子综合评分值进行相关性分析；将HIV-1DNA检测数据、T淋巴细胞综合评分值和细胞因子综合评分值转变为二分类变量指标后，利用logistic回归分析法分析HIV-1DNA检测数据、T淋巴细胞亚群检测数据和细胞因子检测数据之间的影响程度。
进一步地，所述主成分分析法包括以下步骤：
趋同化处理检测数据中各指标数据，将所有指标数据转化为正向指标；
按照累积方差贡献率≥85％提取检测数据中的主成分；
计算每个全血样本或血浆样本中检测数据的主成分的综合评分值，所述综合评分值
Figure GDA0003022726040000061
其中，m为变量个数，k为提取的主成分数，λ为特征根，Ci为第i个主成分，i＝1,2,…,k；
根据综合评分值大小进行排序，综合评分值越大则免疫衰老程度越高，综合评分值越小则免疫衰老程度越低。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明检测了HIV感染者全血样本中HIV-1DNA病毒库的含量和T淋巴细胞亚群的含量，检测了血浆样本中各细胞因子的分泌情况，建立了涵盖核酸、细胞和细胞因子三个维度的检测系统，将检测结果输出到分析单元后，提取T淋巴细胞亚群和细胞因子的主成分，并利用相关分析和回归分析法分析了HIV病毒库、T淋巴细胞亚群、细胞因子的相互关系及相互影响，进而更加完整地从整体上反映出HIV感染者的免疫衰老的机制与进程，不仅为HIV药物的研发和评估用药效果或其他干预手段的效果提供客观的科学支撑，有利于HIV感染者免疫功能的重建，对其他慢性感染性疾病，甚至衰老相关的研究都具有重要作用；
2、本发明基于主成分分析法，实现了对T淋巴细胞亚群和细胞因子的综合分析，为HIV免疫衰老机制和进程的实验性研究提供了可靠的统计分析方法；
3、本发明选择T淋巴细胞亚群作为研究对象，将代表异常分化、过度活化、过度衰老、过度老化和、过度耗竭和胸腺输出功能减弱的细胞亚群纳入研究，能更加敏感和全面的反映T淋巴细胞免疫衰老的情况；
4、本发明通过设置荧光单抗的搭配，可以一次性地检测CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞中T淋巴细胞亚群的含量，显著提高检测效率；
5、本发明的定量标准曲线绘制单元基于人类特异性基因片段的内参基因和HIV-1DNA的特异性基因制定双基因定量标准曲线，进一步地提高了定量检测的准确性；
6、本发明的有效性验证单元不仅对定性结果进行双重验证，而且还能够验证试剂盒的有效性和/或样本的有效性，提高了结果的准确性；
7、本发明选择IL-6和TNF-α作为炎症的预警因子，选择IL-7作为机体稳态的指示因子，共同反映机体的炎症与稳态。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
图1为本发明具体实施例中系统的结构框图；
图2为本发明具体实施例中方法的流程框图；
图3为本发明具体实施例中HIV-1DNA(图3a)和内参基因(图3b)的定量标准曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
本发明所涉及的技术为分子克隆常规技术手段，其中涉及的酶、引物、试剂以及反应条件在未作说明的情况下均可根据本领域技术人员的经验进行合理选择，其中涉及试剂耗材属于市售的普通产品，其中涉及的检测手段以及仪器均为本领域技术人员所熟知并熟练掌握。
本发明所有统计分析均使用SAS 9.4统计分析软件进行。p值小于0.05表示具有统计学意义。
实施例1：
如图1所示的一种用于研究HIV感染者免疫衰老机制的系统，包括：
样本采集单元，用于获取HIV感染者的全血样本和血浆样本；
第一检测单元，用于检测全血样本中的HIV-1DNA病毒库的含量，得到HIV-1DNA检测数据；
第二检测单元，用于检测与免疫衰老相关的T淋巴细胞亚群的含量，得到T淋巴细胞亚群检测数据；
第三检测单元，用于检测血浆样本中与机体炎症和稳态相关的细胞因子含量，得到细胞因子检测数据；
分析单元，用于接收并分析HIV-1DNA检测数据、T淋巴细胞亚群检测数据和细胞因子检测数据之间的相关性以及相互影响程度。
在部分实施例中，所述第一检测单元提取全血样本中的所有DNA，通过PCR法检测并计算单位数量的白细胞中HIV-1DNA的拷贝数；所述第二检测单元利用流式细胞术检测全血样本中与免疫衰老相关的T淋巴细胞亚群占CD4+T淋巴细胞的百分比和/或与免疫衰老相关的T淋巴细胞亚群占CD8+T淋巴细胞的百分比；所述第三检测单元采用酶联免疫吸附试验检测血浆样本中与机体炎症和稳态相关的细胞因子含量，所述与机体炎症和稳态相关的细胞因子包括IL-6、IL-7和TNF-α中的一种或多种。
在部分实施例中，所述分析单元对T淋巴细胞亚群检测数据和/或细胞因子检测数据进行主成分分析，得到T淋巴细胞综合评分值和细胞因子综合评分值，将HIV-1DNA检测数据、T淋巴细胞综合评分值和细胞因子综合评分值进行相关性分析，判断HIV-1DNA检测数据、T淋巴细胞亚群检测数据和细胞因子检测数据之间的相关性；根据含量大小，将HIV-1DNA检测数据分为高病毒库组和低病毒库组，T淋巴细胞综合评分值分为高细胞免疫衰老组和低细胞免疫衰老组，细胞因子综合评分值分为高细胞因子组和低细胞因子组，对高病毒库组、低病毒库组、高细胞免疫衰老组、低细胞免疫衰老组、高细胞因子组和低细胞因子组进行logistic回归分析，判断HIV-1DNA检测数据、T淋巴细胞亚群检测数据和细胞因子检测数据之间的影响程度。
本实施例检测了HIV感染者全血样本中HIV-1DNA病毒库的含量和T淋巴细胞亚群的含量，检测了血浆样本中各细胞因子的分泌情况，建立了涵盖核酸、细胞和细胞因子三个维度的检测系统，将检测结果输出到分析单元后，提取T淋巴细胞亚群和细胞因子的主成分，并利用相关回归分析法分析了HIV病毒库、T淋巴细胞亚群、细胞因子的相互关系及相互影响，进而更加完整地从整体上反映出HIV感染者的免疫衰老的机制与进程，不仅为HIV药物的研发和评估用药效果或其他干预手段的效果提供客观的科学支撑，有利于HIV感染者免疫功能的重建，对其他慢性感染性疾病，甚至衰老相关的研究都具有重要作用。
实施例2：
在实施例1的基础上，第一检测单元包括定量标准曲线绘制单元，所述定量标准曲线绘制单元基于人类特异性基因片段的内参基因和HIV-1DNA的特异性基因制定双基因定量标准曲线以用于PCR定量检测。
在一个或多个实施例中，第一检测单元包括有效性验证单元，用于对定性结果进行双重验证。在一个实施例中，所述有效性验证单元还用于验证试剂盒的有效性和/或样本的有效性。
实施例3：
在上述实施例的基础上，所述与免疫衰老相关的T淋巴细胞亚群包括初始T淋巴细胞、中心记忆T淋巴细胞、效应记忆T淋巴细胞、活化T淋巴细胞、衰老T淋巴细胞老化T淋巴细胞、耗竭T淋巴细胞和胸腺输出T淋巴细胞、中的一种或多种。选择T淋巴细胞亚群作为研究对象，将代表异常分化、过度活化、过度衰老、过度老化、过度耗竭和胸腺输出功能减弱的细胞亚群纳入研究，能更加敏感和全面的反映T淋巴细胞免疫衰老的情况。
在一个或多个实施例中，所述第二检测单元采用单克隆抗体荧光染料染色T淋巴细胞亚群，其中，初始T淋巴细胞的荧光单抗为CD3-PC7、CD4-FITC、CD8-PC5.5、CD45RA-PE、CD27-ECD；中心记忆T淋巴细胞和效应记忆T淋巴细胞的荧光单抗为CD3-PC7、CD4-FITC、CD8-PC5.5、CD45RO-PE、CD27-ECD；活化T淋巴细胞的荧光单抗为CD3-PC7、CD4-ECD、CD8-PC5.5、HLA-DR-FITC、CD38-PE；衰老T淋巴细胞的荧光单抗为CD3-PC7、CD4-ECD、CD8-PC5.5、CD57-FITC、CD28-PE；老化T淋巴细胞和耗竭T淋巴细胞的荧光单抗为CD3-PC7、CD4-FITC、CD8-PC5.5、KLRG1-PE、PD-1-ECD；胸腺输出T淋巴细胞的荧光单抗为CD3-PC7、CD4-FITC、CD8-PC5.5、CD45RA-PE、CD31-ECD。
通过上述荧光单抗的搭配，可以一次性地检测CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞中T淋巴细胞亚群的含量，显著提高检测效率。
实施例4：
如图2所示的一种用于研究HIV感染者免疫衰老机制的方法，包括以下步骤：
获取HIV感染者的全血样本和血浆样本；
检测全血样本中的HIV-1DNA病毒库的含量、以及与免疫衰老相关的T淋巴细胞亚群的含量，得到HIV-1DNA检测数据和T淋巴细胞亚群检测数据；
检测血浆样本中与机体炎症和稳态相关的细胞因子含量，得到细胞因子检测数据；
利用主成分分析法分析T淋巴细胞亚群检测数据和/或细胞因子检测数据，得到T淋巴细胞综合评分值和细胞因子综合评分值，对HIV-1DNA检测数据、T淋巴细胞综合评分值和细胞因子综合评分值进行相关性分析；将HIV-1DNA检测数据、T淋巴细胞综合评分值和细胞因子综合评分值转变为二分类变量指标后，利用logistic回归分析法分析HIV-1DNA检测数据、T淋巴细胞亚群检测数据和细胞因子检测数据之间的影响程度。
在部分实施例中，所述主成分分析法包括以下步骤：
趋同化处理检测数据中各指标数据，将所有指标数据转化为正向指标；
按照累积方差贡献率≥85％提取检测数据中的主成分；
计算每个全血样本或血浆样本中检测数据的主成分的综合评分值，所述综合评分值
Figure GDA0003022726040000091
其中，m为变量个数，k为提取的主成分数，λ为特征根，Ci为第i个主成分，i＝1,2,…,k；
根据综合评分值大小进行排序，综合评分值越大则免疫衰老程度越高，综合评分值越小则免疫衰老程度越低。
实施例5：
本实施例基于上述实施例中的系统及方法研究HIV免疫衰老机制。
本实施例的样本来自HIV成年感染者，经成都市疾病预防控制伦理审查委员会批准，样本采集单元共采集到180份全血样本和111份EDTA抗凝血浆样本(2000g/min，10min)。全血样本完成HIV-1DNA病毒库的检测，以及初始T淋巴细胞Tn、中心记忆T淋巴细胞Tcm、效应记忆T淋巴细胞Tem、活化T淋巴细胞Ta及衰老T淋巴细胞Ts的检测；血浆样本完成IL-6的ELISA检测。
第一检测单元进行的HIV-1DNA病毒库检测采用精耐特公司全血基因组DNA提取试剂盒和HIV-1DNA定量检测试剂盒，其结果以每1×106个白细胞中HIV-1DNA的拷贝数表示，即cps/106cells；第二检测单元所采用的流式细胞术检测的荧光单抗购自Beckman公司，其结果以CD4+T淋巴细胞或CD8+T淋巴细胞中T淋巴细胞亚群目标细胞所占的百分比表示；ELISA试剂购自R&D System公司，其结果以血浆样本中IL-6的浓度(pg/mL)表示。
1.HIV-1DNA病毒库含量检测
1.1提取人全血基因组DNA
(1)取全新的1.5mL离心管，并加入20μL蛋白酶K至管底部。
(2)向管内加入200μL全血样本，当血液样品体积小于200μL时，可加入PBS补足至200μL。
(3)向管内加入200μL血液裂解液(BL)，震荡混匀后56℃孵育10分钟。
(4)向管内加入200μL无水乙醇，震荡混匀后短暂离心。
(5)将纯化柱插入2mL收集管内，将孵育管内液体全部转移至纯化柱中，8000×g离心1分钟，丢弃含有滤出液的收集管。
(6)将纯化柱插入新2mL收集管内，加入500μL漂洗液-1(W1)，8000×g离心1分钟，丢弃含有滤出液的收集管。
(7)将纯化柱插入新2mL收集管内，加入500μL漂洗液-2(W2)，8000×g离心1分钟，丢弃含有滤出液的收集管。
(8)将纯化柱插入新2mL收集管内，8000×g离心1分钟，丢弃含有滤出液的收集管。
(9)将纯化柱插入新1.5mL离心管内，加入50μL56℃预热的洗脱液(E)到膜中央，静置3钟，8000×g离心1分钟，收集洗脱液。
(10)紫外分光光度计可在260nm处检测DNA浓度，琼脂糖凝胶电泳也可用于测定其浓度和片段大小。
(11)DNA提取后，4℃保存备用，立即进行检测。或者将所提DNA保存在-20℃以下保存，冻融避免过5次，保存时间避免超过12个月。
1.2HIV-1DNA的定性检测或定量检测
(1)将试剂盒冰箱里取出恢复至室温，各组分充分溶解、混匀，快速离心15秒；按照10μL/孔分装量将HIV-1反应液和基因组总量反应液分装至8联管中，2孔为一组，剩余试剂于-20℃或以下避光储藏。
(2)将已提取好的DNA样本/阳性对照品/阴性对照品，每孔分别加入10μL，总反应体系体积为20μL，然后采用8联管盖封闭8联管。
(3)加样完毕后，持续震荡2分钟将DNA样本混匀，随后以≥2000g离心1分钟去除气泡。
(4)将离心后反应板放在实时荧光PCR检测仪上，选择SYBR/FAM荧光信号采集通道。按以下条件设置反应程序：96℃预变性2min；96℃变性12s，60℃退火30s，64℃延伸30s，68℃延伸30s，45个循环。
2.T淋巴细胞亚群含量检测
(1)多色荧光抗体的制备：每一组T淋巴细胞亚群检测组的采用5种Beckman@公司的荧光单抗来制备，每一检测管中分别加入FITC和PE的荧光单抗5μL，分别加入ECD、PC5.5、PC7的荧光单抗2.5μL，共配制成17.5μL多色荧光抗体试剂；其中，初始T淋巴细胞Tn的荧光单抗为CD3-PC7、CD4-FITC、CD8-PC5.5、CD45RA-PE、CD27-ECD、中心记忆T淋巴细胞Tcm和效应记忆T淋巴细胞Tem的荧光单抗为CD3-PC7、CD4-FITC、CD8-PC5.5、CD45RO-PE、CD27-ECD、活化T淋巴细胞Ta的荧光单抗为CD3-PC7、CD4-ECD、CD8-PC5.5、HLA-DR-FITC、CD38-PE，衰老T淋巴细Ts的检测的荧光单抗为CD3-PC7、CD4-ECD、CD8-PC5.5、CD57-FITC、CD28-PE。
(2)加入多色荧光抗体后，加入50μL充分混匀的全血样本，旋涡混匀3秒，室温避光孵育15分钟。
(3)加入250μL充分混匀的溶血素，漩涡混匀3秒，室温避光孵育15分钟。
(4)加入150μL鞘液，漩涡混匀3秒，再加入50μL充分混匀的Flow-count绝对计数的微球，充分混匀后在2h以内用Beckman@FC500检测。
(5)完成检测后的结果导入Kaluza软件进行T淋巴细胞亚群分析。
3.细胞因子含量检测
(1)使用前将ELISA试剂盒里的所有试剂平衡至室温，根据试剂盒的要求配制工作标准品。
(2)采用EDTA抗凝全血，全血样本2000g/min，离心10分钟，取上层血浆。
(3)按检测需要选择相应数量的培养板条，剩余板条放回装有干燥剂的锡箔袋中，重新密封。
(4)每孔按说明书要求加入一定量的稀释液，再依次加入标准品、样本和对照，用塑料薄膜密封，室温下5000r/min震荡孵育2个小时。
(5)吸弃孔内液体，每孔加入400μL洗涤液充分洗涤后去除液体，反复洗涤4次，洗涤结束后在干净纸上排干。
(6)每孔按说明书要求加入一定量的酶标抗体试剂，塑料薄膜密封，室温下震荡孵育2个小时。
(7)重复步骤(5)
(8)每孔加入底物液，室温避光孵育一定时间。
(9)每孔加入终止液，充分混匀。
(10)在一定时间内上机检测，采用双波长检测法，校正光学误差。
(11)标准、对照、样本的OD值减去空白对照的OD值后，根据标准品的标准曲线计算出相应的浓度。
4.统计分析
主成分分析利用降维分析技术，将T淋巴细胞亚群检测得到的10个变量结果：CD4+Tn％、CD4+Tcm％、CD4+Tem％、CD4+Ta％、CD4+Ts％、CD8+Tn％、CD8+Tcm％、CD8+Tem％、CD8+Ta％、CD8+Ts％转化为少数几个综合变量作为主成分，并通过计算主成分得分算出综合评分值，通过对这个综合评分值进行排序，可以得到评价对象T淋巴细胞衰老的程度。
分析步骤为：首先对原始数据趋同化处理，其中Ta、Ts、Tcm、Tem随着免疫衰老的加重而增加属于正向指标，Tn随着免疫衰老的加重而减少属于逆向指标，因此对其指标的检测结果CD4+T淋巴细胞亚群中Tn所占百分比(CD4+Tn％)用差值法(100-X)％转化为正向指标；之后按照累积方差贡献率≥85％的原则，提取出主成分，计算每个样本的主成分综合评分值
Figure GDA0003022726040000121
其中，m为变量个数，k为提取的主成分数，λ为特征根，Ci为第i个主成分，i＝1,2,…,k；对该综合评分值进行排序，即可得到T淋巴细胞亚群所代表的免疫衰老的程度，免疫衰老程度越高，综合评分值也越高，反之亦然。
本实施例中，细胞因子为IL-6，因此无需利用主成分分析法处理细胞因子。在一个或多个实施例中，细胞因子可以选用IL-6、IL-7和TNF-α中的至少两种。当细胞因子的数量大于两个时，利用主成分分析法处理细胞因子，得到细胞因子综合评分值，并对综合评分值进行排序，得到细胞因子所代表的免疫衰老程度。细胞因子的主成分分析方法与上述T淋巴细胞亚群的分析方法相同。在细胞因子中，IL-6和TNF-a为正向指标，浓度越高，炎症越严重；IL-7为逆向指标，浓度越高，越有利于细胞稳态。三类细胞因子的量纲不同，需要对三类细胞因子进行标准化处理再进行主成分分析。在部分实施例中，细胞因子也可以选择除了IL-6、IL-7和TNF-α以外的其他与机体炎症和稳态相关的细胞因子。
本实施例中，对HIV-1DNA病毒库和IL-6检测结果进行标准化处理，得到各自相应的标准化Z值。对标准化处理以后的HIV-1DNA病毒库、IL-6浓度及免疫衰老T淋巴细胞亚群综合评分值进行相关性分析。之后对这三类指标进行排序，以中位数为分界点，对每类指标转变为，分为高值组和低值组，即高病毒库组、低病毒库组、高免疫衰老组、低免疫衰老组、高IL-6组、低IL-6组，将连续型变量转变为二分类变量，从而对这些变量进行logistic回归分析。
4.1指标的一般特征
对检测结果进行统计描述，由于得到的HIV-1DNA病毒库和IL-6浓度不满足正态分布，故采用中位数、最小值、最大值对所有指标的一般特征进行统计学描述，结果见表1。
表1：指标的统计学描述
Figure GDA0003022726040000131
4.2T淋巴细胞亚群的主成分分析
对T淋巴细胞亚群进行主成分分析，结果如表2，按累计方差≥85％，提取前5个主成分，综合评分值F＝F1×0.3966+F2×0.1887+F3×0.1101+F4×0.0911+F5×0.0754。
表2：相关矩阵的特征值
Figure GDA0003022726040000132
Figure GDA0003022726040000141
4.3相关性分析
对HIV-1DNA病毒库和IL-6检测结果进行标准化处理，对病毒库、免疫衰老细胞、IL-6浓度进行spearman两两相关性分析，如表3所示，三组指标均两两正相关，即HIV-1DNA病毒库大小与T淋巴细胞亚群免疫衰老程度正相关，HIV-1DNA病毒库大小与IL-6浓度正相关，T淋巴细胞亚群免疫衰老程度也与IL-6的浓度正相关，P值均小于0.05，均有统计学意义。
表3：相关性分析
分析指标 相关系数r P值
病毒库与免疫衰老细胞 0.26 0.0004
病毒库与IL-6 0.24 0.0098
免疫衰老细胞与IL-6 0.20 0.032
4.4logistic回归
将上述指标通过中位数转变为二分类变量指标后，进行logistic回归分析。以病毒库大小作为自变量，细胞免疫衰老程度作为因变量，进行logistic回归，得到OR为1.960，P值为0.026，差异有统计学意义，可以认为病毒库大小对细胞免疫衰老程度有影响，高病毒库含量的HIV感染者出现高度细胞免疫衰老的风险是低病毒库含量者的1.96倍。
以病毒库大小作为自变量，IL-6浓度高低作为因变量，进行logistic回归，得到OR为1.728，P值为0.1526，差异无统计学意义，无法判断病毒库大小对IL-6浓度的影响。以细胞免疫衰老程度作为自变量，IL-6浓度高低作为因变量，进行logistic回归，得到OR为1.385，P值为0.3930，差异无统计学意义，无法判断病毒库大小对IL-6浓度的影响。
上述分析中，无法判断部分指标影响程度的原因在于，在样本收集阶段，用以做IL-6血浆样本只收集到111份而用以做HIV-1DNA病毒库和T淋巴细胞亚群的全血样本收集到了180份，不足全血样本的2/3。此外，T淋巴细胞亚群选择了4类指标(占第二检测单元指标数的2/3)，细胞因子指标只选了1种(占第三检测单元指标数的1/3)，从样本量和指标数的角度都偏少。但是，即使是在这种情况下，通过上述系统及方法也发现了IL-6与HIV-1DNA病毒库和与衰老相关的T淋巴细胞亚群具有正相关，不仅如此，如表4所示，高病毒库和高细胞衰老组的IL-6中位数值分别高于低病毒库和低细胞衰老组。由此可见，上述HIV感染者免疫衰老机制的系统及方法是可靠和有效的，随着样本量增大，细胞因子类型增加，病毒库对细胞因子的浓度，以及细胞免疫衰老程度对细胞因子的浓度影响的统计学差异会在回归分析里出现。
表4：不同分组方式对IL-6浓度的影响
分组方式 高值组 低值组
HIV-1DNA病毒库大小 3.25pg/mL 2.39pg/mL
细胞衰老程度F值 3.17pg/mL 2.44pg/mL
综上，基于本实施例的研究成果，对HIV感染者免疫衰老的机制和进程进行系统性分析。HIV-1DNA病毒库大小、T淋巴细胞免疫衰老程度、IL-6分泌的大小三者之间均是正相关的，并且可以看到HIV-1DNA病毒库的大小会对T淋巴细胞的免疫衰老产生影响，病毒库增大使得HIV感染者T淋巴细胞中初始的T淋巴细胞减少，记忆T淋巴细胞增多，细胞过度活化和衰老，从而加速T淋巴细胞的免疫衰老进程，高病毒库含量的HIV感染者出现高度细胞免疫衰老的风险是低病毒库含量者的1.96倍，此外病毒库与细胞免疫衰老可能会同时伴随IL-6的过度分泌，影响HIV感染者的免疫功能。如果未来能有一些药物或者其他干预手段能以HIV-1DNA病毒库作为靶点，降低其含量，将有利于HIV感染者T淋巴细胞亚群免疫衰老程度，有利于提升HIV感染者的免疫功能。
对HIV感染者免疫衰老机制的研究可能会成为重建免疫功能治疗的关键，有利于药物的研发与评估。同时，由于免疫衰老相关的指标不是治疗最终结局指标，而是中间指标，可能会能更敏感和快速地反映出干预手段如随访干预、心理疏导、营养指导等等的效果，不仅如此，其他慢性感染性疾病如肺结核、乙肝或免疫力低下如老年人等人群中也同样具有应用价值，具有较为广泛的适用人群。
在部分实施例中，基于上述系统及方法，能够评估干预手段。具体地，根据干预手段设置试验组和对照组。对T淋巴细胞亚群和细胞因子进行主成分分析，分析方法同上述实施例所公开的方法。对试验组和对照组的病毒库、T淋巴细胞亚群和细胞因子的综合评分值进行单因素分析，例如独立样本t检验、单因素方差分析、秩和检验等，比较不同干预手段分别对三类指标的影响，之后以干预手段的分组为自变量，三类指标为因变量，进行多元t检验，综合评估药物干预手段对免疫衰老相关的核酸、细胞、细胞因子的影响。
实施例6：
在上述实施例的基础上，第一检测单元的定量标准曲线绘制单元通过以下方法制定双基因定量标准曲线：
经过传代以后的单拷贝HIV-1DNA插入的8E5细胞系，采用DNA提取试剂提取出核酸DNA，提取物的浓度控制在66ng/μL，使得能控制内参基因的浓度为2×104cps/μL，HIV-1DNA目标基因的浓度为1×103cps/μL。在此基础上进行10倍浓度梯度稀释，使得内参基因的浓度梯度2×104cps/μL、2×103cps/μL、2×102cps/μL、20cps/μL，HIV-1DNA的浓度梯度为1×103cps/μL、1×102cps/μL、10cps/μL、1cps/μL。PCR反应体系中核酸加入的量为10μL，因此内参基因的反应体系浓度最终为2×105、2×104、2×103、200cp，HIV-1DNA的反应体系浓度最终为1×104、1×103、100、10cps/μL。
为了使定量结果，更具有可比性，首先要设置统一的荧光信号阈值线。将内参基因荧光信号阈值设为80,000，目标基因荧光信号阈值设为100,000，只要在相同的实验环境和仪器设备上用该试剂盒进行HIV-1DNA的定量检测，均以此阈值线为标准。在此阈值线下，内参基因和HIV-1DNA每个浓度设立三个平行样进行荧光PCR检测，检测结果(以Ct值表示)如表5所示。
表5：HIV-1DNA和内参基因标准曲线的检测结果(Ct值)
Figure GDA0003022726040000161
表5中，样本拷贝数
Figure GDA0003022726040000162
其中，X1代表样本中目标基因的Ct值，X2代表样本中内参基因的Ct值。
选择每个浓度的平均值绘制标准曲线如图3所示，根据这两条标准曲线即可计算出样本中HIV-1DNA的拷贝数。每更换一批试剂，按此方法重新绘制定量标准曲线。
实施例7：
在上述实施例的基础上，第一检测单元包括有效性验证单元，用于对定性结果进行双重验证，验证试剂盒的有效性和/或样本的有效性。
在一个实施例中，有效性验证单元对定性结果进行双重验证，方法如下：
由于定性的判定方式为是以HIV-1DNA基因检测孔Ct值43为界限的划定，而对于阈值线没有特殊的控制，有可能会造成Ct值在43附近的样本检测结果可能会因为人员操作带来误差，故本检测平台要求检测孔Ct值在43±1的样本须进行复检。
复检的方式：将42＜Ct＜43的核酸提取样本进行对倍稀释再重新上机检测；将43＜Ct＜44的样本重新提取，提取时加入的全血量加倍至400μL。如果复检结果与初检结果一致，则维持原结果的判断；如果复检结果与初检结果不一致，则判为“不确定”。
在一个实施例中，有效性验证单元对试剂盒的有效性进行判定，若质控品检测值不在靶值范围以内，则此次实验结果无效建议重新检测。
在一个实施例中，有效性验证单元对样本有效性进行判定，样本控制反应孔信号应升起，Ct值应在20±2；如果控制孔Ct值小于前述范围，说明加入的基因组DNA过量，应减少DNA加入量再进行试验，但检测孔信号无升起或落在阴性区，该试验结果仍可信；如果控制孔为阴性或其Ct值大于前述范围，说明加入的基因组DNA含有PCR抑制剂或DNA加入量过少，需重新提取DNA或增加DNA上样量再进行试验，但检测孔信号有升起且落在阳性区，该试验结果仍可信。
在一个或多个实施例中，对于HIV-1DNA的定性检测，在确定试剂盒和样本的有效性后，样本检测孔Ct值大于43或无Ct值，则该样本为HIV-1阴性；样本检测孔Ct值小于或等于43，则该样本为HIV-1阳性；样本检测孔Ct值在42＜Ct＜44，需进行复检，复检结果与初检结果一致结果报告初检结果，复检结果与初检结果不一致则判为不确定。
在一个或多个实施例中，对于HIV-1DNA的定量检测，如果检测孔的Ct值＜43，采用实施例6制定的定量标准双曲线，输入HIV-1DNA基因Ct值和内参基因Ct值，计算出106的细胞中感染HIV-1DNA拷贝数(copies/106cells；如果检测孔的Ct值＞43或无Ct值，则未检出，这部分样本的结果也为低于检出限。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种用于研究HIV感染者免疫衰老机制的系统，其特征在于，包括：
样本采集单元，用于获取HIV感染者的全血样本和血浆样本，所述HIV感染者是指已通过治疗降低了体内HIV RNA病毒载量的HIV感染患者；
第一检测单元，用于检测全血样本中的HIV-1 DNA病毒库的含量，得到HIV-1 DNA检测数据；
第二检测单元，用于检测与免疫衰老相关的T淋巴细胞亚群的含量，得到T淋巴细胞亚群检测数据；所述第二检测单元利用流式细胞术检测全血样本中与免疫衰老相关的T淋巴细胞亚群占CD4+T淋巴细胞的百分比和/或与免疫衰老相关的T淋巴细胞亚群占CD8+T淋巴细胞的百分比；所述与免疫衰老相关的T淋巴细胞亚群包括初始T淋巴细胞、中心记忆T淋巴细胞、效应记忆T淋巴细胞、活化T淋巴细胞、衰老T淋巴细胞、老化T淋巴细胞、耗竭T淋巴细胞和胸腺输出T淋巴细胞；所述第二检测单元采用单克隆抗体荧光染料染色T淋巴细胞亚群，其中，初始T淋巴细胞的荧光单抗为CD3-PC7、CD4-FITC、CD8-PC5.5、CD45RA-PE、CD27-ECD；中心记忆T淋巴细胞和效应记忆T淋巴细胞的荧光单抗为CD3-PC7、CD4-FITC、CD8-PC5.5、CD45RO-PE、CD27-ECD；活化T淋巴细胞的荧光单抗为CD3-PC7、CD4-ECD、CD8-PC5.5、HLA-DR-FITC、CD38-PE；衰老T淋巴细胞的荧光单抗为CD3-PC7、CD4-ECD、CD8-PC5.5、CD57-FITC、CD28-PE；老化T淋巴细胞和耗竭T淋巴细胞的荧光单抗为CD3-PC7、CD4-FITC、CD8-PC5.5、KLRG1-PE、PD-1-ECD；胸腺输出T淋巴细胞的荧光单抗为CD3-PC7、CD4-FITC、CD8-PC5.5、CD45RA-PE、CD31-ECD；
第三检测单元，用于检测血浆样本中与机体炎症和稳态相关的细胞因子含量，得到细胞因子检测数据；所述第三检测单元采用酶联免疫吸附试验检测血浆样本中与机体炎症和稳态相关的细胞因子含量，所述与机体炎症和稳态相关的细胞因子包括IL-6、IL-7和TNF-α；
分析单元，用于接收HIV-1 DNA检测数据、T淋巴细胞亚群检测数据和细胞因子检测数据，并对T淋巴细胞亚群检测数据和细胞因子检测数据进行主成分分析，得到T淋巴细胞综合评分值和细胞因子综合评分值，将HIV-1 DNA检测数据、T淋巴细胞综合评分值和细胞因子综合评分值进行相关性分析，判断HIV-1 DNA检测数据、T淋巴细胞亚群检测数据和细胞因子检测数据之间的相关性；根据含量大小，将HIV-1 DNA检测数据分为高病毒库组和低病毒库组，T淋巴细胞综合评分值分为高细胞免疫衰老组和低细胞免疫衰老组，细胞因子综合评分值分为高细胞因子组和低细胞因子组，进行logistic回归分析，判断HIV-1 DNA检测数据、T淋巴细胞亚群检测数据和细胞因子检测数据之间的影响程度。
2.根据权利要求1所述的一种用于研究HIV感染者免疫衰老机制的系统，其特征在于，所述第一检测单元提取全血样本中的所有DNA，通过PCR法检测并计算单位数量的白细胞中HIV-1 DNA的拷贝数。
3.根据权利要求2所述的一种用于研究HIV感染者免疫衰老机制的系统，其特征在于，所述第一检测单元包括定量标准曲线绘制单元，所述定量标准曲线绘制单元基于人类特异性基因片段的内参基因和HIV-1 DNA的特异性基因制定双基因定量标准曲线以用于PCR定量检测。
4.根据权利要求1所述的一种用于研究HIV感染者免疫衰老机制的系统，其特征在于，所述分析单元用于将HIV-1 DNA检测数据、T淋巴细胞综合评分值和细胞因子综合评分值转变为二分类变量指标后，利用logistic回归分析法分析HIV-1 DNA检测数据、T淋巴细胞亚群检测数据和细胞因子检测数据之间的影响程度。
5.根据权利要求4所述的一种用于研究HIV感染者免疫衰老机制的系统，其特征在于，所述主成分分析法包括以下步骤：
趋同化处理检测数据中各指标数据，将所有指标数据转化为正向指标；
按照累积方差贡献率≥85%提取检测数据中的主成分；
计算每个全血样本或血浆样本中检测数据的主成分的综合评分值，所述综合评分值
Figure DEST_PATH_IMAGE001
，其中，m为变量个数，k为提取的主成分数，λ为特征根，Ci为第i个主成分，i=1,2,…,k；
根据综合评分值大小进行排序，综合评分值越大则免疫衰老程度越高，综合评分值越小则免疫衰老程度越低。
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