CN112062841A - 多肽及其制备方法、抗p53蛋白的人工抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多肽设计制备方法、一种抗p53蛋白的人工抗体及其应用。发明了一种同时嫁接天然抗体的两个CDR loop片段到纳米粒子上的方法，将天然抗体的两个CDR loop片段通过一个半胱氨酸拼接成一条多肽，并在其两端再各添加一个半胱氨酸；设计的多肽具有3个半胱氨酸，可以和纳米粒子形成3点固定，从而形成M形结构，模拟天然抗体的两个CDR loop正确相对位置和构象并共同完成识别抗原的功能。本发明涉及了一种靶向p53蛋白的金纳米抗体，由设计的一段含2个CDR loop拼接在一起组成的多肽修饰金纳米粒子而来。该金抗体能够特异性地靶向p53蛋白。本发明新型金纳米抗体，可特异性识别p53蛋白，当p53蛋白浓度很低时，金抗体依然可以保持与蛋白高的结合亲和力。

Description

多肽及其制备方法、抗p53蛋白的人工抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种金纳米抗体的设计和其用途，应用于生物纳米材料及生物医药技术领域。

背景技术

p53蛋白含有393个氨基酸，相对分子质量为53,000，因此被命名为p53蛋白。p53下游基因主要包括p21、MDM2、GADD45、CD95/fas、Bax、WT1、p53AIPI、pig3、Cyclin G等。p53下游靶基因直接参与细胞凋亡、生长周期、衰老、DNA修复等功能的形成，对肿瘤的抑制与形成密切相关。

近年来，纳米科技迅速发展，纳米药物在癌症治疗的效果方面越来越显著。公开号为CN105884888A的专利文献公开了一种基于金纳米粒子的人工抗体构建方法，以金纳米粒子作为骨架，嫁接天然抗体的单个互补决定区(complementarity determining region，CDR)片段(CDR loop)，通过构象控制制备得到具有天然抗体功能的的金纳米抗体的方法，只适用于天然抗体中由单个CDR loop起识别抗原的决定性作用的少数情况，对于大多数识别抗原需要同时使用两个CDR loop的情况无能为力，其中的关键难点是控制两个CDR loop的相对位置。因此限制了基于金纳米粒子的人工抗体的开发和应用，如何克服上述技术问题，成为亟待解决的技术问题。

发明内容

为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，针对需要两个CDR loop起作用的天然抗体，发明了一种简单地同时嫁接两个CDRloop到金纳米粒子的方法。其主要特征是将两个CDR loop合并设计成一条多肽，并在这条多肽中设计3个与金纳米粒子的规定位点(半胱氨酸)，使这一条设计的多肽可以在金纳米粒子上形成“M”形的相连的两个loop结构，避免了分别连接两个单CDR loop产生的两个loop随机混乱的相对位置而没有活性的问题。本发明以p53抗原，将p53的天然抗体的两段CDR loop通过一个半胱氨酸拼接在一起，设计出了一种双环肽，通过调节多肽片段在金纳米粒子表面的跨度实现构象的调控，最终制备出一种能够靶向p53的新型金纳米抗体。本发明实现一种能够靶向p53蛋白的新型金纳米抗体的设计和其用途。

为达到上述发明创造目的，本发明采用如下技术方案：

一种多肽，为如下(1)和(2)中的任意一种多肽：

(1)含有序列1所示氨基酸序列的多肽；

(2)在不改变关键结合残基的条件下，将序列1所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失、和/或添加的由(1)衍生的多肽。

优选多肽的氨基酸序列如下：

CysAlaAlaSerGluAlaThrPheSerThrTyrAlaMetCysIleAsnTrpSerGlyThrThrThrTyrAlaCys

上述序列的氨基酸以单字母简写表示为：CAASEATFSTYAMCINWSGTTTYAC。

一种本发明构造金纳米抗体的多肽设计制备方法，将天然抗体的两个互补决定区CDR loop序列通过一个半胱氨酸拼接成一条多肽，并在其两端再各添加一个半胱氨酸；所述多肽具有3个半胱氨酸，能和金纳米粒子形成3点固定，从而形成“M”形的结构，从而模拟天然抗体的两个CDR loop的相对位置。

一种抗p53蛋白的人工抗体，将本发明多肽通过共价作用修饰到金纳米粒子表面，制成的抗p53蛋白的金纳米抗体。

优选所述抗p53蛋白的人工抗体的每个纳米粒子可用接多肽的密度为每平方纳米表面接0.1～1个NP2多肽，最佳接多肽的密度为每平方纳米的表面上接大约0.2个NP2多肽。

一种本发明抗p53蛋白的人工抗体在制备金纳米抗体的应用，包括如下a-c中至少一种用途：

a.制备特异性检测p53蛋白的试剂；

b.制备一种用于治疗或者预防p53蛋白表达水平过高引起的相关疾病的药物。

c.作为靶向p53蛋白的、用于体内显像定位及药物递送的靶向功能单元。

本发明能同时嫁接天然抗体的两个CDR loop片段到纳米粒子上的方法，从而通过构象控制，在纳米粒子上重构天然抗体识别抗原的能力。本发明将天然抗体的两个CDRloop片段通过一个半胱氨酸拼接成一条多肽，并在其两端再各添加一个半胱氨酸。设计的多肽具有3个半胱氨酸，和纳米粒子形成3点固定，从而形成M型构象，模拟天然抗体的两个CDR。

应用本发明设计方法，实现一种能靶向p53蛋白的新型金纳米抗体。设计了一段基于p53天然抗体CDR1和CDR2氨基酸序列组成的多肽片段，该多肽包含有表中序列1所示的氨基酸序列，氨基酸以单字母简写表示：CAASEATFSTYAMCINWSGTTTYAC。应用和公开号为CN105884888A的专利文献公开了一种基于金纳米粒子的人工抗体构建方法相同的方法，把这个多肽嫁接到金纳米粒子，并通过构象控制，得到一种全新的金纳米抗体。

本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：

1.本发明设计了一种同时嫁接两个CDR loop到金纳米粒子并并保持其正确相对位置的方法。

2.本发明设计的新型金纳米抗体，可以特异性识别p53蛋白。并且当p53浓度很低时，金抗体依然可以保持与蛋白高的结合亲和力。

3.本发明金纳米抗体在生物医学领域有着潜在的应用前景。

附图说明

图1为本发明优选实施例的人工抗体设计示意图。

图2为本发明优选实施例人工抗体AuNP-NP2与p53结合的最优密度选择示意图。

图3为本发明优选实施例人工抗体AuNP-NP2对比及其对照组与p53的结合强度图。

图4为本发明优选实施例人工抗体AuNP-NP2与p53结合的动力学试验结果。

图5为本发明优选实施例人工抗体AuNP-NP2与p53的特异性结合试验结果。

具体实施方式

以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本发明的优选实施例详述如下：

在本实施例中，以粒径3.6纳米左右的金纳米粒子为例，设计一种靶向p53蛋白的金纳米抗体，并进行表征和测试如下：

1、多肽片段的设计

设计了一段由双CDR loop组成的多肽序列NP2，氨基酸以单字母简写表示:CAASEATFSTYAMCINWSGTTTYAC。

其通过中间及两端共3个半胱氨酸的巯基固定在纳米金表面，从而形成特定的“M”形双环构象。在此基础上设计了一些对照组，氨基酸以单字母简写表示，用于展示这种设计的优点：

NP2A：CAASEATFSTYAMC；NP2B：CINWSGTTTYAC；NP2A和NP2B为单个CDR loop多肽，用以显示单个CDR loop或这两种的随机组合都不能正确地重现抗体的功能；

NP2C：CAASEATFSTYAMSINWSGTTTYA，NP2D：CASEATFSTYAMSINWSGTTTYAAC；NP2C和NP2D分别为只有一个和两个固定位点氨基酸(半胱氨酸)的对照肽，用于显示设计的目标肽中3个固定位点的重要性。

2、金纳米抗体物理性质的表征

分别通过透射电子显微镜、紫外可见分光光度计和Zeta电位仪对金抗体进行了表征，证明了合成的金抗体粒径大小均一以及分散性良好。

3、人工抗体AuNP-NP2与p53相结合的最优密度筛选

多肽在纳米粒子表面的跨度太宽或者太窄都会影响人工抗体形成正确的构象，只有当密度处于合适的范围下，才可以将多肽调节至合适的跨度。图1为本发明优选实施例的人工抗体设计示意图。将天然抗体的两个CDR片段通过一个半胱氨酸拼接成一条多肽，并在其两端再各添加一个半胱氨酸。设计的多肽具有3个半胱氨酸，可以和纳米粒子形成3点固定，从而形成M形构象，模拟天然抗体的两个CDR。中心圆球为金纳米粒子，C为半胱氨酸，起固定作用，将CDR1和CDR2嫁接在金纳米粒子表面。图2表明所述抗p53蛋白的人工抗体的每个金纳米粒子(粒径约3.6纳米)上接5～40个NP2后与p53蛋白的结合，金纳米粒子的粒径为3.6纳米，对应可用接多肽的密度为每平方纳米金表面接0.1～1个NP2多肽，最佳接多肽的密度为每平方纳米金表面大约0.2个NP2多肽。图2表明最佳密度是每个3.6纳米金纳米粒子上接10个NP2，对应接肽密度为每平方纳米金表面大约0.2个NP2多肽，下面的实验以这个密度进行。

4、金抗体AuNP-NP2和其对照组与p53的结合对比

为了证明基于两段CDR loop环肽设计的金抗体与p53的结合效果好于单个loop设计的金抗体，在同等实验环境下对比了AuNP-NP2及其对照组与p53的结合情况，结果如图3所示。

5、金抗体AuNP-NP2与p53结合的动力学试验

为了验证我们制备的金纳米抗体AuNP-NP2具有与p53较强结合以及特异性识别的能力，我们测定了金纳米抗体AuNP-10NP2与p53结合的动力学实验，对金纳米抗体与p53的动力学数据结果，我们按1:1结合模型拟合，得到两者的结合常数K_D＝9.22×10^-11M，这远远高于p53天然抗体与p53的结合亲和力值，为1uM，这有力地证明了人工抗体AuNP-10NP2与p53的高强度结合。参见图4。

6、金抗体AuNP-NP2与p53蛋白的特异性结合试验

为了检测人工抗体AuNP-NP2与p53特异性结合的能力，我们在相同条件下测定了AuNP-10NP2和p53、BSA以及IgG的结合强度。如图5所示，金抗体AuNP-10NP2与p53有明显的结合，但是与BSA和IgG结合较弱，这充分说明了金抗体AuNP-NP2可以特异性识别p53。

综上所述，本实施例同时嫁接天然抗体的两个CDR loop片段到纳米粒子上，将天然抗体的两个CDR loop片段通过一个半胱氨酸拼接成一条多肽，并在其两端再各添加一个半胱氨酸；设计的多肽具有3个半胱氨酸，和纳米粒子形成3点固定，从而形成M形构象，模拟天然抗体的两个CDR的功能。实现了一种靶向p53蛋白的金纳米抗体，由设计的一段含2个CDR loop环拼接在一起组成的多肽序列修饰金纳米粒子而来。该金抗体能够特异性地靶向p53。本实施例设计的新型金纳米抗体，可以特异性识别p53蛋白。并且当p53浓度很低时，金抗体依然可以保持与蛋白高的结合亲和力。该金纳米抗体在生物医学领域有着潜在的应用前景。

上面对本发明实施例结合附图进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明多肽设计制备方法、抗p53蛋白的人工抗体及其应用的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 上海大学

<120> 多肽及其制备方法、抗p53蛋白的人工抗体及其应用

<141> 2020-06-11

<160> 1

<210> 1

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

Cys Ala Ala Ser Glu Ala Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Cys Ile Asn Trp Ser

1 5 10 15

Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Cys

20 25

Claims (6)

1.一种多肽，其特征在于：为如下(1)和(2)中的任意一种多肽：

(1)含有序列1所示氨基酸序列的多肽；

(2)在不改变关键结合残基的条件下，将序列1所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失、和/或添加的由(1)衍生的多肽。

2.根据权利要求1所述多肽，其特征在于：所述多肽氨基酸序列如下：CysAlaAlaSerGluAlaThrPheSerThrTyrAlaMetCysIleAsnTrpSerGlyThrThrThrTyrAlaCys。

3.一种权利要求1所述多肽的设计制备方法，其特征在于：将天然抗体中识别抗原的两个互补决定区(CDR loop)的序列通过一个半胱氨酸拼接成一条多肽，并在其两端再各添加一个半胱氨酸；所述多肽具有3个半胱氨酸，能和金纳米粒子形成3个Au-S键，从而将多肽以M形链接到金纳米粒子上。

4.一种抗p53蛋白的人工抗体，其特征在于：将权利要求1所述多肽通过共价作用修饰到金纳米粒子表面，制成的抗p53蛋白的金纳米抗体。

5.根据权利要求4所述抗p53蛋白的金纳米抗体，其特征在于：设计的多肽在金纳米粒子表面形成与天然抗体中两个识别抗原的CDR相似的相对取向和构象。

6.一种权利要求4所述抗p53蛋白的金纳米抗体的应用，包括如下a-c中至少一种用途：

a.制备特异性检测p53蛋白的试剂；

b.制备一种用于治疗或者预防p53蛋白表达水平过高引起的相关疾病的药物。

c.作为靶向p53蛋白的、用于体内显像定位及药物递送的靶向功能单元。

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