CN112055715A - 使用cofilin磷酸化定量检测cd4 t细胞损伤和预测抗逆转录病毒治疗后cd4 t细胞恢复 - Google Patents

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Abstract

慢性疾病如HIV感染和癌症中存在的主要免疫功能障碍是T细胞能动性和向组织迁移的障碍。诸如抗逆转录病毒疗法或癌症疗法等疗法往往不能完全恢复T细胞对组织迁移和浸润的能动性。Cofilin是一种Actin解聚因子，调节T细胞迁移的Actin动态变化。我们证明T细胞(CD4和CD8)、巨噬细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞,和/或癌症细胞的cofilin磷酸化水平可以用来量化免疫损害引起的慢性病毒感染和癌症,并预测T细胞治疗后的恢复。

Description

使用COFILIN磷酸化定量检测CD4 T细胞损伤和预测抗逆转录 病毒治疗后CD4 T细胞恢复
交叉引用相关申请
本申请明确了美国临时申请编号62/620,598专利的优先收益权，该专利于2018年1月23日提交，其内容在此作为整体参考纳入本申请书。
背景技术
抗逆转录病毒疗法(ART)显著延长了艾滋病毒感染者的寿命，但既不能治愈，也不能完全恢复免疫。HIV感染的自然过程会导致多种CD4 T细胞缺陷(1)，包括T细胞迁移及向肠相关淋巴组织(GALT，Gut-Associated lymphoid tissue)等的归巢障碍(2-4)。即使通过抗逆转录疗法(ART)抑制了病毒，CD4 T细胞还是无法在淋巴组织中重分布(2,3,5,6)，由此造成的免疫损伤及重建不良会影响长期的病毒抑制(7)。HIV感染者外周循环中大多数CD4T细胞没有感染HIV病毒(每百万0.2-16.4个HIV+细胞)(8)。因此，患者的T细胞迁移缺陷可能是由病毒(9,10)和/或炎症因子的慢性刺激和受体信号传导的旁观者效应造成的(1,2)。然而，造成这种持续的T细胞功能障碍的分子机制尚未阐明。这阻碍了通过恢复T细胞功能，实现持续免疫控制和清除艾滋病毒的有效疗法的发展。
在癌症中，T细胞的迁移和浸润也有类似的损伤(11)。CD8 T细胞等T细胞在肿瘤免疫中发挥重要作用，但肿瘤可以通过各种防御机制直接或间接地抑制T细胞向肿瘤床的迁移，从而进行免疫控制(11)。
在人体免疫系统中，T细胞的活性主要由受体信号调节。趋化受体(如趋化因子受体、细胞因子受体、整合素受体、黏附分子受体和共刺激分子受体如CD28、CTLA-4和PD-1/PD-L)的持续刺激及信号传导通常会导致T细胞极化和分化。在HIV感染中，病毒通过gp120结合CD4和趋化因子共受体CXCR4(X4)或CCR5(R5)从而感染T细胞(12,13)。这种结合也会引发异常信号传导，并造成病理性改变(9,10,14,15)。HIV通过与CXCR4结合可以激活肌动蛋白(Actin)结合因子cofilin动态变化，从而促进病毒在静息CD4 T细胞中的入核过程(9,16)。类似地，在其他慢性疾病，如癌症中，免疫细胞受到高水平炎症趋化因子(如IP-10)和肿瘤抗原的持续刺激，从而导致T细胞极化和功能障碍，并损害T细胞运动能力(图1)。
Cofilin是控制T细胞运动和迁移的主要细胞蛋白，它是Actin结合蛋白，属ADF/Cofilin家族蛋白，广泛存在于真核生物中。ADF/cofilin蛋白以PH依赖方式结合和解聚F-Actin，调控细胞Actin动态变化。第一个ADF/cofilin家族蛋白是从鸡胚脑中鉴定出来(19)。Cofilin是从猪脑中纯化出，并因与Actin结合的结构而被命名，简称为Cofilin。目前，ADF/cofilin家族包含三种高度保守的蛋白：ADF(Actin解聚因子)或destrin，cofilin1(non-muscle cofilin或cofilin)和cofilin-2(muscle-cofilin)。人cofilin含有166个氨基酸，分子量为18kD(20)。
从结构上看，人类cofilin含有一个由β1到β5组成的核心。其中β1到β4反相平行，β5与β4平行，与β3反向平行。而且，C末端剩余的159-161，氨基酸组成了β6。五个螺旋结构α1到α5环绕区，His133和Asp98中间形成盐桥，可通过改变cofilin的PH敏感性影响Actin聚合及解聚。Cofilin结合G-actin，结合位点位于Tyr117周围，这里包括几个α4残基(Lys112，Lys114，Met115，Ile124)及β5。此外，一些其他的残基如Ile12、Pro110和Leu128也被提示与G-actin结合有关。Cofilin还可与F-actin结合，这需要在Cofilin上有两个位点，一个G位点与Actin子域1和3相互作用，另一个F位点与Actin子域1和2相互作用。通过突变确认了与F-actin结合的cofilin残基，包括β4(Lys96及Asp98)及α5(Glu151，Lys152，Gly155)。其他区域，如β3及β5也可能参与了cofilin与F-actin的结合(21)。
Cofilin通过两种机制解聚Actin：直接切断Actin亚基和加速Actin(-)端脱落(22,23)。Cofilin对ADP-actin的亲和力高于对ATP-actin，并且Cofilin与Actin微丝的结合可以促进ATP-actin上的磷酸解离。ATP的水解增加了cofilin的结合亲和力，改变了Actin螺旋的扭曲，将Actin切断为更短的片段(24)。这些切断的Actin可以提供更多的自由(+)端供Arp2/3复合物成核(25)，从而提高Actin聚合的速度。
Cofilin与ADP-actin(-)末端的结合也促进了cofilin-ADP-actin的解离。在释放的ADP-actin复合物中，Cofilin竞争性地被profilin所取代，然后将ADP-actin单体转化为ATP-actin单体，并在(+)末端回收它们进行新的actin聚合。因此，我们认为cofilin和Arp2/3复合物共同调控Actin踏板运动，ATP-actin优先通过Arp2/3在(+)末端进入微丝，然后被cofilin水解为“较老”的ADP-actin，并被cofilin从(-)末端分离(23,26)。
在细胞中，cofilin的活性主要通过n端丝氨酸3(Ser3)的磷酸化来调节，抑制了cofilin与G-actin和F-actin的结合。负责cofilin丝氨酸3磷酸化的激酶是LIM域激酶(LIMK)和Tes激酶，它们是Rho家族GTPases如Rho、Rac和Cdc42的靶点(27)。Rho家族GTPases激活PAK1、PAK2、PAK4、ROCK及MRCK(myotonic dystrophy kinase-related Cdc42-bindingprotein kinase)然后通过磷酸化直接激活LIMK。磷酸化酶PP1、PP2A、slingshot IL(SSH1L)和chronophin等使Ser3去磷酸化，从而激活Cofilin，这些酶将Cofilin的活性与不同的信号通路结合(28-30)。最近的研究表明，酪氨酸68(Y68)也可以被磷酸化，而这种磷酸化可以增加cofilin泛素化和蛋白酶体降解(31)。在趋化细胞中，cofilin磷酸化和去磷酸化周期维持Actin动态变化从而定向驱动细胞迁移。
在细胞中，cofilin是Actin动态的关键调节因子，并参与多种细胞过程(32)。cofilin调节Actin聚合或解聚的能力取决于cofilin的局部浓度。低浓度的cofilin有利于分离，而高浓度的cofilin有利于Actin成核。然而，尚不清楚在细胞中这种体外浓度依赖模型是否成立(33)。总的来说，通过siRNA降低cofilin的表达会增加细胞Actin数量，而过表达cofilin则会诱导形成cofilin-actin结合束(9)。在体外，cofilin通过与Arp2/3复合物竞争性结合诱导Actin微丝结构变化；这些变化降低了Arp2/3的亲和力，并导致Actin微丝分支降低。这种去分支过程可能在Arp2/3调控的细胞迁移前端发挥作用(34)。
除了调节细胞内的Actin动态变化，cofilin还被证明可以介导Actin的核定位，这可能参与基因表达的调节。Actin和Actin相关蛋白如Arp7、Arp9和Baf53是染色质重塑复合体RSC和SWI/SNF的一部分(35,36)。Actin也是起始前复合物的一部分，是RNA聚合酶II转录所必需的(37)。Cofilin介导的Actin核定位可能有助于染色质重塑和转录的起始过程中的细胞骨架连接。
Cofilin Ser3磷酸化使Cofilin的Actin结合能力失活。然而，最近发现cofilin磷酸化可以激活磷脂酶D1(PLD1)。Cofilin在被LIMK1磷酸化后直接特异性地与PLD1相互作用。Phospho-cofilin也能刺激PLD1的活性，提示Phospho-cofilin可能通过对PLD1的刺激作用来控制多种细胞功能(38)。
在人类免疫系统中，cofilin在调节T细胞迁移、趋化和T细胞激活等方面发挥重要作用。在免疫突触内，cofilin是形成维持信号传导和T细胞激活至关重要的超分子激活簇所必需的。使用细胞通透肽阻止cofilin与F-actin相互作用，可以破坏受体接触及免疫突触的形成，从而抑制T细胞的活化(39)。在人血液中的静止T细胞中，当T细胞没有被激活或趋化刺激时，cofilin主要以Ser3磷酸化的形式存在。T细胞激活或趋化刺激，信号级联主要通过共刺激受体如CD2、CD28和趋化因子受体如CXCR4传导，导致短暂的cofilin去磷酸化而被激活，当TCR/CD3刺激激活Arp2/3复合物进行Actin聚合时，CD28介导的共刺激则触发cofilin激活，这是Actin动态变化和维持T细胞信号传导所必需的(40)。目前认为，GTPaseRas和PI3K(磷脂酰肌醇-3-激酶)信号级联主要调控静息T细胞中cofilin的去磷酸化(41)。抑制MAPK/ERK激酶或PI3K会造成妨碍Ras或共刺激诱导的cofilin去磷酸化，而短暂表达优势负性形式H-Ras抑制PI3K的激活和cofilin去磷酸化(41)。
在HIV感染中，病毒通过与CD4和趋化因子共受体CXCR4或CCR5结合进入细胞。在这个进入过程中，HIV-1与CXCR4的结合也触发了一个短暂的cofilin磷酸化和去磷酸化过程，从而增加静止时CD4 T细胞的Actin动态变化(9,42)。这表明，静息T细胞的皮质Actin在没有T细胞激活或趋化刺激的情况下是相对静止的。缺乏Actin活动限制病毒DNA合成和核迁移等早期过程(9)。Cofilin增加皮质Actin和Actin踏板运动，促进病毒的向细胞核迁移(9)。Cofilin和Actin介导的HIV核定位对其在建立静息CD4T细胞的潜伏感染至关重要(9,16)。通过siRNA敲低cofilin表达能够增加皮质Actin浓度，从而导致HIV DNA合成增加，但减少核内HIV DNA含量及早期转录(9)。使用cofilin Ser3 N末端16残基能够通过LIMK竞争性抑制Cofilin磷酸化，从而增加HIV在静息CD4 T细胞中的潜伏感染。药物Staurosporine能够诱导cofilin逐渐激活，从而增加HIV在静息CD4 T细胞中的潜伏感染(9)。此外，使用趋化因子CCL19、CXCL9、CXCL10、CCL20预处理静息CD4 T细胞，导致cofilin激活和Actin微丝变化，从而促进HIV DNA核转移和合成(16,43)。有趣的是，将细胞暴露在机械剪切力下，如在低速旋转或自旋条件下的感染细胞，也会触发cofilin激活和Actin动态变化，导致CXCR4上调，并极大地增强HIV-1DNA合成和核迁移(44)。
HIV-1介导的静息CD4 T细胞内部cofilin活化，是依赖CXCR4下游的Gαi传导的，细菌毒素百日咳毒素(PTX)能够通过Gαi的ADP-核糖基化抑制G蛋白偶联受体，从而抑制cofilin活化及HIV在静息T细胞中的潜伏感染(9)。Cofilin可以被LIMK磷酸化，HIV-1与血液CD4 T细胞和巨噬细胞结合，快速活化LIMK1，与HIV介导的早期Actin早期聚合同时发生(42)。HIV触发快速激活LIMK1活化T细胞(42)。HIV-1被认为抢夺了LIMK1/cofilin的活性，从而直接调控Actin和CXCR4的动态变化，这对HIV病毒入核、进入后DNA合成和核迁移至关重要。通过siRNA敲低LIMK1活性可以降低丝状Actin并损伤SDF-1介导的T细胞趋化。皮质Actin密度的降低也导致CXCR4内化和表面循环增加。因此，LIMK介导的早期皮质Actin聚合可能会暂时阻断CXCR4的内化，促进病毒融合和CXCR4信号转导。LIMK1敲除细胞也支持降低病毒进入、DNA合成和核迁移。此外，用okadaic acid短暂治疗静息期CD4 T细胞，会激活LIMK，促进静息期CD4 T细胞的HIV潜伏感染。HIV-1激活LIMK介导信号通路是静息T细胞中的Rac1、PAK1/2和LIMK。Gp120也可以通过CD4及CXCR4介导Gi及Gαq下游相似的信号通路(42)。在转化的癌细胞中，HIV结合CD4和CXCR4也可触发丝氨酸A的激活，进而导致RhoA-ROCK-LIMK的激活。这一活性促使F-Actin重组引发受体聚类(45)。HIV gp120介导的cofilin磷酸化也可以抑制T细胞向SDF-1趋化(46)。
除了HIV-1gp120之外，另一个HIV因子Nef也可以调节cofilin的活性(47)。在人肿瘤细胞系Jurkat T中过表达Nef可抑制SDF-1诱导的膜流动、Actin重排和细胞向CXCL12、CCL3和CCL19的迁移(47,48)。在细胞划痕愈合实验中，仓鼠CHO细胞中过表达Nef也可以抑制创面诱导的cofilin激活。已有研究表明，nef-PAK2复合物参与了cofilin的磷酸化，尽管在体外cofilin磷酸化实验中，nef似乎没有改变PAK2的活性。在功能上，nef介导的cofilin失调可能影响感染T细胞的迁移行为(47)。
发明概述
这里所提供的方法，成分，试剂盒是用以确定cofilin磷酸化水平血T细胞(CD4和CD8)，从而量化免疫损害引起的慢性病毒感染和癌症，并预测T细胞治疗后的恢复。在确定了cofilin磷酸化和免疫功能障碍之间的相关性后，一些患者可接受调整cofilin并恢复cofilin磷酸化的组合药物治疗。
例如，在艾滋病毒感染患者中，cofilin磷酸化水平可以作为一个指标来量化病毒造成的免疫功能障碍和损害。
在一些实施例中，HIV感染者体内cofilin磷酸化水平可用于测量药物对免疫功能的影响(ART和其他免疫调节药物)。HIV感染患者cofilin磷酸化水平可用于预测药物治疗(ART和其他免疫调节药物)后T细胞功能的恢复。
在一些实施例中，癌症细胞中coflin磷酸化水平可用于量化细胞运动、迁移、组织浸润和转移的改变。
在一些实施例中，癌症患者T细胞(CD4/CD8)中cofilin磷酸化水平可用于预测癌症的免疫功能障碍，并预测药物在恢复抗肿瘤免疫中的作用。
在一些案例中，检测和治疗免疫功能紊乱的病人的方法包括(a)量化细胞cofilin磷酸化水平，这些细胞包括T细胞(CD4/CD8)、单核细胞/巨噬细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞，和/或患者癌细胞，这里肿瘤患者带有的免疫功能紊乱可能表现为cofilin磷酸化水平低或高于健康人；(b)给予该患者有效数量的纠正cofilin失调和恢复cofilin磷酸化的组合物。
在某些实施例中，患者具有引起免疫功能障碍的慢性疾病。在某些实施例中，所述慢性病可能是HIV感染或癌症。
在某些实施例中，所述免疫功能障碍是T细胞、巨噬细胞、B细胞、NK细胞的异常活化、T细胞、单核细胞/巨噬细胞、B细胞、NK细胞的运动性和/或组织迁移。
在某些实施例中，所述组合物可能是cofilin磷酸酶抑制剂或cofilin激酶激活剂。在某些实施例中，所述组合物包括okadaic acid。
在某些实施例中，一种用于确定患者免疫功能障碍的方法，包括定量患者的T细胞(CD4/CD8)、单核细胞/巨噬细胞、B细胞、自然杀伤细胞和/或癌细胞中的cofilin磷酸化水平。
在某些实施例中，患者是癌症患者或HIV感染者。
在某些实施例中，一个病人的治疗癌症的方法包括(a)量化cofilin磷酸化水平T细胞(CD4/CD8),单核细胞/巨噬细胞、B细胞、自然杀伤细胞,和/或癌细胞的病人说,在说病人cofilin磷酸化水平低或高于控制健康的人；和(b)给予该患者有效量的恢复cofilin磷酸化的组合物。
在某些实施例中，所述组合物是cofilin磷酸酶抑制剂或cofilin激酶激活剂，或针对可触发cofilin磷酸化或去磷酸化的趋化受体的抗体，或可触发cofilin磷酸化或去磷酸化的小分子。在某些实施例中，所述组合物包括okadaic acid。
在某些实施例中，该方法用于治疗癌症患者，包括例如没有HIV感染或HIV感染者。
附图说明
图1，T细胞表面受体的持续刺激可导致T细胞向不同系极化。(A)持久和慢性刺激趋化因子受体(例如,趋化因子受体、细胞因子受体整合素受体、粘附分子受体和共刺激分子受体，如B7/CD28、B7-2、CTLA-4/B7 B7-2和PD-1/PD-L)可以导致T细胞极化和向不同系的分化，比如一个不可逆转的带有cofilin过度活化的病理性分化方向。(B)通过刺激受体参与cofilin激活的信号通路。(C)通过刺激整合素受体参与cofilin激活的信号通路(Juliano,2002,Annu Rev Pharmacol Toxicol 42:283)。
图2，HIV感染中的Cofilin过度激活。(A)临床研究流程图。(B)开发用于分析cofilin磷酸化的反相cofilin芯片。合成的肽或细胞裂解物被连续稀释(1:1)并装载到芯片载玻片上，然后用抗cofilin(右)或抗p-cofilin(左)的抗体染色。P-cofilin-S3，一种磷酸化丝氨酸3的合成cofilin肽；cofilin-S3，一个类似的没有丝氨酸3磷酸化的肽。A431或HeLa细胞未处理或用人上皮生长因子(EGF)或pervanadate(Perv)处理。(C)对接受ART治疗(HIV+抗逆转录病毒治疗)或未接受ART治疗HIV感染者或健康对照(HC)静息CD4 T细胞中p-cofilin的相对水平进行分析。箱形图显示四分位范围、中位数和范围。HC、HIV和HIV+ART的静息CD4 T细胞的总蛋白水平无统计学差异(见材料和方法)。(D和E)使用Spearman秩相关检验(Ln，自然对数)绘制未治疗患者的p-cofilin水平和血浆病毒载量(D)和CD4 T细胞计数(E)之间的相关性。(F)在接受ART治疗的感染者中，免疫应答者(IR)的cofilin磷酸化水平明显高于无应答者(INR)。(G)经p-cofilin分析后，之前未接受ART治疗的患者已经接受ART治疗，免疫应答者(IR)的cofilin磷酸化水平明显高于无应答者(INR)。
图3，量化cofilin过度激活对T细胞迁移的影响。(A)不同剂量R10015处理A3R5.7T细胞1小时。用Western blot检测细胞p-cofilin和总cofilin。(B)绘制了R10015处理对p-cofilin/cofilin的影响(n＝4个独立实验)。(C)R10015通过CXCL12抑制cofilin磷酸化和T细胞趋化。用不同剂量的R10015处理A3R5.7细胞1小时后，加入24孔transwell板上室。下室充满CXCL12(40ng/ml)，计数细胞向下室的迁移(n＝3个独立实验)。(D)T细胞迁移与cofilin磷酸化水平之间的线性相关性。x轴为(B)推导出的p-cofilin/cofilin的相对比值；y轴是由(C)得到的迁移细胞数。
图4，血液癌细胞中的Cofilin过度活化。外周血单核细胞(PBMC)健康的捐赠者，癌症细胞系Jurkat T淋巴细胞(来自急性淋巴细胞白血病患者)，A3R5.7 T细胞(来源于一名四岁的急性淋巴细胞白血病患者的白细胞富集液)，或THP-1血液单核细胞的肿瘤细胞(来自一个急性单核细胞的白血病病人)固定，破膜，洗涤，用兔多克隆抗人p-cofilin抗体染色60分钟，洗涤2次，用Alexa Fluor 488标记的兔抗抗体染色。细胞洗涤两次，流式细胞仪检测。使用p-cofilin染色的平均荧光强度减去同型对照抗体非特异性背景染色的平均荧光强度计算相对p-cofilin染色。
图5，癌症患者血液中CD8 T细胞和单核细胞的Cofilin失调。健康供体或结直肠癌患者外周血细胞毒性T细胞(CD8 T细胞)或单核细胞固定，破膜，洗涤，用兔多克隆抗人p-cofilin抗体染色60分钟，洗涤2次，用Alexa Fluor 488标记的兔抗抗体染色。细胞洗涤两次，流式细胞仪检测。相对p-cofilin染色值做计算。(A和B)显示8个供体具有代表性的p-cofilin染色。2例健康供体(A)或2例结直肠癌患者(B)CD8 T细胞中p-cofilin染色的柱状图。填充的灰色图为同型染色，红线图为p-cofilin染色。如图所示，肿瘤患者p-confilin染色变窄，提示CD8 T细胞多样性降低，CD8 T细胞谱系极化，导致T细胞功能障碍，影响T细胞的移动性。(C)使用P-cofilin染色的平均荧光强度计算相对P-cofilin染色。如图所示，来自癌症患者(n＝4例)的CD8 T细胞的p-cofilin染色水平高于健康供体(n＝4例供体)，表明cofilin失活。(D)P-cofilin在癌症患者和健康献血者的血液单核细胞中也进行了类似的分析。
图6，临床研究参与者的特征。具体细节见示例。
图7，患者招募和分组。具体细节见示例。
发明详述
慢性疾病如HIV感染和癌症中存在的主要免疫功能障碍是T细胞能动性和向组织迁移的障碍。ART治疗及目前癌症疗法通常不能完全恢复T细胞对组织迁移和浸润的能动性。Cofilin是一种Actin解聚因子，调节T细胞迁移运动。
如下所述，本研究的发明者发现，血T细胞(CD4或CD8)中cofilin磷酸化水平可用于量化慢性病毒感染和癌症引起的免疫损伤，并预测治疗后T细胞的恢复。在确定了cofilin磷酸化和免疫功能障碍之间的相关性之后，合适的患者可以使用纠正cofilin失调并恢复cofilin磷酸化的组合物进行治疗。例如，细胞可以用cofilin磷酸酶抑制剂或cofilin激酶激活剂来增加cofilin磷酸化，okadaic acid增加cofilin磷酸化(42)或抗整合素抗体来调节cofilin途径(49)证明了这一点。
HIV-1介导的cofilin失调是通过对HIV或gp120治疗后的静置CD4 T细胞中cofilin激活的研究提出的(50)。研究表明，HIV-1或gp120刺激cofilin磷酸化和去磷酸化的周期，提示CD4 T细胞长期暴露于HIV或gp120可能对cofilin活性和T细胞功能产生持久影响。一项小规模临床研究发现，在HIV-1感染患者的外周血中，静息期CD4 T细胞中活跃的cofilin水平显著升高。提示HIV-1介导的cofilin失调可能导致T细胞迁移和激活异常，这可能是病毒发病机制的一部分(50)。
鉴于cofilin是T细胞动力引擎的重要组成部分，HIV感染者T细胞迁移缺陷可能直接由HIV感染导致的cofilin失调所致(50)。在HIV感染的急性期，随着HIV活跃复制，gp120水平非常高。在ART治疗开始前，CD4 T细胞长时间暴露在高水平gp120长。在ART无症状期，外周血gp120水平降低，但感染者淋巴组织中gp120浓度还很高(>300pg/ml)，估计在10pg/ml到10ng/ml之间(51)。因此HIV感染者CD4 T细胞长期暴露于病毒蛋白如gp120(52)，特别是在急性期，持续的病毒信号可能触发cofilin失调，导致感染者T细胞迁移缺陷(2,3,50)。
A.HIV感染对Cofilin活性的影响
为了检测HIV感染对cofilin活性的影响，如下所述，本专利发明人进行了一项大型临床试验，以检测外周静息CD4 T细胞中的cofilin磷酸化水平(图2A)。为此，我们开发了一种反向磷酸化-cofilin芯片，可以同时定量大量临床样本中的cofilin磷酸化(53)(图2B)。从接受ART治疗(HIV+ART,n＝95)、不接受ART治疗(HIV,n＝98)及健康对照(HC,n＝100)(表1)外周血中纯化静息CD4 T细胞，直接裂解。盲法编码所有样本进行cofilin磷酸化芯片检测和分析(图2C)。如图所示，发明人观察到HIV患者cofilin磷酸化水平显著降低(HIV＝0.968；HIV+ART＝1.139；健康控制＝2.254；p<0.001)。而且ART并没有显著恢复HIV感染者cofilin磷酸化水平(HIV＝0.968；HIV+艺术＝1.139；p＝0.981)。这些结果表明HIV介导的cofilin过度活化可能无法通过ART治疗恢复。这种不可逆性似乎类似于早期免疫激活阈值，该阈值决定随后的CD4 T细胞耗损，而不受病毒载量的影响(1)。
B.Cofilin过度活化和病毒载量/CD4计数的相关性
发明人进一步分析cofilin过度活化和感染者本身HIV病毒载量/CD4计数的相关性。在未治疗的患者中，cofilin磷酸化水平与病毒载量之间仅有微弱的相关性(p＝0.043,r＝-0.205)(图2D)，而与CD4 T细胞计数之间无相关性(p＝0.057,r＝0.193)(图2E)。然而，当ART治疗感染者被分为免疫应答者(IR)和免疫无应答者(INR)时，IR的cofilin磷酸化水平明显高于INR(图2F)。ART治疗一年后，IR和INR的病毒载量都被抑制到检测限以下，INR的CD4 T细胞恢复不到20％或CD4 T细胞计数低于200，而IR的CD4T细胞恢复超过20％且CD4计数超过500。因此，接受抗逆转录病毒治疗的患者中p-cofilin水平越高，ART治疗后CD4 T细胞恢复越好。在芯片检测后，继续随访未治疗HIV感染者，其中一些患者随后接受ART治疗(表2)。同样，IR中cofilin磷酸化水平明显高于INR(图2G)。这些结果表明，ART治疗前p-cofilin水平可以用来衡量CD4 T细胞损伤程度，并预测抗逆转录病毒治疗后T细胞的恢复。
Cofilin多度活化与CCR6+CXCR3+辅助T细胞(Th)迁移障碍相关，使得该细胞群即使经过长期ART治疗也无法在外周与组织中正常迁移(2)。T细胞迁移依赖LIMK对Ser3磷酸化来周期性调节Cofilin磷酸化和去磷酸化(27岁,54)，为了量化cofilin过度激活对T细胞迁移的直接影响，我们使用了最近发现的LIMK抑制剂R10015(55)来阻断A3R5.7 CD4 T细胞中cofilin的磷酸化，在cofilin过度活化的情况检测其向CXCL12的趋化作用，CXCL12(SDF-1)与CXCR4结合触发actin/cofilin动态变化，促进T细胞迁移(9)。我们观察到A3R5.7 CD4T细胞出现R10015剂量依赖性cofilin磷酸化降低(图3A和3B)及向CXCL12趋化作用的损伤(图3C和3D)(相关系数r＝0.999,p＝0.002)。在R10015的15μM时，在A3R5.7中cofilin磷酸化降低约50％，与HIV患者的水平接近(图3A和图2C)。cofilin磷酸化减少50％可导致人类A3R5.7 CD4 T细胞迁移减少20-40％(图3C)。这些结果定量测量了cofilin过度激活对T细胞运动的直接影响。
学界推测HIV与趋化因子共受体结合可能触发异常G蛋白信号通路和影响CD4 T细胞HIV病理反应(12)。然而，这一推测并没有被实验和临床数据所证实。在这个大型临床试验中，发明人证明了HIV感染者外周CD4 T细胞中cofilin去磷酸化。Cofilin已被确认为HIV与趋化因子受体结合影响G蛋白信号传导的下游靶点(9)。Cofilin是Actin踏板运动的主要驱动因素(56)，因此其Cofilin过度活化可直接影响T细胞迁移(40)。在HIV感染选择性的损伤CD4细胞(非CD8 T细胞)归巢(2,4)是HIV介导的T细胞功能障碍的一个主要标志(3)，这意味着cofilin失调在HIV介导的CD4 T病理反应有直接作用。Cofilin过度活化信号可能来源于HIV感染中大量的gp120和慢性免疫激活后的病理反应(2)，如外周血中明显升高的IP-10等炎性细胞因子(17、18)。因此，gp120和慢性免疫激活的联合作用可能会加剧和极化CD4 T细胞，发展为ART无法恢复的免疫损伤，而这些极化T细胞又会支持这些异常信号传导及细胞因子分泌，如T细胞在IL-12及干扰素γ的持续刺激下会发生极化并出现不可逆的转录因子T-bet表达。这种不可逆性的cofilin过度活化似乎类似于早期免疫激活阈值，该阈值决定随后的CD4 T细胞耗损，而不受病毒载量的影响(1)。
我们还发现，与HIV-1介导的cofilin过度活化类似，人类癌细胞也存在较低水平的cofilin磷酸化(图4)，这表明通过改变cofilin磷酸化水平，转化癌细胞的活性已经从根本上发生了改变。
癌症患者CD8 T细胞(细胞毒性T细胞)和单核细胞携带高水平cofilin磷酸化(图5c和5d),提示T细胞和其他单核细胞的癌症患者存在cofilin活化失调,可能引起免疫功能及细胞前几能力的改变。此外，癌症患者CD8 T细胞中p-cofilin染色变窄(图5A和B)，表明T细胞多样性降低，出现肿瘤驱动T细胞极化，可能导致T细胞功能障碍，损害T细胞的运动能力。
具体实施方式
下面的例子是说明性的和非限制性的。
案例1：临床研究
纳入200名HIV-1感染者，其中98例cofilin检测时未接受ART治疗，在艾滋病病毒感染者,98没有以前或现在艺术的时候p-cofilin剖析,102例接受ART治疗满一年，其中4例因病毒载量超过1000拷贝/毫升,可能出现耐药被本研究排除。受试者每三个月检测一次CD4 T细胞计数和病毒载量。同时纳入100名年龄和性别匹配的健康对照者。表1和表2列为受试者主要信息。在未接受ART治疗的患者中，有65人在p-cofilin检测6个月后接受ART治疗，治疗时间超过1年。所有接受ART治疗的患者血浆中都检测不到HIV-1RNA。对接受ART治疗的患者进行进一步评估，并将其分为免疫应答者(IR)和免疫无应答者(INR)。IR和INR均接受ART治疗一年以上。IR定义为ART治疗满1年CD4细胞数量上升大于20％且绝对数量高于500cells/uL，INR定义ART治疗满1年CD4细胞数量上升小于20％且绝对数量依然低于200cells/uL。抽取研究对象外周全血，Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离外周血单个核细胞，使用了抗人CD14、CD56、HLA-DR、CD8、CD11b和CD19的单克隆抗体(BD Biosciences,SanJose,CA)及Dynabeads小鼠IgG(Thermo Fisher Scientific)微球分离纯化静息CD4 T细胞(9,57)，将纯化细胞在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养，将100万个细胞溶解于40uL SDS/T-PER溶液[Novex Tris-Glycine SDS Sample Buffer,T-PER Tissue ProteinExtraction Reagent(Thermo Fisher Scientific)和2.5％2-mercaptoethanol(Sigma-Aldrich)]。细胞裂解液在100℃加热8分钟，立即冷冻并在-80℃保存，然后用干冰运输到Theranostics Health(美国马里兰州盖瑟斯堡)进行p-cofilin反相蛋白芯片分析。共296个编码的细胞裂解同时进行蛋白芯片检测，其中3例无信号被排除，其他样本信息用于最终数据分析。
反相蛋白芯片(RPPA)
在NuPAGE LDS样品缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA)中裂解100万个细胞，然后进行超声处理。样本在70℃加热10分钟,通过SDS-PAGE分离,然后转移到硝化纤维素膜(Invitrogen,Carlsbad,CA)。膜在TBST中清洗3分钟，然后在室温下用5％的牛奶封闭30分钟。将膜与小鼠抗cofilin抗体(1:1000稀释)(BD Biosciences,San Jose,CA)和兔抗phospho-cofilin(ser3)抗体(1:50 00稀释)(Cell Signaling)孵育在含3％牛奶的TBST中，4℃震荡过夜。3次洗涤15分钟，然后与DyLight 680山羊抗鼠抗体和DyLight 800山羊抗兔抗体(KPL,Gaithersburg,MD)(阻断缓冲液1:50 000稀释)，4℃孵育1小时。膜清洗3次，持续15分钟，并用Odyssey红外成像仪(Li-cor Biosciences)扫描。
CD4血细胞纯化
非艾滋病患者的外周血通过白细胞分离液纯化(Corning，Coning，纽约)，静息CD4细胞通过报道过的二次负选择纯化(9，57)。简诉如下：第一步用抗体CD14、CD56、HLA-DR、DP和DQ(BD Biosciences,San Jose,CA)。第二步用抗体CD8、CD11b、CD19(BD Biosciences,San Jose,CA)。抗体附着的细胞用Dynabeads老鼠的全IgG(Invitrogen Carlsbad,CA)来去掉。进一步的纯化记忆和非记忆原始细胞可以通过抗体CD45RA(0.02ul每1百万细胞)、CD45R0(0.1ul每1百万细胞)。纯化的细胞可以在培养液中培养(RPMI－1640、10％血清、penicillin 50U/ml,streptomycin 50ug/ml(Invitrogen Carlsbad,CA)。CD4细胞可以培养在IL-7(5ng/ml)培养液中来提高a4b7受体。
p-cofilin和cofilin的磷酸化Western Blot检查
每1百万细胞在超声处理后通过NuPAGE LDS样品裂解液(Invitrogen Carlsbad,CA)来裂解。样品加热70度10分钟，然后通过SDS－PAGE分开，然后转到硝酸仟维膜上(Invitrogen Carlsbad,CA)。硝酸仟维膜用TBST洗30分钟，室温，5％牛奶。硝酸仟维膜然后和抗老鼠抗cofilin抗体(1:1000稀释)(BD Biosciences,San Jose,CA)和兔子抗p-cofilin抗体(Ser3)(1:500稀释)(在3％牛奶－TBST稀释)(BD Biosciences,San Jose,CA)4度过夜孵育。洗三次，每次15分钟。硝酸仟维膜然后和DyLight680羊抗老鼠抗体孵育，和羊抗兔DyLight800抗体孵育(KPL,Gaithergburg,MD)(1:5000稀释)4度一小时。洗硝酸仟维膜3次，每次15分钟，然后通过Odyssey Infrared Imager(Li-cor Biosciences)显影。
趋化实验
用100uL RPMI-1640培养基重悬50万细胞，加入24孔transwell板子(Corning,Corning,NY)上室，下室放入600uL含有CXCL12(40ng/ml)的细胞培养基。37℃孵在2小时,计数由上室趋化下来的细胞数量。为了保证细胞计数的准确性，仅使用Z2Coulter颗粒计数分析仪(Beckman Coulter)。在趋化实验前，使用不同浓度R10015(55)或DMSO对照预处理细胞1小时，或者使用α4β7整合素抗体(Act-1)或IgG1对照抗体处理上室细胞15分钟，α4β7整合素抗体(1g/ml)与CXCL12(40ng/ml)同时加入下室做趋化实验。
细胞内p-cofilin染色和流式检测
用细胞内蛋白染色试剂盒(Virongy,Manassas,VA)在室温固定100万个细胞，用甲醇渗透，洗涤，然后用抗人p-cofilin抗体染色60分钟。细胞洗涤两次，用Alexa Fluor 488标记的鸡抗兔抗体(Invitrogen,Carlsbad,CA)染色。清洗细胞两次，然后在FACSCalibur上进行分析(BD Biosciences,San Jose,CA)。
统计分析
统计计算使用IBM SPSS statistics 23进行。分类数据描述和分析了频率和卡方(χ2)测试。参数比较采用双侧Mann-Whitney U检验评估组间差异(图2)。采用Spearman秩相关检验衡量变量之间的相关性。除非另有说明，p值小于0.05视为有统计学意义。
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Claims (14)

1.一种检测和治疗患者免疫功能障碍的方法，包括
(a)定量患者T细胞(CD4/CD8)、单核/巨噬细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和/或癌细胞中cofilin磷酸化水平，其中免疫功能障碍患者的cofilin磷酸化水平低于或高于对照组健康人或患者；
(b)给予患者纠正cofilin失调和恢复cofilin磷酸化的适量药物组合。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述患者为慢性疾病造成免疫功能障碍的患者。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述慢性疾病为HIV感染或癌症。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫功能包括T细胞、巨噬细胞、B细胞、NK细胞的异常活化、T细胞、单核细胞/巨噬细胞、B细胞、NK细胞的运动性和/或组织迁移。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述药物组合为cofilin磷酸酶抑制剂或cofilin激酶激活物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述药物组合包括okadaic acid。
7.一种定量检测患者免疫功能障碍的方法，包括定量患者T细胞(CD4/CD8)、单核/巨噬细胞、B细胞、自然杀伤细胞和/或癌细胞中的cofilin磷酸化。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述患者为癌症患者或HIV感染者。
9.一种在病人体内治疗癌症的方法，包括
(a)定量患者T细胞(CD4/CD8)、单核/巨噬细胞、B细胞、自然杀伤细胞和/或癌细胞中的cofilin磷酸化水平，其中患者的cofilin磷酸化水平低于或高于对照健康人；
(b)给予患者纠正cofilin失调和恢复cofilin磷酸化的适量药物组合。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述药物组合为一个cofilin磷酸酶抑制剂或cofilin激酶激活剂或一种对抗能触发cofilin磷酸化或去磷酸化的趋化受体的抗体，或一个能触发cofilin磷酸化或去磷酸化的小分子。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述药物组合包括okadaic acid。
12.此处所披露的用于治疗癌症患者的任何方法。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述病人没有艾滋病。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述病人没有HIV感染。
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