CN112042026A - 新型介体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种新型介体。本发明涉及一种新型介体、及包含其的电极改性剂、电子传递促进剂、及包含这些的电极、电池、组合物、酶传感器、以及使用它们的方法。

Description

新型介体
技术领域
本发明涉及一种苯二胺类化合物作为介体的用途及包含该化合物的电极改性剂、包含该化合物的电极、包含该电极的酶传感器、及电池。另外，本发明还涉及一种使用苯二胺类化合物及氧化还原酶的电化学测定、包含苯二胺类化合物及氧化还原酶的组合物、包含苯二胺类化合物的电极。
背景技术
酶电极中，介体被用作媒介物质，该媒介物质用于对电极授受通过利用酶的氧化还原反应而产生的电子。为了高效地从酶向电极传递电子，优选介体集中在电极的附近。因此，使用了各种将介体固定于电极的手段，例如，使电极与介体化学键合的方法、及使介体自身高分子化的方法等。然而，现有的手段缺乏通用性，例如，化学键合法对于介体的侧链官能团存在限制，而使介体自身高分子化的方法则可能导致介体的氧化还原电位产生变化。需要指出，虽然也已经报道了通过用强酸处理玻璃碳电极使表面的官能团活化，以吸附固定醌类等介体，但业界内几乎尚未实用化。
而且，在所有的方法中，均还存在为了将介体固定于电极需要繁复的工序，从而导致成本较高这一问题。因而，期待一种向电极固定时无需繁复的工序，能够简便地使用的电子介体。
作为用于电化学测定方法的电子介体，专利文献1(日本特开平7-234201)记载了对苯二胺化合物。所公开的对苯二胺化合物为具有选自由羟基、巯基、羧基、膦酰氧基及磺基构成的组中的一个以上的基团的对苯二胺衍生物。
专利文献2(国际公开第2004/011929号手册)中报道了：酸处理碳粒子使其表面活化之后，向该酸处理完毕的碳粉中添加N,N'-二苯基-对苯二胺(DPPD)，将该碳粉固定于碳电极；及使用该电极检测溶液中的硫化氢或硫醇。
专利文献3(日本特表2007-526474)记载了包含被N,N'-二苯基-对苯二胺衍生化的碳的电极、及使用该电极的pH传感器。
专利文献4(日本特开2008-185534)记载了作为介体的苯二胺类化合物2,3,5,6-四甲基-1,4-苯二胺或N,N-二甲基-对苯二胺、及使用其测定乙醇。
专利文献5(日本特开2016-042032)记载了作为介体的N,N,N',N'-四甲基-1,4-苯二胺、及使用其测定葡萄糖。
N-异丙基-N'-苯基-对苯二胺(IPPD)、N,N'-二苯基-对苯二胺(DPPD)、N-(1,3-二甲基丁基)-N'-苯基-对苯二胺(6PPD)均作为橡胶的抗老化剂而被熟知(非专利文献2，日本橡胶协会杂志,82卷,第2号,2009,p.45-49)。
非专利文献1(Analyst,2003,128,473-479)报道了：用0.1M盐酸酸处理碳粉使其碳表面活化后，向该酸处理完毕的碳粉中添加DPPD，将该碳粉固定于碳电极(基底平面热分解石墨电极，BPPG电极)；及使用该电极检测硫化物。专利文献6记载了液流电池。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平7-234201
专利文献2：国际公开第2004/011929号手册
专利文献3：日本特表2007-526474(国际公开第2005/085825号手册)
专利文献4：日本特开2008-185534
专利文献5：日本特开2016-042032
专利文献6：日本特开2019-003928
非专利文献
非专利文献1：Analyst,2003,128,473-479
非专利文献2：日本橡胶协会杂志,82卷,第2号,2009,p.45-49
发明内容
本发明的目的在于提供一种至少能够上述问题中的一部分的新型介体。
本发明人等为了解决上述课题进行了多方努力，结果发现，令人惊讶的是，苯二胺类化合物可以无需酸处理等特殊处理而吸附于电极表面，且该化合物可以作为介体起作用，从而完成了本发明。据本发明人等所知，至今尚未报道IPPD、DPPD、6PPD为吸附于电极的介体，这是一项令人惊叹的发现。另外，令人惊讶的是，本发明人等还发现了更多的无需酸处理等特殊处理而吸附于电极表面的苯二胺类化合物。
本发明包含下面的实施方式：
[1]一种电极改性剂，所述电极改性剂包含化合物，所述化合物具有不键合于聚合物或者不聚合物化而吸附于未经酸处理的电极的性质。
[2]一种电子传递促进剂，所述电子传递促进剂包含化合物，所述化合物具有不键合于聚合物或者不聚合物化而吸附于未经酸处理的电极的性质。
[3]一种电池，所述电池包含实施方式1中所述的电极改性剂或实施方式2中所述的电子传递促进剂。
[4]根据实施方式3所述的电池，其中，所述化合物固定于所述电池的电极。
[5]根据实施方式3或4所述的电池，其中，包含氧化还原酶。
[6]根据实施方式5所述的电池，其中，氧化还原酶固定于电极。
[7]一种组合物，包含实施方式1中所述的电极改性剂或实施方式2中所述的电子传递促进剂。
[8]一种电极，包含实施方式1中所述的电极改性剂或实施方式2中所述的电子传递促进剂。
[9]根据实施方式7中所述的组合物或根据实施方式8中所述的电极，其中，所述电极具有酶，所述组合物包含酶。
[10]根据实施方式9中所述的电极或组合物，其中，酶为氧化还原酶。
[11]根据实施方式10中所述的电极，固定有氧化还原酶。
[12]一种包含实施方式1中所述的电极改性剂或实施方式2中所述的电子传递促进剂的传感器、或具有实施方式10或者11中所述的电极的酶传感器。
[13]根据实施方式1中所述的电极改性剂、根据实施方式2中所述的电子传递促进剂、根据实施方式3～6中任一项所述的电池、根据实施方式7、9或10中所述的组合物、根据实施方式8～11中任一项中所述的电极或实施方式12中所述的酶传感器，其中，化合物为具有式I或式II的结构的化合物或其的盐、酸酐或者溶剂化物，
【化学式1】
Figure BDA0002719938670000041
式中，
R1为-NR7R8、-N＝N-R9或-N+≡N，
R2为-NR10R11或-N＝N-R12，
R7及R8分别独立地为氢、任选被一个以上X或V取代的直链或支链的C1-7烷基、C1-7烯基、C1-7炔基、C3-9环烷基、苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基、菲基、乙酰基、羧基、呋喃基甲酰基、吡唑基甲酰基、1-甲基-1H-吡唑-5-基甲酰基、9,9-二甲基芴-2-基、-N+≡N、-N＝N-苯基、苄基、
【化学式2】
Figure BDA0002719938670000051
R10为氢、任选被一个以上X或V取代的直链或支链的C1-7烷基、C1-7烯基、C1-7炔基、C3-9环烷基、苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基或菲基，
R3、R4、R5及R6分别独立地为氢、任选被一个以上Y取代的直链或支链的C1-7烷基、C1-7烯基、C1-7炔基、C1-7烷氧基、卤代基、硝基、氰基、羧基、磺基、羟基或氨基，
或者，R3及R4或R5及R6与含有这些的苯环一起形成任选被一个以上氧代基、X或W取代的苯环或
【化学式3】
Figure BDA0002719938670000052
其中，＊键合于R3所键合的碳原子，＊＊键合于R4所键合的碳原子或＊键合于R5所键合的碳原子，＊＊键合于R6所键合的碳原子，
R11选自由任选被一个以上X或Z取代的苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基及菲基构成的组，
R9选自由氢、任选被一个以上X取代的苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基及菲基构成的组，
R12选自由任选被一个以上X、W、异硫氰酸酯或卤代磺酰基取代的苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基、菲基及
【化学式4】
Figure BDA0002719938670000061
构成的组，
其中，V为任选被C1-7烷基取代的-O-丙烯酰基、乙酰基氨基或苯基，
W为任选被一个以上氨基、C1-7烷基、氨基烷基取代的D或L-丙氨酰基磺酰基、D或L-缬氨酰基磺酰基、D或L-亮氨酰基磺酰基、D或L-蛋氨酰基磺酰基、D或L-脯氨酰基磺酰基、D或L-色氨酰基磺酰基、D或L-甘氨酰基磺酰基、D或L-半胱氨酰基磺酰基、D或L-异亮氨酰基磺酰基、D或L-苯基丙氨酰基磺酰基、D或L-酪氨酰基磺酰基、D或L-丝氨酰基磺酰基、D或L-苏胺酰基磺酰基、D或L-天冬酰胺酰基磺酰基、D或L-谷氨酰胺酰基磺酰基、D或L-精氨酰基磺酰基、D或L-组氨酰基磺酰基、D或L-赖氨酰基磺酰基、D或L-天冬酰胺酰基磺酰基、D或L-谷氨酰胺酰基磺酰基、-C(＝O)-O-琥珀酰亚胺、乙酰基、三氟乙酰基、苯甲酰基氨基、-N＝N-苯基、苯基氨基，二氨基苯基偶氮苯基或；任选被一个以上X取代的苯基偶氮；任选被一个以上Y取代的萘基偶氮、乙酰基氨基、
【化学式5】
Figure BDA0002719938670000071
X为任选被选自由卤代基、氨基、氰基、羧基、羰基、烷氧基、烷基氨基、亚硝基、硝基及磺基构成的组中的一个以上取代基取代的直链或支链的C1-7烷基、C1-7烯基、C1-7炔基、C1-7烷氧基、卤代基、羟基、硝基、羧基、氰基、磺基、氨基或烷基氨基，
Y选自由卤代基、氨基、氰基、羧基、羰基、羟基、烷氧基及磺基构成的组，
Z为-SO2-CH＝CH2或-SO2-C2H4-O-SO3H、4,6-二氯三嗪-2-基氨基。
[14]根据实施方式13中所述的电极改性剂、电子传递促进剂、电池、组合物、电极或传感器，其中，化合物为具有式Ia或IIa的结构、或者具有式Ib或IIb的结构的化合物或者其的盐、酸酐或溶剂化物，
【化学式6】
Figure BDA0002719938670000081
式中，
R1a为-NR7aR8a、-N＝N-R9a或-N+≡N，
R2a为-NR10aR11a或-N＝N-R12a，
R7a及R8a分别独立地为氢、任选被一个以上Xa取代的直链或支链的C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、C3-9环烷基、苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基或菲基，
R10为氢、任选被一个以上Xa取代的直链或支链的C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、C3-9环烷基、苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基或菲基，
R3a、R4a、R5a及R6a分别独立地为氢、任选被一个以上Y取代的直链或支链的C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、C1-6烷氧基、卤代基、硝基、氰基、羧基、磺基、羟基或氨基，
或者，R3a及R4a或R5a及R6a形成苯环或
【化学式7】
Figure BDA0002719938670000082
其中，＊键合于R3a所键合的碳原子、＊＊键合于R4a所键合的碳原子，或＊键合于R5a所键合的碳原子、＊＊键合于R6a所键合的碳原子，
R11a选自由任选被一个以上Xa取代的苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基及菲基构成的组，
R9a及R12a分别独立地选自由氢、任选被一个以上Xa取代的苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基及菲基构成的组，
Xa为任选被选自由卤代基、氨基、氰基、羧基、羰基、羟基、烷氧基、烷基氨基、亚硝基、硝基及磺基构成的组中的一个以上取代基取代的直链或支链的C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、C1-6烷氧基、卤代基、羟基、硝基、羧基、氰基、磺基、氨基或烷基氨基，
Y选自由卤代基、氨基、氰基、羧基、羰基、烷氧基及磺基构成的组；
【化学式8】
Figure BDA0002719938670000091
式中，
R7b、R8b及R10b分别独立地为氢、任选被一个以上Xb取代的直链或支链的C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、C3-9环烷基、苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基或菲基，
R3b、R4b、R5b及R6b分别独立地为氢、任选被一个以上Y取代的直链或支链的C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、C1-6烷氧基、卤代基、硝基、氰基、羧基、磺基或氨基，
R11b选自由任选被一个以上Xb取代的苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基及菲基构成的组，
其中，Xb为任选被选自由卤代基、氨基、氰基、羧基、羰基、烷氧基及磺基构成的组中的一个以上取代基取代的直链或支链的C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、C1-6烷氧基、卤代基、羟基、硝基、羧基、氰基、磺基或氨基，
Y选自由卤代基、氨基、氰基、羧基、羰基、烷氧基及磺基构成的组。
[15]根据实施方式13或14中所述的电极改性剂、电子传递促进剂、电池、组合物、电极或传感器，其中，化合物选自由下述构成的组，
【化学式9】
Figure BDA0002719938670000111
Figure BDA0002719938670000121
及
Figure BDA0002719938670000131
[16]一种电池的制造方法，包含使用实施方式1中所述的电极改性剂或实施方式2中所述的电子传递促进剂的工序。
[17]根据实施方式16中所述的方法，其中，包含使所述电极改性剂或电子传递促进剂与电池的电极接触的工序。
[18]一种发电方法，使用实施方式3～6及13～15中任一项所述的电池。
[19]一种电化学测定方法，使用实施方式7、9、10及13～15中任一项中所述的组合物、实施方式8～11、及13～15中任一项中所述的电极或实施方式12～15中任一项中所述的传感器。
[20]一种电极的改性或修饰方法，包含使实施方式1及13～15中任一项中所述的电极改性剂、实施方式2及13～15中任一项中所述的电子传递促进剂或实施方式7、9、10及13～15中任一项中所述的组合物与电极接触的工序。
本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本专利申请第2018-077593号及日本专利申请第2018-077628号的公开内容。
本发明的苯二胺类化合物与对苯二胺之类的现有的介体不同，它无需电极的酸处理或介体自身的高分子化等特殊处理而直接能够吸附于电极表面，故而，能够简便地固定于电极。另外，这种电极还能够用于电化学测定。另外，这种电极还能够应用于电池。
附图说明
图1示出实施使用IPPD及GDH的循环伏安法并绘制扫频速度与IOmax及IRmax而得到的结果。
图2示出使用DPPD代替IPPD时的结果。
图3示出使用6PPD代替IPPD时的结果。
图4示出使用对苯二胺代替IPPD时的结果。
图5示出使用对苯二胺代替IPPD时的结果。横轴为扫频速度的平方根。
图6示出使用BGLB代替IPPD时的结果。
图7示出使用TDPA代替BGLB时的结果。
图8示出使用IPPD的循环伏安图。
图9示出使用IPPD时葡萄糖最终浓度与300mV时的氧化电流值的关系。
图10示出使用DPPD时葡萄糖最终浓度与300mV时的氧化电流值的关系。
图11示出使用6PPD时葡萄糖最终浓度与300mV时的氧化电流值的关系。
图12示出使用FADGDH-AA和IPPD时葡萄糖最终浓度与300mV时的氧化电流值的关系。
图13示出使用GLD1和IPPD时葡萄糖最终浓度与300mV时的氧化电流值的关系。
图14示出使用GOD和IPPD时葡萄糖最终浓度与300mV时的氧化电流值的关系。
图15示出使用FPOX-CE IPPD时葡萄糖最终浓度与300mV时的氧化电流值的关系。
图16示出将BGLB与FADGDH-AA共同使用并施加+300mV时的氧化电流值的比较。
图17示出将TDPA与FADGDH-AA共同使用并施加+300mV时的氧化电流值的比较。
图18示出将IPPD与PQQ-GDH共同使用并绘制葡萄糖最终浓度与+300mV时的氧化电流值的关系而得到的结果。
图19示出将BGLB与PQQ-GDH共同使用并绘制葡萄糖最终浓度与+300mV时的氧化电流值的关系而得到的结果。
图20示出在DPPD存在下或不存在下使用NAD-GDH时添加葡萄糖前后的响应电流。
图21示出将IPPD与LOD共同使用并绘制乳酸最终浓度与+150mV时的氧化电流值的关系而得到的结果。
图22示出绘制在IPPD存在下或不存在下使用FDH时的果糖最终浓度与+100mV时的氧化电流值的关系而得到的结果。将未添加果糖时的电流设为0。
图23示出使用吸附有IPPD并固定有GDH的电极时葡萄糖最终浓度与200mV时的氧化电流值的关系。
图24示出将使用最终浓度为10pM的DPPD改性后的电极放入包含FADGDH-AA及葡萄糖的溶液中时+100mV时的氧化电流值。将未添加葡萄糖时的电流设为0。
具体实施方式
(苯二胺类化合物)
(吸附有苯二胺类化合物的电极)
在一些实施方式中，本发明提供苯二胺类化合物。本发明的化合物中也包含偶氮化合物、重氮化合物，但在本说明书中，提及苯二胺类化合物或者本发明的苯二胺类化合物时，为了方便起见，不仅包含具有苯二胺骨架的化合物，也包含偶氮化合物、重氮化合物。在其它实施方式中，本发明提供包含苯二胺类化合物的电极改性剂。该电极改性剂可以吸附于电极表面，能够对电极的受电子性进行改性。在其它实施方式中，本发明提供吸附有苯二胺类化合物或本发明的电极改性剂的电极。在其它实施方式中，本发明提供包含苯二胺类化合物或本发明的电极改性剂的电化学测定组合物。组合物可以进一步包含酶。酶可以为氧化还原酶。在其它实施方式中，本发明提供包含苯二胺类化合物或本发明的电极改性剂的电化学测定试剂盒。在本说明书中，有时将电极改性剂称为电极吸附剂。
本发明的苯二胺类化合物能够通过与电极接触而吸附于电极表面。此时，无需为了使其吸附于电极而进行对电极表面酸处理以使其活化等特殊操作。在一些实施方式中，本发明的化合物所具有的吸附于电极的性质是指该化合物物理性吸附于电极的性质，电极能够使用碳、金、铂等素材等。进一步包含使该化合物吸附于碳粉或碳材料等一次材料，接着将该碳粉或碳材料等一次材料固定于电极的方案。但是，这仅是关于本发明的化合物所具有的性质的说明，并不限定该化合物的使用方法。即，在一些实施方式中，本发明提供使本发明的化合物吸附于碳粉或碳材料等一次材料，接着将该碳粉或碳材料等一次材料固定于电极的方法。
在一些实施方式中，本发明提供吸附有本发明的化合物的碳粉或碳材料等一次材料。该碳粉或碳材料等一次材料能够进一步涂布或适用于电极。作为一次材料，可列举：碳、铂、金等，但不限定于此。作为碳材料，可列举：碳黑、碳纤维、单壁或多壁碳纳米管、石墨烯、科琴黑等。
在一些实施方式中，本发明的化合物所具有的吸附于电极、碳粉或碳材料的性质是指该化合物直接物理性吸附于电极、碳粉或碳材料的性质，并不表示通过将该化合物共价键合于聚合物或连接基而将其向电极、碳粉或碳材料键合的性质。在本说明书中，有时将这种性质称为不键合于聚合物而吸附于电极的性质、或者不键合于聚合物或该化合物不聚合物化而吸附于碳粉或碳材料的性质。但是，这仅是关于本发明的化合物所具有的性质的说明，并不限定该化合物的使用方法。即，在一些实施方式中，本发明提供通过使本发明的化合物共价键合于聚合物或连接基而使其与电极、碳粉或碳材料键合的方法。另外，该化合物直接物理性吸附于电极、碳粉或碳材料并不妨碍本发明的化合物自身(作为单体)共价键合于碳粉或碳材料。需要指出，在本说明书中，聚合物是指例如10个以上的相同单元多聚化而成的物质。
在一些实施方式中，用于吸附本发明的化合物的碳粉或碳材料、碳电极、金电极、铂电极未经酸处理。即，在一些实施方式中，从吸附本发明的化合物的碳粉或碳材料中排除经酸处理的碳粉或碳材料、碳电极。
在一些实施方式中，能够将本发明的化合物与酶组合后使用。在一些实施方式中，能够将本发明的化合物与氧化还原酶组合后使用。在一些实施方式中，能够将本发明的化合物用作电子传递促进剂。在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物在被氧化还原酶催化的氧化还原反应中作为介体起作用。作为氧化还原酶，可列举被分类为EC第1组的各种氧化还原酶，但不限定于此，例如，葡萄糖氧化酶、葡萄糖脱氢酶、阿马多里酶(也称为果糖基肽氧化酶或果糖基氨基酸氧化酶)、过氧化物酶、半乳糖氧化酶、胆红素氧化酶、丙酮酸氧化酶、D-或L-氨基酸氧化酶、胺氧化酶、胆固醇氧化酶、胆碱氧化酶、黄嘌呤氧化酶、肌氨酸氧化酶、D-或L-乳酸氧化酶(LOD)、抗坏血酸氧化酶、细胞色素氧化酶、醇脱氢酶、胆固醇脱氢酶、醛脱氢酶、醛氧化酶、果糖脱氢酶(FDH)、山梨糖醇脱氢酶、D-或L-乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、甘油脱氢酶、17B羟基类固醇脱氢酶、雌二醇17B脱氢酶、D-或L-氨基酸脱氢酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶、3-羟基类固醇脱氢酶、心肌黄酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽还原酶、细胞色素b5还原酶、肾上腺素还原酶、细胞色素b5还原酶、肾上腺铁氧还蛋白还原酶、硝酸还原酶、磷酸脱氢酶、胆红素氧化酶、漆酶、多胺氧化酶、甲酸脱氢酶、吡喃糖氧化酶、吡喃糖脱氢酶、牛磺酸脱氢酶等。另外，也可以为多个酶的组合。作为上述酶的辅酶，可列举：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、吡咯并喹啉醌等。即，作为葡萄糖脱氢酶(GDH)，可列举：FAD依赖性GDH、NAD依赖性GDH、PQQ依赖性GDH等。上述所列举的氧化还原酶能够通过例如Methods in Enzymology(1～602卷)中记载的方法进行使用各种底物的活性测定。
在本说明书中，作为介体起作用是指苯二胺类化合物有助于电子转移，例如，在使用电极的系统中，本发明的苯二胺类化合物从氧化还原酶中接受电子而变为还原型，向电极传递电子又恢复为氧化型。从这种观点出发，也能够将作为介体起作用的本发明的苯二胺类化合物称为电子转移介质、电子传递促进剂或者电子介体(也简称为介体)。在本说明书中，这些术语含义相同。
在一些实施方式中，从本发明的电极中排除具有经酸处理的碳粉或碳粒子的电极。
在一些实施方式中，与本发明的电极一起使用的氧化还原酶也可以固定于该电极。即，在本实施方式中，本发明提供固定有氧化还原酶且吸附有本发明的电极改性剂的电极。在一些实施方式中，本发明提供包含固定有氧化还原酶且吸附有本发明的电极改性剂的电极的酶传感器。在一些实施方式中，提供包含本发明的电极改性剂或电子传递促进剂的传感器。
本发明的苯二胺类化合物或包含该苯二胺类化合物的电极改性剂、电极吸附剂或电子传递促进剂能够无需特殊处理而吸附于电极表面。因此，在一些实施方式中，为了制作改性的电极，可以预先使本发明的苯二胺类化合物、电极改性剂、电极吸附剂或电子传递促进剂吸附于电极。在另外的实施方式中，进行电化学测定时，能够使用包含本发明的苯二胺类化合物、电极改性剂、电极吸附剂或电子传递促进剂、及氧化还原酶的测定溶液(组合物)。在该实施方式中，若使包含本发明的苯二胺类化合物、电极改性剂、电极吸附剂或电子传递促进剂、及氧化还原酶的组合物与电极物理性接触，则本发明的苯二胺类化合物、电极改性剂、电极吸附剂或电子传递促进剂吸附于电极，测定时现场制作电化学特性经改性的电极。
在一些实施方式中，使本发明的苯二胺类化合物、电极改性剂、电极吸附剂或电子传递促进剂吸附于电极时，不使用酸对电极进行预处理。在另外的实施方式中，使本发明的苯二胺类化合物、电极改性剂、电极吸附剂或电子传递促进剂吸附于电极时，可以用酸对电极进行预处理。需要指出，此处所说的用酸进行的预处理包括使包含酸的电解质溶液与电极接触。另外，在本说明书中，酸是指pH为4以下、例如pH低于4、pH为3以下、pH低于3、pH为2以下、pH低于2、pH为1的酸。另外，在一些实施方式中，可以通过施加特定电位将本发明的苯二胺类化合物、电极改性剂、电极吸附剂或电子传递促进剂转换为氧化型或者还原型之后再使其吸附于电极。需要指出，作为转换为氧化型或者还原型的手段，可以使用氧化剂或还原剂，但手段不受特别限定。另外，在一些实施方式中，也可以将本发明的苯二胺类化合物、电极改性剂、电极吸附剂或电子传递促进剂包容于高分子中后再吸附于电极。在本说明书中，有时将这种吸附称为包容固定(embedded)或包括固定(entrapped)。它与吸附固定即通过物理吸附进行的固定区别开来。在包容固定或包括固定中，本发明的化合物能够在高分子中扩散，而在吸附固定中，本发明的化合物不扩散或基本不扩散。在另外的实施方式中，可以通过使用离子性聚合物、例如作为阳离子性聚合物的聚乙烯亚胺或聚赖氨酸、作为阴离子性聚合物的聚苯胺、聚丙烯酸等的静电相互作用而使本发明的化合物、电极改性剂、电极吸附剂或电子传递促进剂吸附于电极。在另外的实施方式中，可以将本发明的化合物、电极改性剂、电极吸附剂或电子传递促进剂通过酶吸附或者通过交联剂固定，从而将其与酶一起固定于电极。在另外的实施方式中，可以通过氧化还原反应或者交联剂使所吸附的本发明的化合物聚合物化。
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为下述通式I或II的化合物或者其的盐、酸酐或溶剂化物。
【化学式10】
Figure BDA0002719938670000191
式中，
R1为-NR7R8、-N＝N-R9或-N+≡N，
R2为-NR10R11或-N＝N-R12，
R7及R8分别独立地为氢、任选被一个以上X或V取代的直链或支链的C1-7烷基、C1-7烯基、C1-7炔基、C3-9环烷基、苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基、菲基、乙酰基、羧基、呋喃基甲酰基、吡唑基甲酰基、1-甲基-1H-吡唑-5-基甲酰基、9,9-二甲基芴-2-基、-N+≡N、-N＝N-苯基、苄基、
【化学式11】
Figure BDA0002719938670000201
R10为氢、任选被一个以上X或V取代的直链或支链的C1-7烷基、C1-7烯基、C1-7炔基、C3-9环烷基、苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基或菲基，
R3、R4、R5及R6分别独立地为氢、任选被一个以上Y取代的直链或支链的C1-7烷基、C1-7烯基、C1-7炔基、C1-7烷氧基、卤代基、硝基、氰基、羧基、磺基、羟基或氨基，
或者，R3及R4或R5及R6与含有这些的苯环一起形成任选被一个以上氧代基、X或W取代的苯环或
【化学式12】
Figure BDA0002719938670000202
其中，＊键合于R3所键合的碳原子、＊＊键合于R4所键合的碳原子，或＊键合于R5所键合的碳原子、＊＊键合于R6所键合的碳原子，
R11选自由任选被一个以上X或Z取代的苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基及菲基构成的组，
R9选自由氢、任选被一个以上X取代的苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基及菲基构成的组，
R12选自由任选被一个以上X、W、异硫氰酸酯或卤代磺酰基取代的苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基、菲基及
【化学式13】
Figure BDA0002719938670000211
构成的组，
其中，V为任选被C1-7烷基取代的-O-丙烯酰基、乙酰基氨基或苯基，
W为任选被一个以上氨基、C1-7烷基、氨基烷基取代的D或L-丙氨酰基磺酰基、D或L-缬氨酰基磺酰基、D或L-亮氨酰基磺酰基、D或L-蛋氨酰基磺酰基、D或L-脯氨酰基磺酰基、D或L-色氨酰基磺酰基、D或L-甘氨酰基磺酰基、D或L-半胱氨酰基磺酰基、D或L-异亮氨酰基磺酰基、D或L-苯基丙氨酰基磺酰基、D或L-酪氨酰基磺酰基、D或L-丝氨酰基磺酰基、D或L-苏胺酰基磺酰基、D或L-天冬酰胺酰基磺酰基、D或L-谷氨酰胺酰基磺酰基、D或L-精氨酰基磺酰基、D或L-组氨酰基磺酰基、D或L-赖氨酰基磺酰基、D或L-天冬酰胺酰基磺酰基、D或L-谷氨酰胺酰基磺酰基、-C(＝O)-O-琥珀酰亚胺、乙酰基、三氟乙酰基、苯甲酰基氨基、-N＝N-苯基、苯基氨基，二氨基苯基偶氮苯基或任选被一个以上X取代的苯基偶氮、任选被一个以上Y取代的萘基偶氮、乙酰基氨基、
【化学式14】
Figure BDA0002719938670000221
X为任选被选自由卤代基、氨基、氰基、羧基、羰基、烷氧基、烷基氨基、亚硝基、硝基及磺基构成的组中的一个以上取代基取代的直链或支链的，C1-7烷基、C1-7烯基、C1-7炔基、C1-7烷氧基、卤代基、羟基、硝基、羧基、氰基、磺基、氨基或烷基氨基，
Y选自由卤代基、氨基、氰基、羧基、羰基、羟基、烷氧基及磺基构成的组，
Z为-SO2-CH＝CH2或-SO2-C2H4-O-SO3H、4,6-二氯三嗪-2-基氨基。
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为具有下述通式Ia或者IIa的结构的化合物或者其的盐、酸酐或溶剂化物。
【化学式15】
Figure BDA0002719938670000231
式中，
R1a为-NR7aR8a、-N＝N-R9a或-N+≡N，
R2a为-NR10aR11a或-N＝N-R12a，
R7a及R8a分别独立地为氢、任选被一个以上Xa取代的直链或支链的C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、C3-9环烷基、苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基或菲基，
R10为氢、任选被一个以上Xa取代的直链或支链的C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、C3-9环烷基、苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基或菲基，
R3a、R4a、R5a及R6a分别独立地为氢、任选被一个以上Y取代的直链或支链的C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、C1-6烷氧基、卤代基、硝基、氰基、羧基、磺基、羟基或氨基，
或者，R3a及R4a或R5a及R6a形成苯环或
【化学式16】
Figure BDA0002719938670000232
其中，＊键合于R3a所键合的碳原子、＊＊键合于R4a所键合的碳原子，或＊键合于R5a所键合的碳原子、＊＊键合于R6a所键合的碳原子，
R11a选自由任选被一个以上Xa取代的苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基及菲基构成的组，
R9a及R12a分别独立地选自由氢、任选被一个以上Xa取代的苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基及菲基构成的组，
Xa为任选被选自由卤代基、氨基、氰基、羧基、羰基、羟基、烷氧基、烷基氨基、亚硝基、硝基及磺基构成的组中的一个以上取代基取代的直链或支链的C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、C1-6烷氧基、卤代基、羟基、硝基、羧基、氰基、磺基、氨基或烷基氨基，
Y选自由卤代基、氨基、氰基、羧基、羰基、烷氧基及磺基构成的组。
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为具有下述通式Ib或者IIb的结构的化合物或者其的盐、酸酐或溶剂化物。
【化学式17】
Figure BDA0002719938670000241
式中，
R7b、R8b及R10b分别独立地为氢、任选被一个以上Xb取代的直链或支链的C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、C3-9环烷基、苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基或菲基，
R3b、R4b、R5b及R6b分别独立地为氢、任选被一个以上Y取代的直链或支链的C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、C1-6烷氧基、卤代基、硝基、氰基、羧基、磺基或氨基，
R11b选自由任选被一个以上Xb取代的苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基及菲基构成的组，
其中，Xb为任选被选自由卤代基、氨基、氰基、羧基、羰基、烷氧基及磺基构成的组中的一个以上取代基取代的直链或支链的C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、C1-6烷氧基、卤代基、羟基、硝基、羧基、氰基、磺基或氨基，
Y选自由卤代基、氨基、氰基、羧基、羰基、烷氧基及磺基构成的组。
本说明书中使用的烷基是指直链或支链的具有例如1～7个碳原子、例如1～6个碳原子的烃。作为烷基的例子，可列举甲基、乙基、丙基、异丙基、异丁基、正丁基、叔丁基、异戊基、正戊基、庚基，但不限定于此。
本说明书中使用的(碳原子等)原子的数量例如表示为“Cx-Cy烷基”，它表示具有x至y个碳原子的烷基。关于其它取代基及范围，也使用相同的记法。
本说明书中使用的烯基是指具有一个以上碳-碳双键的直链或支链的脂肪属烃。非限定性举列而言，可列举乙烯基、烯丙基等，但不限定于此。
本说明书中使用的炔基是指具有一个以上碳-碳三键的直链或支链的脂肪属烃。非限定性举列而言，可列举乙炔基等，但不限定于此。
本说明书中使用的环烷基是指取代或未取代的非芳香族环式烃环。作为环烷基，非限定性举列而言，可列举：环丙基、环丁基、环戊基、环己基及环庚基，但不限定于此。
本说明书中使用的卤代基是指VIIA族元素的基团，例如-Cl、-Br、-I等。本说明书中使用的卤素是指氟、氯、溴或碘。
本说明书中使用的卤代烷基是指被至少一个卤素取代的烷基。作为卤代烷基，可列举：独立地被一个以上卤素、例如氟、氯、溴、及碘取代的甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基及叔丁基等，但不限定于此。
本说明书中使用的卤代磺酰基是指被至少一个卤素取代的磺酰基，例如，可列举：氯代磺酰基(Cl-SO2-)、溴代磺酰基(Br-SO2-)等，但不限定于此。
本说明书中使用的苯基是指取代或者未取代的苯环系。本说明书中使用的萘基是指取代或者未取代的萘环系，可列举1-萘基及2-萘基。本说明书中使用的蒽基是指取代或者未取代的蒽环系。本说明书中使用的菲基是指取代或者未取代的菲环系。
在本说明书中，乙酰基是指CH3CO-。在本说明书中，三氟乙酰基是指CF3CO-。本说明书中使用的羧基是指-COOH。在本说明书中，呋喃基是指呋喃的一价的基团，例如2-呋喃基或3-呋喃基。在本说明书中，甲酰基也称为醛，是指-COH。在本说明书中，呋喃基甲酰基是指键合有呋喃基的甲酰基(呋喃基-CO-)。在本说明书中，吡唑基是指吡唑环系。在本说明书中，吡唑基甲酰基是指键合有吡唑基的甲酰基(吡唑基-CO-)。本说明书中使用的芴基是指取代或者未取代的芴环系。
在本说明书中，-N+≡N也称为叠氮化物，也记作-N2基。在本说明书中，苄基是指C6H5CH2-。在本说明书中，苯甲酰基是指C6H5-C(＝O)-。在本说明书中，偶氮也记作R'-N＝N-R”，R'和R”可以相同，也可以不同。例如，萘基偶氮表示萘基-N＝N-。
在本说明书中，硝基是指-NO2基。在本说明书中，亚硝基是指-N＝O基。在本说明书中，氰基是指-CN基。在本说明书中，磺基是指-SO3H。在本说明书中，羟基是指-OH。在本说明书中，氧代基是指＝O。
在本说明书中，氨基是指-NR'R”基，R'和R”可以相同，也可以不同。R'和R”可以为例如H、烷基、烯基、炔基、环烷基、苯基、萘基、蒽基、菲基等，但不限定于此。在本说明书中，氨基烷基具有连接有氨基的亚烷基连接基。作为氨基烷基，可列举-(CH2)nNH2等，但不限定于此。在本说明书中，烷基氨基是指连接有烷基的氨基。作为烷基氨基，可列举C1-7烷基-NH-等，但不限定于此。在本说明书中，乙酰基氨基是指连接有乙酰基的氨基。作为乙酰基氨基，可列举乙酰基-NH-等，但不限定于此。
在本说明书中，丙烯酰基是指H2C＝CH-C(＝O)-。在本说明书中，-O-丙烯酰基是指H2C＝CH-C(＝O)-O-。在本说明书中，异硫氰酸酯是指-N＝C＝S。在本说明书中，琥珀酰亚胺是指(CH2CO)2N-。在本说明书中，羰基是指-C(＝O)-。本说明书中使用的烷氧基是指-O-烷基。
在本说明书中，“任选取代”、“取代或未取代的”表示被一个以上取代基任意取代，其中也包含多个度的取代。
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为N-异丙基-N'-苯基-对苯二胺(IPPD)(CAS No.101-72-4)。
【化学式18】
Figure BDA0002719938670000271
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为N,N'-二苯基-对苯二胺(DPPD)(Cas No.74-31-7)。
【化学式19】
Figure BDA0002719938670000272
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为N-(1,3-二甲基丁基)-N'-苯基-对苯二胺(6PPD)(CAS No.793-24-8)。
【化学式20】
Figure BDA0002719938670000273
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为宾雪德拉氏绿隐色碱(BGLB，CAS号637-31-0)。
【化学式21】
Figure BDA0002719938670000281
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为变胺蓝B色基(VariamineBlue B Base)(CAS号101-64-4)。
【化学式22】
Figure BDA0002719938670000282
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为2-硝基-4-氨基二苯胺(CAS号2784-89-6)。
【化学式23】
Figure BDA0002719938670000283
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为N-甲基-N'-苯基-对苯二胺。
【化学式24】
Figure BDA0002719938670000284
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为N-乙基-N'-苯基-对苯二胺。
【化学式25】
Figure BDA0002719938670000291
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为N-异丙基-N'-(4-氨基苯基)-对苯二胺。
【化学式26】
Figure BDA0002719938670000292
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为三[4-(二乙基氨基)苯基]胺(TDPA，CAS号47743-70-4)。
【化学式27】
Figure BDA0002719938670000293
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为4-(二甲基氨基)-4'-亚硝基二苯胺(CAS号7696-70-0)。
【化学式28】
Figure BDA0002719938670000294
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为N-苯基-邻苯二胺(CAS号534-85-0)。
【化学式29】
Figure BDA0002719938670000301
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为N-(4-氯苯基)-1,2-苯二胺(CAS号68817-71-0)。
【化学式30】
Figure BDA0002719938670000302
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为4-重氮二苯胺硫酸盐(CAS号4477-28-5)。
【化学式31】
Figure BDA0002719938670000303
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为酸性黄(Acid Yellow)36(CAS号587-98-4)。
【化学式32】
Figure BDA0002719938670000311
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为2-氨基-4-异丙基氨基-二苯胺。
【化学式33】
Figure BDA0002719938670000312
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为N-异丙基-N'-(4-羟基苯基)-对苯二胺。
【化学式34】
Figure BDA0002719938670000313
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为N,N'-二-2-萘基-1,4-苯二胺(CAS号93-46-9)。
【化学式35】
Figure BDA0002719938670000314
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为4-(2-辛基氨基)二苯胺(CAS号15233-47-3)。
【化学式36】
Figure BDA0002719938670000321
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为N-(2-氨基-4-氯苯基)氨基苯甲酸(CAS号67990-66-3)。
【化学式37】
Figure BDA0002719938670000322
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为4-重氮-3-甲氧基二苯胺硫酸盐(CAS号36305-05-2)。
【化学式38】
Figure BDA0002719938670000323
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为4-(苯基偶氮)二苯胺(CAS号101-75-7)。
【化学式39】
Figure BDA0002719938670000324
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为酸性橙(Acid Orange)5(CASRN：554-73-4)。
【化学式40】
Figure BDA0002719938670000331
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为茜素绿(Alizarin CyaninGreen)F(CAS号4403-90-1)。
【化学式41】
Figure BDA0002719938670000332
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为茜素鲜红(AlizarinAstrol)(CAS RN：6408-51-1)。
【化学式42】
Figure BDA0002719938670000333
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为分散黄(Disperse Yellow)9(CAS号6373-73-5)。
【化学式43】
Figure BDA0002719938670000334
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为5-磺基-4'-二乙氨基-2，2'-二羟基偶氮苯(5-Sulfo-4'-diethylamino-2,2'-dihydroxyazobenzene)(CAS号1563-01-5)。
【化学式44】
Figure BDA0002719938670000341
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为茜素绿(Alizarin CyaninGreen)F(CAS号4403-90-1)。
【化学式45】
Figure BDA0002719938670000342
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为阿法明红R显色基(Alphamine Red R Base)(CAS号57322-42-6)。
【化学式46】
Figure BDA0002719938670000343
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为藏猩红(Crocein scarlet)3B(CAS号5413-75-2)。
【化学式47】
Figure BDA0002719938670000351
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为对苯基苯二胺(CAS号2198-59-6)。
【化学式48】
Figure BDA0002719938670000352
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以为下面的表中的化合物。
【表1-1】
Figure BDA0002719938670000353
Figure BDA0002719938670000361
Figure BDA0002719938670000371
Figure BDA0002719938670000381
Figure BDA0002719938670000391
Figure BDA0002719938670000401
Figure BDA0002719938670000411
Figure BDA0002719938670000421
Figure BDA0002719938670000431
Figure BDA0002719938670000441
Figure BDA0002719938670000451
Figure BDA0002719938670000461
Figure BDA0002719938670000471
Figure BDA0002719938670000481
Figure BDA0002719938670000491
【表1-2】
Figure BDA0002719938670000492
Figure BDA0002719938670000501
Figure BDA0002719938670000511
从本发明的苯二胺类化合物中排除具有下面的结构的对苯二胺及邻苯二胺。另外，从本发明的苯二胺类化合物中排除N,N-二甲基-对苯二胺，N,N-二甲基-邻苯二胺及N,N,N',N'-四甲基苯二胺。
【化学式49】
Figure BDA0002719938670000521
在一些实施方式中，从本发明的化合物中排除具有下面的通式(1)的结构的三苯胺衍生物。在另外的实施方式中，从用于电池的本发明的化合物中排除具有该结构的三苯胺衍生物。
【化学式50】
Figure BDA0002719938670000522
式中，X1～X9分别独立地表示氢、氟、氯、溴、氰基、硝基、-N(R1)2、链状饱和烃、链状不饱和烃、环状饱和烃或环状不饱和烃，R1为选自由氢、链状饱和烃、链状不饱和烃、环状饱和烃、环状不饱和烃、氰基、硝基及它们的组合构成的组中的至少一种。其中，排除X1～X9均为氢的情况。
在其它实施方式中，从本发明的化合物中排除N,N'-二苯基-N,N'-双(对甲苯基-1,4-苯二胺。在另外的实施方式中，从用于电池的本发明的化合物中排除N,N'-二苯基-N,N'-双(对甲苯基-1,4-苯二胺)。
可以在本发明的苯二胺类化合物上修饰用于与酶共价键合的官能团。可以在苯二胺类化合物与官能团之间放入C1～C20的烷基、氨基酸、肽等作为连接基。可以在连接基之间适当包含羟基、氨基、烯烃等。作为官能团，例如，可列举：羟基、羧基、氨基、醛基、肼基、硫氰酸酯、环氧基、乙烯基、卤代基、酸酯基、磷酸基、硫醇基、二硫化物基、二硫代氨基甲酸酯基、二硫代磷酸酯基、二硫代膦酸酯基、硫醚基、硫代硫酸基、琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基及硫脲基等。
苯二胺类化合物可以具有氧化还原状态及离子化状态。在上述化学式中，以中性型-还原型的形式记载本发明的苯二胺类化合物。然而，不仅是这种形式，本发明的苯二胺类化合物也可以为氧化型(二亚胺型)、半氧化型或还原型(二胺型)。本发明的偶氮化合物或重氮化合物也同样可以为氧化型、半氧化型或还原型。另外，本发明的苯二胺类化合物可以为中性型或阳离子型。为了方便起见，在提及本发明的苯二胺类化合物，例如上述化学式所表示的本发明的苯二胺类化合物的情况下，其包含中性型或阳离子型的、氧化型、半氧化型或还原型的形式的物质。例如，可以向测定系统中添加中性型-氧化型的化合物作为本发明的苯二胺类化合物，然后，通过溶液的pH或电子授受使其变为氧化型-阳离子型的化合物，这样的化合物也包含在本发明的苯二胺类化合物中。另外，提及本发明的苯二胺类化合物时，也包含其的盐、酸加成盐、酸酐及溶剂化物。作为盐，可列举：IA族元素的盐及VIIA族元素的盐，例如Na盐、K盐、Cl盐、Br盐等，但不限定于此。作为酸加成盐，可列举：盐酸盐、硫酸盐、亚硫酸盐，硝酸盐，但不限定于此。
本发明的苯二胺类化合物可以人工合成，也可以获得天然物。另外，还可以为市售的化合物。在合成的情况下，能够使用常用的有机合成手段进行有机合成，并通过NMR、IR、质谱等确认生成物。只要没有明确说明，则本发明使用化学、有机合成、生物化学、分子生物学、电化学的现有技术来实施，这些在本领域技术人员的能力范围内。这些技术在文献已有说明。例如，请参照Organic Chemistry(Jonathan Clayden(编辑),Nick Greeves(著),Stuart Warren(著),Peter Wothers(著))、Oxford Univ Pr,2000、及March's AdvancedOrganic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure(Michael B.Smith(著)、Jerry March(著))Wiley-Interscience,6th edition,2007。这些普通的文本分别作为参考结合在本说明书中。
(酶或氧化还原酶的固定方法)
酶或氧化还原酶可以通过任意公知方法固定于固相。可以将酶、例如氧化还原酶固定于微珠、膜、碳粒子、金粒子、铂粒子、聚合物、电极表面。作为固定方法，具有使用交联试剂的方法、封入高分子基质中的方法、利用透析膜覆盖的方法、光交联性聚合物、导电性聚合物、氧化还原聚合物等，可以固定在聚合物中或者吸附固定在电极上，另外，也可以将这些组合后使用。典型地，使用戊二醛将氧化还原酶固定在碳电极上之后，利用具有胺基的试剂进行处理，以封闭戊二醛。作为所固定的氧化还原酶的量，能够设为可以产生电化学测定或者燃料电池发电所需的电流的量，可以适当确定。
(本发明的苯二胺类化合物的吸附方法)
在一些实施方式中，本发明的苯二胺类化合物可以以游离在溶液中的状态存在，另外，也可以吸附、例如物理性吸附于微珠、膜、碳粒子、金粒子、铂粒子、聚合物、电极表面。有时也将本发明的苯二胺类化合物吸附于电极表面称为被固定于电极表面，在本说明书中，它们的含义相同。作为吸附方法，可列举具有如下工序的方法：使本发明的苯二胺类化合物溶解在适当的介质中，并使该溶液与电极物理性接触。在另外的实施方式中，可以将本发明的苯二胺类化合物喷雾于电极。作为所吸附的苯二胺类化合物的量，能够设为可以产生电化学测定或者电池发电所需的电流的量，可以适当确定。
在一些实施方式中，电极上可以吸附有本发明的苯二胺类化合物，并进一步固定有酶例如氧化还原酶。在该情况下，可以首先吸附本发明的苯二胺类化合物，然后固定酶例如氧化还原酶，或者也可以首先固定酶例如氧化还原酶，接着吸附本发明的苯二胺类化合物，或者还可以在固定酶例如氧化还原酶的操作中同时吸附苯二胺类化合物。
添加于试样溶液的本发明的苯二胺类化合物的最终浓度不受特别限定，例如，可以为1pM以上、2pM以上、3pM以上、4pM以上、5pM以上、6pM以上、7pM以上、8pM以上、9pM以上、10pM以上、1M以下、100mM以下、20mM以下、10mM以下、5mM以下、1mM以下、800μM以下、600μM以下、500μM以下、400μM以下、300μM以下、200μM以下、100μM以下、50μM以下，例如1pM～1M、1pM～100mM、1pM～20mM、1pM～10mM、1pM～5mM、2pM～1mM、3pM～800μM、4pM～600μM、5pM～500μM、6pM～400μM、7pM～300μM、8pM～200μM、9pM～100μM、10pM～50μM的范围。添加于试样溶液的本发明的苯二胺类化合物的最终浓度不受特别限定，例如，可以为0.000001～0.5％(w/v)、0.000003～0.3％(w/v)、0.000005～0.1％(w/v)、0.00001～0.05％(w/v)、0.00002～0.03％(w/v)、0.00003～0.01％(w/v)。需要指出，苯二胺类化合物与其它试剂的添加顺序不作限制，可以同时添加，也可以依次添加。
在一些实施方式中，进行氧化还原反应的时间或进行电化学测定的时间能够设为60分以下、30分以下、10分以下、5分以下或1分以下。或者，在长时间进行测定的酶传感器或电池等中，进行氧化还原反应的时间能够设为60分以上、120分以上、1天以上、2天以上、3天以上、1周以上、2周以上、3周以上。例如，在将苯二胺类化合物与氧化还原酶共同使用的情况下，能够与试样中所含的或推测试样中将生成的还原型的介体的浓度范围相对应地调节用于电化学测定的试剂的各成分的浓度。
只要没有特别说明，则本发明的组合物中所含的酶或者固定于本发明的电极的酶为精制后的酶。包含酶的细胞提取物或细胞破碎液、粗酶提取液中除酶以外还包含各种夹杂物质。例如，有报道称微生物的粗酶提取液中的核黄素量为约53～133μM(J IndustMicro Biotech 1999,22,pp.8-18)。这样的粗酶提取液等若直接用于电化学测定，则夹杂物质会接受电子等而妨碍与电极的电子交换，因此，作为粗酶提取液，如果在该核黄素浓度下，则难以进行准确的电化学测定。因而，在本发明的电化学测定法中，能够使用除去夹杂物质后的酶。在本说明书中，酶已精制或精制酶无需一定是指蛋白质为纯品，而是指从酶标准品中除去夹杂物质直至达到可以进行电化学测定的程度。
(氧化还原酶的活性测定)
对氧化还原酶的活性测定进行说明时，作为具体的酶，将以葡萄糖脱氢酶(GDH)为例。GDH(EC 1.1.99.10)对氧化葡萄糖的氢氧基而生成葡萄糖酸-δ-内酯的反应进行催化。此时，电子受体接受电子而变为还原型电子受体。利用该作用原理，例如，能够通过下面使用吩嗪硫酸甲酯(PMS)及2,6-二氯吲哚酚(DCIP)作为电子受体的测定系统来测定GDH的活性。
(反应1)D-葡萄糖+PMS(氧化型)
→D-葡萄糖酸-δ-内酯+PMS(还原型)
(反应2)PMS(还原型)+DCIP(氧化型)
→PMS(氧化型)+DCIP(还原型)
具体而言，首先，在(反应1)中，随着D-葡萄糖的氧化，生成PMS(还原型)。通过接着进行的(反应2)使PMS(还原型)氧化，随之还原DCIP。能够检测该“DCIP(氧化型)”的消失程度以作为波长600nm处的吸光度的变化量，并基于该变化量求得酶活性。
能够按照下面的程序来测定GDH的活性。将100mM磷酸缓冲液(pH7.0)2.05mL、1MD-葡萄糖溶液0.6mL及2mM DCIP溶液0.15mL混合，在37℃下保温5分钟。接着，添加15mM PMS溶液0.1mL及酶样品溶液0.1mL，并开始反应。测定反应开始时的吸光度及反应开始以后的吸光度，从而求得600nm处的吸光度随着酶反应的进行每1分钟所减少的量(ΔA600)，并按照下式计算出GDH活性。此时，关于GDH活性，将37℃下在浓度200mM的D-葡萄糖存在时于1分钟内还原1μmol的DCIP的酶量定义为1U。
【数学式1】
Figure BDA0002719938670000571
需要指出，式中的3.0表示反应试剂+酶试剂的液量(mL)，16.3表示本活性测定条件下的毫摩尔分子消光系数(cm2/μmol)，0.1表示酶溶液的液量(mL)，1.0表示槽的光程长度(cm)，ΔA600blank表示添加100mM磷酸缓冲液(pH7.0)代替酶样品溶液并开始反应时600nm处的吸光度每1分钟的减少量，df表示稀释倍数。
本发明的电化学测定试剂盒包含足够用于至少一次测验的量的本发明的苯二胺类化合物或包含该苯二胺类化合物的电极改性剂。典型地，除本发明的苯二胺类化合物之外，本发明的电化学测定试剂盒还包含氧化还原酶、测验所需的缓冲液、用于制作校正曲线的底物标准溶液、以及指针(indicator)。例如氧化还原酶可以为GDH，在该情况下，底物标准溶液可以为葡萄糖标准溶液。
在一些实施方式中，本发明的电化学测定试剂盒包含本发明的苯二胺类化合物和氧化还原酶作为同一试剂。在其它实施方式中，本发明的电化学测定试剂盒包含苯二胺类化合物和氧化还原酶作为不同的试剂。在另外的实施方式中，氧化还原酶可以固定于电极，针对这种电极所使用的本发明的电化学测定试剂盒包含苯二胺类化合物作为单一试剂。但是，这里所说的单一试剂并不表示该试剂不包含除苯二胺类化合物以外的物质。为了使本发明的苯二胺类化合物在单一试剂中溶解，该单一试剂可以包含适当的介质。介质只要为本发明的苯二胺类化合物能够溶解在其中的物质，则可以为任意物质，可列举：水、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、乙腈等，但不限定于此。本发明的苯二胺类化合物能够以各种形式提供，例如，作为粉末固体状的试剂、固定于微珠或电极表面的试剂、或适当的保存溶液中的溶液例如避光的溶液而提供。
作为电化学测定的一例，可列举葡萄糖浓度的测定。在用于比色式电化学测定的情况下，例如，能够如下进行葡萄糖浓度的测定。预先将包含葡萄糖脱氢酶(GDH)、以及选自由N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸(ADA)、二(2-羟基乙基)亚氨基三(羟基甲基)甲烷(Bis-Tris)、碳酸钠及咪唑构成的组中的一种以上物质的液状或者固体状的组合物保持在用于电化学测定的反应层中。在此，根据需要添加pH缓冲剂、显色试剂(变色试剂)。向其中加入包含葡萄糖的试样，并反应一定时间。期间检测吸光度，该吸光度相当于通过从GDH直接接受电子进行聚合而生成的色素或者经还原的色素的最大吸收波长。如果为速率法，则由吸光度每小时的变化率，基于预先使用标准浓度的葡萄糖溶液所制作的校正曲线，计算出试样中的葡萄糖浓度，如果为终点法，则由试样中的葡萄糖全部被氧化时刻之前的吸光度的变化，基于预先使用标准浓度的葡萄糖溶液所制作的校正曲线，计算出试样中的葡萄糖浓度。
作为该方法中能够使用的显色试剂(变色试剂)，例如可以添加2,6-二氯吲哚酚(DCIP)作为电子受体，并监测600nm处的吸光度的减少，由此定量葡萄糖。另外，还可以加入硝基四氮唑蓝(NTB)作为显色试剂，并测定570nm吸光度，由此确定所生成的二甲的量，进而计算出葡萄糖浓度。需要指出，所使用的显色试剂(变色试剂)当然不限定于此。
在一些实施方式中，能够利用本发明的化合物吸附于电极的性质来制作能够检测本发明的化合物的传感器。能够向包含本发明的化合物、例如DPPD的溶液中插入电极、例如碳电极，并在该溶液中或者经过一定时间后改插入其它的测定溶液中，通过电化学测定、例如CV或者计时电流法来定量或定性地检测本发明的化合物的量。
(酶传感器)
在一些实施方式中，本发明提供包含固定有氧化还原酶并吸附有本发明的电极改性剂的电极的酶传感器。作为酶传感器的电极，例如，可列举：碳电极、金电极、铂电极等，能够在该电极上涂布或固定氧化还原酶。进一步地，还可以包含含有Co、Pd、Rh、Ir、Ru、Os、Re、Ni、Cr、Fe、Mo、Ti、Al、Cu、V、Nb、Zr、Sn、In、Ga、Mg、Pb、Au、Pt、Ag中的至少一种元素的金属微粒作为导电性材料，这些可以为合金，也可以为镀覆物。作为碳，也包含碳纳米管、碳黑、石墨、富勒烯及其衍生物等。作为氧化还原酶的固定方法，请参照上述的“酶或氧化还原酶的固定方法”的段落。
在一些实施方式中，作为本发明的酶传感器的一例，可列举葡萄糖传感器。该葡萄糖传感器可以具有吸附于电极的本发明的苯二胺类化合物及固定于电极的GDH或葡萄糖氧化酶(GOD)。该葡萄糖传感器可以用于持续血糖测定或连续葡萄糖监测。
本发明的电极、酶传感器及电化学测定组合物能够通过使用恒电位仪或恒电流仪等而用于各种电化学测定手段。作为电化学测定法，可列举：安培法，例如计时电流法、电位步进计时电流法；伏安法，例如循环伏安法、差分脉冲伏安法；电位分析法；库仑法等各种手段。例如，如果待测定底物为葡萄糖，则能够通过安培法测定葡萄糖被还原时的电流，从而计算出试样中的葡萄糖浓度。施加电压虽然也根据条件及装置的设置而不同，但能够设为例如-1000mV～+1000mV(vs.Ag/AgCl)等。
需要指出，能够通过循环伏安法来确认试验化合物是否吸附于电极。改变扫频速度，例如在10mV/sec至50mV/sec的范围内改变扫频速度，从而调查氧化电流的最大值(IOmax)及还原电流的最大值(IRmax)如何变化。由此可知，通常，在介体吸附于电极的情况下，循环伏安法的扫频速度与IOmax及IRmax的值成正比关系。在介体扩散的情况下，IOmax及IRmax与扫频速度的0.5平方成正比。由IOmax及IRmax与扫频速度的关系来确定化合物是吸附还是扩散。
作为电化学测定的一例，可列举葡萄糖的电化学测定。在一些实施方式中，本发明提供葡萄糖的电化学测定方法，该葡萄糖的电化学测定包含下述工序：使可以包含葡萄糖的试样、苯二胺类化合物及精制后的葡萄糖氧化酶或精制后的葡萄糖脱氢酶相接触；及测定电流。该苯二胺类化合物可以存在于溶液中或吸附于电极，酶可以吸附于电极。
例如，葡萄糖浓度的电化学测定能够如下进行。向恒温槽中加入缓冲液，并保持为一定温度。使用固定有GDH或GOD的电极作为工作电极，并使用对电极(例如铂电极)及参比电极(例如Ag/AgCl电极、Ag/Ag+电极)。向反应液中添加本发明的苯二胺类化合物。对碳电极施加一定的电压，电流稳定后，加入包含葡萄糖的试样，测定电流的增加。能够按照使用标准浓度的葡萄糖溶液所制作的校正曲线来计算试样中的葡萄糖浓度。所施加的电位能够设为例如+800mV以下、+700mV以下、+600mV以下、+500mV以下、+400mV以下、+300mV以下、+200mV以下、+100mV以下、+50mV以下，且能够设为-200mV以上、-100mV以上、-50mV以上、例如0mV以上，例如，能够设为+800mV～-200mV、+800mV～-100mV、+800mV～-50mV、+600mV～0mV、+500mV～0mV、+400mV～0mV、+300mV～0mV、+200mV～0mV(均为相对于银/氯化银参比电极)。包含葡萄糖的测定溶液的pH可以在pH3～10的范围内。例如，pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10，溶液中也可以包含甘氨酸、乙酸、柠檬酸、磷酸、碳酸、Good's缓冲剂等作为缓冲剂。即使在使用除GDH、GOD以外的酶、及除葡萄糖以外的底物的情况下，也能够适当地改变pH而进行测定。
作为具体例，预先在玻璃碳(GC)电极上固定苯二胺化合物、例如IPPD，接下来，固定0.2U～150U、例如0.5U～100U的GDH或GOD，测定相对于葡萄糖浓度的响应电流值。向电解槽中添加100mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)10.0ml。将GC电极与恒电位仪BAS100B/W(BAS制造)连接，在37℃下搅拌溶液，对银/氯化银参比电极施加+500mV。向这些的系统中添加1M D-葡萄糖溶液，使最终浓度为5、10、20、30、40、50mM，每次添加均测定稳定状态的电流值。相对于已知的葡萄糖浓度(5、10、20、30、40、50mM)绘制该电流值，从而制成校准曲线。由此可以通过固定有GDH或GOD酶的电极对葡萄糖进行定量。
进一步地，也可以使用印刷电极进行电化学测定。由此，能够降低测定所需的溶液量。电极可以形成在绝缘基板上。具体而言，可以通过光刻技术、丝网印刷、凹版印刷、柔版印刷等印刷技术在基板上形成电极。作为绝缘基板的素材，可列举：硅、玻璃、陶瓷、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯等，能够使用对各种溶剂及化学品的抵抗性较强的材料。工作电极的面积能够根据所需的响应电流来设置。例如，在一些实施方式中，能够将工作电极的面积设为1mm2以上、1.5mm2以上、2mm2以上、2.5mm2以上、3mm2以上、4mm2以上、5mm2以上、6mm2以上、7mm2以上、8mm2以上、9mm2以上、10mm2以上、12mm2以上、15mm2以上、20mm2以上、30mm2以上、40mm2以上、50mm2以上、1cm2以上、2cm2以上、3cm2以上、4cm2以上、5cm2以上，例如10cm2以上。在一些实施方式中，能够将工作电极的面积设为10cm2以下、5cm2以下，例如1cm2以下。对电极也可以相同。另外，也能够在工作电极上固定碳纳米管、石墨烯、科琴黑等，从而增大表观表面积。在该情况下，表观面积可以增加10倍以上、50倍以上、100倍以上、1000倍以上。
在一些实施方式中，在本发明的电极改性剂、电极吸附剂或电子传递促进剂与电极共同使用的情况下，在每1cm2的工作电极的面积上，可以以0.1pmol以上、0.2pmol以上、0.3pmol以上、0.4pmol以上、0.5pmol以上、1pmol以上、10mmol以下、5mmol以下、1mmol以下、800μmol以下、600μmol以下、500μmol以下、400μmol以下、300μmol以下、200μmol以下、100μmol以下、50μmol以下，例如0.1pmol～10mmol、0.1pmol～5mmol、0.2pmol～1mmol、0.3pmol～800μmol、0.4pmol～600μmol、0.5pmol～500μmol、0.6pmol～400μmol、0.7pmol～300μmol、0.8pmol～200μmol、0.9pmol～100μmol、1pmol～50μmol的物质量使用本发明的电极改性剂、电极吸附剂或电子传递促进剂。这些数值是将工作电极的面积设为1cm2时的数值，在增大或减小工作电极的面积的情况下，或者在使用了比表面积较大的碳纳米管、石墨烯等时，表观表面积增大，可以使用相应的物质量的本发明的电极改性剂。
(本发明的电池)
在一些实施方式中，本发明提供具有本发明的苯二胺类化合物、电极改性剂、电极吸附剂或电子传递促进剂的电池。在一些实施方式中，在本发明的电池中，本发明的化合物固定于该电池的电极。在一些实施方式中，本发明的电池具有氧化还原酶。在一些实施方式中，氧化还原酶可以固定于电池所具有的电极。在一些实施方式中，本发明提供使用本发明的电池的发电方法。
(本发明的燃料电池)
在一些实施方式中，本发明提供具有本发明的苯二胺类化合物、电极改性剂、电极吸附剂或电子传递促进剂的用于燃料电池的阳极或阴极、及具备该阳极或阴极的燃料电池。在一些实施方式中，本发明提供使用吸附有本发明的苯二胺类化合物、苯二胺类化合物的电极的发电方法、及将GDH、GOD等氧化还原酶固定于阳极电极，并将与氧化还原酶相对应的底物、例如葡萄糖作为燃料的发电方法。有时，在固定有上述所示的氧化还原酶的情况下，能够将作为所固定的氧化还原酶的底物的化合物作为燃料。
在一些实施方式中，本发明的燃料电池具备本发明的吸附有苯二胺类化合物的阳极或阴极、燃料槽、阴极、具有氧化还原酶的阳极、及电解质。另外，本发明的燃料电池能够根据需要在阳极和阴极之间配置负载电阻器，可以具备用于其的布线。在一些实施方式中，负载电阻器为本发明的燃料电池的一部分。在一些实施方式中，负载电阻器不是本发明的燃料电池的一部分，本发明的燃料电池被配置为能够与适当的负载电阻器连接。在本发明的燃料电池中，氧化还原酶构成阳极的一部分。例如，氧化还原酶可以接近或者接触阳极，也可以固定或吸附于阳极。燃料槽包含作为固定于电极的氧化还原酶的底物的化合物。例如，在将葡萄糖脱氢酶固定于电极的情况下，燃料可以为葡萄糖。在一些实施方式中，本发明的燃料电池可以具有分离阳极与阴极的离子交换膜。离子交换膜可以具有1nm～20nm的孔。阳极可以为如碳电极那样的普通电极。例如，能够利用由碳黑、石墨、活性炭等导电性碳质构成的电极或由金、铂等金属构成的电极。具体而言，可列举：碳纸、碳布、碳毡、玻璃碳、HOPG(高定向热分解石墨)等。作为成对的阴极，例如，能够采用如下所述这样的形式：将铂、铂合金等燃料电池中常用的电极催化剂负载于由诸如碳黑、石墨、碳布、碳毡、活性炭之类的碳质材料或金、铂等构成的导电体上而成的电极、或由铂、铂合金等电极催化剂本身构成的导电体用作阴极电极，并向电极催化剂提供氧化剂(阴极侧底物、氧等)。在一些实施方式中，从本发明的电极中排除汞电极。
在另外的实施方式中，作为与由如上所述的底物氧化型酶电极构成的阳极成对的阴极，可以使用底物还原型酶电极。作为还原氧化剂的氧化还原酶，可列举漆酶、胆红素氧化酶等公知的酶。在使用氧化还原酶作为还原氧化剂的催化剂的情况下，可以根据需要使用公知的电子传递介体。阴极用介体可以与阳极用介体相同，也可以不同。作为氧化剂，可列举：氧、过氧化氢等。
在一些实施方式中，为了避免会妨碍阴极中的电极反应的杂质(抗坏血酸、尿酸等)的影响，能够在阴极电极的周围配置氧选择性膜(例如二甲基聚硅氧烷膜)。
本发明的发电方法包含下述工序：向具有氧化还原酶的阳极供应成为燃料的作为氧化还原酶的底物的化合物。向具有氧化还原酶的阳极供应燃料后，底物被氧化，同时生成电子，氧化还原酶将该电子递交给媒介该氧化还原酶与电极之间的电子传递的电子传递介体、例如苯二胺类化合物，电子被该电子传递介体递交给导电性基材(阳极电极)。电子通过布线(外部电路)从阳极电极到达阴极电极，由此产生电流。
上述过程中所产生的质子(H+)在电解质溶液内移动至阴极电极。并且，在阴极电极中，在电解质溶液内从阳极移动来的质子、经过外部电路从阳极侧移动来的电子、以及氧、过氧化氢等氧化剂(阴极侧底物)进行反应，从而生成水。能够利用该水进行发电。
(本发明的有机电池)
在一些实施方式中，本发明提供具有本发明的苯二胺类化合物、电极改性剂、电极吸附剂或电子传递促进剂的有机电池。电极改性剂、电极吸附剂或电子传递促进剂可以吸附于电极。作为用于有机电池的电极材料，可列举：醌或靛蓝衍生物、具有甲氧基的苯醌化合物、靛蓝胭脂红、并五苯四酮等，但不限定于此。作为用于有机自由基电池的电极材料，可列举：具有硝氧基自由基的化合物，例如将2,2,6,6-四甲基哌啶-N-氧自由基键合于聚合物、例如聚甲基丙烯酸酯或丙烯酸酯而成的电极材料或锂，但不限定于此。例如，参见高分子,54卷,12月号,2005,p.886。在有机电池中，可以将本发明的电极改性剂用作阳极侧、阴极侧的电子介体。
包含本发明的苯二胺类化合物的电极改性剂、及吸附有该电极改性剂的电极能够用于各种电化学测定。另外，该电极通过固定氧化还原酶而能够用于酶传感器。进一步地，包含本发明的苯二胺类化合物的电极改性剂、及吸附有该电极改性剂的电极能够用于燃料电池或有机电池。这些仅为示例，包含本发明的苯二胺类化合物的电极改性剂或吸附有该电极改性剂的电极的用途不限定于此。
通过下面的实施例，进一步例证本发明。但是，本发明的技术范围丝毫不受这些例子限定。
实施例
材料及方法
只要没有特别说明，则材料及试剂为市售的物质、或按照本技术领域中常用的手段、公知文献的程序获得或制备的物质。单壁碳纳米管使用西格玛公司、名城纳米碳公司或Zeon Nano Technology公司的产品。多壁碳纳米管使用西格玛公司、名城纳米碳公司或关东化学公司的产品。作为碳纳米管，使用通过在包含低分子表面活性剂、水溶性高分子、水溶性多糖等的水溶液中进行超声波处理而使其适当分散而成的物质。作为表面活性剂，使用Triton X-100、十二烷基硫酸钠盐等，不限定于此。化合物N-甲基-N'-苯基-对苯二胺、N-乙基-N'-苯基-对苯二胺、N-异丙基-N'-(4-氨基苯基)-对苯二胺、2-氨基-4-异丙基氨基-二苯胺及N-异丙基-N'-(4-羟基苯基)-对苯二胺从株式会社NARD研究所(NARD公司)获得。它们的制造程序如下所述。
使用下面的路径合成N-甲基-N'-苯基-对苯二胺(路径中记作化合物1-1)及N-乙基-N'-苯基-对苯二胺(路径中记作化合物1-2)。
【化学式51】
Figure BDA0002719938670000661
生成物通过硅胶柱(展开溶剂庚烷/乙酸乙酯)精制，并通过质谱及NMR确认。化合物1-1的[M+H]+离子的m/z的理论值为199.1，实测值为199.1，化合物1-2的[M+H]+离子的m/z为理论值213.1，实测值为213.1。
使用下面的路径合成N-异丙基-N'-(4-氨基苯基)-对苯二胺(路径中记作化合物2-2)及N-异丙基-N'-(4-羟基苯基)-对苯二胺(路径中记作化合物2-3)。
【化学式52】
Figure BDA0002719938670000681
生成物通过硅胶柱(展开溶剂庚烷/乙酸乙酯)精制，并通过质谱及NMR确认。化合物2-2的[M+H]+离子的m/z的理论值为242.1，实测值为242.1，化合物2-3的[M+H]+离子的m/z的理论值为243.1，实测值为243.0。
使用下面的路径合成2-氨基-4-异丙基氨基-二苯胺(路径中记作化合物2-1)。
【化学式53】
Figure BDA0002719938670000701
生成物通过硅胶柱(展开溶剂庚烷/乙酸乙酯)精制，并通过质谱及NMR确认。化合物2-1的[M+H]+离子的m/z的理论值为242.1，实测值为242.2。
关于其它化合物，由TCI公司或Sigma-Aldrich公司获得市售品。
实施例1.向宿主导入来自Mucor属的GDH基因及确认GDH活性
专利第4648993号中记载的来自Mucor属的GDH(MpGDH)的氨基酸序列示于序列号1，碱基序列示于序列号2。得到对MpGDH中导入有N66Y/N68G/C88A/A175C/N214C/Q233R/T387C/G466D/E554D/L557V/S559K这些变异的改性GDH(MpGDH-M2)进行编码的基因。MpGDH-M2的氨基酸序列示于序列号3，其基因的碱基序列示于序列号4。通过常用方法将目标基因MpGDH-M2基因插入质粒pUC19的多克隆位点，从而制作DNA结构。具体而言，pUC19使用附属于In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech公司)的pUC19 linearized Vector。使用上述的In-Fusion HD Cloning Kit，按照试剂盒上所附的程序，在位于pUC19的多克隆位点的In-Fusion Cloning Site上连接MpGDH-M1基因，得到结构用质粒(pUC19-MpGDH-M2)。
使这些基因在曲霉(Aspergillus sojae；酱油曲霉)中表达，并评价其的GDH活性。
具体而言，为了获得MpGDH-M2，使用GDH基因进行Double-joint PCR(FungalGenetics and Biology,2004年,第41卷,p.973-981)，构建由5’臂区-pyrG基因-TEF1启动子基因-黄素结合型GDH基因-3’臂区构成的盒，并将其按照下述的程序用于来自酱油曲霉NBRC4239株的pyrG破坏株(pyrG基因的上游48bp、编码区896bp、下游240bp缺失株)的转化。需要指出，pyrG基因为尿嘧啶营养缺陷型标志物。向500ml容量的锥形烧瓶中的包含20mM尿嘧啶的多聚蛋白胨糊精液体培养基100ml中接种来自酱油曲霉NBRC4239株的pyrG破坏株的分生孢子，在30℃下振荡培养约20小时之后，回收菌体。由所回收的菌体制备原生质体。使用得到的原生质体及插入目标基因的DNA结构20μg，通过原生质体PEG法进行转化，接着，使用包含0.5％(w/v)琼脂及1.2M山梨糖醇的Czapek-Dox基本培养基(DIFCO公司；pH6)，在30℃下孵育5天以上，得到转化酱油曲霉，其具有菌落形成能力。
得到的转化酱油曲霉能够通过导入与尿嘧啶缺陷型互补的基因pyrG而生长为未添加尿嘧啶的培养基，因此被选择做为导入有目标基因的菌株。通过PCR从得到的菌株中确认并选择目标转化体。
使用经MpGDH变异体的基因转化后的转化酱油曲霉来生产各自的GDH。
向200ml容量的锥形烧瓶中的DPY液体培养基(1％(w/v)多聚蛋白胨、2％(w/v)糊精、0.5％(w/v)酵母提取物、0.5％(w/v)KH2PO4、0.05％(w/v)MgSO4·7H20；未调节pH)40ml中接种各菌株的分生孢子，并在30℃下以160rpm振荡培养4天。接着，从培养后的培养物中过滤出菌体，将得到的培养基上清组分用Amicon Ultra-15,30K NMWL(密理博公司制造)浓缩及脱盐至10mL，并取代为包含150mM NaCl的20mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)。接下来，用于被包含150mM NaCl的20mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)平衡后的HiLoad 26/60Superdex 200pg(GE医疗公司制造)，用该缓冲液使其溶出，回收显示GDH活性的组分，从而得到MpGDH-M2的精制标准品。需要指出，该酶为经由其FAD键合位点与FAD键合的状态的酶(全酶)。
实施例2.确认苯二胺类化合物与碳电极的吸附性
使用三种苯二胺类化合物(N-异丙基-N'-苯基-对苯二胺(IPPD、东京化成工业公司制造，产品编号P0327)、N,N'-二苯基-对苯二胺(DPPD，东京化成工业公司制造，产品编号D0609)、N-(1,3-二甲基丁基)-N'-苯基-对苯二胺(6PPD，东京化成工业公司制造，产品编号D3331)，进行利用印刷电极的循环伏安法(CV)。具体而言，在印刷有碳的工作电极(12.6mm2)、银的参比电极而成的SCREEN-PRINTED ELECTRODES(DropSens公司制造，产品编号DRP-C110)上涂布最终浓度为10μg/ml的IPPD 10％乙醇水溶液3μl，在室温下干燥。然后，用超纯水清洗电极，使用专用连接器(DropSens公司制造，DRP-CAC)将其连接于ALS电化学分析仪814D(BAS公司制造)。将印刷电极作为工作电极，银/氯化银电极(BAS公司制造)作为参比电极，铂电极(BAS公司制造)作为对电极，并将其浸渍在100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)10mL中。以650rpm搅拌该溶液，同时进行在-200mV至+400mV(vs.Ag/AgCl)的范围内扫描电压的循环伏安法。使扫频速度在10mV/sec～50mV/sec的范围内变化，以调查氧化电流的最大值(IOmax)及还原电流的最大值(IRmax)如何变化。由此可知，通常，在介体吸附于电极的情况下，循环伏安法的扫频速度与IOmax及IRmax的值成正比关系。在介体扩散的情况下，IOmax及IRmax与扫频速度的0.5平方成正比。
实施使用IPPD的循环伏安法并绘制扫频速度与IOmax及IRmax而得到的结果示于图1。其结果，确认了扫频速度与IOmax及IRmax存在正比关系，这表示IPPD会吸附于碳电极。
将使用DPPD、6PPD代替IPPD并进行相同试验而得到的结果示于图2、图3。所有的化合物中均确认了扫频速度与IOmax及IRmax存在正比关系，这表示与IPPD相同地，它们会吸附于碳电极。
比较例(对苯二胺)
需要指出，若使用已知作为介体起作用的对苯二胺代替本发明的二苯胺类化合物并实施相同的测定，则氧化波、还原波均未观测到。考虑这是因为对苯二胺因用超纯水对电极的清洗或电极在磷酸钾缓冲液中浸渍而从电极上剥离。
将最终浓度为100μg/ml的对苯二胺10％乙醇溶液10μl、100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)10μl置于上述的印刷电极上，进行在-200mV～+400mV(vs.Ag/Ag+)的范围内扫描电压的循环伏安法，结果确认，如图4及5所示，IOmax及IRmax与扫频速度的0.5平方成正比。这表示对苯二胺未吸附于电极而是扩散。
实施例3.确认本发明的化合物与碳电极的吸附性
使用宾雪德拉氏绿隐色碱(BGLB，东京化成工业公司制造，产品编号B0482，CAS号637-31-0)或三[4-(二乙基氨基)苯基]胺(TDPA，Sigma-Aldrich公司制造，产品编号556394，CAS号5981-09-9)进行利用印刷电极的循环伏安法(CV)。具体而言，使用最终浓度为1mg/ml的BGLB乙醇溶液使化合物吸附于印刷碳的工作电极(12.6mm2)、银的参比电极而成的SCREEN-PRINTED ELECTRODES(DropSens公司制造，产品编号DRP-C110)。然后，与实施例2相同地实施循环伏安法。
将在使用BGLB的测定中绘制扫频速度与IOmax及IRmax而得到的结果示于图6。其结果，确认了扫频速度与IOmax及IRmax存在正比关系，这表示BGLB会吸附于碳电极。
将使用TDPA代替BGLB进行相同的试验而得到的结果示于图7。TDPA存在两个氧化还原波，因此图中记作IO1、IO2、IR1及IR2。即使在使用TDPA的情况下，也确认了扫频速度与IOmax及IRmax存在正比关系，这表示，与BGLB相同，TDPA也会吸附于碳电极。
利用使用圆形碳电极(Biodevice Technology公司制造，DEP-Chip EP-PP)或SCREEN-PRINTED ELECTRODES(DropSens公司制造，产品编号DRP-C110)的电极，并按照与上述相同的手段，针对下面的化合物，也同样确认了它们会吸附于电极。
【表2】
Figure BDA0002719938670000741
Figure BDA0002719938670000751
Figure BDA0002719938670000761
Figure BDA0002719938670000771
Figure BDA0002719938670000781
Figure BDA0002719938670000791
实施例4.使用苯二胺类化合物的电化学评价
使用FAD依赖性GDH与三种苯二胺类化合物(IPPD、DPPD、6PPD)，进行使用印刷电极的循环伏安法。
具体而言，使用专用连接器将印刷有碳的工作电极(2.64mm2)、银/氯化银的参比电极而成的圆形碳电极(Biodevice Technology公司制造，DEP-Chip EP-PP)连接于ALS电化学分析仪814D(BAS公司制造)，将2000U/ml的FADGDH-AA(Kikkoman Biochemifa公司制造，产品编号60100)溶液2μl、含有1.5M的氯化钾的50mM的磷酸钾缓冲液(pH7.0)8μl、IPPD10％乙醇水溶液10μl置于电极上。IPPD的最终浓度设为2.5μM。并且，进行在-200mV～400mV(vs.Ag/AgCl)的范围内扫描电压的循环伏安法。扫频速度设为10mV/sec。接下来，添加葡萄糖溶液并使葡萄糖的最终浓度为200mM，同样地进行循环伏安法。
将测定时的循环伏安图示于图8。观测到对于葡萄糖的响应电流，由此表示IPPD作为介体起作用。
接下来，使用专用连接器(DropSens公司制造，DRP-CAC)将印刷有碳的工作电极(12.6mm2)、银/氯化银的参比电极而成的SCREEN-PRINTED ELECTRODES(DropSens公司制造，产品编号DRP-110)连接于ALS电化学分析仪814D(BAS公司制造)，将2000U/ml的葡萄糖脱氢酶(FAD-依赖)(BBI公司制造，产品代码:GLD3，下面，记作GLD3)溶液5μl、含有1.5M的氯化钾的50mM的磷酸钾缓冲液(pH7.0)20μl、苯二胺类化合物的10％乙醇水溶液25μl置于电极上。关于化合物的最终浓度，IPPD采用2.5μM，DPPD及6PPD采用0.5μM。并且，进行在-200mV至400mV(vs.Ag/AgCl)的范围内扫描电压的循环伏安法。扫频速度设为30mV/sec。接下来，添加葡萄糖溶液并使葡萄糖达到各种最终浓度，同样地进行循环伏安法。另外，作为对照实验，在不包含苯二胺类化合物的条件下，与上述相同地进行循环伏安法。
另外，将绘制使用IPPD、DPPD、6PPD时葡萄糖最终浓度与300mV时的氧化电流值的关系而得到的图示于图9、10及11。在使用IPPD、DPPD、6PPD中的任意一种化合物的情况下，均观测到对于葡萄糖的响应电流。另一方面，在不包含这些化合物的情况下，未观测到响应电流，由此表示IPPD、DPPD、6PPD均作为介体起作用。因此，这表示也能够用作阳极电极。
接下来，与上述相同地，将FADGDH-AA(Kikkoman Biochemifa公司制造，产品编号60100)或葡萄糖脱氢酶(FAD-依赖)(BBI公司制造，产品代码:GLD1，下面，记作GLD1)与IPPD混合，进行在-200mV至+400mV(vs.Ag/AgCl)的范围内扫描电压的循环伏安法。其中，在与FADGDH-AA组合时，IPPD最终浓度为5μM，在与GLD1组合时，IPPD最终浓度为2.5μM。将结果示于图12及13。仅在添加IPPD时观测到对于葡萄糖的响应电流，由此可知IPPD作为介体起作用。因此表示也能够用作阳极电极。
接下来，将GOD from A.niger Type X-S(Sigma-Aldrich公司制造，产品编号G7141，下面，记作GOD)与IPPD，与上述相同地进行循环伏安法。将结果示于图14。仅在添加IPPD时观测到对于葡萄糖的响应电流，由此可知IPPD作为介体起作用。因此表示也能够用作阳极电极。
实施例5.固定有本发明的化合物及GDH的电极的稳定性试验
使用FAD依赖性GDH与N,N'-二苯基-1,4-苯二胺(DPPD，东京化成工业公司制造，产品编号D0609)，实施使用印刷电极的循环伏安法(CV)。具体而言，首先，按照与实施例2相同的程序，在SCREEN-PRINTED ELECTRODES(DropSens公司制造，产品编号DRP-C110)上吸附DPPD，用超纯水清洗电极后将其风干。然后，将4mg/ml的FADGDH-AA(Kikkoman Biochemifa公司制造，产品编号60100)溶液3μl涂布于电极，并再次风干。接下来，将电极在25％戊二醛溶液(富士薄膜和光纯药公司制造，和光一级，产品编号079-00533)的蒸汽中暴露30分，然后，用纯水清洗电极，制作固定有DPPD-GDH的电极。使用专用连接器(DropSens公司制造，DRP-CAC)将该电极连接于ALS电化学分析仪814D(BAS公司制造)，并将其浸渍在包含最终浓度为100mM的葡萄糖的20mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)10ml中。将印刷电极作为工作电极，银/氯化银电极(BAS公司制造)作为参比电极，铂电极(BAS公司制造)作为对电极，以750rpm搅拌溶液，同时进行在-200mV至+400mV(vs.Ag/AgCl)的范围内扫描电压的CV。扫频速度设为30mV/sec。接下来，从溶液中取出电极，用超纯水清洗后，将其浸渍于相同组成的新测定溶液中，共反复实施相同的测定三次。关于+150mV时第三次的CV中的氧化电流，包含葡萄糖的溶液与不包含葡萄糖的空白溶液中的测定值的差异为149nA。与空白相比响应电流较高，这表示DPPD作为电子转移促进剂起作用。进一步将第一次、第二次CV与第三次CV进行比较，结果电流值几乎没有变化，这表示DPPD及GDH未脱离至溶液中，而是稳定地固定于电极。
比较例(亚甲蓝)
在使用已知作为介体的亚甲蓝(MB)代替本发明的化合物时，未观测到葡萄糖依赖性的响应电流。另一方面，在向电解质溶液中添加有FADGDH-AA和MB的试验系统中，确认到了葡萄糖依赖性的响应电流。由此表示，MB未吸附于电极，在电极制作工序中剥落。
比较例(1-甲氧基-5-甲基酚嗪鎓硫酸甲酯盐)
另外，使用与MB相同地已知作为介体的1-甲氧基-5-甲基酚嗪鎓硫酸甲酯盐(mPMS)实施相同的试验。关于+150mV时第三次的CV中的氧化电流，包含葡萄糖的溶液与不包含葡萄糖的空白溶液中的测定值几乎不存在差异，与使用DPPD时相比，该氧化电流的值显著降低。这表示mPMS容易从电极上剥离而扩散至溶液中。
实施例6.关于其它的氧化还原酶
接下来，使用果糖基肽氧化酶(FPOX-CE)(Kikkoman Biochemifa公司制造，产品编号60123，下面，记作FPOX-CE)与IPPD，进行利用印刷电极的计时电流法。具体而言，将0.79U/ml的FPOX-CE溶液5μl、含有3M的氯化钠的100mM的磷酸钾缓冲液(pH8.0)35μl、10ng/μl的IPPD的10％乙醇溶液5μl置于电极上。进一步分别添加1μl 9mM的果糖基甘氨酸溶液。并且，施加+250mV(vs.Ag/AgCl)，观测响应电流值120秒的变化。
记录施加10秒后的值，由此可知，如图15所示，响应电流值随着果糖基甘氨酸的浓度增加而增加。因此，这表示IPPD对于FPOX-CE也作为介体起作用。因此表示也能够用作阳极电极。
使用FADGDH-AA与BGLB、TDPA进行利用印刷电极的CV。具体而言，按照与实施例2相同的程序制作固定有化合物-GDH的电极，并实施CV。但是，CV的扫频范围设为-200mV至+600mV(vs.Ag/AgCl)，另外，作为对照实验，也利用不包含葡萄糖的溶液进行测定。
将使用BGLB及TDPA时+300mV时的氧化电流值的比较示于图16及17。在使用BGLB、TDPA中任意一种化合物的情况下，均观测到葡萄糖依赖性的响应电流。由此明确判断，它们可以用作使用BGLB、TDPA以及FADGDH-AA时的介体。
接下来，进行使用PQQ依赖性GDH与N-异丙基-N'-苯基-1,4-苯二胺(IPPD，东京化成工业公司制造，产品编号P0327)及BGLB的CV。具体而言，使用专用连接器(DRP-CAC)将印刷电极DRP-C110连接于ALS电化学分析仪814D，将0.8mg/ml的葡萄糖脱氢酶(PQQ-依赖)(东洋纺公司制造，产品编号GLD-321)溶液5μl、含有1.5M的氯化钾的50mM的磷酸钾缓冲液(pH6.8)20μl、5μM化合物的10％乙醇溶液25μl滴加在电极上。作为酶的溶解液，使用包含1mM氯化钙、0.1％聚氧乙烯(10)辛基苯基醚的50mM磷酸钾缓冲液(pH6.8)。并且，实施在-200mV至+400mV(vs.Ag/AgCl)的范围内扫描电压的CV。扫频速度设为30mV/sec。接下来，添加葡萄糖溶液以使葡萄糖达到各种最终浓度，同样地实施CV。
将绘制葡萄糖最终浓度与+300mV时的氧化电流值的关系而得到的图示于图18及19。在使用IPPD、BGLB中任意一种化合物的情况下，均确认到葡萄糖浓度依赖性的电流，由此表示这些化合物作为PQQ依赖性GDH的介体起作用。
接下来，实施使用NAD依赖性GDH与DPPD的计时电流法。具体而言，使用专用连接器(DRP-CAC)将印刷电极DRP-C110连接于ALS电化学分析仪814D，将5mg/ml的葡萄糖脱氢酶(NAD(P)-依赖)(东洋纺公司制造，产品编号GLD-311)溶液5μl、含有1.5M的氯化钾的150mM的磷酸钾缓冲液(pH8.0)15μl、50mM-NAD水溶液5μl、5μM-DPPD的10％乙醇溶液25μl滴加在电极上。作为酶的溶解液，使用150mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)。施加+150mV(vs.Ag/AgCl)的电位，自测定开始60秒后添加500mM葡萄糖溶液5μl，并测定电流变化。另外，作为对照实验，对于不包含DPPD的测定溶液也实施相同的试验。
将添加葡萄糖溶液后电流值达到恒定时刻的、添加葡萄糖前后的响应电流的差示于图20。在DPPD存在下，电流值因添加葡萄糖而大幅增加，而在DPPD不存在下，几乎未观测到对于葡萄糖的响应。由此明确判断，即使在NAD依赖性GDH中，DPPD也作为介体起作用。
接下来，实施使用乳酸氧化酶(LOD)与IPPD的CV。具体而言，使用专用连接器(DRP-CAC)将印刷电极DRP-C110连接于ALS电化学分析仪814D，将5mg/ml的乳酸氧化酶(东洋纺公司制造，产品编号LCO-301)溶液5μl、含有1.5M的氯化钾的1M的磷酸钾缓冲液(pH7.0)20μl、5μM-IPPD的10％乙醇溶液25μl滴加于电极上。作为酶的溶解液，使用1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)。并且，进行在-200mV至+400mV(vs.Ag/AgCl)的范围内扫描电压的CV。扫频速度设为30mV/sec。接下来，添加乳酸溶液以使乳酸达到各种最终浓度，同样地实施CV。
将绘制乳酸最终浓度与+150mV时的氧化电流值的关系而得到的图示于图21。可见响应电流乳酸浓度依赖性地增加，由此明确判断，IPPD作为LOD的介体起作用。
接下来，实施使用果糖脱氢酶(FDH)与IPPD的CV。已知FDH是一种即使在介体不存在下也能够直接使电子向电极移动(即具有直接电子转移能力)，且即使在介体不存在下也能够观测到底物依赖性响应电流的酶。具体而言，使用专用连接器(DRP-CAC)将印刷电极DRP-C110连接于ALS电化学分析仪814D，将10mg/ml的D-果糖脱氢酶(东洋纺公司制造，产品编号FCD-302)溶液5μl、含有1.5M的氯化钾的150mM的乙酸钠缓冲液(pH4.5)20μl、5μM-IPPD的10％乙醇溶液25μl滴加在电极上。作为酶的溶解液，使用包含0.1％-聚氧乙烯(10)辛基苯基醚的150mM的乙酸钠缓冲液(pH4.5)。并且，实施在-200mV至+400mV(vs.Ag/AgCl)的范围内扫描电压的CV。扫频速度设为30mV/sec。接下来，添加果糖溶液以使果糖达到各种最终浓度，同样地实施CV。
将未添加果糖时的电流设为0，绘制果糖最终浓度与+100mV时的氧化电流值的关系，将绘制成的图示于图22。由于FDH具有直接电子转移能力，因此即使在IPPD不存在下也会观测到果糖依赖性响应电流。但是，在IPPD存在下，观测到比IPPD不存在下时更大的电流。由此表示，即使在具有直接电子转移能力的FDH中，IPPD也作为介体起作用。
实施例7.使用固定有苯二胺类化合物-GDH的传感器测定葡萄糖
在丝印电极(SCREEN-PRINTED ELECTRODES)(DropSens公司制造，产品编号DRP-C110)上涂布3μl 5％聚乙烯亚胺(平均分子量10000)，室温下干燥。接着，涂布3μl IPPD(10％乙醇溶解)、30U的量的GDH-M2，室温下干燥。最后，涂布1μl 2.5mg/dl的聚乙二醇二缩水甘油醚(平均分子量500)，在4℃下静置一晚。将得到的电极用纯水清洗，作为IPPD-GDH固定电极。接着，将IPPD-GDH固定电极及Ag/AgCl参比电极、铂对电极浸渍在100mM磷酸钾缓冲液(pH7)中，进行CV测定。扫频速度设为10mV/sec。适当添加2M葡萄糖，计算出各葡萄糖浓度下+200mV时的氧化电流值。将其结果示于图23。可知随着葡萄糖浓度的增加，响应电流值也增加。因此，可以认为能够通过测定已知浓度的葡萄糖并制成校准曲线来定量葡萄糖浓度。另外，还表示能够也能够用作阳极电极。
实施例8.确认使用除碳以外的电极素材时的吸附的试验
将金电极(BAS公司制造，Cat No.002421)、Ag/AgCl参比电极、铂对电极浸渍在包含IPPD与GDH-M2的pH7的磷酸缓冲液中，进行CV测定。将扫频速度设为10～100mV/sec，绘制扫频速度与IOmax及IRmax。其结果，确认了扫频速度与IOmax及IRmax存在正比关系，这表示IPPD会吸附于金电极。
同样地，在使用铂电极(BAS公司制造，Cat No.002422)代替金电极时，也确认了扫频速度与IOmax及IRmax存在正比关系，这表示IPPD会吸附于铂电极。
实施例9.低浓度下的本发明的化合物的电化学检测
将印刷电极DRP-C110静置于包含稀释为10pM～100nM之间的各种浓度的DPPD的50mM磷酸钾缓冲液中。作为对照实验，对于不包含DPPD的溶液也实施处理。适当静置1小时～5天之后，使用专用连接器(DRP-CAC)将印刷电极连接于ALS电化学分析仪814D，在不包含DPPD且包含最终浓度为4mg/ml的FADGDH-AA的50mM的磷酸钾缓冲液(pH6.8)10ml中，实施在-400mV至+200mV(vs.Ag/Ag+)的范围内扫描电压的CV。扫频速度设为30mV/sec。然后，添加1ml 1M的葡萄糖溶液，并同样地实施CV，计算出从+100mV时的氧化电流值中减去未添加葡萄糖时+100mV时的氧化电流值而得到的值。
将使用10pM DPPD溶液时的结果示于向图24。添加葡萄糖时电流值增加，由此说明，在本系统中，即使在10pM的低浓度下，也可以用作能够检测DPPD的传感器。需要指出，在使用不包含DPPD的溶液时，添加葡萄糖时未见响应电流增加。同样地，在使用100pM、1nM、10nM、100nM的DPPD时，与未添加葡萄糖时相比，添加葡萄糖时，确认到响应电流显著增加。
实施例10.构筑燃料电池
分数次在5mm×5mm的碳布(TOYO Corporation公司制造)上涂布80μl多壁碳纳米管溶液，在60℃下干燥。用纯水清洗后，再进行干燥，从而吸附固定IPPD。接下来，涂布20μl12mg/ml的FAD依赖性葡萄糖脱氢酶(GLD1,Funakoshi公司制造)，在25℃下干燥。将上述碳布在25％戊二醛蒸汽中暴露30分钟，以使GLD1交联固定，将其作为阳极电极。使用铂(BAS公司制造)作为阴极电极，将该阴极电极与上述阳极电极、Ag/AgCl参比电极共同浸渍在包含100mM D-葡萄糖的PBS中，并与可变电阻器及恒电位仪连接。利用开路电势测得，连接10kΩ时流过60μA/cm2的电流。需要指出，在使用未吸附固定IPPD的电极时，连接10kΩ时不能观测到电流。因此，如果使用固定有本发明的苯二胺化合物的电极，能够制作无需向燃料槽中添加介体则能够流经电力的电池。
另外，即使使用单壁碳纳米管代替多壁碳纳米管，同样也能够流经电流。
实施例11.构筑使用本发明的化合物的葡萄糖传感器
在单壁碳纳米管中使用1mg/ml的IPPD并使其吸附固定，从而准备溶液。在实施例2中使用的印刷电极的工作电极上涂布3μL该溶液并使其干燥，用超纯水充分清洗。接下来，涂布4mg/ml的GLD1并使其干燥，与上述相同地通过戊二醛交联固定。用超纯水清洗后，浸渍在PBS中，也对银/氯化银参比电极、铂对电极进行浸渍，通过施加施加+250mV进行计时电流法测定。其结果，与未添加葡萄糖时相比，添加100μM葡萄糖时观测到1.3μA的响应电流。因此说明，即使在印刷电极上涂布预先与碳吸附的溶液，也同样能够制作酶传感器。需要指出，即使使用科琴黑代替单壁碳纳米管，也能够制作相同的酶传感器。
工业可用性
通过使用包含本发明的苯二胺类化合物的电极改性剂或吸附有该电极改性剂的电极，能够进行电池等的各种电化学测定。
本说明书中提及或引用的全部刊物、专利及专利申请直接作为参考结合在本说明书中。
序列的简单说明
序列号1来自Mucor prainii(普雷恩毛霉)的GDH(aa)
序列号2来自Mucor prainii的GDH(DNA)
序列号3 MpGDH-M2(aa)
序列号4 MpGDH-M2(DNA)
序列表
<110> 龟甲万株式会社
<120> 新型介体
<130> PH-7748-PCT
<150> JP 2018-077593
<151> 2018-04-13
<150> JP 2018-077628
<151> 2018-04-13
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
<213> 普雷恩毛霉（Mucor prainii）
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tatcccactg gcaacaagaa tcaaaagcaa attatcaagg cccgttatga agttatcatc 900
tcatctggtg ccattggtag tcctaagctt ttggaaatct ctggtatcgg taataaggat 960
atcgtctctg ctgctggtgt cgagtccttg attgacttgc ctggcgttgg ttccaacatg 1020
caagatcacg ttcatgctat cactgtctct actaccaata ttactggcta tactaccaac 1080
agcgtctttg tcaatgaaac ccttgcccaa gaacaaagag aagaatatga agccaacaag 1140
actggtatct gggctacttg tcccaacaac ctcggttatc ctacgcccga acaactcttc 1200
aatggcaccg aattcgtttc tggaaaggag tttgctgaca agattcgtaa ctctactgat 1260
gaatgggcca actattatgc ttccaccaac gcctccaatg tcgagttatt aaagaagcaa 1320
tatgctattg tcgcctctcg ttacgaagag aactacttgt ctcctattga aatcaacttc 1380
actcctggtt atgaggacag cggtaatgtc gatttgcaaa acaacaagta ccaaactgtc 1440
aaccatgtct tgattgctcc tttaagtcgt ggttatactc acattaactc ttctgatgtg 1500
gaggatcatt ctgtcattaa tccccaatac tactctcatc ctatggatat tgatgtccat 1560
atcgcttcca ctaaacttgc tcgcgaaatc atcactgcct ctcccggtct tggtgacatt 1620
aacagtggcg aaatcgaacc cggtatgaat attacttctg acgacgacgt tagaaaatgg 1680
ttgagtaata atgtccgttc tgactggcat cctgttggta cttgtgctat gcttcccaag 1740
gaattaggtg gtgttgtcag ccccgctctc atggtttacg gcacttccaa cttgcgtgtt 1800
gttgatgctt cgattatgcc cctcgaagtc tcttctcatt tgatgcaacc cacctacggt 1860
attgctgaga aggctgctga cattattaag aatttctaca agactcaaca caagaaccaa 1920
aattag 1926

Claims (20)

1.一种电极改性剂，包含化合物，所述化合物具有不键合于聚合物或者不聚合物化而吸附于未经酸处理的电极的性质。
2.一种电子传递促进剂，包含化合物，所述化合物具有不键合于聚合物或者不聚合物化而吸附于未经酸处理的电极的性质。
3.一种电池，包含权利要求1中所述的电极改性剂或权利要求2中所述的电子传递促进剂。
4.根据权利要求3所述的电池，其中，
所述化合物固定于所述电池的电极。
5.根据权利要求3或4所述的电池，其中，
包含氧化还原酶。
6.根据权利要求5所述的电池，其中，
氧化还原酶固定于电极。
7.一种组合物，包含权利要求1所述的电极改性剂或权利要求2所述的电子传递促进剂。
8.一种电极，包含权利要求1所述的电极改性剂或权利要求2所述的电子传递促进剂。
9.根据权利要求8所述的电极或者根据权利要求7所述的组合物，其中，
所述电极具有酶，所述组合物包含酶。
10.根据权利要求9所述的电极或组合物，其中，
酶为氧化还原酶。
11.根据权利要求10所述的电极，固定有氧化还原酶。
12.一种包含权利要求1所述的电极改性剂或权利要求2所述的电子传递促进剂的传感器、或者具有权利要求10或11所述的电极的酶传感器。
13.根据权利要求1所述的电极改性剂、
根据权利要求2所述的电子传递促进剂、
根据权利要求3～6任一项所述的电池、
根据权利要求7、9或10中所述的组合物、
根据权利要求8～11任一项所述的电极、或者
根据权利要求12所述的酶传感器，其中，
化合物为具有式I或式II的结构的化合物或者其的盐、酸酐或溶剂化物，
Figure FDA0002719938660000021
式中，
R1为-NR7R8、-N＝N-R9或-N+≡N，
R2为-NR10R11或-N＝N-R12，
R7及R8分别独立地为氢、任选被一个以上X或V取代的直链或支链的C1-7烷基、C1-7烯基、C1-7炔基、C3-9环烷基、苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基、菲基、乙酰基、羧基、呋喃基甲酰基、吡唑基甲酰基、1-甲基-1H-吡唑-5-基甲酰基、9,9-二甲基芴-2-基、-N+≡N、-N＝N-苯基、苄基、
Figure FDA0002719938660000031
R10为氢、任选被一个以上X或V取代的直链或支链的C1-7烷基、C1-7烯基、C1-7炔基、C3-9环烷基、苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基或菲基，
R3、R4、R5及R6分别独立地为氢、任选被一个以上Y取代的直链或支链的C1-7烷基、C1-7烯基、C1-7炔基、C1-7烷氧基、卤代基、硝基、氰基、羧基、磺基、羟基或氨基，
或者，R3及R4或R5及R6与含有它们的苯环一起形成任选被一个以上氧代基、X或W取代的苯环或
Figure FDA0002719938660000032
其中，＊键合于R3所键合的碳原子、＊＊键合于R4所键合的碳原子，或者＊键合于R5所键合的碳原子、＊＊键合于R6所键合的碳原子，
R11选自由任选被一个以上X或Z取代的苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基及菲基构成的组，
R9选自由氢、任选被一个以上X取代的苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基及菲基构成的组，
R12选自由任选被一个以上X、W、异硫氰酸酯或卤代磺酰基取代的苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基、菲基、及
Figure FDA0002719938660000041
构成的组，
其中，V为任选被C1-7烷基取代的-O-丙烯酰基、乙酰基氨基或苯基，
W为任选被一个以上氨基、C1-7烷基、氨基烷基取代的D或L-丙氨酰基磺酰基、D或L-缬氨酰基磺酰基、D或L-亮氨酰基磺酰基、D或L-蛋氨酰基磺酰基、D或L-脯氨酰基磺酰基、D或L-色氨酰基磺酰基、D或L-甘氨酰基磺酰基、D或L-半胱氨酰基磺酰基、D或L-异亮氨酰基磺酰基、D或L-苯基丙氨酰基磺酰基、D或L-酪氨酰基磺酰基、D或L-丝氨酰基磺酰基、D或L-苏胺酰基磺酰基、D或L-天冬酰胺酰基磺酰基、D或L-谷氨酰胺酰基磺酰基、D或L-精氨酰基磺酰基、D或L-组氨酰基磺酰基、D或L-赖氨酰基磺酰基、D或L-天冬酰胺酰基磺酰基、D或L-谷氨酰胺酰基磺酰基、-C(＝O)-O-琥珀酰亚胺、乙酰基、三氟乙酰基、苯甲酰基氨基、-N＝N-苯基、苯基氨基，二氨基苯基偶氮苯基或；任选被一个以上X取代的苯基偶氮；任选被一个以上Y取代的萘基偶氮、乙酰基氨基、
Figure FDA0002719938660000051
X为任选被选自由卤代基、氨基、氰基、羧基、羰基、烷氧基、烷基氨基、亚硝基、硝基及磺基构成的组中的一个以上取代基取代的直链或支链的C1-7烷基、C1-7烯基、C1-7炔基、C1-7烷氧基、卤代基、羟基、硝基、羧基、氰基、磺基、氨基或烷基氨基，
Y选自由卤代基、氨基、氰基、羧基、羰基、羟基、烷氧基及磺基构成的组，
Z为-SO2-CH＝CH2或-SO2-C2H4-O-SO3H、4,6-二氯三嗪-2-基氨基。
14.根据权利要求13所述的电极改性剂、电子传递促进剂、电池、组合物、电极或传感器，其中，
化合物为具有式Ia或IIa的结构、或者具有式Ib或IIb的结构的化合物或者其的盐、酸酐或溶剂化物，
Figure FDA0002719938660000061
式中，
R1a为-NR7aR8a、-N＝N-R9a或-N+≡N，
R2a为-NR10aR11a或-N＝N-R12a，
R7a及R8a分别独立地为氢、任选被一个以上Xa取代的直链或支链的C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、C3-9环烷基、苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基或菲基，
R10为氢、任选被一个以上Xa取代的直链或支链的C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、C3-9环烷基、苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基或菲基，
R3a、R4a、R5a及R6a分别独立地为氢、任选被一个以上Y取代的直链或支链的C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、C1-6烷氧基、卤代基、硝基、氰基、羧基、磺基、羟基或氨基，
或者，R3a及R4a或R5a及R6a形成苯环或
Figure FDA0002719938660000062
其中，＊键合于R3a所键合的碳原子、＊＊键合于R4a所键合的碳原子，或＊键合于R5a所键合的碳原子、＊＊键合于R6a所键合的碳原子，
R11a选自由任选被一个以上Xa取代的苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基及菲基构成的组，
R9a及R12a分别独立地选自由氢、任选被一个以上Xa取代的苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基及菲基构成的组，
Xa为任选被选自由卤代基、氨基、氰基、羧基、羰基、羟基、烷氧基、烷基氨基、亚硝基、硝基及磺基构成的组中的一个以上取代基取代的直链或支链的C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、C1-6烷氧基、卤代基、羟基、硝基、羧基、氰基、磺基、氨基或烷基氨基，
Y选自由卤代基、氨基、氰基、羧基、羰基、烷氧基及磺基构成的组；
Figure FDA0002719938660000071
式中，
R7b、R8b及R10b分别独立地为氢、任选被一个以上Xb取代的直链或支链的C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、C3-9环烷基、苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基或菲基，
R3b、R4b、R5b及R6b分别独立地为氢、任选被一个以上Y取代的直链或支链的C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、C1-6烷氧基、卤代基、硝基、氰基、羧基、磺基或氨基，
R11b选自由任选被一个以上Xb取代的苯基、1-萘基、2-萘基、蒽基及菲基构成的组，
其中，Xb为任选被选自由卤代基、氨基、氰基、羧基、羰基、烷氧基及磺基构成的组中的一个以上取代基取代的直链或支链的C1-6烷基、C1-6烯基、C1-6炔基、C1-6烷氧基、卤代基、羟基、硝基、羧基、氰基、磺基或氨基，
Y选自由卤代基、氨基、氰基、羧基、羰基、烷氧基及磺基构成的组。
15.根据权利要求13或14所述的电极改性剂、电子传递促进剂、电池、组合物、电极或者传感器，其中，化合物选自由下述构成的组，
Figure FDA0002719938660000091
Figure FDA0002719938660000101
Figure FDA0002719938660000102
及
Figure FDA0002719938660000103
16.一种电池的制造方法，包含使用权利要求1所述的电极改性剂或权利要求2所述的电子传递促进剂的工序。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，
包含使所述电极改性剂或电子传递促进剂与电池的电极接触的工序。
18.一种发电方法，使用权利要求3～6及13～15中任一项所述的电池。
19.一种电化学测定方法，使用权利要求7、9、10及13～15中任一项所述的组合物、权利要求8～11、及13～15中任一项所述的电极或者权利要求12～15中任一项所述的传感器。
20.一种电极的改性或修饰方法，包含使权利要求1及13～15中任一项所述的电极改性剂、权利要求2及13～15中任一项所述的电子传递促进剂或者权利要求7、9、10及13～15中任一项所述的组合物与电极接触的工序。
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