CN112041456A - 用于产生具有低硫酸化的糖分子的重组生物体和方法 - Google Patents

用于产生具有低硫酸化的糖分子的重组生物体和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112041456A
CN112041456A CN201980029409.7A CN201980029409A CN112041456A CN 112041456 A CN112041456 A CN 112041456A CN 201980029409 A CN201980029409 A CN 201980029409A CN 112041456 A CN112041456 A CN 112041456A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ala
leu
ser
val
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980029409.7A
Other languages
English (en)
Inventor
N·C·卡瓦扎
J·尤拉诺
S·坎博乌拉卡斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Conagen Inc
Original Assignee
Conagen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Conagen Inc filed Critical Conagen Inc
Publication of CN112041456A publication Critical patent/CN112041456A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1081—Glycosyltransferases (2.4) transferring other glycosyl groups (2.4.99)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01258—Dolichyl-P-Man:Man5GlcNAc2-PP-dolichol alpha-1,3-mannosyltransferase (2.4.1.258)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/99—Glycosyltransferases (2.4) transferring other glycosyl groups (2.4.99)
    • C12Y204/99018—Dolichyl-diphosphooligosaccharide—protein glycotransferase (2.4.99.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了用于产生低硫酸化糖分子的重组网粘菌纲(Labyrinthulomycetes)细胞。所述细胞包含编码异源糖分子的核酸和编码异源寡糖基转移酶的序列。所述细胞产生所述异源糖分子，与由不包含所述异源寡糖基转移酶的对应细胞产生的相同异源糖分子相比，所述异源糖分子具有较少的硫酸化聚糖。所述细胞有利地产生并任选地分泌所述异源糖分子。因此，本发明提供重组生物体，所述重组生物体提供糖基化谱与哺乳动物细胞中产生的糖基化谱更相似的糖分子。

Description

用于产生具有低硫酸化的糖分子的重组生物体和方法
相关申请的交叉引用
本申请按照美国法典第35卷第119条(e)款的规定要求于2018年5月1日提交的美国序列号62/665,187的优先权权益，该申请的全部内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及用于产生糖分子的重组生物体和方法，该糖分子的聚糖谱具有降低的硫酸化或不具有硫酸化。
序列表的并入
随附序列表中的材料据此以引用方式并入本申请中。名为SGI2170_1WO_Sequence_Listing.txt的随附序列表文本文件创建于2019年4月23日，并且为111kb。可在使用Windows OS的计算机上使用Microsoft Word访问该文件。
背景技术
糖分子包括作为治疗多种疾病和障碍的重要治疗来源的药物。这类药物包括单克隆抗体，其在许多应用中都非常有用。许多糖分子药物需要糖基化才能在人和动物中发挥最佳功效。然而，不同类型的宿主细胞(例如，哺乳动物、植物、昆虫、真菌等)产生不同的糖基化谱。因此，这带来了问题，因为在非哺乳动物宿主细胞中产生的治疗性糖分子上产生的糖基化谱可在用该治疗剂治疗的人或动物患者中引起免疫原性应答。因此，如果非哺乳动物宿主细胞在治疗分子上产生的糖基化谱与哺乳动物细胞产生的糖基化谱相匹配，则是有利的。此外，许多宿主细胞系统产生具有硫酸化聚糖部分的多肽，这对于在人或动物中使用的一些糖蛋白或糖肽治疗剂而言是不期望的。
治疗性糖分子通常在酵母和真菌中产生。虽然已对这些细胞类型进行了一些工程改造以使得这些生物体产生更类似哺乳动物的糖基化谱，但这些生物体生长缓慢。虽然可获得生长更快的宿主细胞系统，但这些宿主细胞系统产生硫酸化聚糖，这并不总是期望的，因为一些糖分子在未硫酸化或低硫酸化形式下是最安全或最有效的。因此，具有快速生长的宿主细胞系统是非常有利的，该宿主细胞系统能够产生具有与哺乳动物细胞产生的糖基化谱相似的N-连接糖基化谱的治疗性糖分子，并且能够产生具有更少硫酸化聚糖或没有硫酸化聚糖的治疗性糖分子。
发明内容
本发明提供含有编码异源糖分子的核酸的重组宿主细胞或生物体，该异源糖分子由该细胞或生物体产生。该糖分子可具有未硫酸化的或具有低硫酸化谱的聚糖。在一个实施方案中，异源糖分子为免疫球蛋白分子。重组宿主细胞具有涉及一种或多种异源寡糖基转移酶(OST)基因的表达的遗传修饰。基因修饰可以是异源OST基因的引入和表达。细胞可有利地产生并任选地分泌异源糖分子，该异源糖分子可具有的糖基化谱不具有硫酸化聚糖，或者具有比由不包含该遗传修饰的对应细胞产生的相同异源糖分子更少的硫酸化聚糖。因此，所产生的糖分子可具有与哺乳动物细胞中产生的糖基化谱更相似的糖基化谱，并因此更安全或更有效地用作人类或动物中的治疗剂。在各种实施方案中，糖分子可为糖蛋白、糖肽或糖脂。
在第一方面，本发明提供用于产生糖分子的破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)的重组细胞，该糖分子的聚糖谱具有低硫酸化。该重组细胞可具有编码异源糖分子的核酸和编码异源寡糖基转移酶的序列。该重组细胞可产生异源糖分子，与由不包含异源寡糖基转移酶的对应细胞产生的相同异源糖分子相比，该异源糖分子具有较少的硫酸化聚糖。在一些实施方案中，该糖分子为糖蛋白或糖肽。重组细胞可任选地在甘露糖基转移酶基因中具有遗传修饰，并且甘露糖基转移酶基因可为alg3。
在一些实施方案中，异源寡糖基转移酶来自原生动物，并且还可具有调控编码异源寡糖基转移酶的序列的原生动物启动子。异源寡糖基转移酶可为单一蛋白酶。在一些实施方案中，寡糖基转移酶(OST)来自锥虫科(Trypanosomatidae)的原生动物，例如锥体虫，并且也可以是来自利什曼原虫属(Leishmania)的生物体的OST。异源OST可以是原生动物OST的Stt3亚基。
在一些实施方案中，异源OST是由选自TbStt3A、TbStt3B、LmStt3D、LbStt3_1和LbStt3_3的基因编码的原生动物酶。在一些实施方案中，原生动物基因处于来自破囊壶菌科的生物体的启动子的控制下。
在各种实施方案中，由本发明的重组细胞产生的异源糖蛋白或糖肽可产生具有少于65％硫酸化聚糖或少于50％硫酸化聚糖的聚糖谱。重组细胞可产生并分泌异源糖蛋白或糖肽分子或其功能部分。该异源糖蛋白或糖肽可为抗体分子或其功能部分。聚糖谱可具有N-聚糖，并且可包括Man3-5GlcNAc2。在一些实施方案中，由细胞产生的异源糖蛋白或糖肽可具有小于60％的S-Man3-5/(S-Man3-5+Man3-5)比率。
在各种实施方案中，该重组细胞可属于破囊壶菌科，并且可来自选自日本壶菌属(Japanochytrium)、椭圆壶菌属(Oblongichytrium)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、橙壶菌属(Aurantiochytrium)和裂殖壶菌属(Schizochytrium)的属。
在各种实施方案中，异源糖蛋白或糖肽可为以下中的任一种：曲妥珠单抗、依库珠单抗、那他珠单抗、西妥昔单抗、奥马珠单抗、优特克单抗、帕尼单抗或阿达木单抗或它们中任一种的功能性片段。
在另一方面，本发明提供了一种组合物，该组合物包含由本文所述的重组细胞产生的异源糖蛋白或糖肽中的任一种。该组合物可在药学上可接受的载体中提供。
在另一方面，本发明提供了产生包括具有低的聚糖硫酸化的糖基化谱的糖分子的方法。该方法可涉及提供破囊壶菌科重组细胞的步骤，该重组细胞具有编码异源糖分子的核酸和编码异源寡糖基转移酶的序列。该重组细胞可产生异源糖分子，与由不包含异源寡糖基转移酶的对应细胞产生的相同异源糖分子相比，该异源糖分子具有较少的硫酸化聚糖。该重组细胞可为本文所述的任何细胞，并且可具有本文所述的任何细胞的任何特征。
上述发明内容不是限制性的，并且根据本发明的以下具体实施方式和权利要求书，本发明的其他特征和优点将显而易见。
附图说明
图1提供了从OST过表达菌株纯化的抗体上的硫酸化(ManS)聚糖与非硫酸化(Man)聚糖的图示说明。分析从过表达指示的OST的菌株纯化的抗体的硫酸化聚糖。针对表达野生型OST(ChStt3)、TbStt3A和LbStt3_3OST的细胞，对以观察到的所有聚糖的百分比表示的硫酸化Man(3-5)GlcNAc2(ManS)的量和非硫酸化Man(3-5)GlcNAc2(Man)的量作图。
图2A至图2E：图2a提供了构建体pCAB056的图谱。图2b提供了构建体pCAB-057的图谱。图2c提供了构建体pCAB-060的图谱。图2d提供了构建体pCAB-061的图谱。图2e提供了构建体pSGI-AM-001的图谱。
图3A至图3C：图3a提供了Man3GlcNAc2的结构的图示(硫酸化未示出)；图3b提供了Man4GlcNAc2聚糖结构的图示；图3c提供了Man5GlcNAc2聚糖结构的图示(硫酸化未示出)。
图4示出了来自各种物种的各种聚糖结构的图示。可以看出，人和动物聚糖结构具有Man3核心结构，而酵母聚糖具有高甘露糖聚糖结构。示出人和动物聚糖具有复杂的聚糖结构。
具体实施方式
本发明提供含有编码异源糖分子的氨基酸序列的核酸分子的重组细胞或生物体。该细胞或生物体还可表达异源寡糖基转移酶(OST)。细胞或生物体产生异源糖分子，与由不表达异源OST并且在相同条件下培养的对应生物体或宿主细胞产生的相同糖分子相比，该异源糖分子具有包含较少硫酸化聚糖的聚糖谱。本发明人意外地发现，异源OST的表达导致产生异源糖分子的重组宿主细胞，该异源糖分子具有显著较少的硫酸化聚糖部分。因此，该发现允许产生具有包括低硫酸化或无硫酸化聚糖的聚糖(或糖基化)谱的糖分子。因此，糖分子可以更安全地用作治疗分子，并且/或者不太可能在人或其他哺乳动物中引发免疫应答。糖分子在相关治疗应用中也可具有更高的功效。在本文所公开的任何实施方案中，糖分子可为糖蛋白、糖肽或糖脂。
在各种实施方案中，相对于硫酸化Man(3-5)聚糖和非硫酸化Man(3-5)聚糖的总量，由本发明的重组生物体或宿主细胞产生的异源糖分子的低硫酸化谱是具有70％或更少、或65％或更少、或60％或更少、或55％或更少、或50％或更少、或40％或更少、或30％或更少、或25％或更少、或15％或更少、或10％或更少的硫酸化Man(3-5)聚糖的聚糖谱，该聚糖谱可表达为硫酸化Man(3-5)聚糖(图1)。在另一个实施方案中，异源糖分子的低硫酸化谱可表达为具有以下硫酸化Man(3-5)与总的硫酸化和未硫酸化的Man(3-5)(其可表达为S-Man(3-5)/(S-Man(3-5)+Man(3-5)))的比率的聚糖谱：0.65或更小、或0.60或更小、或0.55或更小、或0.50或更小、或0.45或更小、或0.40或更小、或0.35或更小、或0.30或更小、或0.25或更小、或0.20或更小、或0.15或更小、或0.10或更小。在另一个实施方案中，与不表达异源OST的对应细胞相比，异源糖分子的低硫酸化(聚糖)谱可为具有20％或更多、或25％或更多、或30％或更多、或32％或更多、或35％或更多、或40％或更多、或45％或更多、或50％或更多、或55％或更多、或60％或更多的未硫酸化Man(3-5)聚糖(相对于总硫酸化和未硫酸化的Man(3-5)聚糖)的聚糖谱。在低硫酸化谱中的任一种中，聚糖可为甘露糖(3-5)。本文实施方案中的任一个中，硫酸化谱可描述与N-聚糖谱、O-聚糖谱、C-连接的聚糖谱、糖分子的磷酸糖基化谱或它们的任何组合或子组合相关的硫酸化。
由活生物体产生的许多蛋白质、肽和脂质通过糖基化进行修饰。糖蛋白和糖肽是具有共价连接到其多肽链上的碳水化合物基团的蛋白质或肽；糖脂是具有通过糖苷键连接的碳水化合物的脂质分子。在各种实施方案中，糖蛋白或糖肽可具有至少一个连接到多肽链的碳水化合物部分，或者至少两个或两个至三个或两个至四个或两个至五个或至少三个或至少四个或至少五个或至少六个或至少七个或至少八个或至少九个或至少十个连接到糖蛋白、糖肽或糖脂的至少一个多肽链的碳水化合物部分。
聚糖谱可指示分子中存在的聚糖的类型、它们的组成和结构，包括谱中硫酸化或未硫酸化的聚糖的百分比或量。聚糖谱可仅包括Man(3-5)聚糖，其为具有3至5个甘露糖部分的那些聚糖。图3a描绘了Man3聚糖，并且图3b描绘了Man5聚糖作为示例。Man(3-5)聚糖还可包含GlcNAc2茎，并且可具有或不具有连接的岩藻糖或其他糖部分。糖分子的聚糖谱可出于以下各种原因而为重要的，诸如细胞识别信号，防止针对蛋白质或肽的免疫应答，蛋白质折叠，以及稳定性。可发生糖基化以产生以下中的任一者或多者：N-连接的聚糖、O-连接的聚糖、C-连接的聚糖或磷酸糖基化、或它们的任何组合或子组合。N-连接糖基化是指糖分子(或称为聚糖的低聚糖)在蛋白质或肽的序列中与氮原子(例如，天冬酰胺的酰胺氮)连接。N-连接的聚糖(或N-聚糖)谱是指存在于特定糖分子上或者糖蛋白组、糖肽组或糖脂组上的此类氮原子处的特定糖基化(单糖或寡糖)模式。糖分子的N-聚糖谱可以是与特定糖分子相关联的N-连接的单糖或低聚糖的数量和结构的描述。在一些实施方案中，N-聚糖谱可测量为由宿主细胞产生的糖分子上的硫酸化甘露糖部分相对于未硫酸化甘露糖部分的百分比。N-聚糖谱可具有描述所述甘露糖部分的硫酸化的百分比或量的硫酸化特征。因此，聚糖谱可具有低硫酸化谱，表明聚糖的硫酸化水平较低，如本文所述。O-连接的糖基化是指糖分子与蛋白质或肽的氨基酸(例如，丝氨酸或苏氨酸)中的氧原子的连接。当甘露糖与色氨酸的吲哚环结合时，可发生C-连接的糖基化。当聚糖经由磷酸二酯键与丝氨酸结合时，发生磷酸糖基化。
N-聚糖和/或O-聚糖也可被硫酸化(或未被硫酸化)，意指它们包含硫酸根部分(例如，SO3)，并且硫酸化的量、程度或位置可为N-聚糖或O-聚糖谱的一部分。对于人和动物中的某些类型的治疗分子功能，N-聚糖谱不具有硫酸化的N-聚糖。因此，可能期望宿主细胞中产生的某些治疗性糖蛋白和糖肽分子不含有硫酸化聚糖或含有较少的硫酸化聚糖，或具有低硫酸化谱。单克隆抗体和其他免疫球蛋白仅是本发明可应用的许多类别的糖蛋白中的两种。在一些实施方案中，N-聚糖谱的N-连接聚糖可连接到天冬酰胺侧链的氮原子，该天冬酰胺侧链可作为糖分子的共有肽序列Asn-X-Thr/Ser的一部分存在，其中X为除脯氨酸之外的任何氨基酸，并且Thr/Ser为苏氨酸或丝氨酸。
宿主细胞
在一些实施方案中，本发明的重组细胞或生物体来自网粘菌纲(Labyrinthulomycetes)。网粘菌纲是单细胞海洋分解者，通常消耗非活体的植物、藻类和动物物质。它们无处不在，数量丰富，尤其是在死亡的植被上，以及在盐沼和红树林沼泽中。虽然破囊壶菌(Thraustochytrid)和网粘菌(Labyrinthulid)的分类多年来一直在演变，但出于本申请的目的，“网粘菌纲”是包括破囊壶菌目和网粘菌目微生物的综合术语。破囊壶菌目或网粘菌目的生物体在本发明中是有用的，并且包括(但不限于)阿尔托尼氏壶菌属(Althornia)、不动壶菌属(Aplanochytrium)、橙壶菌属(Aurantiochytrium)、葡萄串状壶菌属(Botryochytrium)、珊瑚壶菌属(Corallochytrium)、Diplophryids、两孔壳虫属(Diplophrys)、玲眼蝶属(Elina)、日本壶菌属、网粘菌属(Labyrinthula)、类网粘菌属(Labryinthuloides)、椭圆壶菌属、多孢堆菌属(Pyrhosorus)、帕里蒂氏壶菌属(Parietichytrium)、萌芦状壶菌属(Sicyoidochytrium)、裂殖壶菌属、破囊壶菌属和吾肯氏壶菌属(Ulkenia)。本发明的重组宿主细胞也可以是网粘菌目(Labyrinthulales)的成员。
在一些实施方案中，本发明的宿主细胞或生物体可以是网粘菌纲和分类学的破囊壶菌科的生物体，破囊壶菌科包括但不限于以下中的任一种或多种：破囊壶菌属、日本壶菌属、橙壶菌属、不动壶菌属、萌芦状壶菌属、葡萄串状壶菌属、帕里蒂氏壶菌属、椭圆壶菌属、裂殖壶菌属、吾肯氏壶菌属和玲眼蝶属或包括它们的组合或子组合的任何组，其公开时如在本文中以所有可能的组合充分阐述。属内的本发明的合适微生物物种的示例包括但不限于：任何裂殖壶菌属物种，包括但不限于：聚合裂殖壶菌(Schizochytrium aggregatum)、裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)、微小裂殖壶菌(Schizochytrium mintum)、红树林裂殖壶菌(Schizochytrium mangrovei)、Schizochytrium marinum、Schizochytriumoctosporum、和任何橙壶菌属物种(Aurantiochytrium sp.)、任何破囊壶菌属(Thraustochytrium)物种(包括以前的吾肯氏壶菌属(Ulkenia)物种，诸如威瑟吾肯氏壶菌(U.visurgensis)、阿姆氏吾肯氏壶菌(U.amoeboida)、萨迦氏吾肯氏壶菌(U.Sarkariana)、普氏吾肯氏壶菌(U.profunda)、雷迪安吾肯氏壶菌(U.radiata)、米钮塔吾肯氏壶菌(U.Minuta)和吾肯氏壶菌物种BP-5601)，并且包括纹状破囊壶菌(Thraustochytriumstriatum)、金黄色破囊壶菌(Thraustochytrium aureum)、蔷薇色破囊壶菌(Thraustochytrium roseum)；以及任何日本壶菌属物种。可特别适用于本文公开的本发明的破囊壶菌目(Thraustochytriales)菌株包括但不限于：裂殖壶菌属物种(S31)(ATCC20888)；裂殖壶菌属物种(S8)(ATCC 20889)；裂殖壶菌属物种(LC-RM)(ATCC 18915)；裂殖壶菌属物种(SR21)；聚合裂殖壶菌(ATCC 28209)；裂殖壶菌(IFO 32693)；破囊壶菌属物种(23B ATCC20891)；纹状破囊壶菌(ATCC 24473)；金黄色破囊壶菌(ATCC34304)；蔷薇色破囊壶菌(ATCC 28210)；和日本壶菌属物种(LI ATCC28207)。在一些实施方案中，本发明的重组宿主细胞可选自橙壶菌属或裂殖壶菌属或破囊壶菌属，或者所有三组一起或它们的任何组合或子组合。本发明的重组宿主细胞可选自上述分类学组的任何组合，它们据此以每种可能的组合或子组合公开，如同在本文中完整阐述一样。
本发明的细胞或生物体可为重组的，其为含有重组核酸的细胞或生物体。重组核酸可编码在重组细胞中表达并任选地从重组细胞分泌的功能性糖分子。如本文所用，术语“重组”核酸分子是指已通过人为干预被改变的核酸分子。作为非限制性示例，cDNA是重组DNA分子，也可以是通过体外聚合酶反应产生的任何核酸分子，或者接头已连接到其上的任何核酸分子，或者已整合到载体(诸如克隆载体或表达载体)中的任何核酸分子。作为非限制性示例，重组核酸分子可包括以下中的任一种：1)已例如使用化学或酶技术(例如，通过使用化学核酸合成，或通过使用酶进行核酸分子的复制、聚合、外切酶消化、核酸内切酶消化、连接、逆转录、转录、碱基修饰(包括例如甲基化)或重组(包括同源和位点特异性重组))在体外合成或修饰的核酸分子；2)包括在自然界中不结合的结合的核苷酸序列，3)已使用分子克隆技术进行了工程改造，使得其相对于天然存在的核酸分子序列缺少一个或多个核苷酸，和/或4)已使用分子克隆技术进行操纵，使得其关于天然存在的核酸序列具有一个或多个序列改变或重排。作为非限制性示例，cDNA是重组DNA分子，也可以是通过体外聚合酶反应产生的任何核酸分子，或者接头已连接到其上的任何核酸分子，或者已整合到载体(诸如克隆载体或表达载体)中的任何核酸分子。重组细胞含有重组核酸。
如本文所用，关于核酸或基因的“外源”表示该核酸或基因已通过人为干预被引入(例如，“转化”)到生物体、微生物或细胞中。通常，这种外源核酸经由重组核酸构建体引入细胞或生物体中。外源核酸可以是从一个物种引入另一物种的序列，即异源核酸。异源核酸也可以是在引入异源核酸的物种中不存在的外源合成序列。外源核酸也可以是与生物体同源的序列(即，核酸序列在该物种中天然存在或编码在宿主物种中天然存在的多肽)，该序列已被分离并随后重新引入该生物体的细胞中。包含同源序列的外源核酸通常可通过与外源核酸连接的非天然序列(例如重组核酸构建体中的侧接同源基因序列的非天然调控序列)的存在而与天然存在的序列区分开。另选地或除此之外，稳定转化的外源核酸可通过其与已整合到的基因组中的序列并置来检测和/或区别于天然基因。此外，如果核酸已被引入所考虑的细胞、生物体或菌株的祖细胞中，则该核酸被认为是外源的。
当应用于生物体时，术语“转基因的”、“转化的”或“重组的”或“工程改造的”或“遗传工程改造的”是指已通过将外源或重组核酸序列引入生物体中或通过操纵天然序列进行操纵的生物体，因此天然序列是重组的(例如，通过序列的突变、缺失、插入、置换和下文所述的其他操纵)。在一些实施方案中，外源或重组核酸可表达异源蛋白质产物。此类操纵的非限制性示例包括基因敲除、靶向突变和基因置换、基因置换、启动子置换、缺失或插入、基因或调控序列中的破坏、以及将转基因引入生物体中。例如，转基因微生物可包括可操作地连接至转基因微生物的内源基因的引入的外源调控序列。重组的或遗传工程改造的生物体也可以是其中已引入了用于基因“敲除”、缺失或破坏的构建体的生物体。此类构建体包括但不限于RNAi构建体、微RNA构建体、shRNA构建体、反义构建体和核酶构建体。还包括基因组已被大范围核酸酶或锌指核酸酶的活性改变的生物体。异源或重组核酸分子可被整合到遗传工程改造的/重组的生物体的基因组中，或者在其他情况下，不整合到重组的/遗传工程改造的生物体的基因组中，或者整合到载体或其他核酸构建体上。如本文所用，“重组微生物”或“重组宿主细胞”包括本公开的重组微生物的子代或衍生物。由于突变或环境影响可在后代中出现某些修饰，因此这种子代或衍生物实际上可与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语的范围内。
OST的表达
在各种实施方案中，本发明的宿主细胞或生物体包含编码异源糖分子的多肽序列的核酸序列并在功能上表达该核酸序列，并且在功能上表达编码一种或多种异源寡糖基转移酶(OST)的核酸序列。异源糖分子可由外源核酸分子(例如，质粒或人工染色体)表达，或者可整合进宿主细胞基因组中并由其表达。OST可在与异源糖分子的序列相同的外源核酸分子上提供，或在单独的外源核酸分子上提供。编码一个或多个OST的序列也可插入宿主细胞的基因组中。编码这些OST的序列还可包含本文所述的用于表达OST的合适启动子(以及任选的终止子)，或者可插入内源启动子的后面。OST可从上述任何位点表达，或从其提供的任何地方表达。在一些实施方案中，因此OST可被插入(例如，插入到宿主细胞的基因组中)或者可在编码一种或多种异源OST酶的一种或多种外源核酸(例如，质粒)上转化到宿主细胞中。宿主细胞可在功能上表达、产生并任选地分泌所编码的异源糖分子，与由不表达异源OST的对应宿主细胞或生物体产生的相同糖分子相比，所述异源糖分子可具有较少的硫酸化聚糖部分，或者所述异源糖分子可以其他方式具有本文所述的低硫酸化谱。宿主细胞还可表达并产生异源OST。在一些实施方案中，OST可插入宿主细胞的基因组上的启动子的后面，并且启动子可为调控异源OST的内源启动子。启动子另外可插入在基因组上将由内源启动子表达的位置处。在一个实施方案中，OST基因可插入在内源肌动蛋白启动子(SEQ IDNO:41)的后面，但借助本公开的普通技术人员将认识到也将起作用的许多其他启动子。
异源糖分子上的聚糖部分可为N-聚糖部分或O-聚糖部分或两者。因此，在一些实施方案中，相对于由不表达OST的对应细胞在相同条件下产生的相同异源糖分子，异源OST的表达导致产生具有较少硫酸化N-聚糖部分或具有较少硫酸化O-聚糖部分(或两者)的异源糖分子，或以其他方式具有低硫酸化谱。在一些实施方案中，糖分子硫酸化被消除，或被还原成零硫酸化N-聚糖或硫酸化O-聚糖部分，或两者兼有。
遗传修饰可表示缺失、突变、破坏、插入、失活、衰减、重排、倒置中的任一种或多种，该遗传修饰导致经修饰基因或调控序列发生物理变化，并减少或消除一种或多种基因产物的表达。在各种实施方案中，遗传修饰可为缺失。天然存在于生物体中的未修饰核酸序列表示天然或野生型序列。在各种实施方案中，遗传修饰可为缺失。如本文所用，缺失可意指核酸序列的至少一部分丢失，但缺失也可通过例如插入另一序列(例如，选择标记)或缺失和插入的组合以破坏基因来实现，但缺失也可通过其他遗传修饰来进行。缺失可意指基因不再产生其功能基因产物，或者在各种实施方案中，相对于在标准培养条件下无缺失的产生，基因产生小于20％或小于10％或小于5％或小于1％的其功能基因产物。术语缺失盒和破坏盒可互换使用。
在一些实施方案中，N-聚糖可由于遗传修饰而具有减少的硫酸化、低硫酸化或不具有硫酸化，该N-聚糖可包括但不限于Man3GlcNAc2、Man4GlcNAc2和Man5GlcNAc2，或它们的任何组合或子组合，它们公开时如在本文中以所有可能的组合充分阐述。这些聚糖可存在于如本文所公开的糖分子上。
寡糖基转移酶
寡糖基转移酶(OST)是多聚体、膜结合的蛋白质复合物，其将糖寡糖转移到新生蛋白质，或从脂质连接的寡糖(LLO)转移到靶蛋白质或肽。在一些实施方案中，糖Glc3Man9GlcNAc2连接到序列Asn-X-Ser或Asn-X-Thr中的Asn残基，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。OST可由一个催化活性亚基(STT3)和若干个非催化亚基组成，这些亚基通过调控复合物的底物特异性、稳定性或组装而有助于N-糖基化。在一些生物体中可存在酶的若干同种型，并且一些生物体可缺少一些OST亚基。OST催化N-连接糖基化途径中的反应步骤。在各种实施方案中，可用于本发明的OST可为原生动物OST，该原生动物OST可为单蛋白OST。任何OST可在本发明的生物体中过表达。过表达可意指基因相对于正常表达以增加的量表达。在一个实施方案中，过表达通过将序列置于强启动子之后发生，该强启动子可以是外源的或内源的。可在本发明的宿主细胞或生物体中过表达的内源OST包括但不限于来自破囊壶菌科的生物体的ChStt3(SEQ ID NO:27)。原生动物OST的示例包括但不限于来自锥虫科的原生动物的那些。这些原生动物可为血鞭毛虫(hemoflagellate)，并且包括短膜虫属(Crithidia)、匐滴虫属(Herpetomonas)、丝滴虫属(Leptomonas)、芽短膜虫属(Blastocrithidia)、植滴虫属(Phytomonas)、孢子虫纲内锥属(Endotrypanum)、利什曼原虫属和锥体虫属(Trypanosoma)物种。可用于本发明的这些属的物种可为单细胞寄生鞭毛原生动物。可用于本发明的原生动物OST可衍生自诸如以下的物种：例如，巴西利什曼原虫(Leishmania brasiliensis)、硕大利什曼原虫(Leishmania master)、婴儿利什曼原虫(Leishmania infantum)或布氏锥虫(Trypanosoma brucei)(例如，得自布氏锥虫的Stt3A)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)。可用于本发明的原生动物OST的具体示例包括但不限于TbStt3A(SEQ ID NO:28)、TbStt3B(SEQ ID NO:29)、TbStt3C(SEQ ID NO:30)、LbStt3_1(SEQ ID NO:32)、LbStt3_3(SEQ ID NO:33)、LmStt3A、LmStt3B、LmStt3C和LmStt3D(SEQ ID NO:31)、LiStt3_1、LiStt3_2和LiStt3_3。在一些实施方案中，OST可以是作为Pfam家族PF02516和/或Pfam宗族CL0111的成员的那些。在其他实施方案中，OST是PPM超家族273的成员，或者是被分类为家族3rce的成员的膜蛋白取向(OPM)的成员，或者在被分类为家族GT66的成员的碳水化合物-活性酶数据库(CAZy)中。因此，OST可来源于原生动物，这意味着它天然存在于原生动物中，或者它与原生动物中天然存在的OST具有至少90％的序列同一性。
异源糖分子
糖蛋白和糖肽具有一个或多个连接到其多肽链上的碳水化合物基团。在一些实施方案中，由本发明的细胞或生物体产生的异源糖分子可以是治疗分子，诸如糖蛋白、糖肽或糖脂治疗分子，例如酶、Ig-Fc-融合蛋白或抗体。抗体可以是功能性抗体或抗体的功能性片段。在各种实施方案中，抗体可以是阿仑单抗、地诺单抗、依库珠单抗、那他珠单抗、西妥昔单抗、奥马珠单抗、优特克单抗、帕尼单抗、曲妥珠单抗、贝利单抗、帕利珠单抗、那他珠单抗、阿昔单抗、巴利昔单抗、达利珠单抗、阿达木单抗(抗TNF-α抗体)、托西莫单抗-I131、莫罗单抗-CD3、卡那单抗、英夫利昔单抗、达克珠单抗、托珠单抗、胸腺细胞球蛋白、抗胸腺细胞球蛋白或它们中任一者的功能性片段。糖蛋白也可以是阿法西普、利纳西普、依那西普、贝拉西普、阿巴西普、促卵泡素-β或它们中任一者的功能性片段。抗体也可以是任何抗TNF-α抗体或抗HER2抗体，或它们中任一者的功能性片段。糖蛋白可为酶，例如艾杜硫酶、阿替普酶、拉罗尼酶、伊米苷酶、阿糖苷酶-β、透明质酸酶、阿葡糖苷酶-α、GalNAc 4-硫酸酯酶、胰脂肪酶或脱氧核糖核酸酶。该蛋白质可为抗体和/或治疗性蛋白质，并且也可为单克隆抗体。功能性抗体(或免疫球蛋白)或抗体的片段与靶表位结合，从而产生应答，例如生物学应答或作用，或终止应答或作用。该应答可与对天然抗体的应答相同，但该应答也可模拟或破坏与配体-受体相互作用相关联的天然生物效应。
当蛋白质为抗体的功能性片段时，其可包含重链可变区的至少一部分，或者可包含抗体的整个抗原识别单元，但仍然包含完全抗体的足够部分，以执行与完全抗体的性质和亲和力相似或相同的抗原结合特性。在各种实施方案中，糖蛋白、糖肽、糖脂、抗体或免疫球蛋白的功能性片段可包含至少10％或至少20％或至少30％或至少50％或至少60％或至少70％或至少80％或至少90％或至少95％的天然序列，并且任选地任何功能性片段还可与天然序列的指示部分具有至少70％或至少80％或至少90％或至少95％的序列同一性；例如，功能性片段可包含至少85％的天然抗体序列，并且具有与天然抗体序列的该85％部分至少90％的序列同一性。本文所公开的任何重组细胞可包含编码本文所述的功能性和/或组装的抗体分子或其功能性片段的核酸。
在各种实施方案中，糖分子可为激素，例如人生长激素、促黄体生成激素、促甲状腺素-α、干扰素、达贝泊汀、促红细胞生成素、依泊汀-α、依泊汀-β、FS因子VIII、因子VIIa、因子IX、抗凝血酶/ATII细胞因子、凝血因子、胰岛素、促红细胞生成素(EPO)、胰高血糖素、葡萄糖依赖性促胰岛素肽(GIP)、胆囊收缩素B、脑啡肽，以及胰高血糖素样肽(GLP-2)PYY、瘦蛋白和抗微生物肽。在任一实施方案中，糖分子可被编码在细胞外源的DNA上，例如质粒、人工染色体、其他核外DNA或另一类型的载体DNA。它也可存在于插入细胞基因组中的外源序列上。
如本文所用，关于核酸或多肽序列的术语“同一性百分比”或“同源性”定义为在将序列比对最大同一性百分比并引入空位(如有必要)以实现最大同源性百分比后，候选序列中与已知多肽相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比。N端或C端插入或缺失不应理解为影响同源性，并且多肽序列中小于约30个、小于约20个或小于约10个氨基酸残基的内部缺失和/或插入不应理解为影响同源性。核苷酸或氨基酸序列水平上的同源性或同一性可通过BLAST(基本局部比对搜索工具)分析并使用程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx所采用的算法来确定(Altschul(1997)，Nucleic Acids Res.，第25卷，第3389-3402页，以及Karlin(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第87卷，第2264-2268页)，其被定制用于序列相似性搜索。BLAST程序所用的方法是，首先考虑查询序列和数据库序列之间具有和不具有空位的相似段，然后评估所有已鉴定匹配的统计显著性，最后只总结那些满足预先选择的显著性阈值的匹配。对于序列数据库的相似性搜索中的基本问题的讨论，参见Altschul(1994)，Nature Genetics，第6卷，第119-129页。用于直方图、描述、比对、期望值(即，用于报告与数据库序列的匹配的统计显著性阈值)、截止值、矩阵和过滤器(低复杂度)的搜索参数可处于默认设置。由blastp、blastx、tblastn和tblastx使用的默认评分矩阵为BLOSUM62矩阵(Henikoff(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第89卷，第10915-10919页)，推荐用于长度超过85个(核苷酸碱基或氨基酸)的查询序列。
对于设计用于比较核苷酸序列的blastn，评分矩阵由M(即，一对匹配残基的奖励分数)与N(即，错配残基的惩罚分数)的比率设定，其中M和N的默认值可分别为+5和-4。可如下调节四个blastn参数：Q＝10(空位形成罚分)；R＝10(空位延伸罚分)；wink＝1(沿着查询在每隔wink个位置处生成字词命中)；并且gapw＝16(设置在其中生成空位比对的窗口宽度)。用于比较氨基酸序列的等效Blastp参数设置可为：Q＝9；R＝2；wink＝1；并且gapw＝32。在GCG软件包10.0版中提供的
Figure BDA0002752444700000141
序列间比较可使用DNA参数GAP＝50(空位形成罚分)和LEN＝3(空位延伸罚分)，并且蛋白质比较中的等效设置可为GAP＝8和LEN＝2。
当提及本公开中的异源糖分子或OST的核酸或多肽序列时，包括在本公开中的是被认为源自初始序列的序列。因此，所公开的序列包括核酸和多肽序列，这些序列与SEQ IDNo:1-41中的任一者的全长多肽或核酸序列及其片段具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％的序列同一性、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或至少85％的序列同一性，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或约100％、或85％-99％、或85％-95％、或90％-99％、或95％-99％、或97％-99％、或98％-99％的序列同一性。序列片段可包括如下序列，这些序列具有整个蛋白质的至少20、或至少30、至少50、至少75、至少100、至少125、150或更多、或20-40或20-50或30-50或30-75或30-100个氨基酸残基的连续序列，或者至少100或至少200或至少300或至少400或至少500或至少600或至少700或至少800或至少900或至少1000或100-200或100-500或100-1000或500-1000或这些量中的任一者，但少于500或少于1000或少于2000个SEQ ID No:1-41中的任一者的连续核苷酸。本发明还公开了此类序列的变体，例如，其中至少一个氨基酸残基已在所公开的含有插入和置换的序列的N端和/或C端和/或内部插入。除此之外或另选地，设想的变体可包括含有通过例如同源重组或定点或PCR诱变进行的预定突变的那些变体，以及其他物种的对应多肽或核酸，包括但不限于本文所述的那些变体，含有插入和置换的多肽或核酸家族的等位基因或其他天然存在的变体；和/或衍生物，其中多肽已通过置换、化学、酶促或其他适当的手段用含有插入和置换的天然存在的氨基酸之外的部分(例如，可检测的部分诸如酶)共价修饰。
启动子和终止子
启动子和终止子可用于本发明的表达盒或其他核酸构建体上，并且启动子(和终止子)可为任何合适的启动子和/或终止子。本文所公开的启动子和/或终止子可以任何组合或子组合使用。例如，本文所述的任何启动子(或可从宿主细胞或生物体分离或在宿主细胞或生物体中起作用的其他启动子)或来源于此类序列的任何启动子可与本文所述的任何终止子或在重组细胞或生物体中起作用的或来源于此类序列的其他终止子组合使用。例如，启动子和终止子序列可来源于生物体，包括但不限于长短鞭毛体(包括网粘菌纲)、破囊壶菌科的生物体、酵母或其他真菌、微藻类、藻类和其他真核生物体。在各种实施方案中，启动子和/或终止子是在细胞或生物体中可操作的任一种，该细胞或生物体是网粘菌纲细胞，包括其任何科(例如，破囊壶菌科)或属。任何构建体还可视情况含有一个或多个选择标记。大量的启动子和终止子可与本发明的宿主细胞一起使用。本文所述的那些是示例，并且借助本公开的普通技术人员将认识到或能够鉴定可用于本发明的其他启动子。可用于本发明的启动子的示例包括α微管蛋白启动子，肌动蛋白启动子，TEF、TEF1、hsp60、hsp60-788启动子，hsp70、RPL11、Tsp-749启动子，Tubu738启动子，Tubu-997启动子，来自聚酮合酶系统的启动子，以及脂肪酸去饱和酶启动子。可用的终止子的示例包括pgkl、CYCl和eno2。启动子和终止子可以任何有利的组合使用，并且公开了这些启动子和终止子的所有可能的组合，如同在本文中完整阐述一样。
在一些实施方案中，本发明中利用的表达盒包含以下中的任一者或多者：1)一种或多种信号序列；2)一种或多种启动子；3)一种或多种终止子；以及4)编码一种或多种蛋白质的外源序列，所述一种或多种蛋白质可以是异源蛋白质；5)任选地，用于在培养基或一系列媒介上或其他生长条件下筛选的一种或多种选择性标记。表达盒的这些组分可以任何组合存在，并且公开了每个可能的子组合，如同在本文中完整阐述一样。在具体实施方案中，信号序列可以是本文所述的任何信号序列，但也可以是其他信号序列。多种宿主细胞的各种信号序列是本领域已知的，并且其他信号序列可参考本公开进行鉴定并且在所用的宿主细胞中也起作用。在示例性的具体实施方案中，启动子可以是α-微管蛋白启动子或TEFp。本文所公开的任何启动子可与任何合适的终止子配对，但在具体实施方案中，tub-alpha-p可与pgk1终止子配对。在另一个实施方案中，TEFp启动子可与eno2终止子配对，两种终止子均来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)并且也在网粘菌纲中起作用。选择性标记可为任何合适的一个或多个选择性标记，但在具体实施方案中，其可为nptII或hph。在一个实施方案中，nptII可连接至重链构建体，并且hph可连接至轻链构建体。
本发明还提供核酸构建体，其可为用于进行本文所述的OST基因和/或另一种异源基因的插入的插入盒。核酸构建体可具有编码在网粘菌纲宿主细胞中起作用的本文所述OST基因的序列，均在宿主细胞中起作用的启动子和任选的终止子。核酸构建体也可以是用于在基因中进行突变或其他遗传修饰的突变或修饰盒，该基因可以是本文所述的任何基因(同源或异源)。核酸构建体可通过启动子序列以及任选地在宿主细胞中起作用的终止子序列进行调控。宿主细胞可包含如本文所公开的表达盒以及插入、突变或其他修饰盒，并且也可为可修饰如本文所公开的靶基因中的任一个或多个靶基因的CRISPR/Cas 9盒。构建体或盒还可具有编码与基因具有5'和3'同源臂的序列，该基因在一些实施方案中可为OST。该构建体还可具有选择标记，其在一个实施方案中可为nat，但可使用任何合适的选择标记。
在任一实施方案中，OST或其他基因可过表达。基因的过表达可通过添加基因的额外拷贝来实现，诸如基因的两个或更多个、或三个或更多个、或四个或更多个、或五个或更多个拷贝。对于天然基因，可将更多拷贝添加到基因组中，或对于任何基因，过表达可涉及从质粒或其他核酸构建体表达基因。过表达还可涉及从比天然启动子更强的启动子表达基因(天然或异源)。在一个实施方案中，任何OST基因可利用肌动蛋白启动子(SEQ ID NO:41)过表达。
另外的修饰
在一些实施方案中，本发明的重组细胞或生物体含有对编码甘露糖基转移酶的一个或多个基因的遗传修饰。由于该修饰，细胞产生具有更简化(例如，具有Man3和/或Man4聚糖结构)的N连接聚糖谱的异源糖分子。在一些实施方案中，糖分子具有聚糖谱，与不具有对一种或多种甘露糖基转移酶基因的修饰的对应细胞产生的相同分子相比，该聚糖谱具有至少25％或至少35％或至少40％或至少45％或至少50％或至少55％或至少60％或至少65％或至少70％或至少75％或至少80％或至少85％或至少90％的较少高甘露糖(Man5和更高，参见图3c)N-聚糖结构。图3a-b中示出的Man3和Man4聚糖结构可仅为连接有3-4个甘露糖的GlcNAc2茎。在一些实施方案中，GlcNAc茎可具有附加的连接的糖(例如岩藻糖)或可不具有连接的其它糖。除了连接到GlcNAc2茎之外，Man3和Man4也可不具有其他连接的糖。该糖分子也可具有低硫酸化谱，如本文所述。
具有对一种或多种甘露糖基转移酶基因的遗传修饰的本发明的宿主细胞或生物体可提供具有聚糖谱的异源糖蛋白和糖肽，其中至少10％或至少20％或至少30％或至少40％或至少50％或至少60％或至少70％或至少75％或至少80％或至少85％或至少90％的N-聚糖在一个实施方案中为Man3，在另一个实施方案中为Man4，或在另一个实施方案中为Man3和Man4结构的组合。由细胞或生物体产生的异源糖蛋白或糖肽还可具有聚糖谱，与不具有对至少一个甘露糖基转移酶基因的遗传修饰并且在相同的条件下培养的参考细胞相比，该聚糖谱在一个实施方案中具有至少20％以上、或至少30％以上、或至少40％以上、或至少50％以上、或至少60％以上、或至少70％以上、或至少80％以上、或至少90％以上，或至少2倍以上，或至少3倍以上的Man3，在另一个实施方案中为Man4，或在另一个实施方案中为Man3和Man4的组合。
在一些实施方案中，该遗传修饰对alg3基因中的任一个或多个进行，或者对甘露糖基转移酶基因家族中的任一个或多个基因进行，或者在影响基因表达的调控序列中(例如，在启动子中)，但也可在非调控序列中。该家族的成员包括但不限于alg1、alg2、alg3、alg6、alg8、alg9、alg10、alg11、alg13和alg14。在一个实施方案中，该遗传修饰是缺失或破坏，但可以是任何遗传修饰，其可存在于甘露糖基转移酶基因家族中的任一个或多个基因中，或者以它们的任何组合或子组合形式存在，其公开时如在本文中以所有可能的组合和子组合充分阐述。宿主细胞可以是本文所述的本发明的细胞。因此，所产生的蛋白质避免了与使用具有非人物种的糖基化模式的糖蛋白、糖肽或糖脂相关的许多问题。当与对如本文所述的编码宿主细胞中的OST的一个或多个基因的表达组合时，通过减少或去除N-聚糖结构上的硫酸根部分进一步人源化糖分子来实现进一步的有益效果。
可在本发明中修饰的甘露糖基转移酶基因可包括α-1,2-甘露糖基转移酶、α-1,3-甘露糖基转移酶或α-1,6-甘露糖基转移酶中的任一种或多种。这些基因中的任一种或多种可作为不止一个拷贝存在，并且所述细胞和方法可具有对基因的所有拷贝的遗传修饰。
在一个实施方案中，缺失、破坏或遗传修饰针对编码如下酶的一种或多种alg3基因，该酶催化将α-1,3键中的第一dol-P-Man衍生的甘露糖添加至Man5GlcNAc2-PP-Dol。作为alg3亚家族成员的基因编码α-1,3-甘露糖基转移酶，并且存在于真菌、哺乳动物、酵母、网粘菌纲(例如，破囊壶菌科(包括但不限于裂殖壶菌属、橙壶菌属、破囊壶菌属)和其他网粘菌纲)以及多种其他生物体中。在具体的实施方案中，该修饰是一个或多个alg3基因的缺失或敲除或破坏，这可在破囊壶菌科家族(诸如裂殖壶菌属或橙壶菌属)的宿主细胞中进行。一些细胞含有不止一个alg3基因，并且缺失、敲除或破坏可在alg3基因中的任一个或多个或所有alg3基因中。
本文所述的本发明的宿主细胞具有优于其他细胞类型的重要优点。本发明的宿主细胞或生物体仅需要对一种或多种alg3基因进行缺失或破坏以产生异源糖分子，与没有对一种或多种alg3基因进行遗传修饰并且在相同的条件下培养的对应细胞产生的相同糖分子相比，该异源糖分子具有较少的高甘露糖结构和更多的寡甘露糖结构(Man3和/或Man4)。因此，本文所述的网粘菌纲宿主细胞仅需要甘露糖基转移酶基因的单个缺失以产生具有N-连接聚糖谱的异源糖蛋白或糖肽，该N-连接聚糖谱具有高的寡甘露糖聚糖结构，这意味着细胞产生的异源糖蛋白或糖肽上至少10％、或至少20％，或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％的N-聚糖具有Man3和/或Man4聚糖结构。类似地，本发明的宿主细胞或生物体产生具有聚糖谱的异源糖分子，与不包含遗传修饰的对应细胞(即参考细胞)产生的糖蛋白或糖肽相比，该聚糖谱具有至少30％以上、或至少40％以上、或至少50％以上、或至少60％以上、或至少70％以上、或至少75％以上、或至少80％以上、或至少85％以上、或至少90％以上的Man3和/或Man4聚糖结构。因此，本发明允许通过选择具有产生Man3和/或Man4(或寡甘露糖结构)的更大能力的宿主，以更少的努力更有效地产生这些结构。
因此，在任一实施方案中，本发明的宿主细胞或生物体包含最少的遗传修饰或遗传操纵。在任一实施方案中，本发明的宿主细胞或生物体不包含α-1,6-甘露糖基转移酶的缺失，或仅包含未过表达或遗传修饰的野生型α-1,6-甘露糖基转移酶。这些细胞不需要并且可不存在蛋白质甘露糖基转移酶基因的遗传修饰(例如，缺失或破坏)，在异源糖分子产生的任何点处不需要Pmtp抑制剂的存在，并且不需要存在或使用α-1,2-甘露糖苷酶或任何外源甘露糖苷酶来减少由细胞产生的异源糖分子上的甘露糖部分；并且不需要或没有对任何β-甘露糖基转移酶基因的遗传修饰(例如，BMT1、BMT2、BMT3或BMT4的缺失或破坏)。
在任一实施方案中，本发明的宿主细胞或生物体可仅含有编码甘露糖基转移酶的基因的单个遗传修饰。在任一实施方案中，单个甘露糖基转移酶基因修饰可针对alg3基因。在任一实施方案中，除alg3外的所有甘露糖基转移酶都可从编码该酶并存在于基因组上的野生型基因表达，例如宿主细胞或者生物体可表达野生型alg11基因。在另一个实施方案中，宿主细胞可对alg3和alg9和/或alg12具有遗传修饰，但对任何其他甘露糖基转移酶基因没有其他遗传修饰。
在任一实施方案中，细胞也可不包含任何异源酶。本发明的宿主细胞或生物体可不含有异源翻转酶，和/或可不含有异源甘露糖苷酶和/或不含有过表达的同源或野生型甘露糖苷酶，并且另外可不含有异源糖脂易位蛋白，示例包括但不限于Rft1和/或Rft1p。另外，本发明的宿主细胞或生物体的任何实施方案可不含有野生型或外源翻转酶或野生型或外源糖脂易位蛋白的过表达。宿主细胞也不具有或不需要ATT1(获得性耐热性1)基因的缺失或破坏；并且不具有或不需要OCH1(外链)基因的缺失或破坏；并且不具有或不需要骨肉瘤基因(例如OS-9)的缺失或破坏。对于所有这些基因，宿主细胞可具有天然的野生型基因。宿主细胞也可不包含任何外源或重组的GnTI或GnTII基因。宿主细胞也可不具有任何突变以降低或消除内源蛋白酶活性。在一些实施方案中，本发明的宿主细胞可产生在聚糖中不含木糖，或者至少在Man3或Man4结构中不含木糖的N-聚糖和/或O-聚糖。
在任一实施方案中，宿主细胞或生物体可含有对alg3基因的遗传修饰，并且不含有对任何其他编码甘露糖基转移酶的基因的遗传修饰。由本发明的宿主细胞或生物体产生的糖分子可以是糖蛋白、糖肽或糖脂。
在一些实施方案中，宿主细胞或生物体在alg3中含有遗传修饰，并且除了alg3外，还可含有从基因组表达的所有野生型甘露糖基转移酶基因，并且可不含有甘露糖基转移酶基因的其他表达，即也可不含有来自质粒或其他核酸构建体的甘露糖基转移酶的任何表达。
额外的修饰和信息可见于2017年10月31日提交的美国申请序列号15/799,785和2018年4月30日提交的美国申请序列号15/967,202，这两份申请据此全文以引用方式并入，包括所有表格、附图和权利要求书。
方法
本发明还提供在本文所述的宿主细胞中产生具有聚糖谱的糖分子的方法，该聚糖谱具有如本文所述的N-聚糖或O-聚糖或两者的低硫酸化。该方法可涉及以下中的任一个或多个步骤：用载体(例如，表达载体)或编码用于从载体或从整合到细胞染色体中的位点表达的异源糖分子的其他外源核酸转化宿主细胞；任选地，用载体(例如，表达载体)或编码异源OST的其他外源核酸转化宿主细胞以从载体表达或整合到细胞基因组中以用于表达的步骤，或对一种或多种天然OST基因进行遗传修饰的步骤；或在编码内源OST的序列后面插入本文所述的启动子的步骤；培养细胞；以及收获具有聚糖谱的异源糖分子，该聚糖谱具有如本文所述的低硫酸化。任选地，该方法还可具有对如本文所述的一种或多种甘露糖基转移酶基因进行缺失、破坏或其他遗传修饰的步骤。如上所述，代替执行这些步骤，可执行获得具有所述特征的宿主细胞的步骤。
方法中的任一种可任选地包括在宿主细胞中缺失或破坏本文所述的一种或多种甘露糖基转移酶基因的步骤，该甘露糖基转移酶基因可为alg3基因。异源OST基因可为原生动物OST。糖分子可为免疫球蛋白、抗体或本文所述的任何异源糖分子。
在一个实施方案中，方法中的任一种还可涉及用表达盒、突变盒或修饰盒转化宿主细胞，从而用如本文所公开的异源OST转化宿主细胞(或使天然OST突变)，表达异源OST，对宿主细胞中的甘露糖基转移酶基因进行遗传修饰(例如缺失或破坏)，培养该细胞，并收获具有如本文所述的低硫酸化聚糖谱的糖分子。
组合物
本发明还提供包含由本文所述的重组细胞或生物体产生的糖分子的组合物，其中糖分子具有聚糖谱，该聚糖谱不具有硫酸化聚糖或具有低硫酸化谱，如本文所述；i.即，相对于非硫酸化聚糖，糖分子具有70％或更少、或65％或更少、或60％或更少、或55％或更少、或50％或更少、或45％或更少、或40％或更少、或35％或更少、或30％或更少、或25％或更少、或15％或更少、或10％或更少的硫酸化聚糖。在另一个实施方案中，该糖分子具有聚糖谱，该聚糖谱具有0.65或更小、或0.50或更小、或0.40或更小、或0.30或更小、或0.25或更小、或0.15或更小、或0.10或更小的硫酸化Man(3-5)与总的硫酸化和未硫酸化Man(3-5)(或者S-Man(3-5)/S-Man(3-5)+Man(3-5))的比率。
聚糖谱可以是N-聚糖谱、O-聚糖谱或两者。组合物可由本文所述的重组网粘菌纲细胞或任一种生物体产生，并来源于本文所述的重组网粘菌纲细胞或任一种生物体。来源于细胞意指该糖分子由细胞合成并任选地被收获。在一些实施方案中，整个糖分子由细胞合成，包括聚糖部分。如本文所述，产生糖分子的细胞可包含并表达异源OST，以及任选地在编码甘露糖基转移酶基因的一个或多个基因中的遗传修饰。组合物可以是如本文所述的来源于宿主细胞的任何组合物。
本发明还提供了含有由本文所述的本发明的细胞或生物体产生的治疗性糖分子的组合物。治疗性糖分子可以是在人类或动物患者中用于治疗目的的糖分子。组合物中所含的治疗性糖分子可以是本文所述的任何糖分子，例如本文所述的抗体、免疫球蛋白、单结构域抗体或任何治疗性蛋白质。非限制性示例包括那他珠单抗和曲妥珠单抗(SEQ ID No:3-4)。治疗性糖分子可在药学上可接受的载体中提供。
糖基化和分析
可进行聚糖分析以确定糖分子上存在的碳水化合物的种类、结构和/或量以及修饰位点。聚糖分析允许确定聚糖的存在和/或其相对量。在各种实施方案中，可存在(例如，当糖蛋白是抗体时)并且可根据本发明硫酸化或未硫酸化的聚糖包括但不限于Man3GlcNAc2、Man4GlcNAc2和Man5GlcNAc2。
普通技术人员理解从糖分子释放聚糖的方法，其可包括酶促释放。酶促释放的一个示例包括使用肽-N-葡糖苷酶F(PNGaseF)或内切糖苷酶H，其通常释放大多数聚糖。PNGaseA可用于释放含有连接到还原末端GlcNAc的α1-3岩藻糖的聚糖。O-聚糖可使用化学方法(例如β-消除)释放。
具有无衍生化的脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱(HPAE-PAD)是本领域普通技术人员已知的用于分离和分析聚糖的方法。在该技术中，基于各种标准(包括大小和结构)分离聚糖，并且可生成聚糖谱。质谱和HPLC是用于分析聚糖和生成聚糖谱的其他技术。
本发明的宿主细胞或生物体产生如本文所公开的具有低硫酸化谱的糖分子，或者与没有该遗传修饰并在相同条件下生长的对应生物体产生的相同产物相比，产生的糖蛋白、糖肽或糖脂具有80％或更少、或75％或更少、或70％或更少、或60％或更少、或55％或更少、或50％或更少、或45％或更少、或40％或更少、或35％或更少、或30％或更少、或25％或更少、或20％或更少、或15％或更少的硫酸化聚糖部分。低硫酸化谱还可意指在本发明的宿主细胞或生物体中产生的糖蛋白或糖肽具有至少1％或至少10％的硫酸化聚糖部分。
生物体
本领域的普通技术人员能够在多个近岸海域栖息地诸如盐沼和红树林沼泽(例如，存在于热带地区)中分离本文所述的网粘菌纲生物体。对于本发明，使用浮游生物拖网(10μm)从得自墨西哥热带地区的红树林泻湖的样本中分离出分类学的破囊壶菌科(橙壶菌属物种)的细胞。将收获的生物体在含有海水、葡萄糖、酵母提取物和蛋白胨的培养基上培养，并在同一媒介上进行标准富集步骤。选择单个菌落分离物，发现该分离物适于产生和分泌蛋白质并用作基础菌株(命名为#6267)。
菌株表
#6267-基础橙壶菌属物种(Aurantiochytrium sp.)菌株
#5942-产生曲妥珠单抗的菌株
#5950/1—产曲妥珠单抗菌株
#6456–产生曲妥珠单抗并携带Cas9
#6669/70-具有alg3缺失的#6456
聚糖测定
有多种方法可用于测定蛋白质或肽的聚糖谱中硫酸化聚糖与未硫酸化聚糖的百分比。释放的N-连接聚糖可通过利用NHS氨基甲酸酯快速标记基团、有效的喹啉荧光团和用于增强质谱电离的高碱性叔胺来测定。NHS氨基甲酸酯水解生成二氧化碳和对应的胺。便利的商用试剂盒可用于实施该方案，诸如购自
Figure BDA0002752444700000231
Corporation的
Figure BDA0002752444700000232
N-聚糖试剂盒。
测定聚糖的一般程序利用以下步骤：用阴离子表面活性剂(
Figure BDA0002752444700000233
SF)进行蛋白质变性；酶促蛋白质去糖基化(PNGase F)；用质谱敏感性衍生化试剂对释放的聚糖氨基基团进行小分子标记，该质谱敏感性衍生化试剂利用也具有强荧光团(例如，
Figure BDA0002752444700000234
)的NHS氨基甲酸酯标记基团；基于固相萃取标记的聚糖清理以除去过量试剂和污染物分子；经由亲水相互作用液相色谱(HILIC)和超高效液相色谱(UHPLC)进行衍生化的聚糖分离；以及通过解读MS数据进行聚糖鉴定并通过整合荧光信号来定量聚糖丰度。
使用
Figure BDA0002752444700000235
1290UHPLC系统以及使用四极杆-飞行时间技术(即，
Figure BDA0002752444700000236
6520QTof质谱仪)联接到LC/MS系统的HILIC色谱通过色谱法纯化N-聚糖，并且用荧光检测器(即，
Figure BDA0002752444700000237
1260infinity II荧光检测器)检测。通过解释QTof准确质量数据来完成从头聚糖鉴定。一旦基于MS数据进行了最终鉴定，则基于其相应荧光信号的手动积分来定量对应于感兴趣分子的峰。
该分析通过色谱法分离了Man3GlcNAc2、Man4GlcNAc2和Man5GlcNAc2的硫酸化形式与未硫酸化形式，其占生物体#0394中产生的曲妥珠单抗上存在的聚糖的80％以上。单独表达的硫酸化Man(3-5)GlcNAc2(ManS)的总量和非硫酸化Man(3-5)GlcNAc2(Man)的总量占观察到的所有聚糖的百分比在图1中以图形形式示出。
实施例
实施例1–表达曲妥珠单抗的alg3缺失菌株(#6670)的构建
构建体pCAB056(图2a)是针对曲妥珠单抗轻链(SEQ ID NO:3)的TEF启动子(SEQID NO:1)驱动表达的壶菌表达盒，其中分泌由信号肽#552(SEQ ID NO:25)介导。该盒携带用于破囊壶菌科生物体中的选择的hph标记。
构建体pCAB057(图2b)是针对曲妥珠单抗轻链的TEF启动子驱动表达的壶菌表达盒，其中分泌由信号肽#579(SEQ ID NO:2)介导。该盒携带用于破囊壶菌科生物体中的选择的hph标记。
构建体pCAB060(图2c)是针对曲妥珠单抗重链(SEQ ID NO:4)的TEF启动子驱动表达的壶菌表达盒，其中分泌由信号肽#552(SEQ ID NO:25)介导。该盒携带用于破囊壶菌科生物体中的选择的nptII标记。
构建体pCAB061(图2d)是针对曲妥珠单抗重链的TEF启动子驱动表达的壶菌表达盒，其中分泌由信号肽#579(SEQ ID NO:2)介导。该盒携带用于破囊壶菌科生物体中的选择的nptII标记。
表达曲妥珠单抗的壶菌菌株通过共转化橙壶菌属物种#6267与已通过AhdI消化线性化的pCAB056、057、060和061产生。对潮霉素B和巴龙霉素均具有抗性的转化体通过ELISA筛选抗体的产生。将每个克隆在24孔板中的3mL FM2(17g/L Instant OceanTM、10g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、20g/L右旋糖)中培养过夜。然后将它们在新鲜的FM2(3mL)中稀释1000倍并温育约24小时。通过离心(2000g×5分钟)沉淀细胞，并通过HC捕获/LC检测夹心ELISA测定上清液中抗体的存在。还针对已通过菌落PCR引入到菌株中的信号肽筛选转化体。
通过ELISA测量前三位产曲妥珠单抗菌株的曲妥珠单抗滴度。结果示于下表中。这些菌株中存在的信号肽也用菌株ID号示出。
表1–曲妥珠单抗滴度
Figure BDA0002752444700000241
实施例2–CAS9表达构建体
构建体pSGI-AM-001(SEQ ID NO:5)是Cas9的表达盒。该盒携带用于在hsp60启动子(SEQ ID NO:6)的控制下组成型表达来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9的序列。该构建体还携带TurboGFP报告基因和ble标记(图2e)。
实施例3–携带CAS9的产曲妥珠单抗菌株(#6456)的构建
通过用AhdI消化线性化的pAM-001盒转化该菌株，将CAS9引入产曲妥珠单抗菌株#5942。通过ELISA检查ZeocinTM抗性克隆的曲妥珠单抗产量。将每个克隆在24孔板中的3mLFM2(17g/L Instant OceanTM、10g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、20g/L右旋糖)中培养过夜。将10μL该培养物用于接种新鲜的FM2(3mL)并温育约24小时。通过离心(2000g×5分钟)沉淀细胞，并通过HC捕获/LC检测夹心ELISA测定上清液中抗体的存在。还使用引物oSGI-JU-1360(SEQ ID NO:7)和oSGI-JU-0459(SEQ ID NO:26)，通过PCR筛选产曲妥珠单抗的转化体中CAS9表达盒的存在。将以与亲本菌株#5942相似的水平产生曲妥珠单抗并且对于CAS9表达盒呈阳性的这些克隆中的一个命名为#6456。
实施例4–alg3缺失盒的构建
用于缺失或破坏alg3的破坏盒是DNA的线性片段，具有从5'到3'的三个部分：1)5'同源臂，2)选择标记和3)3'同源臂。5'同源臂可为存在于靶向缺失的序列的基因组上游的500bp-1000bp的区域。选择标记通常含有编码基因(即，抗生素抗性基因)表达的序列，该基因允许选择成功的转化体。3'同源臂可为存在于靶向缺失的序列的基因组下游的500bp-1000bp的区域。
该实施例描述了橙壶菌属物种中alg3基因的破坏盒的构建。三个翻译ID(SG4EUKT579099、SG4EUKT579102和SG4EUKT561246)(分别为SEQ ID NO:11-13)存在于橙壶菌属物种基础菌株(#6267)的基因组组装中。所有三个序列编码434氨基酸蛋白(甘露糖基转移酶)(SEQ ID NO:8-10)。SG4EUKT579099和SG4EUKT579102在氨基酸水平和核苷酸水平上都是相同的。SG4EUKT561246与其他序列在氨基酸水平和核苷酸水平上具有大于99％的同一性。这种高水平的同一性允许使用Cas9和单个向导RNA(gRNA)序列(SEQ ID NO:14)以及由选择性标记(nat)构成的单个破坏盒(alg3::nat)来靶向所有三个序列，该选择性标记提供对诺尔丝菌素的抗性并且侧接5'和3'alg3同源臂(500bp至约1000bp)。
通过从基础菌株(#6267)基因组DNA扩增5'和3'alg3同源臂来产生alg3::nat破坏盒，同时从携带用于nat的破囊壶菌科表达盒的质粒扩增选择性标记(nat)。使用引物oSGI-JU-0017(SEQ ID NO:17)和oSGI-JU-0001(SEQ ID NO:18)扩增nat标记。使用引物oCAB-0294(SEQ ID NO:19)和oCAB-0295(SEQ ID NO:20)扩增5'同源臂，后者具有与oSGI-JU-017互补的5'延伸。使用引物oCAB-0296(SEQ ID NO:21)和oCAB-0297(SEQ ID NO:22)扩增3'同源臂，前者具有与oSGI-JU-0001互补的5'延伸。也通过使用引物oCAB-0294和pCAB-0297的PCR组装这三个片段。将纯化的PCR产物用于转化。
使用可商购获得的MEGAshortscriptTMT7试剂盒生成gRNA，但将RNA酶抑制剂添加到反应混合物中。通过将寡核苷酸oCAB-0341和oCAB-0342(分别为SEQ ID NO:15-16)一起退火来生成模板。
实施例5–alg3的缺失
用于缺失基因的基因组编辑可通过用靶向基因组中的特定位点的gRNA和使用侧接该位点的同源臂生成的破坏盒转化表达Cas9的宿主菌株来进行。同源臂被设计成从基因组序列缺失数百个碱基。
通过用线性alg3::nat破坏盒和gRNA转化该菌株来进行曲妥珠单抗Cas9克隆#6456中的alg3的缺失。使用引物oCAB-0298和oCAB-0299(分别为SEQ ID NO:23-24)，通过定量PCR(qPCR)筛选诺尔丝菌素抗性菌落中alg3的缺失。鉴定了具有alg3缺失的四个克隆并命名为菌株ID#6667-#6670。
实施例6–抗体制备
将上述菌株#6456和四个alg3缺失克隆在24孔板中培养22小时，通过ELISA测定上清液中的曲妥珠单抗水平。通过用未标记的小鼠抗人IgG捕获抗体来包被板，然后用检测抗体小鼠抗人kappa-HRP温育来确定IgG-ELISA。缺失alg3对抗体滴度没有负面影响。
表2：在alg3缺失克隆的培养物中曲妥珠单抗的滴度
Figure BDA0002752444700000261
Figure BDA0002752444700000271
实施例7–OST在网粘菌纲细胞中的过表达
鉴定了来自若干原生动物的系列OST(Stt3)基因并对其进行密码子优化(表3)以用于在野生型网粘菌纲菌株#6267中的过表达。序列获自数据库诸如
Figure BDA0002752444700000272
数据库或
Figure BDA0002752444700000273
数据库。
表3–OST基因和来自数据库的鉴定参考
Figure BDA0002752444700000274
使用可商购获得的ArchtypeTM优化工具对OST基因进行密码子优化，以在网粘菌纲细胞中表达，并将其克隆在肌动蛋白启动子之后和ENO2终止子之前。构建体还携带bsr标记。通过肌动蛋白启动子序列内的限制性消化将构建体线性化，并转化到#6670中。通过切入启动子序列内，将表达盒的整合靶向内源肌动蛋白启动子序列。通过菌落PCR在盒和外部基因组序列之间的5’和3’连接处筛选在肌动蛋白启动子序列上整合的所得转化体。通过ELISA分析确认曲妥珠单抗的产生。
使用过表达网粘菌纲野生型ChStt3、TbStt3A和LbStt3_3的菌株在摇瓶发酵中产生曲妥珠单抗。最终产物通过蛋白A柱纯化，并通过释放的N-连接聚糖分析确定其糖基化。该分析可解析Man3GlcNAc2(图3a)、Man4GlcNAc2(图3b)和Man5GlcNAc2(图3c)的硫酸化和非硫酸化形式。这些聚糖占在alg3缺失的网粘菌纲细胞中产生的抗体上发现的所有聚糖的>80％。硫酸化Man(3-5)GlcNAc2(ManS)的总量和非硫酸化Man(3-5)GlcNAc2(Man)的总量占观察到的所有聚糖的百分比以图形式示出于图1。表达内源性野生型ChStt3 OST的对照菌株产生具有聚糖谱的抗体，其中75％硫酸化聚糖对约15％非硫酸化聚糖。异源TbStt3A OST的过表达导致聚糖谱中硫酸化大大降低，其中非硫酸化(Man(3-5)GlcNAc2(Man))聚糖从15％变为约50％，而硫酸化聚糖(Man(3-5)GlcNAc2(ManS))从约75％降低至约43％。
对于过表达LbStt3_3OST的菌株，聚糖谱的硫酸化部分从野生型中的75％降低至约50％，而聚糖谱的非硫酸化部分从野生型中的15％增加至约30％。
实施例8–聚糖分析
该实施例示出了通过alg3缺失产生的聚糖结构。通过使用PNGaseF和PNGaseA释放聚糖并通过MALDI TOF/TOF和ESI-MS分析来分析由Alg3+和Alg3-菌株产生的纯化抗体。对所有数据的分析给出了每个样品中存在的所有聚糖的数量和丰度以及每个样品中的结构的完整图片。
来自先前分析的组合数据证实两种样品中的N连接糖基化仅发生在Asn327处。在来自Alg3+菌株的抗体上检测到大量的高甘露糖聚糖，其中一些含有木糖和硫酸化结构；其中在来自Alg3-菌株的样品上观察到少得多的N-连接聚糖。由Alg3-产生的N-连接聚糖均不包含木糖。由Alg3-产生的大多数N-连接聚糖具有Man3结构(图3a)。
这些分析显示，在缺失alg3后聚糖谱存在显著差异。就寡甘露糖N-聚糖而言，基于聚糖释放的方法，在Alg3+菌株谱中存在0％至3％的寡甘露糖N-聚糖，而在Alg3-菌株谱中存在89％至90％的寡甘露糖N-聚糖。类似地，就高甘露糖N-聚糖而言，基于聚糖释放的方法，在Alg3+菌株谱中存在97％至100％的高甘露糖N-聚糖，而在Alg3-菌株谱中存在10％至11％的高甘露糖N-聚糖。因此，缺失alg3导致高甘露糖N-聚糖减少(高达90％)，同时导致寡甘露糖N-聚糖产量增加(高达3000％)。
下表4示出了通过MALDI TOF/TOF MS检测到的来自alg3+菌株的N-连接聚糖。基于各个峰的ESI-Msnn碎片来指定结构。观察到许多高甘露糖(Man5和更高)核心结构。
Figure BDA0002752444700000291
下表5示出了通过MALDI TOF/TOF MS检测到的来自alg3-菌株的N-连接聚糖，并且基于各个峰的ESI-MSn碎片来指定结构。
Figure BDA0002752444700000301
下表6示出了高甘露糖N-聚糖谱和寡甘露糖N-聚糖谱在alg3+菌株和alg3-菌株之间的差异。注意，alg3-菌株大量产生异源糖蛋白并且不含任何连接到Man3NAc2和/或Man4NAc2聚糖的木糖、岩藻糖、半乳糖或其他碳水化合物部分。
Figure BDA0002752444700000302
本文说明性地描述的本发明可在不存在本文未具体公开的任一个或多个元素、一个或多个限制的情况下适当地实施。因此，例如，在本文的每种情况下，术语“包含”、“基本上由......组成”和“由......组成”中的任一个均可被替换为其他两个术语中的任一个。已采用的术语和表达用作描述术语，并且不旨在使用此类术语和表达排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同形式，但是应当认识到，在受权利要求书保护的本发明的范围内的各种修改是可能的。此外，在根据马库什群组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，由此本发明也根据马库什群组的任何单个成员或成员子群组来描述。例如，如果X被描述为选自溴、氯和碘，则X为溴的权利要求和X为溴和氯的权利要求被完整描述，如同在本文中单独阐述一样。子标题仅用于组织目的并用于辅助读者，不应理解为限制本公开。其他实施方案在以下权利要求书的范围内。
序列表
<110> 合成基因组学公司（合成 GENOMICS, INC.）
CAIAZZA, Nicky C.
URANO, Jun
KAMBOURAKIS, Spiros
<120> 用于产生具有低硫酸化的糖分子的重组生物体和方法
<130> SGI2170-1WO
<150> US 62/665,187
<151> 2018-05-01
<160> 41
<170> 国际专利版本3.5
<210> 1
<211> 3017
<212> DNA
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium）
<220>
<221> misc_feature
<223> TEF启动子
<400> 1
agcaggagtg gattcggaag gccccaaatg gatggcacga gcgagctcct tccttcctct 60
cgcgccgcac tctctccctc cctccctcct ctctctcgcg cgcgagtctc gctcactctc 120
ctttgcaaga gcaacaagca gcctcggcag cgaatgaatg agagtcctcc ttcgcttctt 180
tctcgattca actcgaagaa tgaatgattt tcattgctca aataaataaa taaataaata 240
aataaataaa taattattgt tccattcatg gattggcaat tacttggtta gctagctagc 300
tagctagtga gtgagttagt gggttttagt agtgctaacg gatggcggca aagacctcgt 360
caaaaaaaaa tcaagaaagc aagatgaaga agggcctgtg attcaagacc cgcgttctgt 420
ctcgcttact gcgtggagtg cggagctccg acacgcttga aattggccaa aagctgcact 480
tcgcgccacc ctctgcgccc cgaaggtggc tttgggccgg agcaccaagt ttagcgcact 540
gtaaaaaggc gcgaaacttt gttggagaag ccaattaatt aattaattaa ttaattaatc 600
ctttcgacga aaactaaaga agaagaaaga aatcaagttt ccgccctata aaatatccct 660
tcttcacact tccttcattt tgtagttaga tgataggcag cgaaaggact aaaggtgaaa 720
ggcgtaggga ccacataggc gcgctagggc ggagggaaag atacaaatgg cctcagaaag 780
gaagaagaag aggcctcgcg gaggaaggat gctgaagcag gaaagataca gcgaaagaga 840
aatcctgtat cttccacagt ggatggacac cttcgaggcc tgcataagtc cacatcactc 900
gctattcaat cattgaattg gtcatttaat tcaagcattt aattcaatca tgtcttcatg 960
caatccaccg tccaacaaca gagcgcatag aagatgttat ccaggtaagg ctgcaataat 1020
acgcagtttg agttttctat tttaaaagta agtttaaaac ttaaaaattt catacttatg 1080
catgctattc aaaataagat tgtatcatcc taaagtattc ttcttctcgt tcttcttcta 1140
atcggaacag agacaacttt ggtgggtttg cgggcctttg agagaaagaa aaaaaactct 1200
caaaagaaac caggcttccg aggccgactt gcgcagctct ggattgaggt tccttcgatc 1260
gctcgcttca ccttcctggc ccgcgcatgc ctcgctctgg gtacacagct gagtgagtga 1320
gcgaaagatg agcgaatgaa tgcaatattt ttctattttc tattcattta actgtactta 1380
attaattgat tattgattga ttgattgatt gattgattga ttgattaatg actctcgctt 1440
ctgagaatac atctgttctc atcttcatcg tcacgtcaga atggaaggat gagaaatgaa 1500
aagaattcga tcactttccc gccttcttgc tagctcatgc tcctttcccg ccaaaaagaa 1560
agaagaggaa agcaccccga agaaaagaaa gaaatcaccc aaacaccctc ctccttcctc 1620
gtccacagac agctcagaat aatgaaagct atctttccat cgctcttgac ctaactctct 1680
ttctgctcct gtaaattcat ccaacaaatg tttagtctca gaaacccatc tgcctcatac 1740
tactacttac taccttcctt acttgaaagc aggcaggctc acggccagct tggcagatag 1800
gatagttctc atatctattg ctgatcgttc ccgtttcttt ctcaaagcaa agtcttttct 1860
cttcattcct tttctttttc ttttcttttc aggctctcca cgttttcagg agtagtacat 1920
ttgctactta gtaattagaa agcttagtac tttttgcttt tctggattct gaagacttgg 1980
aaatagaaag aaattaaaaa tctttttctt ctttctttca gcctttgctg gactccctcg 2040
cacgcctcct tcttccccag ccatccatca gcgggcactc cacccgcgct tcaacgctcg 2100
ctcgagtgcg tgcttatttg ccttcaacgc ggcgcggcgg ttaatatagt cccagcactc 2160
cttaaggggg gcatcgcagg gattatcttt ttaaaacctg tcacggagtt acattttccc 2220
tcgcatcaaa gtgttcccgg ccgcgtcgca catctaagtt ttataaccta cacccctcgt 2280
ggggtagggg cgaattctat gtacacagca cctcagaact tgcgcgcgtt ccgtgacaaa 2340
tgaggggtgt ggcggcgcat tcggccgcat cgccacattc agatatctaa catacccccc 2400
cttcgcgatg agtggcaggc gaggcggatt cgctcgcgag aggcgaggtg ccacagcaga 2460
ccagtaacga ggagccaagg taggtgacca ccgacgacta cgaccacgac cacgaccaca 2520
gccacggcgg ctgcagccac gggacgcctc gcatggcagc gcatcagcac cagcaacgac 2580
agctgcgagg agcgcagggc cgatctggac gcgccggagc cgcacgacca atgccgacgc 2640
aacgctgatt cttctggatt acctctacac atgcatatat gtgtagaggt gcggatgaaa 2700
tgccctgcga ataaatgaat ggcttcgagt ttgcctgccg tatgctcgaa agtgcgtgtg 2760
cagacacagg cacgaccgag aggacaacag tctgtgctta cctcaccagc acattcttgc 2820
aacgccatac gaagcacgcg aaatcttgtg gctcagagag gaaggcattc gtgtacggga 2880
acgtggggaa cgctatcaat ttggaattca aaatgagtga accagacaac taactgtgac 2940
ttgaactgtt gctccacgca tcaaaaccaa acccttaaca gaagtagacc agttcgaagc 3000
tactagcacc aaacaaa 3017
<210> 2
<211> 81
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> misc_feature
<223> SP579_核苷酸_序列
<400> 2
atgcccttta accgcctttc tcttccttgc cttcttcttg ctctcattgc tagcctcttc 60
attcatgctg ctcaagctgg t 81
<210> 3
<211> 645
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> misc_feature
<223> 曲妥珠单抗_轻_链_核苷酸_序列
<400> 3
gacatccaaa tgacacaaag cccttctagc cttagcgctt ctgttggtga tcgtgtgacc 60
attacatgtc gtgcttctca ggatgtgaac acagctgttg cttggtacca acaaaagcct 120
ggtaaagctc ctaagctcct catttacagc gctagctttc tctactctgg cgttccttct 180
cgcttttctg gttctagatc tggcaccgat ttcacactca ccattagctc tcttcagcct 240
gaggattttg ccacatacta ctgccagcag cactacacaa cacctcctac atttggtcaa 300
ggcacaaagg tggagattaa gcgtacagtt gctgctccta gcgtgttcat ttttcctcct 360
tctgatgagc agctcaagtc tggtacagct tctgttgttt gcctcctcaa caacttctac 420
cctagagaag ctaaggtgca gtggaaggtt gataacgctc ttcaatctgg caactctcag 480
gagtctgtta cagagcaaga cagcaaggat agcacctact ctctttctag cacccttacc 540
cttagcaagg ctgattacga gaagcacaag gtttacgctt gcgaggttac acatcagggt 600
ctttcttctc ctgtgaccaa gagctttaac cgtggtgaat gttaa 645
<210> 4
<211> 1350
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<220>
<221> misc_feature
<223> 曲妥珠单抗_轻_链_核苷酸_序列
<400> 4
gaggttcagc ttgtagaaag tggtggtggt cttgttcaac ctggtggttc tcttcgtctt 60
tcttgtgctg cttctggctt caacatcaag gatacctaca tccactgggt tcgtcaagct 120
cctggtaaag gtttagagtg ggttgctcgc atttacccta caaatggcta cacacgttac 180
gctgatagcg ttaaaggccg ctttaccatt tctgctgata cctctaagaa caccgcctac 240
cttcagatga actctcttag agctgaggat acagccgtgt actattgttc tagatggggt 300
ggtgacggct tttatgctat ggattattgg ggtcagggca cacttgtgac agtttcttct 360
gcttctacca agggtcctag cgtttttcct ttagctcctt ctagcaagag cacatctggt 420
ggtacagctg ctttaggttg ccttgttaag gactacttcc ctgaacctgt gacagtttct 480
tggaactctg gtgctcttac atctggcgtt cacacatttc ctgctgttct tcagtcttct 540
ggcctctatt ctcttagctc tgtggttaca gtgccttctt cttctcttgg tacacagacc 600
tacatctgca acgttaacca caagcctagc aacacaaagg tggacaagaa ggttgagcct 660
aagtcttgcg ataagaccca tacatgtcct ccttgtcctg ctcctgaatt attaggtggt 720
cctagcgtgt tcctctttcc tcctaaacct aaggacaccc tcatgatttc tcgcacacct 780
gaagttacat gcgttgtggt tgacgtttct cacgaagatc ctgaggtgaa gttcaactgg 840
tacgttgatg gtgtggaggt tcataacgct aagacaaaac ctcgtgagga gcagtacaac 900
tctacatatc gcgtggttag cgtgcttaca gttcttcatc aggactggct taacggtaag 960
gagtataagt gcaaggtgag caacaaggct cttcctgctc ctattgagaa gaccattagc 1020
aaggctaagg gccaacctag agaacctcaa gtttacacac tccctccttc tcgtgaagag 1080
atgacaaaga accaggtgtc tcttacctgc cttgttaagg gcttttaccc tagcgacatt 1140
gctgttgaat gggagtctaa cggtcaacct gagaacaact acaagacaac acctcctgtg 1200
cttgactctg atggcagctt ttttctctac agcaagctta ccgtggacaa gtctagatgg 1260
caacaaggta acgtgttctc ttgctctgtg atgcatgagg ctcttcataa ccactacacc 1320
cagaagtctc ttagcctttc tcctggttaa 1350
<210> 5
<211> 4251
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<223> NLS-标记-Cas9 (pAM-001)
<400> 5
atgcccaaga aaaagcggaa ggtcggcgac tacaaggatg acgatgacaa gttggagcct 60
ggagagaagc cctacaaatg ccctgagtgc ggaaagagct tcagccaatc tggagccttg 120
acccggcatc aacgaacgca tacacgagac aagaagtact ccatcgggct ggacatcggg 180
acgaactccg tgggatgggc cgtgatcaca gacgaataca aggtgccttc caagaagttc 240
aaggtgctgg ggaacacgga cagacactcc atcaagaaga acctcatcgg ggccttgctc 300
ttcgactccg gagaaaccgc cgaagcaacg cgattgaaaa gaaccgccag aagacgatac 360
acacgacgga agaaccgcat ctgctacctc caggagatct tcagcaacga gatggccaag 420
gtggacgact cgttctttca tcgcctggag gagagcttcc tggtggagga agacaagaaa 480
catgagcgcc acccgatctt cgggaacatc gtggacgaag tggcctacca cgagaaatac 540
cccacgatct accacttgcg caagaaactc gtggactcca cggacaaagc ggacttgcgg 600
ttgatctact tggccttggc ccacatgatc aaatttcggg gccacttcct gatcgagggc 660
gacttgaatc ccgacaattc cgacgtggac aagctcttca tccagctggt gcagacctac 720
aaccagctct tcgaggagaa ccccatcaat gcctccggag tggacgccaa agccatcttg 780
tccgcccgat tgtccaaatc cagacgcttg gagaacttga tcgcacaact tcctggcgag 840
aagaagaacg gcctcttcgg caacttgatc gcgctgtcgc tgggattgac gcctaacttc 900
aagtccaact tcgacttggc cgaggacgcc aagttgcaac tgtccaagga cacctacgac 960
gacgacctcg acaacctgct ggcccaaatt ggcgaccaat acgcggactt gtttttggcg 1020
gccaagaact tgagcgacgc catcttgttg agcgacatct tgcgcgtgaa tacggagatc 1080
accaaagccc ctttgtccgc ctctatgatc aagcggtacg acgagcacca ccaagacttg 1140
accctgttga aagccctcgt gcggcaacaa ttgcccgaga agtacaagga gatcttcttc 1200
gaccagtcca agaacgggta cgccggctac atcgacggag gagcctccca agaagagttc 1260
tacaagttca tcaagcccat cctggagaag atggacggca ccgaggagtt gctcgtgaag 1320
ctgaaccgcg aagacttgtt gcgaaaacag cggacgttcg acaatggcag catcccccac 1380
caaatccatt tgggagagtt gcacgccatc ttgcgacggc aagaggactt ctacccgttc 1440
ctgaaggaca accgcgagaa aatcgagaag atcctgacgt tcagaatccc ctactacgtg 1500
ggacccttgg cccgaggcaa ttcccggttt gcatggatga cgcgcaaaag cgaagagacg 1560
atcaccccct ggaacttcga agaagtggtc gacaaaggag catccgcaca gagcttcatc 1620
gagcgaatga cgaacttcga caagaacctg cccaacgaga aggtgttgcc caagcattcg 1680
ctgctgtacg agtacttcac ggtgtacaac gagctgacca aggtgaagta cgtgaccgag 1740
ggcatgcgca aacccgcgtt cctgtcggga gagcaaaaga aggccattgt ggacctgctg 1800
ttcaagacca accggaaggt gaccgtgaaa cagctgaaag aggactactt caagaagatc 1860
gagtgcttcg actccgtgga gatctccggc gtggaggacc gattcaatgc ctccttggga 1920
acctaccatg acctcctgaa gatcatcaag gacaaggact tcctggacaa cgaggagaac 1980
gaggacatcc tggaggacat cgtgctgacc ctgaccctgt tcgaggaccg agagatgatc 2040
gaggaacggt tgaaaacgta cgcccacttg ttcgacgaca aggtgatgaa gcagctgaaa 2100
cgccgccgct acaccggatg gggacgattg agccgcaaac tgattaatgg aattcgcgac 2160
aagcaatccg gaaagaccat cctggacttc ctgaagtccg acgggttcgc caaccgcaac 2220
ttcatgcagc tcatccacga cgactccttg accttcaagg aggacatcca gaaggcccaa 2280
gtgtccggac aaggagactc cttgcacgag cacatcgcca atttggccgg atcccccgca 2340
atcaaaaaag gcatcttgca aaccgtgaaa gtggtcgacg aactggtgaa ggtgatggga 2400
cggcacaagc ccgagaacat cgtgatcgaa atggcccgcg agaaccaaac cacccaaaaa 2460
ggacagaaga actcccgaga gcgcatgaag cggatcgaag agggcatcaa ggagttgggc 2520
tcccagatcc tgaaggagca tcccgtggag aatacccaat tgcaaaacga gaagctctac 2580
ctctactacc tccagaacgg gcgggacatg tacgtcgacc aagagctgga catcaaccgc 2640
ctctccgact acgatgtgga tcatattgtg ccccagagct tcctcaagga cgacagcatc 2700
gacaacaagg tcctgacgcg cagcgacaag aaccggggca agtctgacaa tgtgccttcc 2760
gaagaagtcg tgaagaagat gaagaactac tggcggcagc tgctcaacgc caagctcatc 2820
acccaacgga agttcgacaa cctgaccaag gccgagagag gaggattgtc cgagttggac 2880
aaagccggct tcattaaacg ccaactcgtg gagacccgcc agatcacgaa gcacgtggcc 2940
caaatcttgg actcccggat gaacacgaaa tacgacgaga atgacaagct gatccgcgag 3000
gtgaaggtga tcacgctgaa gtccaagctg gtgagcgact tccggaagga cttccagttc 3060
tacaaggtgc gggagatcaa caactaccat cacgcccatg acgcctacct gaacgccgtg 3120
gtcggaaccg ccctgatcaa gaaatacccc aagctggagt ccgaattcgt gtacggagat 3180
tacaaggtct acgacgtgcg gaagatgatc gcgaagtccg agcaggagat cggcaaagcc 3240
accgccaagt acttctttta ctccaacatc atgaacttct tcaagaccga gatcacgctc 3300
gccaacggcg agatccgcaa gcgccccctg atcgagacca acggcgagac gggagagatt 3360
gtgtgggaca aaggaagaga ttttgccaca gtgcgcaagg tgctgtccat gcctcaggtg 3420
aacatcgtga agaagaccga ggtgcaaaca ggagggtttt ccaaagagtc cattttgcct 3480
aagaggaatt ccgacaagct catcgcccgc aagaaggact gggaccccaa gaagtacggg 3540
ggcttcgact cccccacggt ggcctactcc gtgttggtgg tggccaaagt ggagaaaggg 3600
aagagcaaga agctgaaatc cgtgaaggag ttgctcggaa tcacgatcat ggaacgatcg 3660
tcgttcgaga aaaaccccat cgacttcctc gaagccaaag ggtacaaaga ggtgaagaag 3720
gacctgatca tcaagctgcc caagtactcc ctgttcgagc tggagaacgg ccgcaagcgg 3780
atgctggcct ccgccgggga actgcagaaa gggaacgaat tggccttgcc ctccaaatac 3840
gtgaacttcc tctacttggc ctcccattac gaaaagctca aaggatcccc tgaggacaat 3900
gagcagaagc aactcttcgt ggaacaacac aagcactacc tggacgagat catcgagcag 3960
atcagcgagt tctccaagcg cgtgatcctc gccgacgcca acctggacaa ggtgctctcc 4020
gcctacaaca agcaccgcga caagcctatc cgcgagcaag ccgagaatat cattcacctg 4080
tttaccctga cgaatttggg agcccctgcc gcctttaaat actttgacac caccatcgac 4140
cgcaaaagat acacctccac caaggaagtc ttggacgcca ccctcatcca ccagtccatc 4200
acgggcctct acgagacgcg catcgacctc tcccaattgg gcggcgacta a 4251
<210> 6
<211> 788
<212> DNA
<213> 酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）
<220>
<221> misc_feature
<223> hsp60启动子
<400> 6
acgttcttcg cgaagtcaat ccattccccg cgttccccaa atgagggttc gcggtcgaac 60
ccgggggctg agaagggcct taaaagcgcg ggtttaaaga gggatcggga gcggcgggag 120
acaagggatt aaggtggaag tggacccttt tccagaaggg agaaaagcac gagcgggaga 180
ttgactggtg cagcagatcc cgaacgacgt cttcgacagg tacgtgcctc agattgaggt 240
gccgctcatg cggcactgta ttcaagcgct ctagctggcc gccatgttgc tgccactctg 300
tttgccgctc gcggccacac ggctgccgcc aggaccaccc accacccgct ccagctgccg 360
tgagctgagc ttacctatgg acgcatgagc ggctccaagc cacacgtcct gtctggtgaa 420
tatccaactt gacgtcgcgg ctttgtctcc atcattctag ctgcgaatct ggattgctga 480
ggagatcatc gcttctgcgc ggtgtgacgc cggcttcagc cgcgatagat tgatttggat 540
ggaagcgacc aagcagagcg tcgcatctcc ttaccgggta ttagggttct gtagatccaa 600
aagacctagt ttatgtattg agtggcagag acgaaaaatt ggctcaggct aatttgaatg 660
gctgtggcta agtccttaaa tgcttggtgg acaatcgatg gaagaagagc aaagtgaaca 720
aaaaagactg acctttcaag tttaatttat ttgcaatcca caggcgacaa aacaaaacac 780
aaataaaa 788
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物oSGI-JU-1360
<400> 7
cttaaatgct tggtggacaa t 21
<210> 8
<211> 434
<212> PRT
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium）
<220>
<221> misc_feature
<223> 甘露糖基转移酶（alg3）SG4EUKT579099
<400> 8
Met Ser Leu Arg Ala Ser Lys Asp Ala Leu Val Arg Leu Arg Gly Ala
1 5 10 15
Leu Asp Asn Ala Ser Thr Gln Trp Trp Trp Trp Ala Met Ala Ala Thr
20 25 30
Ala Asp Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ile Val Lys Leu Val Pro Tyr Thr
35 40 45
Glu Ile Asp Phe Lys Ala Tyr Met Gln Glu Val Glu Gly Pro Leu Leu
50 55 60
His Asp Glu Trp Asp Tyr Thr Lys Leu Arg Gly Asp Thr Gly Pro Leu
65 70 75 80
Val Tyr Pro Ala Gly Phe Val Tyr Ile Tyr Met Gly Ile Arg Trp Leu
85 90 95
Thr Glu Asp Gly Thr Asn Leu Trp Arg Gly Gln Ile Leu Phe Ala Ser
100 105 110
Leu His Ala Ile Leu Val Tyr Leu Val Leu Gly Ser Ile Tyr Tyr Gln
115 120 125
Pro Asp Ala Ser Lys Asp Pro Arg Arg Val Pro Phe Trp Val Gly Pro
130 135 140
Leu Ala Val Leu Ser Arg Arg Val His Ser Ile Phe Val Leu Arg Leu
145 150 155 160
Phe Asn Asp Gly Ile Ala Met Val Phe Met Tyr Ala Ala Val Tyr Met
165 170 175
Tyr Val Arg Arg Arg Trp Thr Leu Gly Thr Ala Phe Phe Ser Ala Ala
180 185 190
Leu Ser Val Lys Met Asn Ile Leu Leu Phe Ala Pro Gly Leu Ala Val
195 200 205
Leu Met Leu Glu Ala Thr Gly Leu Ala Ser Ser Ile Leu Gln Ala Val
210 215 220
Ile Cys Val Ala Ser Gln Ile Ala Leu Ala Leu Pro Phe Leu Gln Val
225 230 235 240
Asn Ala Ala Gly Tyr Leu Asn Arg Ala Phe Glu Leu Gly Arg Val Phe
245 250 255
Thr Tyr Lys Trp Thr Val Asn Phe Lys Phe Leu Ser Pro Glu Ala Phe
260 265 270
Val Ser Lys Ala Leu Ala Gln Gly Leu Leu Ser Ala Thr Leu Leu Thr
275 280 285
Trp Val Gly Phe Gly Ser Arg His Phe Ala Ser Ser His Thr Gly Gly
290 295 300
Leu Arg Gly Leu Val Tyr Thr Ser Ile Val Arg Pro Leu Lys Ala Pro
305 310 315 320
Leu Glu Asp Thr Ile Ser Thr Val Gln Met His Asp Trp Lys Leu His
325 330 335
Val Leu Thr Leu Leu Phe Thr Ser Asn Phe Ile Gly Ile Val Phe Ala
340 345 350
Arg Ser Ile His Tyr Gln Phe Tyr Thr Trp Tyr Phe His Thr Val Ser
355 360 365
Phe Leu Val Tyr Ala Ser Gly Gly Asn Phe Ala Leu Ser Leu Leu Ile
370 375 380
Cys Val Ser Leu Glu Val Cys Phe Asn Val Tyr Pro Ser Thr Ala Glu
385 390 395 400
Ser Ser Ala Ile Leu Gln Ala Thr His Leu Val Leu Leu Leu Arg Leu
405 410 415
Ala Thr Arg Lys Pro Cys Pro Leu Thr Ala Gln Ser Lys Arg Pro Lys
420 425 430
Gln Ala
<210> 9
<211> 434
<212> PRT
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium）
<220>
<221> misc_feature
<223> 甘露糖基转移酶（alg3）SG4EUKT579102
<400> 9
Met Ser Leu Arg Ala Ser Lys Asp Ala Leu Val Arg Leu Arg Gly Ala
1 5 10 15
Leu Asp Asn Ala Ser Thr Gln Trp Trp Trp Trp Ala Met Ala Ala Thr
20 25 30
Ala Asp Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ile Val Lys Leu Val Pro Tyr Thr
35 40 45
Glu Ile Asp Phe Lys Ala Tyr Met Gln Glu Val Glu Gly Pro Leu Leu
50 55 60
His Asp Glu Trp Asp Tyr Thr Lys Leu Arg Gly Asp Thr Gly Pro Leu
65 70 75 80
Val Tyr Pro Ala Gly Phe Val Tyr Ile Tyr Met Gly Ile Arg Trp Leu
85 90 95
Thr Glu Asp Gly Thr Asn Leu Trp Arg Gly Gln Ile Leu Phe Ala Ser
100 105 110
Leu His Ala Ile Leu Val Tyr Leu Val Leu Gly Ser Ile Tyr Tyr Gln
115 120 125
Pro Asp Ala Ser Lys Asp Pro Arg Arg Val Pro Phe Trp Val Gly Pro
130 135 140
Leu Ala Val Leu Ser Arg Arg Val His Ser Ile Phe Val Leu Arg Leu
145 150 155 160
Phe Asn Asp Gly Ile Ala Met Val Phe Met Tyr Ala Ala Val Tyr Met
165 170 175
Tyr Val Arg Arg Arg Trp Thr Leu Gly Thr Ala Phe Phe Ser Ala Ala
180 185 190
Leu Ser Val Lys Met Asn Ile Leu Leu Phe Ala Pro Gly Leu Ala Val
195 200 205
Leu Met Leu Glu Ala Thr Gly Leu Ala Ser Ser Ile Leu Gln Ala Val
210 215 220
Ile Cys Val Ala Ser Gln Ile Ala Leu Ala Leu Pro Phe Leu Gln Val
225 230 235 240
Asn Ala Ala Gly Tyr Leu Asn Arg Ala Phe Glu Leu Gly Arg Val Phe
245 250 255
Thr Tyr Lys Trp Thr Val Asn Phe Lys Phe Leu Ser Pro Glu Ala Phe
260 265 270
Val Ser Lys Ala Leu Ala Gln Gly Leu Leu Ser Ala Thr Leu Leu Thr
275 280 285
Trp Val Gly Phe Gly Ser Arg His Phe Ala Ser Ser His Thr Gly Gly
290 295 300
Leu Arg Gly Leu Val Tyr Thr Ser Ile Val Arg Pro Leu Lys Ala Pro
305 310 315 320
Leu Glu Asp Thr Ile Ser Thr Val Gln Met His Asp Trp Lys Leu His
325 330 335
Val Leu Thr Leu Leu Phe Thr Ser Asn Phe Ile Gly Ile Val Phe Ala
340 345 350
Arg Ser Ile His Tyr Gln Phe Tyr Thr Trp Tyr Phe His Thr Val Ser
355 360 365
Phe Leu Val Tyr Ala Ser Gly Gly Asn Phe Ala Leu Ser Leu Leu Ile
370 375 380
Cys Val Ser Leu Glu Val Cys Phe Asn Val Tyr Pro Ser Thr Ala Glu
385 390 395 400
Ser Ser Ala Ile Leu Gln Ala Thr His Leu Val Leu Leu Leu Arg Leu
405 410 415
Ala Thr Arg Lys Pro Cys Pro Leu Thr Ala Gln Ser Lys Arg Pro Lys
420 425 430
Gln Ala
<210> 10
<211> 434
<212> PRT
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium）
<220>
<221> misc_feature
<223> 甘露糖基转移酶（alg3）SG4EUKT561246
<400> 10
Met Ser Phe Arg Ala Ser Lys Asp Ala Leu Val Arg Leu Arg Gly Ala
1 5 10 15
Leu Asp Asn Ala Ser Thr Gln Trp Trp Trp Trp Ala Met Ala Ala Thr
20 25 30
Ala Asp Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ile Val Lys Leu Val Pro Tyr Thr
35 40 45
Glu Ile Asp Phe Lys Ala Tyr Met Gln Glu Val Glu Gly Pro Leu Leu
50 55 60
His Asp Glu Trp Asp Tyr Thr Lys Leu Arg Gly Asp Thr Gly Pro Leu
65 70 75 80
Val Tyr Pro Ala Gly Phe Val Tyr Ile Tyr Met Gly Ile Arg Trp Leu
85 90 95
Thr Glu Asp Gly Thr Asn Leu Trp Arg Gly Gln Ile Leu Phe Ala Ser
100 105 110
Leu His Ala Ile Leu Val Tyr Leu Val Leu Gly Ser Ile Tyr Tyr Gln
115 120 125
Pro Asp Ala Ser Lys Asp Pro Arg Arg Val Pro Phe Trp Val Gly Pro
130 135 140
Leu Ala Val Leu Ser Arg Arg Val His Ser Ile Phe Val Leu Arg Leu
145 150 155 160
Phe Asn Asp Gly Ile Ala Met Val Phe Met Tyr Ala Ala Val Tyr Met
165 170 175
Tyr Val Arg Arg Arg Trp Thr Leu Gly Thr Ala Phe Phe Ser Ala Ala
180 185 190
Leu Ser Val Lys Met Asn Ile Leu Leu Phe Ala Pro Gly Leu Ala Val
195 200 205
Leu Met Leu Glu Ala Thr Gly Leu Ala Ser Ser Ile Leu Gln Ala Val
210 215 220
Ile Cys Val Ala Ser Gln Ile Ala Leu Ala Leu Pro Phe Leu Gln Val
225 230 235 240
Asn Ala Ala Gly Tyr Leu Asn Arg Ala Phe Glu Leu Gly Arg Val Phe
245 250 255
Thr Tyr Lys Trp Thr Val Asn Phe Lys Phe Leu Ser Pro Glu Ala Phe
260 265 270
Val Ser Lys Ala Leu Ala Gln Gly Leu Leu Ser Ala Thr Leu Leu Thr
275 280 285
Trp Val Gly Phe Gly Ser Arg His Phe Ala Ser Ser His Thr Gly Gly
290 295 300
Leu Arg Gly Leu Val Tyr Thr Ser Ile Val Arg Pro Leu Lys Ala Pro
305 310 315 320
Leu Glu Asp Thr Ile Ser Thr Val Gln Met His Asp Trp Lys Leu His
325 330 335
Val Leu Thr Leu Leu Phe Thr Ser Asn Phe Ile Gly Ile Val Phe Ala
340 345 350
Arg Ser Ile His Tyr Gln Phe Tyr Thr Trp Tyr Phe His Thr Val Ser
355 360 365
Phe Leu Val Tyr Ala Ser Gly Gly Asn Phe Ala Leu Ser Leu Leu Ile
370 375 380
Cys Val Ser Leu Glu Val Cys Phe Asn Val Tyr Pro Ser Thr Ala Glu
385 390 395 400
Ser Ser Ala Ile Leu Gln Ala Thr His Leu Val Leu Leu Leu Arg Leu
405 410 415
Ala Thr Arg Lys Pro Cys Pro Leu Thr Ala Gln Ser Lys Arg Pro Lys
420 425 430
Gln Ala
<210> 11
<211> 1305
<212> DNA
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium）
<220>
<221> misc_feature
<223> 甘露糖基转移酶SG4EUKT579099
<400> 11
atgtctttgc gtgcgagtaa ggatgccctc gtacgtcttc gaggggccct cgacaatgca 60
agcactcagt ggtggtggtg ggccatggca gccacggcag acttggcact tagcctgctt 120
attgtgaaac tcgtgcctta tacggagatc gactttaaag cgtacatgca agaggttgaa 180
ggccccctat tgcatgatga atgggactat acaaagctca ggggcgacac aggcccgctg 240
gtttatcctg ccggttttgt gtatatttat atgggcatcc gctggctcac tgaagacggc 300
acgaacctgt ggcgaggcca gatacttttt gcaagtctgc atgcaattct tgtttacctt 360
gtacttggat ccatatatta ccagccagat gcatcaaaag atcctcgcag agtgccgttc 420
tgggtaggac ctctagcagt attatcgaga cgtgtgcatt caatctttgt tctgaggctc 480
ttcaacgacg gcattgctat ggtgtttatg tatgcagcag tatatatgta tgtgcggagg 540
cgttggacgc taggtacggc tttcttcagc gcagcactta gcgtgaaaat gaatatactc 600
ctatttgcgc caggattagc cgtgttgatg ctcgaggcta cgggtttggc gtcgagcata 660
ctgcaggcag tgatctgcgt agcatcacag attgccttag ctttgccgtt cctccaagtc 720
aacgcagccg ggtatctaaa tcgggctttt gagctaggtc gtgtctttac gtacaaatgg 780
acagtaaact tcaagtttct cagccctgaa gcttttgtga gtaaggcact tgcccaaggc 840
ctgctgtctg ccactttact tacatgggtc ggctttgggt ctcgccactt tgcttcctct 900
cacacaggtg gtcttcgcgg ccttgtgtac acgagcattg ttcgaccact gaaagctccg 960
cttgaagaca caatttcaac cgtccaaatg catgactgga aacttcacgt tttgacgctc 1020
ctattcacaa gcaactttat tggcatcgtt tttgcgcgaa gcatccatta ccaattctac 1080
acttggtact ttcacactgt ctcattctta gtgtacgcca gtggtggaaa cttcgcgttg 1140
tctcttctta tttgcgtttc tctagaagta tgctttaacg tgtatccttc aacagcagaa 1200
tcgagtgcta tcttgcaggc aactcatctt gttttgttat tgagacttgc tacacgaaaa 1260
ccttgcccac ttacagcaca gagcaagcgc cctaaacaag catga 1305
<210> 12
<211> 1305
<212> DNA
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium）
<220>
<221> misc_feature
<223> 甘露糖基转移酶（alg3）SG4EUKT579102
<400> 12
atgtctttgc gtgcgagtaa ggatgccctc gtacgtcttc gaggggccct cgacaatgca 60
agcactcagt ggtggtggtg ggccatggca gccacggcag acttggcact tagcctgctt 120
attgtgaaac tcgtgcctta tacggagatc gactttaaag cgtacatgca agaggttgaa 180
ggccccctat tgcatgatga atgggactat acaaagctca ggggcgacac aggcccgctg 240
gtttatcctg ccggttttgt gtatatttat atgggcatcc gctggctcac tgaagacggc 300
acgaacctgt ggcgaggcca gatacttttt gcaagtctgc atgcaattct tgtttacctt 360
gtacttggat ccatatatta ccagccagat gcatcaaaag atcctcgcag agtgccgttc 420
tgggtaggac ctctagcagt attatcgaga cgtgtgcatt caatctttgt tctgaggctc 480
ttcaacgacg gcattgctat ggtgtttatg tatgcagcag tatatatgta tgtgcggagg 540
cgttggacgc taggtacggc tttcttcagc gcagcactta gcgtgaaaat gaatatactc 600
ctatttgcgc caggattagc cgtgttgatg ctcgaggcta cgggtttggc gtcgagcata 660
ctgcaggcag tgatctgcgt agcatcacag attgccttag ctttgccgtt cctccaagtc 720
aacgcagccg ggtatctaaa tcgggctttt gagctaggtc gtgtctttac gtacaaatgg 780
acagtaaact tcaagtttct cagccctgaa gcttttgtga gtaaggcact tgcccaaggc 840
ctgctgtctg ccactttact tacatgggtc ggctttgggt ctcgccactt tgcttcctct 900
cacacaggtg gtcttcgcgg ccttgtgtac acgagcattg ttcgaccact gaaagctccg 960
cttgaagaca caatttcaac cgtccaaatg catgactgga aacttcacgt tttgacgctc 1020
ctattcacaa gcaactttat tggcatcgtt tttgcgcgaa gcatccatta ccaattctac 1080
acttggtact ttcacactgt ctcattctta gtgtacgcca gtggtggaaa cttcgcgttg 1140
tctcttctta tttgcgtttc tctagaagta tgctttaacg tgtatccttc aacagcagaa 1200
tcgagtgcta tcttgcaggc aactcatctt gttttgttat tgagacttgc tacacgaaaa 1260
ccttgcccac ttacagcaca gagcaagcgc cctaaacaag catga 1305
<210> 13
<211> 1305
<212> DNA
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium）
<220>
<221> misc_feature
<223> 甘露糖基转移酶(alg3) SG4EUKT561246
<400> 13
atgtctttcc gtgcgagtaa ggatgccctc gtacgtcttc gaggggccct cgacaatgca 60
agcactcagt ggtggtggtg ggccatggca gccacggcag acttggcact tagcctgctt 120
attgtgaaac tcgtgcctta tacggagatc gactttaaag cgtacatgca agaggttgaa 180
ggccccctac tgcatgatga atgggactat acaaagctca ggggcgacac aggcccgctg 240
gtttatcctg ctggttttgt gtatatttat atgggcatcc gctggctcac tgaagacggc 300
acaaacctgt ggcgaggcca gatacttttt gcaagtctgc atgcaattct tgtttacctt 360
gtacttggat ccatatacta ccagccagat gcatcaaaag atcctcgcag agtgccgttc 420
tgggtaggac ctctagcagt attatcgaga cgtgtgcatt caatctttgt tctgaggctc 480
ttcaacgacg gcattgctat ggtgtttatg tatgcagcag tatatatgta tgtgcggagg 540
cgttggacgc taggtacggc tttcttcagc gcagcactta gcgtgaaaat gaatatactc 600
ctatttgcgc caggattagc cgtgttgatg ctcgaggcta cgggtttggc gtcgagcata 660
ctgcaggcag tgatctgcgt agcatcacag attgccttag ctttgccgtt cctccaagtc 720
aatgcagcag ggtatctaaa tcgggctttt gagctaggtc gtgtctttac gtacaagtgg 780
acagtaaact tcaagtttct cagccctgaa gcttttgtaa gtaaggcact tgcccaaggc 840
ctgctgtctg ccactttact tacatgggtc ggctttgggt ctcgccattt tgcttcctct 900
cacacaggtg gccttcgcgg ccttgtgtac acgagcattg ttcgaccact gaaagctccg 960
cttgaagaca caatttcaac cgtccaaatg catgactgga aacttcacgt tttgacgctc 1020
ctattcacaa gcaactttat tggcatcgtt tttgcgcgaa gcatccatta ccaattctac 1080
acttggtact ttcacactgt ctcattctta gtgtacgcca gtggtggaaa cttcgcgttg 1140
tctcttctta tttgcgtttc tctagaagta tgctttaacg tgtatccttc aacagcagaa 1200
tcgagtgcta tcttgcaggc aactcatctt gttttgttat tgagacttgc tacacgaaaa 1260
ccttgcccac ttacagcaca gagcaagcgc cctaaacaag catga 1305
<210> 14
<211> 103
<212> RNA
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium）
<220>
<221> misc_feature
<223> alg3_gRNA
<400> 14
gcguacaugc aagagguuga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103
<210> 15
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物oCAB-0341
<400> 15
taatacgact cactatagcg tacatgcaag aggttgagtt ttagagctag aaatagcaag 60
ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttt 120
<210> 16
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物, oCAB-0342
<400> 16
aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt caagttgata acggactagc cttattttaa 60
cttgctattt ctagctctaa aactcaacct cttgcatgta cgctatagtg agtcgtatta 120
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物oJU-0017
<400> 17
cacgacgttg taaaacgacg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物oJU-0001
<400> 18
gttgtgtgga attgtgagcg 20
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物oCAB-0294
<400> 19
tactgctcta ggattattta ttactaggtc 30
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物oCAB-0295
<400> 20
cgtcgtttta caacgtcgtg attgcagaat tgacgacgtg 40
<210> 21
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物oCAB-0296
<400> 21
cgctcacaat tccacacaac tttatatggg catccgctgg 40
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物oCAB-0297
<400> 22
tacacgttaa agcatacttc tagagaa 27
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物oCAB-0298
<400> 23
gcttattgtg aaactcgtgc c 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物oCAB-0299
<400> 24
gcccctgagc tttgtatagt c 21
<210> 25
<211> 90
<212> DNA
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium）
<220>
<221> misc_feature
<223> SP552
<400> 25
atgaagttcg ctacctctgt cgccattgtg cttgttgcta acgttgctac cgctcttgct 60
cagtctgatg gttgtacagc taccgatcaa 90
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物oSGI-JU-0459
<400> 26
agccacatgc acttcaagag 20
<210> 27
<211> 2457
<212> DNA
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium）
<220>
<221> misc_feature
<223> 寡糖基转移酶ChStt3
<400> 27
atgggcaaga aggccaagtc ggctgcccct gtgaaggggg cggccagcag cacaacctcc 60
gagcctgtgg agtcgagtga tgctcccgct gctccccagt acaagctggt ggcgaaccca 120
aactcgatgt tctggtgggg tattcgtatc atcgtgctcg ggtttgccat tcagctcgcg 180
tacaacatcc gactctatgc catcaaagaa tacggcctcg tgattcatga gtttgacccc 240
tggttcaact accgcgccac cgagtacctc aaggaccatg gtatgcgtga cttctttcgc 300
tggtatgacc atatgagctg gtatcctctc ggacgacctg tcggtacgac catctacccc 360
ggcatgcaga tcacctctgt ggctatctgg aacgctctcg agtcactcgg tatgcccatg 420
tcccttaacg acatctgctg ctacgtgccc gcctggtttg gagtctcggc cactatcttc 480
gtaggtcttc ttaccgccga gtgcaccggc agccgtaacg ctggcgcatt cgcatctctg 540
gtcatgtcct gcatccctgc tcacaccatg cgctccgtcg gaggaggcta cgacaacgag 600
tccatcgctg ttactgccat gagtatgacc ttcttcttct ggtgccgatc cctgcgtgac 660
gacaagtcct ggatttttgg cattcttact ggcctctctt acttctatat ggtcgctgcc 720
tggggaggat acatctttgt actcaacctc atcggtctgc acgcgattgt cctcgtcgtc 780
aacggtcagt tctcccgttc tttgtactgg tcctacacac tcttctacac gattggcact 840
gcttgcgcca ttcagatccc tgtcgtcggc ctcacgccgc tcaagtctct tgaacagctc 900
ggaccttttg gagtttgggg tatcatgcag cttctctaca tctgcgatat cttgcgcgag 960
cgcaggaatc tcaatgccaa gcagctcttc caggtgcgca tccaggtctt cagcatcgca 1020
ggaattgcct ttgctgtggt ctgcgccatg ctctacccca ctggatactt tggtcctctc 1080
agctctcgcg tgcgcagtct ctttgtgcag cacacgcgta ctggaaaccc gctcgtagac 1140
tctgtggctg agcaccagcc cgcgagtgcc aacgcttact ttcaatactt gcactttgcc 1200
tgctacctgg cgcccatcgg tttcatccgc tccctcttca gtttgaccaa agctaactcc 1260
tttttgccgc tgtacggagc tgtaggatac ttcttctcgg ccaagatggt gcgtcttatt 1320
atcttgctcg gacctatttc atctgcactc tccggagttg cattggcgac aatgttggaa 1380
tggtgctaca accagttctt tatggataag gtcccgctca ctccggagga agtagctgcc 1440
caggacaact cttcatccgc gaagaagcgc aagggtgcag ctgcccagga agagccctcg 1500
gcccttggcc cggatatcga ccgtcttatc aagcaagcaa atgtcttcta tgagcgcaac 1560
ggcactgttc gcaagtacgc tgctgtcatt ttgctcatgg gtcttggagc catggcacca 1620
gagttccaca agtactgcca cgctatggcc cgtgccatgt caaacccgag cattatgtac 1680
aacgcccgta ctcgtgatgg ccgcactgtg ctcgttgatg actaccgcga ggcttacttc 1740
tggctgcgtg acaacactcc tgaggatgct cgtgtaatgg cctggtggga ctatggctat 1800
cagattgctg gtattggcaa cagaactact attgctgatg gaaacacctg gaaccacgag 1860
catattgcta cccttggtcg gtgccttgtg tcccccgagg aaactgcaca caagatgatt 1920
cgccacctgg ctgattatgt tcttatttgg accggtggtg gtggtgatga cctcgccaag 1980
atgccgcaca ttgcgcgtat tgctaactct gtgtactcct cggtatgtaa tggcgaccct 2040
ctgtgctcgc agcttggcta cattgatcgc cagggtacac cctctgagat gatggccaat 2100
tcgctcatct acaagctcca cagtggcttc cagcgccccg gtgttgttgt agaccagaac 2160
cgtttcgaga acgtgttcac ttccaagtac aacaaggtac gcatctggcg cgtcaagtct 2220
gttgacaagg agtctaaggc ctgggctgct gaccttgcca acaagaagtg cgaccctgcc 2280
ccgaacgact tcatctgcaa gggtgattac ccgccaaagt tcagggagtt cattaaggat 2340
cgccaggact ttgctcagct tgaagatttt aacgctaaga aaaagaccaa ggaggctgag 2400
gagtaccaga agcgttacca tgaggagatg gctcgtcgtg gccagcgtcg caactaa 2457
<210> 28
<211> 2406
<212> DNA
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium）
<220>
<221> misc_feature
<223> 寡糖基转移酶TbStt3A
<400> 28
atgacaaagg gcggtaaagt ggcagtgaca aagggttctg ctcagtctga tggtgctggt 60
gaaggtggta tgtctaaggc taagagctct accaccttcg tggctacagg tggtggttct 120
ttacctgctt gggctcttaa ggctgtgagc acaattgtgt ctgccgtgat tctcatctac 180
agcgttcatc gtgcctacga tattcgcctt acctctgttc gcctttacgg tgagctcatt 240
cacgagtttg acccttggtt caactaccgt gctacccaat accttagcga taacggttgg 300
cgcgctttct ttcaatggta cgactacatg agctggtacc ctcttggtag acctgttggt 360
accaccattt ttcctggcat gcagcttaca ggcgtggcta ttcatcgcgt tcttgagatg 420
cttggtcgcg gtatgagcat caacaacatt tgcgtgtaca tccctgcctg gtttggctct 480
attgctactg ttcttgctgc cctcatcgct tacgagtcat ctaacagcct tagcgtgatg 540
gctttcaccg cttacttctt cagcatcgtt cctgctcacc ttatgcgctc tatggctggt 600
gagtttgaca acgaatgcgt ggctatggct gctatgcttc tcaccttcta catgtgggtt 660
cgctctcttc gctcttcttc ttcttggcct attggcgctc ttgctggtgt tgcttacggt 720
tatatggtgt ctacatgggg cggctacatc tttgtgctca acatggtggc tttccacgct 780
tctgtttgcg tgcttcttga ttgggctcgc ggtatttaca gcgtgtctct tcttcgtgcc 840
tacagcctct ttttcgtgat tggtaccgct ctcgctatct gtgttcctcc tgttgaatgg 900
accccttttc gctctcttga gcagttaacc gctctcttcg tgttcgtgtt catgtgggct 960
cttcactaca gcgagtacct tcgtgaacgt gctagagctc ctattcacag ctctaaggct 1020
ctccaaattc gtgctcgcat ctttatgggc accctttctc ttctcctcat cgttgctagc 1080
cttcttgctc ctttcggctt ctttaagcct accgcttacc gtgttcgcgc tctttttgtt 1140
aagcacacac gcacaggcaa ccctcttgtt gattctgttg ctgagcatcg ccctactaca 1200
gctggtgctt atcttcgcta cttccacgtt tgctaccctt tatggggttg tggtggcctt 1260
agcatgctcg ttttcatgaa gaaggaccgt tggcgcgcta ttgtgtttct tgcttctctt 1320
agcaccgtga ccatgtactt ttctgctcgc atgtctcgcc ttcttctttt agctggtcct 1380
gctgctactg cttgtgctgg tatgtttatt ggcggcctct ttgaccttgc tcttagccaa 1440
tttggcgacc ttcactctcc taaggacgct tctggtgact ctgatcctgc tggtggttct 1500
aaacgtgcta agggtaaggt ggtgaacgag ccttctaaac gcgctatttt ctctcatcgc 1560
tggtttcaac gcctcgttca gtctttacct gtgcctctta gacgcggtat tgctgttgtg 1620
gttcttgtgt gcctcttcgc taatcctatg cgccactctt tcgagaagtc ttgcgagaaa 1680
atggcccacg ctctttcttc tcctcgcatt attgctgtga ccgaccttcc taatggtgag 1740
agagttcttg cagacgacta ctacgtgagc tacctttggc ttcgcaacaa cacacctgag 1800
gatgctcgca ttctttcttg gtgggattac ggttaccaga ttaccggtat cggtaaccgc 1860
acaacactcg ctgatggtaa tacctggagc cacaagcaca ttgctaccat tggcaagatg 1920
ctcacctctc ctgttaagga gtctcacgct cttattcgcc accttgctga ttacgtgctc 1980
atttgggctg gtgaagatcg tggtgacctc cttaaatctc cccatatggc tcgcattggc 2040
aactctgttt accgcgatat gtgctctgag gatgatccta gatgccgcca atttggcttt 2100
gaaggtggcg atctcaacaa gcctacccct atgatgcaac gcagccttct ttacaacctt 2160
caccgctttg gcacagatgg tggtaagaca cagctcgata agaacatgtt ccagctcgct 2220
tacgtgagca agtacggtct tgtgaagatc tacaaggtgg tgaacgtgtc tgaggagtct 2280
aaagcttggg tggctgatcc taagaaccgt gtttgtgatc ctcctggtag ctggatttgt 2340
gctggtcaat atcctcctgc caaggagatt caggacatgc ttgctaagcg cttccactac 2400
gagtag 2406
<210> 29
<211> 2466
<212> DNA
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium）
<220>
<221> misc_feature
<223> 寡糖基转移酶TbStt3B
<400> 29
atgacaaagg gcggtaaagt ggcagtgaca aagggttctg ctcagtctga tggtgctggt 60
gaaggtggta tgtctaaggc taagagctct accaccttcg tggctacagg tggtggttct 120
ttacctgctt gggctcttaa ggctgtgtct acagtggttt ctgccgtgat tctcatctac 180
tctgttcatc gcgcctacga tattcgcctt acatctgttc gcctctacgg tgagctcatt 240
cacgagtttg atccctggtt caactaccgt gctacccaat accttagcga taacggttgg 300
cgcgctttct ttcaatggta cgactacatg agctggtacc ctcttggtag acctgttggt 360
accaccattt ttcctggcat gcagcttaca ggcgtggcta ttcatcgcgt tcttgagatg 420
cttggtcgcg gtatgagcat caacaacatt tgcgtgtaca tccctgcctg gtttggctct 480
attgctactg ttcttgctgc cctcatcgct tacgagtcat ctaacagcct tagcgtgatg 540
gctttcaccg cttacttctt cagcatcgtt cctgctcacc ttatgcgctc tatggctggt 600
gagtttgaca acgaatgcgt ggctatggct gctatgcttc tcaccttcta catgtgggtt 660
cgctctcttc gctcttcttc ttcttggcct attggcgctc ttgctggtgt tgcttacggt 720
tatatggtgt ctacatgggg cggctacatc tttgtgctca acatggtggc tttccacgct 780
tctgtttgcg tgcttcttga ttgggctcgt ggtacataca gcgtgtctct tcttcgtgct 840
tacagcctct tcttcgtgat tggtaccgct ctcgctattt gcgttcctcc tgttgaatgg 900
accccttttc gctctcttga gcagttaacc gctctcttcg tgttcgtgtt catgtgggct 960
cttcactaca gcgagtacct tcgtgaacgt gctagagctc ctattcacag ctctaaggct 1020
ctccaaattc gtgctcgcat ctttatgggc accctttctc ttctcctcat cgtggctatc 1080
tacctctttt ctaccggcta ctttcgccct tttagctcta gagttcgcgc tcttttcgtg 1140
aagcatacac gtacaggcaa ccctcttgtg gattctgttg ctgagcatca tcctgctagc 1200
aacgacgact ttttcggcta ccttcacgtg tgctacaacg gttggattat cggcttcttc 1260
ttcatgagcg tgagctgctt cttccactgt acacctggta tgagcttcct tctcctctac 1320
agcattctcg cctactactt tagcctcaag atgtctcgcc tccttcttct ttctgctcct 1380
gttgctagca tccttacagg ctacgttgtt ggcagcattg tggatttagc agctgactgc 1440
ttcgctgctt ctggtacaga acatgctgat agcaaggagc atcagggtaa agctcgtggt 1500
aagggtcaaa aggagcagat tacagtggag tgcggttgcc ataacccctt ttacaagctt 1560
tggtgcaaca gcttcagctc tcgccttgtt gttggcaagt tctttgtggt tgtggtgctc 1620
agcatttgcg gtcctacctt tcttggcagc aactttcgca tctacagcga gcaattcgca 1680
gactctatga gctctcctca gatcattatg cgcgctacag ttggtggtcg tcgcgttatt 1740
cttgacgact actacgtgag ctacctctgg cttcgtaaca acacacctga ggatgctcgc 1800
attctttctt ggtgggatta cggttaccag attaccggta tcggtaaccg cacaacactc 1860
gctgatggta atacctggaa ccacgagcac attgctacca ttggcaagat gcttaccagc 1920
cctgttaagg agtctcacgc tcttattcgc caccttgctg attacgtgct catttgggct 1980
ggctatgatg gctctgatct ccttaagtct ccccatatgg ctcgcattgg caactctgtt 2040
taccgcgata tttgctctga ggacgaccct ctttgcaccc aatttggctt ttactctggc 2100
gacttcagca agcctacccc tatgatgcaa cgctctcttc tctacaacct tcaccgcttt 2160
ggcacagatg gtggtaagac acagctcgat aagaacatgt tccagctcgc ttacgtgagc 2220
aagtacggtc ttgtgaagat ctacaaggtg atgaacgtga gcgaggagtc taaagcttgg 2280
gttgctgatc ccaagaaccg taagtgtgat gctcctggta gctggatttg cacaggtcaa 2340
tatcctcctg ccaaggagat tcaggacatg cttgctaagc gcatcgacta cgagcaactt 2400
gaggacttta accgtcgtaa ccgctctgat gcctactatc gtgcttacat gcgccaaatg 2460
ggctga 2466
<210> 30
<211> 2466
<212> DNA
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium）
<220>
<221> misc_feature
<223> 寡糖基转移酶TbStt3C
<400> 30
atgacaaagg gcggtaaagt ggcagtgaca aagggttctg ctcagtctga tggtgctggt 60
gaaggtggta tgtctaaggc taagagctct accaccttcg tggctacagg tggtggttct 120
ttacctgctt gggctcttaa ggctgtgtct acagtggttt ctgccgtgat tctcatctac 180
tctgttcatc gcgcctacga tattcgcctt acatctgttc gcctctacgg tgagctcatt 240
cacgagtttg atccctggtt caactaccgt gctacccaat accttagcga taacggttgg 300
cgcgctttct ttcaatggta cgactacatg agctggtacc ctcttggtag acctgttggt 360
accaccattt ttcctggcat gcagcttaca ggcgtggcta ttcatcgcgt tcttgagatg 420
cttggtcgcg gtatgagcat caacaacatt tgcgtgtaca tccctgcctg gtttggctct 480
attgctactg ttcttgctgc cctcatcgct tacgagtcat ctaacagcct tagcgtgatg 540
gctttcaccg cttacttctt cagcatcgtt cctgctcacc ttatgcgctc tatggctggt 600
gagtttgaca acgaatgcgt ggctatggct gctatgcttc tcaccttcta catgtgggtt 660
cgctctcttc gctcttcttc ttcttggcct attggcgctc ttgctggtgt tgcttacggt 720
tatatggtgt ctacatgggg cggctacatc tttgtgctca acatggtggc tttccacgct 780
tctgtttgcg tgcttcttga ttgggctcgt ggtacataca gcgtgtctct tcttcgtgct 840
tacagcctct tcttcgtgat tggtaccgct ctcgctattt gcgttcctcc tgttgaatgg 900
accccttttc gctctcttga gcagttaacc gctctcttcg tgttcgtgtt catgtgggct 960
cttcactaca gcgagtacct tcgtgaacgt gctagagctc ctattcacag ctctaaggct 1020
ctccaaattc gtgctcgcat ctttatgggc accctttctc ttctcctcat cgtggctatc 1080
tacctctttt ctaccggcta ctttcgcagc tttagctctc gtgttcgcgc tcttttcgtg 1140
aagcatactc gtacaggcaa ccctcttgtg gattctgttg ctgaacatcg ccctacaact 1200
gctggtgctt ttcttcgtca ccttcacgtt tgctacaacg gctggattat cggcttcttc 1260
ttcatgagcg tgagctgctt cttccactgt acacctggta tgagcttcct tctcctctac 1320
agcattctcg cctactactt tagcctcaag atgtctcgcc tccttcttct ttctgctcct 1380
gttgctagca tccttacagg ctacgttgtt ggcagcattg tggatttagc agctgactgc 1440
ttcgctgctt ctggtacaga acatgctgat agcaaggagc atcagggtaa agctcgtggt 1500
aagggtcaaa agcgccagat tacagttgag tgtggctgcc ataacccctt ctacaaactt 1560
tggtgcaaca gcttcagcag ccgcttagtt gttggcaagt tctttgtggt ggtggtgctc 1620
tctatttgcg gtcctacctt tcttggcagc gagtttagag ctcattgcga gcgttttagc 1680
gtgtctgttg caaatcctcg catcattagc agcattcgcc attctggcaa gcttgttctt 1740
gcagacgact actacgtgag ctacctttgg cttcgcaaca acacacctga ggatgctcgc 1800
attctttctt ggtgggatta cggttaccag attaccggta tcggtaaccg cacaacactc 1860
gctgatggta atacctggaa ccacgagcac attgctacca ttggcaagat gcttaccagc 1920
cctgttaagg agtctcacgc tcttattcgc caccttgctg attacgtgct catttgggct 1980
ggtgaagatc gtggtgatct tcgtaagtct cgccatatgg ctcgcattgg taactctgtt 2040
taccgcgata tgtgctctga ggatgaccct ctttgcaccc aattcggctt ttactctggc 2100
gacttcaaca agcctacccc tatgatgcaa cgcagccttc tttacaacct tcaccgcttt 2160
ggcacagatg gtggtaagac acagctcgat aagaacatgt tccagctcgc ttacgtgagc 2220
aagtacggtc ttgtgaagat ctacaaggtg atgaacgtga gcgaggagtc taaagcttgg 2280
gttgctgatc ccaagaaccg taagtgtgat gctcctggta gctggatttg tgctggtcaa 2340
tatcctcctg ccaaggagat tcaggacatg cttgctaagc gcatcgacta cgagcaactt 2400
gaggacttta accgtcgtaa ccgctctgat gcctactatc gtgcttacat gcgccaaatg 2460
ggctga 2466
<210> 31
<211> 2574
<212> DNA
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium）
<220>
<221> misc_feature
<223> 寡糖基转移酶LmStt3D
<400> 31
atgggtaagc gtaaggggaa tagtcttggc gattctggtt ctgctgctac agcttctcgt 60
gaagcttctg ctcaagctga agatgctgct tctcagacaa agaccgcttc tcctcctgct 120
aaggtgattc ttctccctaa gacccttacc gacgagaagg actttatcgg catcttccct 180
ttcccctttt ggcctgttca ctttgtgctt acagtggtgg ctctctttgt gttagctgct 240
agctgctttc aggcctttac tgttcgcatg atcagcgtgc agatctacgg ttacctcatt 300
cacgagttcg acccttggtt caactacaga gctgctgagt acatgagcac acatggttgg 360
agcgctttct ttagctggtt cgactacatg agctggtacc ctcttggtag acctgttggt 420
tctaccacat accctggcct tcagttaaca gctgtggcta ttcatcgcgc tcttgctgct 480
gctggtatgc ctatgtctct caacaacgtt tgcgtgctca tgcctgcttg gtttggtgct 540
attgctacag ctaccctcgc tttttgcacc tatgaggctt ctggctctac agttgctgca 600
gccgcagctg ctctttcttt cagcattatc cctgctcacc tcatgcgctc tatggctggt 660
gaatttgaca acgagtgcat cgctgttgct gctatgcttc ttaccttcta ctgctgggtt 720
cgctctctta gaacacgctc ttcttggcct attggcgtgt taacaggcgt tgcttacggc 780
tatatggctg ctgcttgggg tggttacatc tttgtgctca acatggtggc catgcatgct 840
ggtattagct ctatggtgga ctgggctcgt aacacataca accctagcct tcttcgcgct 900
tacaccctct tttacgttgt tggtaccgct atcgctgtgt gtgttcctcc tgttggtatg 960
agccctttca agtctcttga gcaacttggc gctcttctcg ttctcgtgtt tctttgtggc 1020
cttcaggttt gcgaggttct tagagctaga gctggtgttg aggttcgttc tcgtgcaaac 1080
ttcaagattc gcgttcgcgt gtttagcgtg atggctggtg ttgctgctct cgctatttct 1140
gttcttgctc ctacaggcta cttcggtcct ctttctgttc gtgttcgcgc tctttttgtg 1200
gagcatactc gtacaggcaa ccctcttgtg gattctgttg ctgagcacca acctgcttct 1260
cctgaagcta tgtgggcttt tcttcacgtt tgcggcgtta catggggttt aggctctatt 1320
gtgctcgctg tgagcacctt tgtgcactat tctcctagca aggtgttctg gctcctcaat 1380
tctggtgctg tgtactactt ctctacccgt atggctcgcc ttcttcttct ttctggtcct 1440
gctgcttgcc tttctacagg catttttgtg ggcaccatcc ttgaagctgc tgttcaactc 1500
agcttctggg actctgatgc tacaaaggcc aagaagcagc agaagcaagc tcaacgtcat 1560
caaagaggtg ctggtaaggg ttctggtcgt gatgatgcta agaacgctac aacagctcgc 1620
gctttttgcg acgtttttgc tggtagcagc cttgcttggg gtcatagaat ggtgctcagc 1680
attgctatgt gggctcttgt gacaacaacc gctgtgagct tcttttctag cgagtttgct 1740
agccacagca ccaagtttgc tgagcaatct agcaacccca tgatcgtgtt tgctgctgtt 1800
gtgcaaaacc gcgctactgg taaacccatg aaccttcttg tggacgacta ccttaaggcc 1860
tacgaatggc ttcgcgattc tacacctgag gatgctcgtg ttcttgcttg gtgggattac 1920
ggttaccaga ttaccggtat cggtaaccgc acctctcttg ctgatggtaa tacctggaac 1980
cacgagcaca ttgctaccat tggcaagatg cttaccagcc ctgttgttga agctcactct 2040
cttgttcgcc acatggctga ttacgtgctc atttgggctg gccaatctgg tgatctcatg 2100
aaatctcccc acatggctcg cattggcaac tctgtttacc acgacatttg ccctgatgac 2160
cctctttgcc agcaatttgg ctttcatcgc aacgactact ctcgccctac acctatgatg 2220
agagctagcc ttctctacaa cctccatgaa gctggtaagc gtaagggcgt taaggttaac 2280
cctagcctct ttcaggaggt gtacagctct aagtacggcc ttgttcgcat cttcaaggtg 2340
atgaacgtgt ctgctgagag caagaagtgg gttgctgatc ctgctaatcg cgtttgtcat 2400
cctcctggta gctggatttg tcctggtcaa tatcctcctg ccaaggagat tcaggagatg 2460
ttagctcatc gcgtgccttt tgatcaggtg acaaacgctg atcgcaagaa caacgttggc 2520
tcttaccaag aggagtacat gcgtcgtatg cgtgaatctg agaaccgccg ttaa 2574
<210> 32
<211> 2319
<212> DNA
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium）
<220>
<221> misc_feature
<223> 寡糖基转移酶LbStt3_1
<400> 32
atgtactgcc tcaacaaagc ctaccgcatt cgcatgttta gcgtgcaact ttacggctac 60
atcatccacg agttcgatcc ttggttcaac tacagagctg ccgagtacat gtctgctcat 120
ggttggtctg ccttctttag ctggttcgac tacatgagct ggtaccctct tggtagacct 180
gttggtacaa ccacataccc tggccttcag ttaacagctg tggctattca tcgcgctctt 240
gctgctgctg gtgttcctat gtctctcaac aacgtttgcg tgctcatccc tgcttggtat 300
ggtgctattg ctaccgctct tgaggctctc atgatctatg agtgcaacgg tagcggcatt 360
acagctgcta ttggcgcttt catcttcatg atcctccctg ctcaccttat gcgctctatg 420
gctggtgagt ttgacaacga gtgcattgct gttgctgcca tgcttcttac cttctacctt 480
tgggttcgct ctcttcgtac acgttgttct tggcctatcg gcattcttac cggcattgct 540
tacggctaca tggttgctgc ttggggtggt tacatctttg tgctcaacat ggtggccatg 600
catgctggta ttagctctat ggtggactgg gctcgtaaca catacaaccc tagccttctt 660
cgcgcttacg ctctctttta cgttgttggt accgctatcg ctacacgtgt tcctcctgtt 720
ggtatgagcc cttttcgctc tcttgagcaa cttggtgctc ttgctgtgct cctttttctt 780
tgcggccttc aagcttgcga ggtttttaga gctcgcgctg atgttgaggt tcgttctaga 840
gctaacttca agatccgcat gcgcgctttt agcgttatgg ctggtgttgg tgctctcgct 900
attgctgttc tttctcctac aggctacttc ggtcctctta cagctagagt tcgcgctctc 960
tttatggagc atacacgtac aggcaaccct cttgtggatt ctgttgctga acaccgcaag 1020
acaaaccctc aagcttacga gtacttcctc gacttcacct acagcatgtg gatgttaggc 1080
gctgttctcc agcttttagg tgctgctgtt ggttctcgta aggaagctcg cctctttatg 1140
ggcctttact ctcttgctac ctactacttc agcgaccgca tgtctcgtct tatggtttta 1200
gctggtcctg ctgctgctgc tattgctgct gaaattctcg gcatccctta cgaatggtgc 1260
tggacacaac ttacaggttg ggcttctcca aacacctctg ctagagaacg caagtctaag 1320
gaggatggtc cttgcaagac aaagcgcaat caacgccaga cagtggctac aaagcttgat 1380
catggtgcta gagctcgcgc tacagctgct gttaagttta tggagaccgc tcttgagcgc 1440
gttcctcttg tttttagagc tgctatcgcc atcggcatca ttggtgctac agttggtacc 1500
ccttacgtgt accagtttca agctcgctgc attcagagct cttacagctt tgctgttccc 1560
cgcatcatgt ttcacaccca acttagaact ggcgagaccg tgattgtgaa ggattacgtt 1620
gaggcctacg agtggcttcg tgataataca cctgcagatg ctcgcgtgct ttcttggtgg 1680
gattatggtt accagatcac cggtatcggt aaccgtacct ctcttgctga tggcaatacc 1740
tggaaccacg agcatattgc taccattggc aagatgctca cctctcctgt tgctgaagct 1800
cactctcttg ttcgccatat ggctgattac gtgctcattt gggctggtca aggtggtgat 1860
ctcatgaaat ctccccacat ggctcgcatt ggcaactctg tttaccacga catttgccca 1920
aacgaccctc tttgccagca ttttggcttc tacgaggact actctcgccc taaacccatg 1980
atgagagcta gccttctcta caacctccat gaagctggtc gttctgctgg tgttaaggtt 2040
gatcctagcc tctttcagga ggtgtacagc tctaagtacg gccttgttcg catcttcaag 2100
gtgatgaacg tgtctgctga gagcaagaag tgggttgctg atcctgctaa tcgcgtttgt 2160
catcctcctg gtagctggat ttgtcctggt caatatcctc ctgccaagga gattcaggag 2220
atgttagctc atcgcgtgcc ttttgaccaa atgggtaaga agcacgacga cacacacaaa 2280
gctcgtatgg ctagatctcg cacacttggt gaggcttaa 2319
<210> 33
<211> 2565
<212> DNA
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium）
<220>
<221> misc_feature
<223> 寡糖基转移酶LbStt3_3
<400> 33
atgggcaaga agaaggcaat tccgtctggc tctgttggtc ctgctacaac aacatctcgt 60
gaagctcctg gcaaggatga aggtgcttct caacctgcta agacagctgc tcttcctgtt 120
aagcctttcg tgcttccaaa cacccttacc gatgaagagg agtttgtggg catctttcct 180
tgcccttttt ggcctgttcg cttcgtgatt accgtgatgg ctcttgtgct tcttggcgct 240
tcttgcattc gcgctttcac aattcgcatg cttagcgttc agctctacgg ctacatcatt 300
cacgagtttg acccctggtt caactacaga gctgctgaat acatgagcgc tcatggttgg 360
agcgctttct ttagctggtt cgactacatg agctggtacc ctcttggtag acctgttggt 420
acaaccacat accctggcct tcagttaaca gctgtggcta ttcatcgcgc tcttgctgct 480
gctggtgttc ctatgtctct caacaacgtt tgcgtgctca tccctgcttg gtatggtgct 540
attgctaccg ctattctcgc tctttgcgct tacgaggttt ctcgttctat ggttgctgct 600
gctgttgctg ctctctcttt cagcattatc cctgctcacc ttatgcgctc tatggctggt 660
gagtttgaca acgagtgcat tgctgttgct gccatgcttc ttaccttcta cctttgggtt 720
cgctctcttc gtacacgttg ttcttggcct atcggcattc ttaccggcat tgcttacggc 780
tacatggttg ctgcttgggg tggttacatc tttgtgctca acatggtggc catgcatgct 840
ggtattagct ctatggtgga ctgggctcgt aacacataca accctagcct tcttcgcgct 900
tacgctctct tttacgttgt tggtaccgct atcgctacac gtgttcctcc tgttggtatg 960
agcccttttc gctctcttga gcaacttggt gctcttgctg tgctcctttt tctttgcggc 1020
cttcaagctt gcgaggtttt tagagctcgc gctgatgttg aggttcgttc tagagctaac 1080
ttcaagatcc gcatgcgcgc ttttagcgtt atggctggtg ttggtgctct cgctattgct 1140
gttctttctc ctacaggcta cttcggtcct cttacagcta gagttcgcgc tctctttatg 1200
gagcatacac gtacaggcaa ccctcttgtg gattctgttg ctgagcatca tcctgcttct 1260
cctgaagcta tgtggacctt tcttcacgtt tgcggcgtta catggggttt aggctctatt 1320
gtgctccttg tgtctctcct tgtggactac tctagcgcta agctcttttg gctcatgaac 1380
tctggcgctg tgtactactt ttctacccgc atgtctcgcc ttcttcttct tacaggtcct 1440
gctgcttgcc tttctacagg ttgctttgtt ggcacccttc ttgaagctgc tatccagttc 1500
accttctgga gctctgatgc tacaaaggcc aagaagcaac aggagacaca gcttcatcag 1560
aagggtgctc gtaagcactc tgatcgctca aacagcaaga acgctcttac agttcgcaca 1620
cttggcgatg ttcttcgctc tacaagctta gcttggggtc atcgtatggt gctttgcttt 1680
gctatgtggg ctctcgtgat tacagtggct gtttgccttc ttggcagcga ttttacctct 1740
cacgctacca tgtttgctcg ccaaacatct aaccccctca tcgtttttgc caccgttctt 1800
agagatcgcg ctacaggtaa gcctacacag gttcttgtgg acgactacct tcgctcttac 1860
ctttggcttc gcgataacac acctcgtaat gctcgcgttc tttcttggtg ggattacggt 1920
taccagatta ccggtatcgg taaccgcacc tctcttgctg atggtaatac ctggaaccac 1980
gagcacattg ctaccattgg caagatgctt accagccctg ttgctgaagc tcactctctt 2040
gttcgccata tggctgatta cgtgctcatt tgggctggtc aaggtggtga tctcatgaaa 2100
tctccccaca tggctcgcat tggcaactct gtttaccacg acatttgccc aaacgaccct 2160
ctttgccagc attttggctt ctacaagaac gaccgcaacc gtcctaagcc tatgatgaga 2220
gctagcctcc tctacaacct tcatgaagct ggtcgttctg ctggcgttaa ggttgatcct 2280
agcctctttc aggaggtgta cagctctaag tacggccttg ttcgcatctt caaggtgatg 2340
aacgtgtctg ctgagagcaa gaagtgggtt gctgatcctg ctaatcgcgt ttgtcatcct 2400
cctggtagct ggatttgtcc tggtcaatat cctcctgcca aggagattca ggagatgtta 2460
gctcatcgcg tgccttttga tcacgtgaac agctttagcc gcaagaaagc tggctcttac 2520
catgaggagt acatgagacg tatgcgtgag gagcaagatc gctaa 2565
<210> 34
<211> 846
<212> PRT
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium）
<220>
<221> misc_feature
<223> 寡糖基转移酶ChStt3
<400> 34
Met Lys Asn Lys Gln Leu Lys Gln Gln Thr Ala Asn Thr Tyr Arg His
1 5 10 15
Gln Ser Ala Asn Gly Asp Ser Leu Thr Arg Ala Lys Met Gly Lys Lys
20 25 30
Ala Lys Ser Ala Ala Pro Val Lys Gly Ala Ala Ser Ser Thr Thr Ser
35 40 45
Glu Pro Val Glu Ser Ser Asp Ala Pro Ala Ala Pro Gln Tyr Lys Leu
50 55 60
Val Ala Asn Pro Asn Ser Met Phe Trp Trp Gly Ile Arg Ile Ile Val
65 70 75 80
Leu Gly Phe Ala Ile Gln Leu Ala Tyr Asn Ile Arg Leu Tyr Ala Ile
85 90 95
Lys Glu Tyr Gly Leu Val Ile His Glu Phe Asp Pro Trp Phe Asn Tyr
100 105 110
Arg Ala Thr Glu Tyr Leu Lys Asp His Gly Met Arg Asp Phe Phe Arg
115 120 125
Trp Tyr Asp His Met Ser Trp Tyr Pro Leu Gly Arg Pro Val Gly Thr
130 135 140
Thr Ile Tyr Pro Gly Met Gln Ile Thr Ser Val Ala Ile Trp Asn Ala
145 150 155 160
Leu Glu Ser Leu Gly Met Pro Met Ser Leu Asn Asp Ile Cys Cys Tyr
165 170 175
Val Pro Ala Trp Phe Gly Val Ser Ala Thr Ile Phe Val Gly Leu Leu
180 185 190
Thr Ala Glu Cys Thr Gly Ser Arg Asn Ala Gly Ala Phe Ala Ser Leu
195 200 205
Val Met Ser Cys Ile Pro Ala His Thr Met Arg Ser Val Gly Gly Gly
210 215 220
Tyr Asp Asn Glu Ser Ile Ala Val Thr Ala Met Ser Met Thr Phe Phe
225 230 235 240
Phe Trp Cys Arg Ser Leu Arg Asp Asp Lys Ser Trp Ile Phe Gly Ile
245 250 255
Leu Thr Gly Leu Ser Tyr Phe Tyr Met Val Ala Ala Trp Gly Gly Tyr
260 265 270
Ile Phe Val Leu Asn Leu Ile Gly Leu His Ala Ile Val Leu Val Val
275 280 285
Asn Gly Gln Phe Ser Arg Ser Leu Tyr Trp Ser Tyr Thr Leu Phe Tyr
290 295 300
Thr Ile Gly Thr Ala Cys Ala Ile Gln Ile Pro Val Val Gly Leu Thr
305 310 315 320
Pro Leu Lys Ser Leu Glu Gln Leu Gly Pro Phe Gly Val Trp Gly Ile
325 330 335
Met Gln Leu Leu Tyr Ile Cys Asp Ile Leu Arg Glu Arg Arg Asn Leu
340 345 350
Asn Ala Lys Gln Leu Phe Gln Val Arg Ile Gln Val Phe Ser Ile Ala
355 360 365
Gly Ile Ala Phe Ala Val Val Cys Ala Met Leu Tyr Pro Thr Gly Tyr
370 375 380
Phe Gly Pro Leu Ser Ser Arg Val Arg Ser Leu Phe Val Gln His Thr
385 390 395 400
Arg Thr Gly Asn Pro Leu Val Asp Ser Val Ala Glu His Gln Pro Ala
405 410 415
Ser Ala Asn Ala Tyr Phe Gln Tyr Leu His Phe Ala Cys Tyr Leu Ala
420 425 430
Pro Ile Gly Phe Ile Arg Ser Leu Phe Ser Leu Thr Lys Ala Asn Ser
435 440 445
Phe Leu Pro Leu Tyr Gly Ala Val Gly Tyr Phe Phe Ser Ala Lys Met
450 455 460
Val Arg Leu Ile Ile Leu Leu Gly Pro Ile Ser Ser Ala Leu Ser Gly
465 470 475 480
Val Ala Leu Ala Thr Met Leu Glu Trp Cys Tyr Asn Gln Phe Phe Met
485 490 495
Asp Lys Val Pro Leu Thr Pro Glu Glu Val Ala Ala Gln Asp Asn Ser
500 505 510
Ser Ser Ala Lys Lys Arg Lys Gly Ala Ala Ala Gln Glu Glu Pro Ser
515 520 525
Ala Leu Gly Pro Asp Ile Asp Arg Leu Ile Lys Gln Ala Asn Val Phe
530 535 540
Tyr Glu Arg Asn Gly Thr Val Arg Lys Tyr Ala Ala Val Ile Leu Leu
545 550 555 560
Met Gly Leu Gly Ala Met Ala Pro Glu Phe His Lys Tyr Cys His Ala
565 570 575
Met Ala Arg Ala Met Ser Asn Pro Ser Ile Met Tyr Asn Ala Arg Thr
580 585 590
Arg Asp Gly Arg Thr Val Leu Val Asp Asp Tyr Arg Glu Ala Tyr Phe
595 600 605
Trp Leu Arg Asp Asn Thr Pro Glu Asp Ala Arg Val Met Ala Trp Trp
610 615 620
Asp Tyr Gly Tyr Gln Ile Ala Gly Ile Gly Asn Arg Thr Thr Ile Ala
625 630 635 640
Asp Gly Asn Thr Trp Asn His Glu His Ile Ala Thr Leu Gly Arg Cys
645 650 655
Leu Val Ser Pro Glu Glu Thr Ala His Lys Met Ile Arg His Leu Ala
660 665 670
Asp Tyr Val Leu Ile Trp Thr Gly Gly Gly Gly Asp Asp Leu Ala Lys
675 680 685
Met Pro His Ile Ala Arg Ile Ala Asn Ser Val Tyr Ser Ser Val Cys
690 695 700
Asn Gly Asp Pro Leu Cys Ser Gln Leu Gly Tyr Ile Asp Arg Gln Gly
705 710 715 720
Thr Pro Ser Glu Met Met Ala Asn Ser Leu Ile Tyr Lys Leu His Ser
725 730 735
Gly Phe Gln Arg Pro Gly Val Val Val Asp Gln Asn Arg Phe Glu Asn
740 745 750
Val Phe Thr Ser Lys Tyr Asn Lys Val Arg Ile Trp Arg Val Lys Ser
755 760 765
Val Asp Lys Glu Ser Lys Ala Trp Ala Ala Asp Leu Ala Asn Lys Lys
770 775 780
Cys Asp Pro Ala Pro Asn Asp Phe Ile Cys Lys Gly Asp Tyr Pro Pro
785 790 795 800
Lys Phe Arg Glu Phe Ile Lys Asp Arg Gln Asp Phe Ala Gln Leu Glu
805 810 815
Asp Phe Asn Ala Lys Lys Lys Thr Lys Glu Ala Glu Glu Tyr Gln Lys
820 825 830
Arg Tyr His Glu Glu Met Ala Arg Arg Gly Gln Arg Arg Asn
835 840 845
<210> 35
<211> 801
<212> PRT
<213> 布氏锥虫（Trypanosoma brucei）
<220>
<221> misc_feature
<223> 寡糖基转移酶TbStt3A
<400> 35
Met Thr Lys Gly Gly Lys Val Ala Val Thr Lys Gly Ser Ala Gln Ser
1 5 10 15
Asp Gly Ala Gly Glu Gly Gly Met Ser Lys Ala Lys Ser Ser Thr Thr
20 25 30
Phe Val Ala Thr Gly Gly Gly Ser Leu Pro Ala Trp Ala Leu Lys Ala
35 40 45
Val Ser Thr Ile Val Ser Ala Val Ile Leu Ile Tyr Ser Val His Arg
50 55 60
Ala Tyr Asp Ile Arg Leu Thr Ser Val Arg Leu Tyr Gly Glu Leu Ile
65 70 75 80
His Glu Phe Asp Pro Trp Phe Asn Tyr Arg Ala Thr Gln Tyr Leu Ser
85 90 95
Asp Asn Gly Trp Arg Ala Phe Phe Gln Trp Tyr Asp Tyr Met Ser Trp
100 105 110
Tyr Pro Leu Gly Arg Pro Val Gly Thr Thr Ile Phe Pro Gly Met Gln
115 120 125
Leu Thr Gly Val Ala Ile His Arg Val Leu Glu Met Leu Gly Arg Gly
130 135 140
Met Ser Ile Asn Asn Ile Cys Val Tyr Ile Pro Ala Trp Phe Gly Ser
145 150 155 160
Ile Ala Thr Val Leu Ala Ala Leu Ile Ala Tyr Glu Ser Ser Asn Ser
165 170 175
Leu Ser Val Met Ala Phe Thr Ala Tyr Phe Phe Ser Ile Val Pro Ala
180 185 190
His Leu Met Arg Ser Met Ala Gly Glu Phe Asp Asn Glu Cys Val Ala
195 200 205
Met Ala Ala Met Leu Leu Thr Phe Tyr Met Trp Val Arg Ser Leu Arg
210 215 220
Ser Ser Ser Ser Trp Pro Ile Gly Ala Leu Ala Gly Val Ala Tyr Gly
225 230 235 240
Tyr Met Val Ser Thr Trp Gly Gly Tyr Ile Phe Val Leu Asn Met Val
245 250 255
Ala Phe His Ala Ser Val Cys Val Leu Leu Asp Trp Ala Arg Gly Ile
260 265 270
Tyr Ser Val Ser Leu Leu Arg Ala Tyr Ser Leu Phe Phe Val Ile Gly
275 280 285
Thr Ala Leu Ala Ile Cys Val Pro Pro Val Glu Trp Thr Pro Phe Arg
290 295 300
Ser Leu Glu Gln Leu Thr Ala Leu Phe Val Phe Val Phe Met Trp Ala
305 310 315 320
Leu His Tyr Ser Glu Tyr Leu Arg Glu Arg Ala Arg Ala Pro Ile His
325 330 335
Ser Ser Lys Ala Leu Gln Ile Arg Ala Arg Ile Phe Met Gly Thr Leu
340 345 350
Ser Leu Leu Leu Ile Val Ala Ser Leu Leu Ala Pro Phe Gly Phe Phe
355 360 365
Lys Pro Thr Ala Tyr Arg Val Arg Ala Leu Phe Val Lys His Thr Arg
370 375 380
Thr Gly Asn Pro Leu Val Asp Ser Val Ala Glu His Arg Pro Thr Thr
385 390 395 400
Ala Gly Ala Tyr Leu Arg Tyr Phe His Val Cys Tyr Pro Leu Trp Gly
405 410 415
Cys Gly Gly Leu Ser Met Leu Val Phe Met Lys Lys Asp Arg Trp Arg
420 425 430
Ala Ile Val Phe Leu Ala Ser Leu Ser Thr Val Thr Met Tyr Phe Ser
435 440 445
Ala Arg Met Ser Arg Leu Leu Leu Leu Ala Gly Pro Ala Ala Thr Ala
450 455 460
Cys Ala Gly Met Phe Ile Gly Gly Leu Phe Asp Leu Ala Leu Ser Gln
465 470 475 480
Phe Gly Asp Leu His Ser Pro Lys Asp Ala Ser Gly Asp Ser Asp Pro
485 490 495
Ala Gly Gly Ser Lys Arg Ala Lys Gly Lys Val Val Asn Glu Pro Ser
500 505 510
Lys Arg Ala Ile Phe Ser His Arg Trp Phe Gln Arg Leu Val Gln Ser
515 520 525
Leu Pro Val Pro Leu Arg Arg Gly Ile Ala Val Val Val Leu Val Cys
530 535 540
Leu Phe Ala Asn Pro Met Arg His Ser Phe Glu Lys Ser Cys Glu Lys
545 550 555 560
Met Ala His Ala Leu Ser Ser Pro Arg Ile Ile Ala Val Thr Asp Leu
565 570 575
Pro Asn Gly Glu Arg Val Leu Ala Asp Asp Tyr Tyr Val Ser Tyr Leu
580 585 590
Trp Leu Arg Asn Asn Thr Pro Glu Asp Ala Arg Ile Leu Ser Trp Trp
595 600 605
Asp Tyr Gly Tyr Gln Ile Thr Gly Ile Gly Asn Arg Thr Thr Leu Ala
610 615 620
Asp Gly Asn Thr Trp Ser His Lys His Ile Ala Thr Ile Gly Lys Met
625 630 635 640
Leu Thr Ser Pro Val Lys Glu Ser His Ala Leu Ile Arg His Leu Ala
645 650 655
Asp Tyr Val Leu Ile Trp Ala Gly Glu Asp Arg Gly Asp Leu Leu Lys
660 665 670
Ser Pro His Met Ala Arg Ile Gly Asn Ser Val Tyr Arg Asp Met Cys
675 680 685
Ser Glu Asp Asp Pro Arg Cys Arg Gln Phe Gly Phe Glu Gly Gly Asp
690 695 700
Leu Asn Lys Pro Thr Pro Met Met Gln Arg Ser Leu Leu Tyr Asn Leu
705 710 715 720
His Arg Phe Gly Thr Asp Gly Gly Lys Thr Gln Leu Asp Lys Asn Met
725 730 735
Phe Gln Leu Ala Tyr Val Ser Lys Tyr Gly Leu Val Lys Ile Tyr Lys
740 745 750
Val Val Asn Val Ser Glu Glu Ser Lys Ala Trp Val Ala Asp Pro Lys
755 760 765
Asn Arg Val Cys Asp Pro Pro Gly Ser Trp Ile Cys Ala Gly Gln Tyr
770 775 780
Pro Pro Ala Lys Glu Ile Gln Asp Met Leu Ala Lys Arg Phe His Tyr
785 790 795 800
Glu
<210> 36
<211> 801
<212> PRT
<213> 布氏锥虫（Trypanosoma brucei）
<220>
<221> misc_feature
<223> 寡糖基转移酶TbStt3B
<400> 36
Met Thr Lys Gly Gly Lys Val Ala Val Thr Lys Gly Ser Ala Gln Ser
1 5 10 15
Asp Gly Ala Gly Glu Gly Gly Met Ser Lys Ala Lys Ser Ser Thr Thr
20 25 30
Phe Val Ala Thr Gly Gly Gly Ser Leu Pro Ala Trp Ala Leu Lys Ala
35 40 45
Val Ser Thr Ile Val Ser Ala Val Ile Leu Ile Tyr Ser Val His Arg
50 55 60
Ala Tyr Asp Ile Arg Leu Thr Ser Val Arg Leu Tyr Gly Glu Leu Ile
65 70 75 80
His Glu Phe Asp Pro Trp Phe Asn Tyr Arg Ala Thr Gln Tyr Leu Ser
85 90 95
Asp Asn Gly Trp Arg Ala Phe Phe Gln Trp Tyr Asp Tyr Met Ser Trp
100 105 110
Tyr Pro Leu Gly Arg Pro Val Gly Thr Thr Ile Phe Pro Gly Met Gln
115 120 125
Leu Thr Gly Val Ala Ile His Arg Val Leu Glu Met Leu Gly Arg Gly
130 135 140
Met Ser Ile Asn Asn Ile Cys Val Tyr Ile Pro Ala Trp Phe Gly Ser
145 150 155 160
Ile Ala Thr Val Leu Ala Ala Leu Ile Ala Tyr Glu Ser Ser Asn Ser
165 170 175
Leu Ser Val Met Ala Phe Thr Ala Tyr Phe Phe Ser Ile Val Pro Ala
180 185 190
His Leu Met Arg Ser Met Ala Gly Glu Phe Asp Asn Glu Cys Val Ala
195 200 205
Met Ala Ala Met Leu Leu Thr Phe Tyr Met Trp Val Arg Ser Leu Arg
210 215 220
Ser Ser Ser Ser Trp Pro Ile Gly Ala Leu Ala Gly Val Ala Tyr Gly
225 230 235 240
Tyr Met Val Ser Thr Trp Gly Gly Tyr Ile Phe Val Leu Asn Met Val
245 250 255
Ala Phe His Ala Ser Val Cys Val Leu Leu Asp Trp Ala Arg Gly Ile
260 265 270
Tyr Ser Val Ser Leu Leu Arg Ala Tyr Ser Leu Phe Phe Val Ile Gly
275 280 285
Thr Ala Leu Ala Ile Cys Val Pro Pro Val Glu Trp Thr Pro Phe Arg
290 295 300
Ser Leu Glu Gln Leu Thr Ala Leu Phe Val Phe Val Phe Met Trp Ala
305 310 315 320
Leu His Tyr Ser Glu Tyr Leu Arg Glu Arg Ala Arg Ala Pro Ile His
325 330 335
Ser Ser Lys Ala Leu Gln Ile Arg Ala Arg Ile Phe Met Gly Thr Leu
340 345 350
Ser Leu Leu Leu Ile Val Ala Ser Leu Leu Ala Pro Phe Gly Phe Phe
355 360 365
Lys Pro Thr Ala Tyr Arg Val Arg Ala Leu Phe Val Lys His Thr Arg
370 375 380
Thr Gly Asn Pro Leu Val Asp Ser Val Ala Glu His Arg Pro Thr Thr
385 390 395 400
Ala Gly Ala Tyr Leu Arg Tyr Phe His Val Cys Tyr Pro Leu Trp Gly
405 410 415
Cys Gly Gly Leu Ser Met Leu Val Phe Met Lys Lys Asp Arg Trp Arg
420 425 430
Ala Ile Val Phe Leu Ala Ser Leu Ser Thr Val Thr Met Tyr Phe Ser
435 440 445
Ala Arg Met Ser Arg Leu Leu Leu Leu Ala Gly Pro Ala Ala Thr Ala
450 455 460
Cys Ala Gly Met Phe Ile Gly Gly Leu Phe Asp Leu Ala Leu Ser Gln
465 470 475 480
Phe Gly Asp Leu His Ser Pro Lys Asp Ala Ser Gly Asp Ser Asp Pro
485 490 495
Ala Gly Gly Ser Lys Arg Ala Lys Gly Lys Val Val Asn Glu Pro Ser
500 505 510
Lys Arg Ala Ile Phe Ser His Arg Trp Phe Gln Arg Leu Val Gln Ser
515 520 525
Leu Pro Val Pro Leu Arg Arg Gly Ile Ala Val Val Val Leu Val Cys
530 535 540
Leu Phe Ala Asn Pro Met Arg His Ser Phe Glu Lys Ser Cys Glu Lys
545 550 555 560
Met Ala His Ala Leu Ser Ser Pro Arg Ile Ile Ala Val Thr Asp Leu
565 570 575
Pro Asn Gly Glu Arg Val Leu Ala Asp Asp Tyr Tyr Val Ser Tyr Leu
580 585 590
Trp Leu Arg Asn Asn Thr Pro Glu Asp Ala Arg Ile Leu Ser Trp Trp
595 600 605
Asp Tyr Gly Tyr Gln Ile Thr Gly Ile Gly Asn Arg Thr Thr Leu Ala
610 615 620
Asp Gly Asn Thr Trp Ser His Lys His Ile Ala Thr Ile Gly Lys Met
625 630 635 640
Leu Thr Ser Pro Val Lys Glu Ser His Ala Leu Ile Arg His Leu Ala
645 650 655
Asp Tyr Val Leu Ile Trp Ala Gly Glu Asp Arg Gly Asp Leu Leu Lys
660 665 670
Ser Pro His Met Ala Arg Ile Gly Asn Ser Val Tyr Arg Asp Met Cys
675 680 685
Ser Glu Asp Asp Pro Arg Cys Arg Gln Phe Gly Phe Glu Gly Gly Asp
690 695 700
Leu Asn Lys Pro Thr Pro Met Met Gln Arg Ser Leu Leu Tyr Asn Leu
705 710 715 720
His Arg Phe Gly Thr Asp Gly Gly Lys Thr Gln Leu Asp Lys Asn Met
725 730 735
Phe Gln Leu Ala Tyr Val Ser Lys Tyr Gly Leu Val Lys Ile Tyr Lys
740 745 750
Val Val Asn Val Ser Glu Glu Ser Lys Ala Trp Val Ala Asp Pro Lys
755 760 765
Asn Arg Val Cys Asp Pro Pro Gly Ser Trp Ile Cys Ala Gly Gln Tyr
770 775 780
Pro Pro Ala Lys Glu Ile Gln Asp Met Leu Ala Lys Arg Phe His Tyr
785 790 795 800
Glu
<210> 37
<211> 821
<212> PRT
<213> 布氏锥虫（Trypanosoma brucei）
<220>
<221> misc_feature
<223> 寡糖基转移酶TbStt3C
<400> 37
Met Thr Lys Gly Gly Lys Val Ala Val Thr Lys Gly Ser Ala Gln Ser
1 5 10 15
Asp Gly Ala Gly Glu Gly Gly Met Ser Lys Ala Lys Ser Ser Thr Thr
20 25 30
Phe Val Ala Thr Gly Gly Gly Ser Leu Pro Ala Trp Ala Leu Lys Ala
35 40 45
Val Ser Thr Val Val Ser Ala Val Ile Leu Ile Tyr Ser Val His Arg
50 55 60
Ala Tyr Asp Ile Arg Leu Thr Ser Val Arg Leu Tyr Gly Glu Leu Ile
65 70 75 80
His Glu Phe Asp Pro Trp Phe Asn Tyr Arg Ala Thr Gln Tyr Leu Ser
85 90 95
Asp Asn Gly Trp Arg Ala Phe Phe Gln Trp Tyr Asp Tyr Met Ser Trp
100 105 110
Tyr Pro Leu Gly Arg Pro Val Gly Thr Thr Ile Phe Pro Gly Met Gln
115 120 125
Leu Thr Gly Val Ala Ile His Arg Val Leu Glu Met Leu Gly Arg Gly
130 135 140
Met Ser Ile Asn Asn Ile Cys Val Tyr Ile Pro Ala Trp Phe Gly Ser
145 150 155 160
Ile Ala Thr Val Leu Ala Ala Leu Ile Ala Tyr Glu Ser Ser Asn Ser
165 170 175
Leu Ser Val Met Ala Phe Thr Ala Tyr Phe Phe Ser Ile Val Pro Ala
180 185 190
His Leu Met Arg Ser Met Ala Gly Glu Phe Asp Asn Glu Cys Val Ala
195 200 205
Met Ala Ala Met Leu Leu Thr Phe Tyr Met Trp Val Arg Ser Leu Arg
210 215 220
Ser Ser Ser Ser Trp Pro Ile Gly Ala Leu Ala Gly Val Ala Tyr Gly
225 230 235 240
Tyr Met Val Ser Thr Trp Gly Gly Tyr Ile Phe Val Leu Asn Met Val
245 250 255
Ala Phe His Ala Ser Val Cys Val Leu Leu Asp Trp Ala Arg Gly Thr
260 265 270
Tyr Ser Val Ser Leu Leu Arg Ala Tyr Ser Leu Phe Phe Val Ile Gly
275 280 285
Thr Ala Leu Ala Ile Cys Val Pro Pro Val Glu Trp Thr Pro Phe Arg
290 295 300
Ser Leu Glu Gln Leu Thr Ala Leu Phe Val Phe Val Phe Met Trp Ala
305 310 315 320
Leu His Tyr Ser Glu Tyr Leu Arg Glu Arg Ala Arg Ala Pro Ile His
325 330 335
Ser Ser Lys Ala Leu Gln Ile Arg Ala Arg Ile Phe Met Gly Thr Leu
340 345 350
Ser Leu Leu Leu Ile Val Ala Ile Tyr Leu Phe Ser Thr Gly Tyr Phe
355 360 365
Arg Ser Phe Ser Ser Arg Val Arg Ala Leu Phe Val Lys His Thr Arg
370 375 380
Thr Gly Asn Pro Leu Val Asp Ser Val Ala Glu His Arg Pro Thr Thr
385 390 395 400
Ala Gly Ala Phe Leu Arg His Leu His Val Cys Tyr Asn Gly Trp Ile
405 410 415
Ile Gly Phe Phe Phe Met Ser Val Ser Cys Phe Phe His Cys Thr Pro
420 425 430
Gly Met Ser Phe Leu Leu Leu Tyr Ser Ile Leu Ala Tyr Tyr Phe Ser
435 440 445
Leu Lys Met Ser Arg Leu Leu Leu Leu Ser Ala Pro Val Ala Ser Ile
450 455 460
Leu Thr Gly Tyr Val Val Gly Ser Ile Val Asp Leu Ala Ala Asp Cys
465 470 475 480
Phe Ala Ala Ser Gly Thr Glu His Ala Asp Ser Lys Glu His Gln Gly
485 490 495
Lys Ala Arg Gly Lys Gly Gln Lys Arg Gln Ile Thr Val Glu Cys Gly
500 505 510
Cys His Asn Pro Phe Tyr Lys Leu Trp Cys Asn Ser Phe Ser Ser Arg
515 520 525
Leu Val Val Gly Lys Phe Phe Val Val Val Val Leu Ser Ile Cys Gly
530 535 540
Pro Thr Phe Leu Gly Ser Glu Phe Arg Ala His Cys Glu Arg Phe Ser
545 550 555 560
Val Ser Val Ala Asn Pro Arg Ile Ile Ser Ser Ile Arg His Ser Gly
565 570 575
Lys Leu Val Leu Ala Asp Asp Tyr Tyr Val Ser Tyr Leu Trp Leu Arg
580 585 590
Asn Asn Thr Pro Glu Asp Ala Arg Ile Leu Ser Trp Trp Asp Tyr Gly
595 600 605
Tyr Gln Ile Thr Gly Ile Gly Asn Arg Thr Thr Leu Ala Asp Gly Asn
610 615 620
Thr Trp Asn His Glu His Ile Ala Thr Ile Gly Lys Met Leu Thr Ser
625 630 635 640
Pro Val Lys Glu Ser His Ala Leu Ile Arg His Leu Ala Asp Tyr Val
645 650 655
Leu Ile Trp Ala Gly Glu Asp Arg Gly Asp Leu Arg Lys Ser Arg His
660 665 670
Met Ala Arg Ile Gly Asn Ser Val Tyr Arg Asp Met Cys Ser Glu Asp
675 680 685
Asp Pro Leu Cys Thr Gln Phe Gly Phe Tyr Ser Gly Asp Phe Asn Lys
690 695 700
Pro Thr Pro Met Met Gln Arg Ser Leu Leu Tyr Asn Leu His Arg Phe
705 710 715 720
Gly Thr Asp Gly Gly Lys Thr Gln Leu Asp Lys Asn Met Phe Gln Leu
725 730 735
Ala Tyr Val Ser Lys Tyr Gly Leu Val Lys Ile Tyr Lys Val Met Asn
740 745 750
Val Ser Glu Glu Ser Lys Ala Trp Val Ala Asp Pro Lys Asn Arg Lys
755 760 765
Cys Asp Ala Pro Gly Ser Trp Ile Cys Ala Gly Gln Tyr Pro Pro Ala
770 775 780
Lys Glu Ile Gln Asp Met Leu Ala Lys Arg Ile Asp Tyr Glu Gln Leu
785 790 795 800
Glu Asp Phe Asn Arg Arg Asn Arg Ser Asp Ala Tyr Tyr Arg Ala Tyr
805 810 815
Met Arg Gln Met Gly
820
<210> 38
<211> 857
<212> PRT
<213> 硕大利什曼原虫（Leishmania major）
<220>
<221> misc_feature
<223> 寡糖基转移酶LmStt3D
<400> 38
Met Gly Lys Arg Lys Gly Asn Ser Leu Gly Asp Ser Gly Ser Ala Ala
1 5 10 15
Thr Ala Ser Arg Glu Ala Ser Ala Gln Ala Glu Asp Ala Ala Ser Gln
20 25 30
Thr Lys Thr Ala Ser Pro Pro Ala Lys Val Ile Leu Leu Pro Lys Thr
35 40 45
Leu Thr Asp Glu Lys Asp Phe Ile Gly Ile Phe Pro Phe Pro Phe Trp
50 55 60
Pro Val His Phe Val Leu Thr Val Val Ala Leu Phe Val Leu Ala Ala
65 70 75 80
Ser Cys Phe Gln Ala Phe Thr Val Arg Met Ile Ser Val Gln Ile Tyr
85 90 95
Gly Tyr Leu Ile His Glu Phe Asp Pro Trp Phe Asn Tyr Arg Ala Ala
100 105 110
Glu Tyr Met Ser Thr His Gly Trp Ser Ala Phe Phe Ser Trp Phe Asp
115 120 125
Tyr Met Ser Trp Tyr Pro Leu Gly Arg Pro Val Gly Ser Thr Thr Tyr
130 135 140
Pro Gly Leu Gln Leu Thr Ala Val Ala Ile His Arg Ala Leu Ala Ala
145 150 155 160
Ala Gly Met Pro Met Ser Leu Asn Asn Val Cys Val Leu Met Pro Ala
165 170 175
Trp Phe Gly Ala Ile Ala Thr Ala Thr Leu Ala Phe Cys Thr Tyr Glu
180 185 190
Ala Ser Gly Ser Thr Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Phe Ser
195 200 205
Ile Ile Pro Ala His Leu Met Arg Ser Met Ala Gly Glu Phe Asp Asn
210 215 220
Glu Cys Ile Ala Val Ala Ala Met Leu Leu Thr Phe Tyr Cys Trp Val
225 230 235 240
Arg Ser Leu Arg Thr Arg Ser Ser Trp Pro Ile Gly Val Leu Thr Gly
245 250 255
Val Ala Tyr Gly Tyr Met Ala Ala Ala Trp Gly Gly Tyr Ile Phe Val
260 265 270
Leu Asn Met Val Ala Met His Ala Gly Ile Ser Ser Met Val Asp Trp
275 280 285
Ala Arg Asn Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Leu Arg Ala Tyr Thr Leu Phe
290 295 300
Tyr Val Val Gly Thr Ala Ile Ala Val Cys Val Pro Pro Val Gly Met
305 310 315 320
Ser Pro Phe Lys Ser Leu Glu Gln Leu Gly Ala Leu Leu Val Leu Val
325 330 335
Phe Leu Cys Gly Leu Gln Val Cys Glu Val Leu Arg Ala Arg Ala Gly
340 345 350
Val Glu Val Arg Ser Arg Ala Asn Phe Lys Ile Arg Val Arg Val Phe
355 360 365
Ser Val Met Ala Gly Val Ala Ala Leu Ala Ile Ser Val Leu Ala Pro
370 375 380
Thr Gly Tyr Phe Gly Pro Leu Ser Val Arg Val Arg Ala Leu Phe Val
385 390 395 400
Glu His Thr Arg Thr Gly Asn Pro Leu Val Asp Ser Val Ala Glu His
405 410 415
Gln Pro Ala Ser Pro Glu Ala Met Trp Ala Phe Leu His Val Cys Gly
420 425 430
Val Thr Trp Gly Leu Gly Ser Ile Val Leu Ala Val Ser Thr Phe Val
435 440 445
His Tyr Ser Pro Ser Lys Val Phe Trp Leu Leu Asn Ser Gly Ala Val
450 455 460
Tyr Tyr Phe Ser Thr Arg Met Ala Arg Leu Leu Leu Leu Ser Gly Pro
465 470 475 480
Ala Ala Cys Leu Ser Thr Gly Ile Phe Val Gly Thr Ile Leu Glu Ala
485 490 495
Ala Val Gln Leu Ser Phe Trp Asp Ser Asp Ala Thr Lys Ala Lys Lys
500 505 510
Gln Gln Lys Gln Ala Gln Arg His Gln Arg Gly Ala Gly Lys Gly Ser
515 520 525
Gly Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ala Thr Thr Ala Arg Ala Phe Cys Asp
530 535 540
Val Phe Ala Gly Ser Ser Leu Ala Trp Gly His Arg Met Val Leu Ser
545 550 555 560
Ile Ala Met Trp Ala Leu Val Thr Thr Thr Ala Val Ser Phe Phe Ser
565 570 575
Ser Glu Phe Ala Ser His Ser Thr Lys Phe Ala Glu Gln Ser Ser Asn
580 585 590
Pro Met Ile Val Phe Ala Ala Val Val Gln Asn Arg Ala Thr Gly Lys
595 600 605
Pro Met Asn Leu Leu Val Asp Asp Tyr Leu Lys Ala Tyr Glu Trp Leu
610 615 620
Arg Asp Ser Thr Pro Glu Asp Ala Arg Val Leu Ala Trp Trp Asp Tyr
625 630 635 640
Gly Tyr Gln Ile Thr Gly Ile Gly Asn Arg Thr Ser Leu Ala Asp Gly
645 650 655
Asn Thr Trp Asn His Glu His Ile Ala Thr Ile Gly Lys Met Leu Thr
660 665 670
Ser Pro Val Val Glu Ala His Ser Leu Val Arg His Met Ala Asp Tyr
675 680 685
Val Leu Ile Trp Ala Gly Gln Ser Gly Asp Leu Met Lys Ser Pro His
690 695 700
Met Ala Arg Ile Gly Asn Ser Val Tyr His Asp Ile Cys Pro Asp Asp
705 710 715 720
Pro Leu Cys Gln Gln Phe Gly Phe His Arg Asn Asp Tyr Ser Arg Pro
725 730 735
Thr Pro Met Met Arg Ala Ser Leu Leu Tyr Asn Leu His Glu Ala Gly
740 745 750
Lys Arg Lys Gly Val Lys Val Asn Pro Ser Leu Phe Gln Glu Val Tyr
755 760 765
Ser Ser Lys Tyr Gly Leu Val Arg Ile Phe Lys Val Met Asn Val Ser
770 775 780
Ala Glu Ser Lys Lys Trp Val Ala Asp Pro Ala Asn Arg Val Cys His
785 790 795 800
Pro Pro Gly Ser Trp Ile Cys Pro Gly Gln Tyr Pro Pro Ala Lys Glu
805 810 815
Ile Gln Glu Met Leu Ala His Arg Val Pro Phe Asp Gln Val Thr Asn
820 825 830
Ala Asp Arg Lys Asn Asn Val Gly Ser Tyr Gln Glu Glu Tyr Met Arg
835 840 845
Arg Met Arg Glu Ser Glu Asn Arg Arg
850 855
<210> 39
<211> 772
<212> PRT
<213> 巴西利什曼原虫（Leishmania brasiliensis）
<220>
<221> misc_feature
<223> 寡糖基转移酶LbStt3_1
<400> 39
Met Tyr Cys Leu Asn Lys Ala Tyr Arg Ile Arg Met Phe Ser Val Gln
1 5 10 15
Leu Tyr Gly Tyr Ile Ile His Glu Phe Asp Pro Trp Phe Asn Tyr Arg
20 25 30
Ala Ala Glu Tyr Met Ser Ala His Gly Trp Ser Ala Phe Phe Ser Trp
35 40 45
Phe Asp Tyr Met Ser Trp Tyr Pro Leu Gly Arg Pro Val Gly Thr Thr
50 55 60
Thr Tyr Pro Gly Leu Gln Leu Thr Ala Val Ala Ile His Arg Ala Leu
65 70 75 80
Ala Ala Ala Gly Val Pro Met Ser Leu Asn Asn Val Cys Val Leu Ile
85 90 95
Pro Ala Trp Tyr Gly Ala Ile Ala Thr Ala Leu Glu Ala Leu Met Ile
100 105 110
Tyr Glu Cys Asn Gly Ser Gly Ile Thr Ala Ala Ile Gly Ala Phe Ile
115 120 125
Phe Met Ile Leu Pro Ala His Leu Met Arg Ser Met Ala Gly Glu Phe
130 135 140
Asp Asn Glu Cys Ile Ala Val Ala Ala Met Leu Leu Thr Phe Tyr Leu
145 150 155 160
Trp Val Arg Ser Leu Arg Thr Arg Cys Ser Trp Pro Ile Gly Ile Leu
165 170 175
Thr Gly Ile Ala Tyr Gly Tyr Met Val Ala Ala Trp Gly Gly Tyr Ile
180 185 190
Phe Val Leu Asn Met Val Ala Met His Ala Gly Ile Ser Ser Met Val
195 200 205
Asp Trp Ala Arg Asn Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Leu Arg Ala Tyr Ala
210 215 220
Leu Phe Tyr Val Val Gly Thr Ala Ile Ala Thr Arg Val Pro Pro Val
225 230 235 240
Gly Met Ser Pro Phe Arg Ser Leu Glu Gln Leu Gly Ala Leu Ala Val
245 250 255
Leu Leu Phe Leu Cys Gly Leu Gln Ala Cys Glu Val Phe Arg Ala Arg
260 265 270
Ala Asp Val Glu Val Arg Ser Arg Ala Asn Phe Lys Ile Arg Met Arg
275 280 285
Ala Phe Ser Val Met Ala Gly Val Gly Ala Leu Ala Ile Ala Val Leu
290 295 300
Ser Pro Thr Gly Tyr Phe Gly Pro Leu Thr Ala Arg Val Arg Ala Leu
305 310 315 320
Phe Met Glu His Thr Arg Thr Gly Asn Pro Leu Val Asp Ser Val Ala
325 330 335
Glu His Arg Lys Thr Asn Pro Gln Ala Tyr Glu Tyr Phe Leu Asp Phe
340 345 350
Thr Tyr Ser Met Trp Met Leu Gly Ala Val Leu Gln Leu Leu Gly Ala
355 360 365
Ala Val Gly Ser Arg Lys Glu Ala Arg Leu Phe Met Gly Leu Tyr Ser
370 375 380
Leu Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Arg Met Ser Arg Leu Met Val Leu
385 390 395 400
Ala Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ile Ala Ala Glu Ile Leu Gly Ile Pro
405 410 415
Tyr Glu Trp Cys Trp Thr Gln Leu Thr Gly Trp Ala Ser Pro Asn Thr
420 425 430
Ser Ala Arg Glu Arg Lys Ser Lys Glu Asp Gly Pro Cys Lys Thr Lys
435 440 445
Arg Asn Gln Arg Gln Thr Val Ala Thr Lys Leu Asp His Gly Ala Arg
450 455 460
Ala Arg Ala Thr Ala Ala Val Lys Phe Met Glu Thr Ala Leu Glu Arg
465 470 475 480
Val Pro Leu Val Phe Arg Ala Ala Ile Ala Ile Gly Ile Ile Gly Ala
485 490 495
Thr Val Gly Thr Pro Tyr Val Tyr Gln Phe Gln Ala Arg Cys Ile Gln
500 505 510
Ser Ser Tyr Ser Phe Ala Val Pro Arg Ile Met Phe His Thr Gln Leu
515 520 525
Arg Thr Gly Glu Thr Val Ile Val Lys Asp Tyr Val Glu Ala Tyr Glu
530 535 540
Trp Leu Arg Asp Asn Thr Pro Ala Asp Ala Arg Val Leu Ser Trp Trp
545 550 555 560
Asp Tyr Gly Tyr Gln Ile Thr Gly Ile Gly Asn Arg Thr Ser Leu Ala
565 570 575
Asp Gly Asn Thr Trp Asn His Glu His Ile Ala Thr Ile Gly Lys Met
580 585 590
Leu Thr Ser Pro Val Ala Glu Ala His Ser Leu Val Arg His Met Ala
595 600 605
Asp Tyr Val Leu Ile Trp Ala Gly Gln Gly Gly Asp Leu Met Lys Ser
610 615 620
Pro His Met Ala Arg Ile Gly Asn Ser Val Tyr His Asp Ile Cys Pro
625 630 635 640
Asn Asp Pro Leu Cys Gln His Phe Gly Phe Tyr Glu Asp Tyr Ser Arg
645 650 655
Pro Lys Pro Met Met Arg Ala Ser Leu Leu Tyr Asn Leu His Glu Ala
660 665 670
Gly Arg Ser Ala Gly Val Lys Val Asp Pro Ser Leu Phe Gln Glu Val
675 680 685
Tyr Ser Ser Lys Tyr Gly Leu Val Arg Ile Phe Lys Val Met Asn Val
690 695 700
Ser Ala Glu Ser Lys Lys Trp Val Ala Asp Pro Ala Asn Arg Val Cys
705 710 715 720
His Pro Pro Gly Ser Trp Ile Cys Pro Gly Gln Tyr Pro Pro Ala Lys
725 730 735
Glu Ile Gln Glu Met Leu Ala His Arg Val Pro Phe Asp Gln Met Gly
740 745 750
Lys Lys His Asp Asp Thr His Lys Ala Arg Met Ala Arg Ser Arg Thr
755 760 765
Leu Gly Glu Ala
770
<210> 40
<211> 854
<212> PRT
<213> 巴西利什曼原虫（Leishmania brasiliensis）
<220>
<221> misc_feature
<223> 寡糖基转移酶LbStt3_3
<400> 40
Met Gly Lys Lys Lys Ala Ile Pro Ser Gly Ser Val Gly Pro Ala Thr
1 5 10 15
Thr Thr Ser Arg Glu Ala Pro Gly Lys Asp Glu Gly Ala Ser Gln Pro
20 25 30
Ala Lys Thr Ala Ala Leu Pro Val Lys Pro Phe Val Leu Pro Asn Thr
35 40 45
Leu Thr Asp Glu Glu Glu Phe Val Gly Ile Phe Pro Cys Pro Phe Trp
50 55 60
Pro Val Arg Phe Val Ile Thr Val Met Ala Leu Val Leu Leu Gly Ala
65 70 75 80
Ser Cys Ile Arg Ala Phe Thr Ile Arg Met Leu Ser Val Gln Leu Tyr
85 90 95
Gly Tyr Ile Ile His Glu Phe Asp Pro Trp Phe Asn Tyr Arg Ala Ala
100 105 110
Glu Tyr Met Ser Ala His Gly Trp Ser Ala Phe Phe Ser Trp Phe Asp
115 120 125
Tyr Met Ser Trp Tyr Pro Leu Gly Arg Pro Val Gly Thr Thr Thr Tyr
130 135 140
Pro Gly Leu Gln Leu Thr Ala Val Ala Ile His Arg Ala Leu Ala Ala
145 150 155 160
Ala Gly Val Pro Met Ser Leu Asn Asn Val Cys Val Leu Ile Pro Ala
165 170 175
Trp Tyr Gly Ala Ile Ala Thr Ala Ile Leu Ala Leu Cys Ala Tyr Glu
180 185 190
Val Ser Arg Ser Met Val Ala Ala Ala Val Ala Ala Leu Ser Phe Ser
195 200 205
Ile Ile Pro Ala His Leu Met Arg Ser Met Ala Gly Glu Phe Asp Asn
210 215 220
Glu Cys Ile Ala Val Ala Ala Met Leu Leu Thr Phe Tyr Leu Trp Val
225 230 235 240
Arg Ser Leu Arg Thr Arg Cys Ser Trp Pro Ile Gly Ile Leu Thr Gly
245 250 255
Ile Ala Tyr Gly Tyr Met Val Ala Ala Trp Gly Gly Tyr Ile Phe Val
260 265 270
Leu Asn Met Val Ala Met His Ala Gly Ile Ser Ser Met Val Asp Trp
275 280 285
Ala Arg Asn Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Leu Arg Ala Tyr Ala Leu Phe
290 295 300
Tyr Val Val Gly Thr Ala Ile Ala Thr Arg Val Pro Pro Val Gly Met
305 310 315 320
Ser Pro Phe Arg Ser Leu Glu Gln Leu Gly Ala Leu Ala Val Leu Leu
325 330 335
Phe Leu Cys Gly Leu Gln Ala Cys Glu Val Phe Arg Ala Arg Ala Asp
340 345 350
Val Glu Val Arg Ser Arg Ala Asn Phe Lys Ile Arg Met Arg Ala Phe
355 360 365
Ser Val Met Ala Gly Val Gly Ala Leu Ala Ile Ala Val Leu Ser Pro
370 375 380
Thr Gly Tyr Phe Gly Pro Leu Thr Ala Arg Val Arg Ala Leu Phe Met
385 390 395 400
Glu His Thr Arg Thr Gly Asn Pro Leu Val Asp Ser Val Ala Glu His
405 410 415
His Pro Ala Ser Pro Glu Ala Met Trp Thr Phe Leu His Val Cys Gly
420 425 430
Val Thr Trp Gly Leu Gly Ser Ile Val Leu Leu Val Ser Leu Leu Val
435 440 445
Asp Tyr Ser Ser Ala Lys Leu Phe Trp Leu Met Asn Ser Gly Ala Val
450 455 460
Tyr Tyr Phe Ser Thr Arg Met Ser Arg Leu Leu Leu Leu Thr Gly Pro
465 470 475 480
Ala Ala Cys Leu Ser Thr Gly Cys Phe Val Gly Thr Leu Leu Glu Ala
485 490 495
Ala Ile Gln Phe Thr Phe Trp Ser Ser Asp Ala Thr Lys Ala Lys Lys
500 505 510
Gln Gln Glu Thr Gln Leu His Gln Lys Gly Ala Arg Lys His Ser Asp
515 520 525
Arg Ser Asn Ser Lys Asn Ala Leu Thr Val Arg Thr Leu Gly Asp Val
530 535 540
Leu Arg Ser Thr Ser Leu Ala Trp Gly His Arg Met Val Leu Cys Phe
545 550 555 560
Ala Met Trp Ala Leu Val Ile Thr Val Ala Val Cys Leu Leu Gly Ser
565 570 575
Asp Phe Thr Ser His Ala Thr Met Phe Ala Arg Gln Thr Ser Asn Pro
580 585 590
Leu Ile Val Phe Ala Thr Val Leu Arg Asp Arg Ala Thr Gly Lys Pro
595 600 605
Thr Gln Val Leu Val Asp Asp Tyr Leu Arg Ser Tyr Leu Trp Leu Arg
610 615 620
Asp Asn Thr Pro Arg Asn Ala Arg Val Leu Ser Trp Trp Asp Tyr Gly
625 630 635 640
Tyr Gln Ile Thr Gly Ile Gly Asn Arg Thr Ser Leu Ala Asp Gly Asn
645 650 655
Thr Trp Asn His Glu His Ile Ala Thr Ile Gly Lys Met Leu Thr Ser
660 665 670
Pro Val Ala Glu Ala His Ser Leu Val Arg His Met Ala Asp Tyr Val
675 680 685
Leu Ile Trp Ala Gly Gln Gly Gly Asp Leu Met Lys Ser Pro His Met
690 695 700
Ala Arg Ile Gly Asn Ser Val Tyr His Asp Ile Cys Pro Asn Asp Pro
705 710 715 720
Leu Cys Gln His Phe Gly Phe Tyr Lys Asn Asp Arg Asn Arg Pro Lys
725 730 735
Pro Met Met Arg Ala Ser Leu Leu Tyr Asn Leu His Glu Ala Gly Arg
740 745 750
Ser Ala Gly Val Lys Val Asp Pro Ser Leu Phe Gln Glu Val Tyr Ser
755 760 765
Ser Lys Tyr Gly Leu Val Arg Ile Phe Lys Val Met Asn Val Ser Ala
770 775 780
Glu Ser Lys Lys Trp Val Ala Asp Pro Ala Asn Arg Val Cys His Pro
785 790 795 800
Pro Gly Ser Trp Ile Cys Pro Gly Gln Tyr Pro Pro Ala Lys Glu Ile
805 810 815
Gln Glu Met Leu Ala His Arg Val Pro Phe Asp His Val Asn Ser Phe
820 825 830
Ser Arg Lys Lys Ala Gly Ser Tyr His Glu Glu Tyr Met Arg Arg Met
835 840 845
Arg Glu Glu Gln Asp Arg
850
<210> 41
<211> 3000
<212> DNA
<213> 橙壶菌属物种（Aurantiochytrium）
<220>
<221> misc_feature
<223> 肌动蛋白启动子
<400> 41
ttcatctata aagtttgatg aagattagtt caaagatcga caatgggaag tctaggtagt 60
tatggactac cataagacac ctagcttctg tgatgcatcg gggaaatgca tcggcactgg 120
accttgtggt tgccaagccg tcaagtcaaa agtgtggact agacttcaaa aactctcttt 180
attcaagata ctcacaattg aaaccaatgc ttggagaatt gttggacacc tagcctcgaa 240
tgaatttccg taacttatga acaaatttga tgatgctttt tgtatcaata tgctaaatga 300
aatggtcaaa aggtctggaa tactttacaa tgtccatcag gtctctaatt cgtaagtcga 360
aactcctttg cctttatttg tcactgtact catgactaaa cttctatatc tttactaatc 420
gactttccag tctataaatg tcaattatta gtgctaccaa gagaattttt tttgatatga 480
tgctaccccc aatacgtaga cgaggcaact ccttagatct tttagctaga gtagaagcct 540
caatccaaat caagcacttg tatgatgcag aagcctttca agcaatattc ttgtcgaaaa 600
gaaacttgca gcgtctgaaa ggtcgttgac aggtcgcgaa cacccgtact actgctgtga 660
gcttcgaaag accttttcac acatcttaag atgtgaaatg tagggcctat tctctctctt 720
ttgctaaact ttcacttcat gcctaaagtt actatctatg tacctagcca ggtacctaca 780
taccacccat gcaatgagtg attggtttgg ctagagtgtt taagaattga catgagttgc 840
agtgagagta caacttttca ttttatatga tacaatacac aagattatat caccgtgatg 900
atggtcgcta gatgttggct cacacacact cactaggaac ctggtcatag cgtttgattg 960
gcgagtgtgt gtttactcag gatttctatc cctgcaaacg aattgaaaag tacaaacaag 1020
tcaaaacaaa gaggacccta tttgatgcaa agttgtgtat tttcaatcaa agagacttga 1080
aagagtagag tgagttgcaa tccgtctttt ggaagcagac aacatgctgg caagcttaaa 1140
gcaaagcata cttgaagcaa atcttaactt gaacgcggga gtgttgcgat catggatgca 1200
ataaaaatcc aaaggttagg gttttcaaag ttagtatact gtcggctgac tcgttctgtg 1260
tatttaaagc ccccctcccc ccctctgatg ggattctgtc cttatttaat taaatggaca 1320
cacccaactt gaactttagc ataatcgtgg ctttttaatt gtaaaacgta actaaatgtc 1380
gtgctaacac actgcgcacg actcacacaa gtcaaaggct attcctacaa attacattct 1440
tcttgataga acttaaggaa aatcttattg ctctaccata gcatgggttc gggaaaactt 1500
taaaagaaaa aagcatactc ttcatactct cgtatttcct aatttatttg agcacgagcc 1560
aacacaagct ccctcgtaag agaaggtagt aggtacttta gcagtgagca tctgggtaga 1620
ggtatctgcc ttctaatatc acctacctca aggtccgtgc cacgcgcgag ggaaactctg 1680
aagaagacta ggaagtgcac tactactcca cgagggaatc ccgctttcac gagatactca 1740
actacattct cagccagtag gcacccagca ctctgtagta gctgtaccta atggaagact 1800
agatgctctg tacactcaac ttacctactt ctgtttctgc ggtgtagaat atcgcagtca 1860
ttaactaaaa acaagataaa aatgagaata ctttgtaagt ttaatttatt attagtagca 1920
atcatatcat atatggaatc tttttcgaaa gataaagcaa aaaataaaca ttattttgga 1980
aataaaaaga attgttaatc aaagcgtaag acgtcctata cagctgactg tatgatggga 2040
cattaggtaa attggtccta agaaggttca cccaagtcat tgaccattca agttgagtaa 2100
agctagtgat tcaagttgtt ttgacttgag ttttttaccc aagttaaaag atctcaactc 2160
agtacctctg actacctcgt gagagtggcc attggctttt gatatttact tgtgtaagaa 2220
gagttcctcc cgacggcagg tgggcagtag tacctaccaa taggagaagc gctacgtgct 2280
attcctgaag tacacaccac gtaggtgagt gagttttatt attcttttta ttttaaacat 2340
aatgtgtatg aagcttacta tagttagtta attttagaaa taccatacca taatatatca 2400
tctttatata gtcggggtac aacagaaaag ggcaatgaaa atcgactttg ggcgggcgag 2460
tgagagtccg cagctgctct ggccttcggg tcggtgtccg cactcacatt ggtagtctgt 2520
agacagaatt tggaccttct gtaggcagag agtacctact aggagcgtct tccaataatc 2580
gcctcgattt ccccaacctg gatgatgctg gtggctcaac ttgaactaaa acctgaggat 2640
gaaggagcca ctcgattcca cgcacaccct tcaggtggtc atttgcaggt tagcgataga 2700
ggtatctccc tcacaataca ctgtaaatag ttttgtgatt aaatacacac acgagcactc 2760
ctataaaggg tgtgtaagca aaggaaattc ctctcacaac acactgagta tcaaaagagg 2820
aacctaggac taagaaggtt atcatagatg gatctaatca gaggaggtaa cactgtaaat 2880
ttgtggagac agtggagggt ctttggccac gaagatctgc aagcgcgcca tcagcagatc 2940
cgcaaccttc gagctcaaga agcaactcaa cagtagaaga acaagcaccc aactagcaaa 3000

Claims (38)

1.一种用于产生具有低硫酸化的糖分子的破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)的重组细胞，其包含：
编码异源糖分子的核酸序列；
编码异源寡糖基转移酶的核酸序列；
其中所述重组细胞产生所述异源糖分子，与由不包含所述异源寡糖基转移酶的对应细胞产生的相同异源糖分子相比，所述异源糖分子具有较少的硫酸化聚糖。
2.根据权利要求1所述的重组细胞，其中所述糖分子是糖蛋白或糖肽，并且其中所述重组细胞还包含甘露糖基转移酶基因中的遗传修饰。
3.根据权利要求2所述的重组细胞，其中所述甘露糖基转移酶基因为alg3。
4.根据权利要求3所述的重组细胞，其中所述异源寡糖基转移酶来自原生动物，并且还包含调控编码所述异源寡糖基转移酶的序列的原生动物启动子。
5.根据权利要求4所述的重组细胞，其中所述异源寡糖基转移酶为单一蛋白酶。
6.根据权利要求3所述的重组细胞，其中所述寡糖基转移酶来自锥虫科(Trypanosomatidae)的原生动物。
7.根据权利要求5所述的重组细胞，其中所述原生动物为锥体虫。
8.根据权利要求5所述的重组细胞，其中所述原生动物为利什曼原虫属(Leishmania)。
9.根据权利要求5所述的重组细胞，其中所述原生动物基因包含调控编码所述异源寡糖基转移酶的所述序列的原生动物启动子。
10.根据权利要求8所述的重组细胞，其中所述异源寡糖基转移酶包含原生动物寡糖基转移酶的Stt3亚基。
11.根据权利要求10所述的重组细胞，其中所述异源寡糖基转移酶是由选自以下的基因编码的原生动物酶：TbStt3A、TbStt3B、LmStt3D、LbStt3_1和LbStt3_3。
12.根据权利要求11所述的重组细胞，其中所述基因处于来自破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)的生物体的启动子的控制下。
13.根据权利要求3所述的重组细胞，其中所述异源糖蛋白或糖肽包含少于65％的硫酸化聚糖。
14.根据权利要求13所述的重组细胞，其中所述异源糖蛋白或糖肽包含少于50％的硫酸化聚糖。
15.根据权利要求3所述的重组细胞，其中所述细胞产生并分泌所述异源糖蛋白或糖肽分子或其功能部分。
16.根据权利要求15所述的重组细胞，其中所述异源糖蛋白或糖肽是抗体分子或其功能部分。
17.根据权利要求3所述的重组细胞，其中所述聚糖是N-聚糖并包含Man3-5GlcNAc2。
18.根据权利要求3所述的重组细胞，其中所述异源糖蛋白或糖肽包含小于60％的S-Man3-5/(S-Man3-5+Man3-5)比率。
19.根据权利要求3所述的重组细胞，其中所述异源糖蛋白或糖肽分子是抗体分子或其部分。
20.根据权利要求3所述的重组细胞，其中所述破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)细胞是选自以下的属：日本壶菌属(Japanochytrium)、椭圆壶菌属(Oblongichytrium)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、橙壶菌属(Aurantiochytrium)和裂殖壶菌属(Schizochytrium)。
21.根据权利要求20所述的重组细胞，其中所述破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)细胞是橙壶菌属(Aurantiochytrium)或裂殖壶菌属(Schizochytrium)。
22.根据权利要求3所述的重组细胞，其中所述异源糖蛋白或糖肽选自：曲妥珠单抗、依库珠单抗、那他珠单抗、西妥昔单抗、奥马珠单抗、优特克单抗、帕尼单抗和阿达木单抗、或它们中任一种的功能性片段。
23.根据权利要求4所述的重组细胞，其中所述异源糖蛋白或糖肽包含少于65％的硫酸化聚糖。
24.根据权利要求23所述的重组细胞，其中所述异源糖蛋白或糖肽包含少于50％的硫酸化聚糖。
25.一种组合物，所述组合物包含由根据权利要求4所述的重组细胞产生的所述异源糖蛋白或糖肽。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述异源糖蛋白或糖肽是免疫球蛋白。
27.根据权利要求25所述的组合物，其中所述异源糖蛋白或糖肽选自：曲妥珠单抗、依库珠单抗、那他珠单抗、西妥昔单抗、奥马珠单抗、优特克单抗、帕尼单抗和阿达木单抗、或它们中任一种的功能性片段。
28.根据权利要求25所述的组合物，所述组合物包含在药学上可接受的载体中。
29.一种产生具有包括低聚糖硫酸化的糖基化谱的糖分子的方法，包括：
提供包含编码异源糖分子的核酸的重组破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)细胞；
编码异源寡糖基转移酶的序列；并且
其中所述重组细胞产生所述异源糖分子，与由不包含所述异源寡糖基转移酶的对应细胞产生的相同异源糖分子相比，所述异源糖分子具有较少的硫酸化聚糖。
30.根据权利要求29所述的重组细胞，还包含甘露糖基转移酶基因中的遗传修饰。
31.根据权利要求30所述的重组细胞，其中所述甘露糖基转移酶基因为alg3。
32.根据权利要求30所述的重组细胞，其中所述异源糖分子具有聚糖谱，所述聚糖谱具有少于65％的硫酸化聚糖。
33.根据权利要求30所述的重组细胞，其中所述异源糖蛋白或糖肽包含小于60％的S-Man3-5/(S-Man3-5+Man3-5)比率。
34.根据权利要求32所述的重组细胞，其中所述寡糖基转移酶来自锥体虫。
35.根据权利要求34所述的重组细胞，其中所述异源糖蛋白或糖肽分子是抗体分子或其部分。
36.根据权利要求35所述的重组细胞，其中所述异源糖蛋白或糖肽选自：曲妥珠单抗、依库珠单抗、那他珠单抗、西妥昔单抗、奥马珠单抗、优特克单抗、帕尼单抗和阿达木单抗、或它们中任一种的功能性片段。
37.根据权利要求34所述的重组细胞，其中所述异源寡糖基转移酶是由选自以下的基因编码的原生动物酶：TbStt3A、TbStt3B、LmStt3D、LbStt3_1和LbStt3_3。
38.根据权利要求37所述的重组细胞，其中所述基因处于来自破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)的生物体的启动子的控制下。
CN201980029409.7A 2018-05-01 2019-04-30 用于产生具有低硫酸化的糖分子的重组生物体和方法 Pending CN112041456A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862665187P 2018-05-01 2018-05-01
US62/665,187 2018-05-01
PCT/US2019/029900 WO2019213069A1 (en) 2018-05-01 2019-04-30 Recombinant organisms and methods for producing glycomolecules with low sulfation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112041456A true CN112041456A (zh) 2020-12-04

Family

ID=68386934

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980029409.7A Pending CN112041456A (zh) 2018-05-01 2019-04-30 用于产生具有低硫酸化的糖分子的重组生物体和方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20210087540A1 (zh)
EP (1) EP3788163A4 (zh)
CN (1) CN112041456A (zh)
WO (1) WO2019213069A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3265567B1 (en) 2015-03-02 2020-07-29 Conagen Inc. Regulatory elements from labyrinthulomycetes microorganisms
US10633454B2 (en) 2016-11-01 2020-04-28 Conagen Inc. Expression of modified glycoproteins and glycopeptides

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050208617A1 (en) * 2000-06-28 2005-09-22 Piotr Bobrowicz N-acetylglucosamintransferase III expression in lower eukaryotes
US20100221763A1 (en) * 2005-10-17 2010-09-02 Health Research, Inc Specific Acceptors for Transferases to Saccharides and Method for Obtaining and Using Same
CN102858949A (zh) * 2010-02-24 2013-01-02 默沙东公司 用于增加在巴氏毕赤酵母中生产的治疗性糖蛋白上的n-糖基化位点占据的方法
US20160153019A1 (en) * 2013-07-10 2016-06-02 Novartis Ag Production of Glycoproteins Having Increased N-Glycosylation Site Occupancy
US20170268015A1 (en) * 2016-03-16 2017-09-21 Synthetic Genomics, Inc. Production of proteins in labyrinthulomycetes

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050208617A1 (en) * 2000-06-28 2005-09-22 Piotr Bobrowicz N-acetylglucosamintransferase III expression in lower eukaryotes
US20100221763A1 (en) * 2005-10-17 2010-09-02 Health Research, Inc Specific Acceptors for Transferases to Saccharides and Method for Obtaining and Using Same
CN102858949A (zh) * 2010-02-24 2013-01-02 默沙东公司 用于增加在巴氏毕赤酵母中生产的治疗性糖蛋白上的n-糖基化位点占据的方法
US20160153019A1 (en) * 2013-07-10 2016-06-02 Novartis Ag Production of Glycoproteins Having Increased N-Glycosylation Site Occupancy
US20170268015A1 (en) * 2016-03-16 2017-09-21 Synthetic Genomics, Inc. Production of proteins in labyrinthulomycetes

Also Published As

Publication number Publication date
US20210087540A1 (en) 2021-03-25
EP3788163A1 (en) 2021-03-10
EP3788163A4 (en) 2022-01-26
WO2019213069A1 (en) 2019-11-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101930961B1 (ko) 피키아 파스토리스에서 생산된 치료 당단백질 상의 ｎ-글리코실화 부위 점유를 증가시키는 방법
CA2715107C (en) Production of glycosylated polypeptides in microalgae
EP1505149B1 (en) Methylotroph yeast producing mammalian type sugar chain
EP3172333B1 (en) Production of glycoproteins with mammalian-like n-glycans in filamentous fungi
US20200399649A1 (en) Organisms and methods for producing glycomolecules with low sulfation
CN103333860A (zh) 产生抗体组合物的细胞
Kainz et al. N-glycan modification in Aspergillus species
JP2012506710A (ja) 宿主細胞中での糖鎖付加タンパク質の産生のための新規ツール
KR20140091017A (ko) Alg3 발현이 결핍된 피키아 파스토리스 균주에서 n-글리칸 점유율을 증가시키고 하이브리드 n-글리칸의 생산을 감소시키는 방법
US20210087540A1 (en) Recombinant organisms and methods for producing glycomolecules with low sulfation
US20210189002A1 (en) Recombinant organisms and methods for producing glycomolecules with high glycan occupancy
WO2021254054A1 (zh) 一种预防冠状病毒引起疾病的疫苗
KR102134936B1 (ko) Crz1 돌연변이체 진균 세포
US10633454B2 (en) Expression of modified glycoproteins and glycopeptides
US10457970B2 (en) Expression of modified glycoproteins and glycopeptides
CN113754739B (zh) 一种冠状病毒s蛋白rbd糖蛋白的制备方法及其应用
CN113754739A (zh) 一种冠状病毒s蛋白rbd糖蛋白的制备方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination