CN112034188A - 一种检测牛cart活性肽与牛卵泡颗粒细胞膜受体是否结合的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测牛CART活性肽与牛卵泡颗粒细胞膜受体是否结合的方法，包括如下步骤：S1、合成牛CART基因，亚克隆构建到表达载体pATX1上，哺乳系统表达目的蛋白，纯化后去内毒素，并标记生物素，制备出生物素标记的CART活性肽；S2、牛卵泡颗粒细胞膜碎片的获取；S3、通过BLItz单样本分子互作分析仪检测是否出现结合信号，从而检测牛卵泡颗粒细胞膜是否存在CART受体。本发明无需合成特定膜蛋白，可有效解决跨膜蛋白合成困难的问题，为鉴定CART受体及CART调控牛卵泡发育机理奠定基础，并为筛选神经肽受体提供思路。

Description

一种检测牛CART活性肽与牛卵泡颗粒细胞膜受体是否结合的 方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测牛CART活性肽与牛卵泡颗粒细胞膜受体是否结合的方法。
背景技术
可卡因-苯丙胺调节转录肽（Cocaine - and Amphetamine - RegulatedTranscript Peptide，CART）是一种在牛卵泡发育过程中起负调控作用的神经肽，神经肽属于经典类激素，其对靶细胞的调控作用是通过其受体——靶细胞膜上的G蛋白偶联受体实现的。
已知神经肽受体除心房钠尿肽受体外，均为鸟核苷酸调节蛋白，即G蛋白偶联受体，由于G蛋白偶联受体为结构复杂的7次跨膜蛋白，故通过蛋白重组或合成，检测与其配体是否结合的方法不可行。
生物膜干涉技术（Biolayer Interferometry，BLI）可实时监控分子间的结合过程，该技术中抗原分子结合到光纤材质的生物传感器末端时形成生物膜，当抗原—抗体结合后生物膜厚度发生变化，此时，光通过传感器产生干涉光波，生物膜厚度是否变化通过干涉光波是否发生相对位移即可判断，干涉光波被光谱仪检测并形成干涉光谱，以干涉图谱的实时位移（nm）显示出来。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种检测牛CART活性肽与牛卵泡颗粒细胞膜受体是否结合的方法，通过特定传感器固化CART，然后与细胞膜碎片结合，通过干涉图谱实时位移（nm）的变化判断是否有结合信号，从而检测CART受体是否存在，无需合成特定膜蛋白，可有效解决跨膜蛋白合成困难的问题。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种检测牛CART活性肽与牛卵泡颗粒细胞膜受体是否结合的方法，包括如下步骤：
S1、合成牛
Figure 812356DEST_PATH_IMAGE001
基因，亚克隆构建到表达载体
Figure 145249DEST_PATH_IMAGE002
上，哺乳系统表达目的蛋白，纯化后去内毒素，并标记生物素，制备出生物素标记的
Figure 100566DEST_PATH_IMAGE001
活性肽；
S2、牛卵泡颗粒细胞膜碎片的获取；
S3、通过
Figure 860712DEST_PATH_IMAGE003
单样本分子互作分析仪检测是否出现结合信号，从而检测牛卵泡颗粒细胞膜是否存在CART受体。
进一步地，所述步骤S1具体包括如下步骤：
S11、取PCR管并标记，依次加入4
Figure 65428DEST_PATH_IMAGE004
同源重组酶，5
Figure 936432DEST_PATH_IMAGE004
目的基因片段，1
Figure 277415DEST_PATH_IMAGE004
线性化载体；吹打均匀后，置于预热的50℃ PCR仪中孵育45 min，得重组质粒；
S12、检测所得重组质粒的浓度及纯度，对纯度符合要求的质粒进行酶切，配制如下酶切体系：6
Figure 474041DEST_PATH_IMAGE004
Figure 634895DEST_PATH_IMAGE005
I内切酶，10
Figure 778432DEST_PATH_IMAGE006
10×
Figure 973921DEST_PATH_IMAGE007
，50
Figure 341448DEST_PATH_IMAGE008
质粒；
将酶切混合物放入37℃水浴锅中酶切30 min，并混匀，酶切后，根据质粒体积加入0.75倍异丙醇，混匀，4℃离心30 min后弃上清，加入1 mL 70%乙醇4 ℃离心5 min，进行回收；
S13、将质粒瞬时转染到
Figure 989598DEST_PATH_IMAGE009
细胞中，收集培养基和细胞，直至存活率下降到50%以下，具体操作如下：
（1）转染前一天，接种27×106个细胞到完全培养基中培养；
（2）稀释15
Figure 202405DEST_PATH_IMAGE010
DNA 至1.5 mL 完全培养基中，轻柔混匀，另稀释45
Figure 517980DEST_PATH_IMAGE011
PEI转染试剂至1.5 mL完全培养基中，轻柔混匀，各自室温孵育5 min；
（3）将稀释后的PEI 加入稀释后的DNA中，此时转染混合物总体积为3 mL，轻柔混匀，室温孵育25 min；
（4）将3 mL转染混合物加入27 mL细胞悬液中，轻柔混匀，37 ℃， 5% CO2， 130 rpm条件下培养10 d，至细胞活率降到50%以下收样；
S14、CART蛋白160 mL放大及纯化
（1）对
Figure 525250DEST_PATH_IMAGE012
表达结构进行无内毒素DNA制备，采用
Figure 191855DEST_PATH_IMAGE013
去内毒素质粒提取试剂盒；
（2）亲和蛋白A树脂的纯化；
（3）清洗树脂：根据树脂用量选择10倍树脂体积 binding buffer （PBS pH 7.5）清洗；
（4）上样：将收集的上清样品过柱，此过程缓慢进行，加速时必须控制速度：1 s/滴；
（5）淋洗：用PBS pH 7.5淋洗结合液，结合液通过自身重力向下滴，控制速度在1 s/滴；
（6）用20 mM柠檬酸pH 2.7缓冲液进行洗脱，缓慢进行；
（7）中和缓冲液：1 M Tris-HCl pH 9.0，每个淋洗的样品取样跑SDS-PAGE胶，IN 和FT上样量为10
Figure 208352DEST_PATH_IMAGE014
，其他上样量为20
Figure 644013DEST_PATH_IMAGE014
；
（8）将E1 - E6组分混合，进行缓冲液交换和浓缩，蛋白终浓度为：1.7 mg/mL，总蛋白量：500
Figure 87764DEST_PATH_IMAGE010
；
S15、生物素标记CART
将生物素使用DMF溶解，浓度20 mg/mL，并将抗体溶解于PBS，使用CBS调至pH 8.5，终浓度1-10 mg/mL；
按每mg抗体加5
Figure 495525DEST_PATH_IMAGE014
生物素溶液，室温避光搅拌2 h，收集反应物使用PBS透析过夜，中途更换PBS 3-4次，经生物素标记后终浓度：0.1 mg/mL，总蛋白：495
Figure 315713DEST_PATH_IMAGE010
。
进一步地，所述步骤S2具体包括如下步骤：
收集牛卵泡颗粒细胞，600 g离心5 min，4 ℃PBS缓冲液漂洗细胞两次，加入1 mL冷的细胞裂解液（50 mM Hepes、150 mM NaCl、3 mM MgCl2）并收集细胞，移至EP管，反复吹打，1000 g 3min离心，将上清移至另一新EP管，21,460 g 1 h 4℃离心，收集沉淀，加入1 mLPBS后反复吹打，得到细胞膜碎片。
进一步地，所述步骤S3具体包括如下步骤：
在BLItz Pro 1.3系统中操作，反应体积300
Figure 871460DEST_PATH_IMAGE014
，实验方法如下: (1) 基线平衡：将SA传感器放入PBS中浸湿10 min，在系统中进行第一次基线平衡，时间60 s；(2) CART固定：将传感器伸入含有生物素标记的终浓度为0.1 μg/μL的CART溶液中，时间300 s；(3) 基线平衡：将传感器伸入PBS中进行第二次基线平衡，时间240 s；(4) 结合测定：将传感器移至包含膜碎片的PBS溶液中进行结合测定，时间300 s；(5) 蛋白解离：将结合后的探针再次转移到PBS中进行解离实验，时间300 s。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过特定传感器固化CART，然后与细胞膜碎片结合，通过干涉图谱实时位移（nm）的变化判断是否有结合信号，从而检测CART受体是否存在，无需合成特定膜蛋白，可有效解决跨膜蛋白合成困难的问题，为鉴定CART受体及CART调控牛卵泡发育机理奠定基础，并为筛选神经肽受体提供思路。
附图说明
图1为 CART蛋白纯化及定量检测示意图；
图中：MW:蛋白Marker；IN：上柱前；FT：流穿液；W：洗涤；E：洗脱
图2 为不同浓度GCs膜碎片溶液与SA传感器的结合示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实验例
一、生物素标记CART活性肽
1.1 CART表达载体亚克隆
表达载体：pATX1，亚克隆位点：EcoRI/ NotI
（1）取PCR管并标记，依次加入4
Figure 17270DEST_PATH_IMAGE014
同源重组酶（EasyGeno快速重组克隆试剂盒（天根生化科技有限公司，中国，货号：VI201）中的同源重组酶），5
Figure 658467DEST_PATH_IMAGE014
目的基因片段（CART基因片段），1
Figure 282346DEST_PATH_IMAGE014
线性化载体（pATX1）；
（2）吹打均匀后，置于预热的50℃ PCR仪中孵育45 min；
（3）重组好的体系放置4℃冰箱，用于下一步的转化。
交由公司测序，鉴定质粒重组是否成功，通过比对，其测序结果正确，CART活性肽序列及基因序列如下：
>CART活性肽序列
MESPRLRLLPLLGAALLLLLPLLGALAQEDAELQPRALDIYSAVEDASHEKELIEALQEVLKKLKSKRIPIYEKKYGQVPMCDAGEQCAVRKGARIGKLCDCPRGTSCNSFLLKCL
> CART基因序列
GCCGCCACCATGGAGTCCCCCAGGCTGAGGCTGCTGCCCCTGCTGGGAGCCGCTCTGCTGCTGCTGCTCCCCCTGCTGGGCGCTCTGGCTCAGGAGGACGCCGAGCTGCAGCCTAGGGCCCTGGATATCTACAGCGCCGTGGAGGACGCCAGCCACGAGAAGGAGCTGATCGAGGCCCTGCAGGAGGTGCTGAAGAAGCTGAAGTCCAAGAGAATCCCCATCTACGAGAAGAAGTACGGCCAGGTGCCCATGTGCGATGCCGGCGAGCAGTGTGCCGTGAGAAAGGGCGCCAGAATCGGCAAGCTGTGCGATTGCCCCAGAGGCACATCCTGCAATTCCTTTCTGCTGAAGTGCCTG
1.2 载体线性化
检测所提取质粒的浓度及纯度，对纯度符合要求的质粒进行酶切，配制如下酶切体系：6
Figure 958178DEST_PATH_IMAGE014
PvuI内切酶（Thermo，美国），10
Figure 9311DEST_PATH_IMAGE014
10×Fast Digest Buffer/Fast Digest GreenBuffer，50
Figure 137804DEST_PATH_IMAGE014
质粒，将酶切混合物放入37℃水浴锅中酶切30 min，并混匀，酶切后，根据质粒体积加入0.75倍异丙醇，混匀，4℃离心30 min后弃上清，加入1 mL 70%乙醇4 ℃离心5min，进行回收。
1.3 质粒转染细胞
将质粒瞬时转染到XtenCHO细胞中，收集培养基和细胞，直至存活率下降到50%以下，具体操作如下：
（1）转染前一天，接种27×106个细胞到完全培养基中培养；
（2）稀释15
Figure 299795DEST_PATH_IMAGE010
DNA 至1.5 mL 完全培养基中，轻柔混匀，另稀释45
Figure 830134DEST_PATH_IMAGE014
PEI转染试剂至1.5 mL完全培养基中，轻柔混匀，各自室温孵育5 min；
（3）将稀释后的PEI 加入稀释后的DNA中，此时转染混合物总体积为3 mL，轻柔混匀，室温孵育25 min；
（4）将3 mL转染混合物加入27 mL细胞悬液中，轻柔混匀，37 ℃， 5% CO2， 130 rpm条件下培养10 d，至细胞活率降到50%以下收样。
1.4 CART蛋白160 mL放大及纯化
（1）对pATX1表达结构进行无内毒素DNA制备，采用PureLink™ Expi Endotoxin-FreeMaxi Plasmid Purification Kit去内毒素质粒提取试剂盒（Thermo，美国）；
（2）亲和蛋白A树脂的纯化；
（3）清洗树脂：根据树脂用量选择10倍树脂体积 binding buffer （PBS pH 7.5）清洗；
（4）上样：将收集的上清样品过柱，此过程缓慢进行，加速时必须控制速度：1 s/滴；
（5）淋洗：结合液通过自身重力向下滴，控制速度（1 s/滴），W1：用PBS pH 7.5淋洗；
（6）用20 mM柠檬酸pH 2.7缓冲液进行洗脱，缓慢进行；
（7）中和缓冲液：1 M Tris-HCl pH 9.0，每个淋洗的样品取样跑SDS-PAGE胶（IN 和FT上样量为10
Figure 317747DEST_PATH_IMAGE014
，其他上样量为20
Figure 933536DEST_PATH_IMAGE014
）；
（8）纯化结果如图1 A所示，将E1 - E6组分混合，进行缓冲液交换和浓缩，最终的QC 如图1 B所示。
1.5 生物素标记CART
蛋白终浓度为：1.7 mg/mL，总蛋白量：500
Figure 899218DEST_PATH_IMAGE010
，生物素使用DMF溶解，浓度20 mg/mL，将抗体溶解于PBS，使用CBS调至pH 8.5，终浓度1-10 mg/mL，按每mg抗体加5 μL生物素溶液，室温避光搅拌2 h，收集反应物使用PBS透析过夜，中途更换PBS 3-4次，经生物素标记后终浓度：0.1 mg/mL，总蛋白：495
Figure 18484DEST_PATH_IMAGE010
。
二、BLI技术
2.1牛卵泡颗粒细胞收集
无菌DPBS漂洗卵泡，并投入盛有DPBS的培养皿中，用眼科剪将其剪开，沿内壁轻轻刮取颗粒细胞，然后将颗粒细胞和DPBS共同移至1.5 mL EP管中，1,000 rpm离心7 min，弃上清，将颗粒细胞立即投入液氮中，备用。
2.2 膜碎片的获取
收集细胞，600 g离心5 min，4 ℃PBS缓冲液漂洗细胞两次，加入1 mL冷的细胞裂解液（50 mM Hepes、150 mM NaCl、3 mM MgCl2）并收集细胞，移至EP管，反复吹打，1000 g 3min离心，将上清移至另一新EP管，21,460 g 1 h 4℃离心，收集沉淀，加入1 mL PBS后反复吹打，即可得到细胞膜碎片。
2.3 BLI体外检测细胞膜CART受体与CART的结合
在BLItz Pro 1.3系统中操作，反应体积300
Figure 676998DEST_PATH_IMAGE014
，实验方法如下: (1) 基线（Baseline）平衡。将SA传感器放入PBS中浸湿10 min，在系统中进行第一次基线平衡，时间60 s。(2) CART固定。将传感器伸入含有生物素标记的终浓度为0.1 μg/μL的CART溶液中，时间300 s。(3) 基线（Baseline）平衡。将传感器伸入PBS中进行第二次基线平衡，时间240s。(4) 结合测定。将传感器移至包含膜碎片的PBS溶液中进行结合（Association）测定，时间300 s。(5) 蛋白解离。将结合后的探针再次转移到PBS中进行解离（Dissociation）实验，时间300 s。
三、结果与分析
本次BLI实验共分为4组，第1组为空白对照组，即用PBS代替膜碎片溶液，第2组~第4组分别为提取到的膜碎片溶液、稀释1倍后的膜碎片溶液、稀释2倍后的膜碎片溶液。
如图2所示，横坐标表示实验时间，纵坐标表示实时位移。第一阶段（0~60 s）基线平衡为校准阶段，将SA传感器伸入PBS溶液中，此时溶液中没有与CART结合的物质，故4组输出的实时位移均为0 nm；第二阶段（60~360 s）将生物素标记的CART固定于SA传感器，此时系统输出的实时位移瞬间上升，且随着时间的进行，该曲线逐渐趋于平缓，表明传感器已成功钓取到CART；第三阶段（360 s~600 s）将传感器上面除CART以外的其他物质用PBS进行洗脱，该阶段与第一阶段实时位移相较，各组均明显升高且几乎为直线，表明CART已稳定结合于传感器；第四阶段（600~900 s）结合测定，将传感器伸入膜碎片溶液中，曲线慢慢上升，说明溶液中存在CART受体并与CART发生结合；第五阶段（900~1200 s）再次将探针伸入PBS中，该阶段主要对未与CART结合的物质进行洗脱，该阶段与第三阶段（传感器上只结合CART）相较，各组（除空白对照组外）实时位移都存在不同程度的升高，再次验证膜碎片溶液中确实存在与CART相结合的CART受体。
第三阶段结束后，各组实时位移分别是：1.99951 nm、1.31913 nm、1.73816 nm和2.4418 nm，表明各组结合CART量由大到小分别是：第4组、第1组、第3组和第2组；第四阶段结束后，各组实时位移分别是：2.02263 nm、2.43398 nm、3.02121 nm和3.38309 nm，经历第三阶段后，第1组SA传感器上结合的CART量较多，但实时位移基本不变，说明该组第四阶段未结合其他物质，也验证了空白对照组具有可信性；当第五阶段洗脱结束后，各组实时位移分别是：2.0571 nm、2.32464 nm、2.9521 nm和3.13984 nm，因此膜碎片结合量由大到小依次为：第4组、第3组、第2组和第1组，虽然各组固化的CART量不同，但结合的膜碎片量并未随CART量增加而增加，膜碎片溶液稀释后反而增加了其与CART的结合量，推测可能原因为，溶液稀释后导致膜表面的受体暴露更多，促进了更多的受体与CART作用，因此显示第4组实时位移最高，即稀释2倍后的膜碎片溶液与CART结合性最强。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
序列表
<110> 山西农业大学
<120> 一种检测牛CART活性肽与牛卵泡颗粒细胞膜受体是否结合的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 357
<212> RNA
<213> 人工序列(gccgccacca tggagtcccc caggctgagg ctgctgcccc tgctgggagccgctctgctg 60 ctgctgctcc ccctgctggg cgctctggct caggaggacg ccgagctgcagcctagggcc 120 ctggatatct acagcgccgt ggaggacgcc agccacgaga aggagctgatcgaggccctg 180 caggaggtgc tgaagaagct gaagtccaag agaatcccca tctacgagaagaagtacggc 240 caggtgccca tgtgcgatgc cggcgagcag tgtgccgtga gaaagggcgccagaatcggc 300 aagctgtgcg attgccccag aggcacatcc tgcaattcct ttctgctgaa gtgcctg357)
<400> 1
<210> 2
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(mesprlrllp llgaalllll pllgalaqed aelqpraldi ysavedashekeliealqev 60 lkklkskrip iyekkygqvp mcdageqcav rkgarigklc dcprgtscns fllkcl116)
<400> 2

Claims (4)

1.一种检测牛
Figure DEST_PATH_IMAGE002
活性肽与牛卵泡颗粒细胞膜受体是否结合的方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、合成牛
Figure 623318DEST_PATH_IMAGE002
基因，亚克隆构建到表达载体
Figure DEST_PATH_IMAGE004
上，哺乳系统表达目的蛋白，纯化后去内毒素，并标记生物素，制备出生物素标记的
Figure 884666DEST_PATH_IMAGE002
活性肽；
S2、牛卵泡颗粒细胞膜碎片的获取；
S3、通过
Figure DEST_PATH_IMAGE006
单样本分子互作分析仪检测是否出现结合信号，从而检测牛卵泡颗粒细胞膜是否存在CART受体。
2.如权利要求1所述的一种检测牛
Figure DEST_PATH_IMAGE008
活性肽与牛卵泡颗粒细胞膜受体是否结合的方法，其特征在于：所述步骤S1具体包括如下步骤：
S11、取PCR管并标记，依次加入4
Figure DEST_PATH_IMAGE010
同源重组酶，5
Figure 743032DEST_PATH_IMAGE010
目的基因片段，1
Figure 810345DEST_PATH_IMAGE010
线性化载体；吹打均匀后，置于预热的50℃ PCR仪中孵育45 min，得重组质粒；
S12、检测所得重组质粒的浓度及纯度，对纯度符合要求的质粒进行酶切，配制如下酶切体系：6
Figure 296821DEST_PATH_IMAGE010
Figure DEST_PATH_IMAGE012
I内切酶，10
Figure DEST_PATH_IMAGE014
10×
Figure DEST_PATH_IMAGE016
，50
Figure DEST_PATH_IMAGE018
质粒；
将酶切混合物放入37℃水浴锅中酶切30 min，并混匀，酶切后，根据质粒体积加入0.75倍异丙醇，混匀，4℃离心30 min后弃上清，加入1 mL 70%乙醇4 ℃离心5 min，进行回收；
S13、将质粒瞬时转染到
Figure DEST_PATH_IMAGE020
细胞中，收集培养基和细胞，直至存活率下降到50%以下，具体操作如下：
（1）转染前一天，接种27×106个细胞到完全培养基中培养；
（2）稀释15
Figure DEST_PATH_IMAGE022
DNA 至1.5 mL 完全培养基中，轻柔混匀，另稀释45
Figure DEST_PATH_IMAGE024
PEI转染试剂至1.5 mL完全培养基中，轻柔混匀，各自室温孵育5 min；
（3）将稀释后的PEI 加入稀释后的DNA中，此时转染混合物总体积为3 mL，轻柔混匀，室温孵育25 min；
（4）将3 mL转染混合物加入27 mL细胞悬液中，轻柔混匀，37 ℃， 5% CO2， 130 rpm条件下培养10 d，至细胞活率降到50%以下收样；
S14、CART蛋白160 mL放大及纯化
（1）对
Figure DEST_PATH_IMAGE026
表达结构进行无内毒素DNA制备，采用
Figure DEST_PATH_IMAGE028
去内毒素质粒提取试剂盒；
（2）亲和蛋白A树脂的纯化；
（3）清洗树脂：根据树脂用量选择10倍树脂体积 binding buffer （PBS pH 7.5）清洗；
（4）上样：将收集的上清样品过柱，此过程缓慢进行，加速时必须控制速度：1 s/滴；
（5）淋洗：用PBS pH 7.5淋洗结合液，结合液通过自身重力向下滴，控制速度在1 s/滴；
（6）用20 mM柠檬酸pH 2.7缓冲液进行洗脱，缓慢进行；
（7）中和缓冲液：1 M Tris-HCl pH 9.0，每个淋洗的样品取样跑SDS-PAGE胶，IN 和FT上样量为10
Figure DEST_PATH_IMAGE030
，其他上样量为20
Figure 429205DEST_PATH_IMAGE030
；
（8）将E1 - E6组分混合，进行缓冲液交换和浓缩，蛋白终浓度为：1.7 mg/mL，总蛋白量：500
Figure 368342DEST_PATH_IMAGE022
；
S15、生物素标记CART
将生物素使用DMF溶解，浓度20 mg/mL，并将抗体溶解于PBS，使用CBS调至pH 8.5，终浓度1-10 mg/mL；
按每mg抗体加5
Figure 239346DEST_PATH_IMAGE030
生物素溶液，室温避光搅拌2 h，收集反应物使用PBS透析过夜，中途更换PBS 3-4次，经生物素标记后终浓度：0.1 mg/mL，总蛋白：495
Figure 580329DEST_PATH_IMAGE022
。
3.如权利要求1所述的一种检测牛CART活性肽与牛卵泡颗粒细胞膜受体是否结合的方法，其特征在于：所述步骤S2具体包括如下步骤：
收集牛卵泡颗粒细胞，600 g离心5 min，4 ℃PBS缓冲液漂洗细胞两次，加入1 mL冷的细胞裂解液并收集细胞，移至EP管，反复吹打，1000 g 3min离心，将上清移至另一新EP管，21,460 g 1 h 4℃离心，收集沉淀，加入1 mL PBS后反复吹打，得到细胞膜碎片，所述细胞裂解液包括50 mM Hepes、150 mM NaCl、3 mM MgCl2。
4.如权利要求1所述的一种检测牛CART活性肽与牛卵泡颗粒细胞膜受体是否结合的方法，其特征在于：所述步骤S3具体包括如下步骤：
在BLItz Pro 1.3系统中操作，反应体积300 μL，实验方法如下: (1) 基线平衡：将SA传感器放入PBS中浸湿10 min，在系统中进行第一次基线平衡，时间60 s；(2) CART固定：将传感器伸入含有生物素标记的终浓度为0.1 μg/μL的CART溶液中，时间300 s；(3) 基线平衡：将传感器伸入PBS中进行第二次基线平衡，时间240 s；(4) 结合测定：将传感器移至包含膜碎片的PBS溶液中进行结合测定，时间300 s；(5) 蛋白解离：将结合后的探针再次转移到PBS中进行解离实验，时间300 s。
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