CN112029816A - 一种快速检测单个生物大分子活性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种快速检测单个生物大分子活性的方法，使用PBS溶液配置辣根过氧化酶溶液S1，将PBS溶液和甘油混合，并向甘油/PBS混合溶液加入过氧化氢和3,3',5,5'‑四甲基联苯胺溶液作为酶催化底物溶液S2，并将S1和S2混合得到酶促反应溶液S3，先将S2以微小液滴喷到暗场显微镜基底材料上，再将S3以微小液滴喷到暗场显微镜相同基底材料上，通过暗场显微镜观察基底上微小液滴的暗场显微信号并记录，对比S2和S3喷雾形成的同样大小液滴的暗场信号，并分析S3喷雾形成的液滴暗场信号和时间变化曲线，最终得到辣根过氧化物酶催化底物的动力学曲线和酶的活性。本发明具有简单便捷、易于检测且反应迅速等优点，可实现单个酶分子及其活力的快速且精准检测。

Description

一种快速检测单个生物大分子活性的方法
技术领域
本发明涉及暗场显微镜成像和生物大分子分析测试技术领域，特别涉及一种快速检测单个生物大分子活性的方法。
背景技术
在生命科学技术中，为了研究生物大分子(如蛋白质、酶、病毒、纳米药物)的活性，显微成像技术必不可少，其中以分子荧光技术为代表的光谱分析手段具有实时、原位、非侵入等优势，在生命分析技术领域中得到广泛应用。荧光分析需要对研究对象进行荧光标记，标记过程既繁琐又耗时，还会对研究对象造成不可避免的干扰。
为解决现有技术中，使用荧光标记存在的技术问题，通常会使用暗场显微镜和表面等离子体共振显微镜等免标记成像技术，其中暗场显微镜具有光学信号稳定、免标记、实时成像等优点，在生命科学领域以及纳米粒子分析中具有独特优势。
酶是一类极为重要的生物催化剂，其由活细胞产生且对其底物具有高度特异性和高度催化效能的蛋白质或RNA，并且酶属于生物大分子，分子质量至少为一万以上，甚至可达百万，其中辣根过氧化物酶是典型例子。辣根过氧化物酶通常来源于辣根，是临床检验试剂中最常用的酶，具有稳定性好、分子量小、活性高、特异性强、容易分离提纯等优异特性，不但被广泛应用于多个生化检测项目，并且也被运用于免疫类(ELISA)试剂盒，因此对于辣根过氧化物酶含量或活性的测定，在分析化学、环境科学、临床化学、组织化学研究中具有重要意义。
目前关于辣根过氧化物酶的测定方法主要有伏安法、化学发光法、分光光度法和荧光法，其中使用伏安法测定辣根过氧化物酶的方法报道最多，并且灵敏度较高，典型的测定浓度范围在1*10-13～1*10-9g/mL，使用伏安法测定辣根过氧化物酶是基于催化H2O2氧化苯胺类化合物，生成能在电极上还原的电活性物质，通过测定氧化产物可间接测定辣根过氧化物酶的含量。而采用化学发光测定辣根过氧化物酶的方法也较为灵敏，其检测限可达6.6*10-13g/亮点。而分光光度法虽然简便、易操作，但其灵敏度不高，精确性也不够好。而荧光法基于辣根过氧化物酶催化H2O2氧化邻苯二胺、香高草酸等还原性物质，生成能产生荧光物质，测定荧光产物的量可间接测定辣根过氧化物酶含量，但在荧光分析中，由于受到杂蛋白影响，使空白背景的荧光也较高，最终存在精确性不够好缺陷。另外现有技术的荧光法、化学发光法以及电化学对于辣根过氧化物酶进行检测，其检测的极限约为10-15～10-18g水平。
纳米粒子催化剂的催化性能与粒子的材料、表面形貌以及不同晶面的暴露都有关系，即使同一方法合成的单个纳米粒子，其催化性能往往由于表面缺陷、活性位点以及晶面的不同而表现出差异性。对于高效的生物催化剂酶而言，由于其空间结构、构象不同以及酶活力波动，同一种酶的单个酶活性也可能表现出差异性。细胞内的酶活性在生病期间和正常时期活性也是有明显差异，因此酶活性研究对于细胞生物学、生物体发病过程的理解和疾病的检测至关重要。除了纯粹的生物学功能外，酶通过高效的催化反应的能力来实现绿色化学，选择和使用合适的生物催化剂，可在温和条件下对塑料、染料等材料进行完全的生物降解，实现资源可再生利用。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种简单便捷、易于检测且反应迅速的快速检测单个生物大分子活性的方法，旨在实现单个酶分子及其活力的快速且精准检测。
为实现上述目的，本发明提出的一种快速检测单个辣根过氧化酶分子活性的方法，包括以下步骤：
步骤1：使用PBS溶液配置一定浓度的辣根过氧化物酶溶液S1；
步骤2：使用PBS溶液和甘油以一定体积比混合，并向甘油/PBS混合溶液中，加入一定浓度的过氧化氢和3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液，作为酶催化底物溶液S2；
步骤3：将溶液S1和溶液S2混合得到酶促反应溶液S3；
步骤4：将溶液S2通过雾化器产生微小液滴并喷到暗场显微镜的基底材料上，通过暗场显微镜观察基底上微小液滴的暗场显微信号并记录；
步骤5：将溶液S3通过雾化器产生微小液滴并喷到暗场显微镜的基底材料上，通过暗场显微镜观察基底上微小液滴的暗场显微信号并记录；
步骤6：对比溶液S2和溶液S3喷雾形成的同样大小液滴的暗场信号，并分析溶液S3喷雾形成的液滴暗场信号和时间变化曲线，最终得到辣根过氧化物酶催化底物的动力学曲线和酶的活性。
优选地，所述步骤1中PBS溶液浓度为0.01～1.0mol/L，PBS溶液pH值范围为3.0～8.0，辣根过氧化物酶的浓度为0.001nmol/L～1.0μmol/L。
优选地，所述步骤2中甘油/PBS混合溶液中，甘油体积含量为5％～90％，过氧化氢的浓度为0.1～500mmol/L，3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的浓度为0.05～5.0mmol/L。
优选地，所述暗场显微镜的基底材料为普通玻璃片、十八烷基三氯硅烷修饰的玻璃片、金片、抛光后硅片、抛光后铝片、有机玻璃片的任意一种。
优选地，所述方法检测大于或等于6.6*10-20g的单个酶分子。
本发明技术方案相对现有技术具有以下优点：
本发明技术方案使用暗场显微镜可快速检测辣根过氧化物酶活性，方法简单方便，检测极限可低至约6.6*10-20g的单个酶分子，通过喷雾器将酶分子限定在极小的液滴内，通过酶分子催化底物发生化学反应而使得液滴在暗场显微镜中的信号发生改变。由于生物酶的催化效率极高，本发明技术方案可以实现对单个酶分子的检测以及活性测定。与此同时，本发明技术方案的检测方法具有使用样品量少、反应效率高以及稳定性好等优点，能够实现单纳米粒子以及单个酶分子催化行为研究，为解释催化剂的行为、催化机理以及研发高效的催化剂提供了良好的工具。
此外，本发明技术方案通过研究单个酶分子在一定时间内催化底物反应，并观察其在暗场显微镜中信号的变化得到酶催化底物的动力学曲线，从而对单个酶分子的活力进行测定。由于是单个酶分子的分析检测，因此所需要用到的样品量是最小的，本发明技术方案可通过更换不同波长的激光光源或者滤光片来研究不同结构和活性的催化剂与底物的反应。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明的空白玻璃片结构示意图；
图2为本发明实施例1中溶液S2喷雾液滴在暗场显微镜中的信号图；
图3为本发明实施例1中溶液S3喷雾液滴在暗场显微镜中的信号图；
图4为本发明实施例1中溶液S2与溶液S3液滴大小与信号强度关系图；
图5为本发明实施例2中溶液S2喷雾液滴在暗场显微镜中的信号图；
图6为本发明实施例2中溶液S3喷雾液滴在暗场显微镜中的信号图；
图7为本发明实施例2中溶液S2和溶液S3喷雾液滴在暗场显微镜的信号随时间变化图；
图8为本发明实施例3中溶液S2喷雾液滴在暗场显微镜中的信号图；
图9为本发明实施例3中溶液S3喷雾液滴在暗场显微镜中的信号图；
图10为本发明实施例3中溶液S2和溶液S3喷雾液滴在暗场显微镜的信号随时间变化图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明，若本发明实施例中有涉及方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)，则该方向性指示仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
另外，若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
本发明提出一种快速检测单个生物大分子活性的方法。
实施例1
请参见图1至图4，本发明实施例中，通过将0.1M的PBS溶液(pH＝5.0)与辣根过氧化物酶配置成浓度为100.0nmol/L的溶液S1，然后再将0.1M的PBS溶液和甘油按照90:10体积比混合，并向甘油/PBS混合溶液加入20mM的过氧化氢和1.0mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液作为酶催化底物溶液S2。
将50μL溶液S1和4.95mL溶液S2混合得到酶促反应溶液S3；等1个小时反应完全后，将溶液S3通过雾化器产生微小液滴并喷到十八烷基三氯硅烷修饰的玻璃上，通过暗场显微镜观察基底上微小液滴的暗场显微信号并作记录，然后将溶液S2通过雾化器将微小液滴喷到暗场显微镜的基底材料上，通过暗场显微镜观察基底上微小液滴的暗场显微信号并作记录。
通过Fiji软件和Matlab软件读取溶液S2喷雾液滴和溶液S3喷雾液滴的大小和强度信息并作图得到溶液S2和溶液S3中液滴大小和信号强度的关系曲线。
实施例2
请参见图5至图7，本发明实施例中，通过将0.1M的PBS溶液(pH＝5.0)与辣根过氧化物酶配置成浓度为10.0nmol/L的溶液S1，然后再将0.1M的PBS溶液和甘油按照70:30体积比混合，量取4.70mL甘油/PBS混合溶液，然后注入容量为15mL的离心管内，然后加入5μL30％过氧化氢和245μL的10mM3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液作为酶催化底物溶液S2。
将50μL溶液S1和4.95mL溶液S2混合得到酶促反应溶液S3；迅速将溶液S3通过雾化器产生微小液滴并喷到十八烷基三氯硅烷修饰的玻璃上，通过暗场显微镜观察基底上微小液滴的暗场显微信号并作记录。然后再将溶液S2喷雾到十八烷基三氯硅烷修饰的玻璃片上并观察其暗场信号。
通过Fiji软件读取溶液S2和溶液S3喷雾液滴的暗场强度和时间关系曲线，从溶液S2喷雾液滴和时间变化曲线可以看出，溶液S2喷雾液滴在300s时间内信号基本保持不变，根据S3液滴信号变化和时间曲线可以得到辣根过氧化物酶催化底物的动力学曲线以及酶的活性。
实施例3
请参见图8至图10，本发明实施例中，通过将0.1M的PBS溶液(pH＝5.0)与辣根过氧化物酶配置成浓度为20.0nmol/L的溶液S1，然后再将0.1M的PBS溶液和甘油按照体积比70:30混合，量取4.70mL甘油/PBS混合溶液，然后注入容量为15mL的离心管内，然后加入5μL30％过氧化氢和245μL的10mM3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液作为酶催化底物溶液S2。
将50μL溶液S1和4.95mL溶液S2混合得到酶促反应溶液S3；迅速将溶液S3通过雾化器产生微小液滴并喷到十八烷基三氯硅烷修饰的玻璃上，通过暗场显微镜观察基底上微小液滴的暗场显微信号并作记录，然后再将溶液S2喷雾到十八烷基三氯硅烷修饰的玻璃片上并观察其暗场信号。
通过Fiji软件读取溶液S2和溶液S3喷雾液滴的暗场强度和时间的关系曲线，从溶液S2喷雾液滴和时间变化曲线可以看出，溶液S2喷雾液滴在300s的时间内信号基本保持不变，根据S3液滴信号变化和时间曲线可以得到辣根过氧化物酶催化底物的动力学曲线以及酶的活性。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (5)

1.一种快速检测单个生物大分子活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：使用PBS溶液配置一定浓度的辣根过氧化物酶溶液S1；
步骤2：使用PBS溶液和甘油以一定体积比混合，并向甘油/PBS混合溶液中，加入一定浓度的过氧化氢和3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液，作为酶催化底物溶液S2；
步骤3：将溶液S1和溶液S2混合得到酶促反应溶液S3；
步骤4：将溶液S2通过雾化器产生微小液滴并喷到暗场显微镜的基底材料上，通过暗场显微镜观察基底上微小液滴的暗场显微信号并记录；
步骤5：将溶液S3通过雾化器产生微小液滴并喷到暗场显微镜的基底材料上，通过暗场显微镜观察基底上微小液滴的暗场显微信号并记录；
步骤6：对比溶液S2和溶液S3喷雾形成的同样大小液滴的暗场信号，并分析溶液S3喷雾形成的液滴暗场信号和时间变化曲线，最终得到辣根过氧化物酶催化底物的动力学曲线和酶的活性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中PBS溶液浓度为0.01～1.0mol/L，PBS溶液pH值范围为3.0～8.0，辣根过氧化物酶的浓度为0.001nmol/L～1.0μmol/L。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中甘油/PBS混合溶液中，甘油体积含量为5％～90％，过氧化氢的浓度为0.1～500mmol/L，3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的浓度为0.05～5.0mmol/L。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述暗场显微镜的基底材料为普通玻璃片、十八烷基三氯硅烷修饰的玻璃片、金片、抛光后硅片、抛光后铝片、有机玻璃片的任意一种。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法检测大于或等于6.6*10-20g的单个酶分子。
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