CN112014965A - 一种可见-近红外实时图像融合的荧光显微镜系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可见‑近红外实时图像融合的荧光显微镜系统，包括内置激光同轴照明模块、可见光透射照明模块、可见光‑近红外荧光双通道同步成像模块、数据线和工控机；固体激光器发出的785nm的激光依次经由光纤束、准直镜头、激光扩束器、分光镜和物镜到达样品；可见光透射照明模块的汞灯发出的可见光照射样品；可见光‑近红外荧光双通道同步成像模块，样品发出的可见光依次经由分光镜、785nm陷波滤光片、第一反射镜、成像镜头、棱镜、第二反射镜到达集成相机；样品发出的近红外荧光依次经由分光镜、785nm陷波滤光片、第一反射镜、成像镜头、棱镜、800nm长波通滤光片到达集成相机；集成相机经由数据线与工控机信号连接。

Description

一种可见-近红外实时图像融合的荧光显微镜系统
技术领域
本发明涉及医疗领域，更具体地说，涉及一种可见-近红外实时图像融合的荧光显微镜系统。
背景技术
荧光显微技术是通过检测荧光物质在样品中的空间分布，实现对样品表面以及内部的结构、成分信息的检测，尤其在生物医学领域的荧光标记显微镜检测上已有广泛应用。目前市面上荧光显微镜局限在可见波段荧光，可用于观察近红外荧光的显微镜极少且价格昂贵。相对于可见荧光，近红外荧光由于其具有较低的生物组织吸收、散射和自发荧光的特性，有效降低了荧光成像的背景噪声并提高了组织穿透深度，以此为基础的成像技术在生物医学领域具有广阔的应用前景。而在近红外荧光成像技术的临床实践中，急需一种能够研究近红外荧光物质（尤其是吲哚菁绿及其衍生物）微观分布的手段，并且由于临床应用对检测效率的要求非常高，荧光物质的分布要以实时同步的方式与可见光常规染色图像进行对比分析，这就对近红外荧光显微镜提出了更高的要求，即可见-近红外实时图像融合。
目前，近红外荧光显微镜的解决方案大多是采用近红外光谱仪与光学显微镜联用的系统，荧光图像是经过逐点光谱扫描和图像二维重建得到的。这类手段成像速度慢，数据流量大，需要强大的计算机分析处理能力；模拟信号重建的图像不是真实的光学信号，使呈现出的荧光信号空间分布失真，可见此类解决方案难以满足可见-近红外实时图像融合的要求，面对着迫切的临床需求和研究需求，开发一种可见-近红外实时图像融合的荧光显微镜是十分有必要的。
发明内容
本发明旨在提供一种可见-近红外实时图像融合的荧光显微镜系统，旨在解决现有技术中现有的近红外荧光显微镜无法实现可见-近红外实时图像融合的问题，以满足临床快速病理的快速检测筛查需求的问题。
为实现此目的，本发明提供了一种可见-近红外实时图像融合的荧光显微镜系统，包括内置激光同轴照明模块、可见光透射照明模块、可见光-近红外荧光双通道同步成像模块、数据线和工控机；内置激光同轴照明模块包括固体激光器、光纤束、准直镜头、激光扩束器、分光镜和物镜，由固体激光器发出的785nm的激光依次经由光纤束、准直镜头、激光扩束器、分光镜和物镜到达样品；可见光透射照明模块，包括汞灯，汞灯发出的可见光照射样品；可见光-近红外荧光双通道同步成像模块，包括785nm陷波滤光片、第一反射镜、成像镜头、棱镜，第二反射镜、800nm长波通滤光片、集成相机、数据线和工控机，其中785nm陷波滤光片用于吸收785纳米激光而允许可见光和近红外荧光通过，棱镜用于全反射可见光而增强近红外荧光透射，800nm长波通滤光片用于将荧光纯化；样品发出的可见光依次经由分光镜、785nm陷波滤光片、第一反射镜、成像镜头、棱镜和第二反射镜到达集成相机；样品发出的近红外荧光依次经由分光镜、785nm陷波滤光片、第一反射镜、成像镜头、棱镜和800nm长波通滤光片到达集成相机；集成相机经由数据线与工控机信号连接。
优选的，所述内置激光同轴照明模块还包括785nm带通滤光片，用于对从激光扩束器传出的785nm的激光进行过滤。
优选的，所述可见光透射照明模块还包括770 nm短波通滤光片，用于过滤汞灯发出的光线。
优选的，所述激光扩束器包括凹透镜、凸透镜和套筒，且凹透镜和凸透镜均位于套筒内。
优选的，所述光纤束包括多根圆角矩形截面的光纤。
优选的，所述集成相机集成了黑白相机和彩色相机。
优选的，所述分光镜为780nm陷波二向色镜。
相比于现有技术，本发明的优点在于：通过一种采用内置同轴照明的可见-近红外实时图像融合的荧光显微镜的系统设计，采用内置激光同轴照明的方式，结合45°设置的激发光波段陷波二向色镜和0°设置的激发光波段陷波滤光片实现了激发光与其他波段光（包括可见光和荧光）的分离，再通过棱镜9初步分离可见光与荧光，770 nm短波通滤光片16和800nm长波通滤光片11进一步分离可见光与荧光，然后同时在集成了黑白相机和彩色相机的集成相机12上进行成像，最后使用图像实时融合技术将荧光图像以伪彩的形式实时叠加于可见光图像之上，并可对图像荧光强度进行静态定量分析和对图中尺寸进行实时测量。本发明适用于对激发峰为785±5 nm，发射峰为800-900 nm的近红外荧光物质（尤其适用于吲哚菁绿及其衍生物）在生物组织等生物样本中的分布进行实时双通道显微观测，能满足临床快速检测筛查的需求。
附图说明
图1为本发明的可见-近红外实时图像融合的荧光显微镜系统的示意图。
图中标号说明：
1、激光同轴照明模块；2、激光扩束器；3、785nm带通滤光片；4、分光镜；5、物镜；6、785nm陷波滤光片；7、第一反射镜；8、成像镜头；9、棱镜；10、第二反射镜；11、800nm长波通滤光片；12、集成相机；13、数据线；14、工控机；16、770nm短波通滤光片；17、样品；101、固体激光器；102、光纤束；103、准直镜头；201、凹透镜；202、凸透镜。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”、“顶/底端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置有”、“套设/接”、“连接”等，应做广义理解，例如“连接”，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接，可以是机械连接，也可以是电连接，可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通，对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
请参阅图1所示，一种可见-近红外实时图像融合的荧光显微镜，包括内置激光同轴照明模块1、可见光透射照明模块、可见光-近红外荧光双通道同步成像模块、数据线13和工控机14；内置激光同轴照明模块包括固体激光器101、光纤束102、准直镜头103、激光扩束器2、分光镜4和物镜5，由固体激光器101发出的785nm的激光依次经由光纤束102、准直镜头103、激光扩束器2、分光镜4和物镜5到达样品17；可见光透射照明模块，包括汞灯15，汞灯15发出的可见光照射样品17；可见光-近红外荧光双通道同步成像模块，包括785nm陷波滤光片6、第一反射镜7、成像镜头8、棱镜9，第二反射镜10、800nm长波通滤光片11、集成相机12、数据线13和工控机14，其中785nm陷波滤光片6用于吸收785纳米激光而允许可见光和近红外荧光通过，棱镜9用于全反射可见光而增强近红外荧光透射，800nm长波通滤光片11用于将荧光纯化；样品17发出的可见光依次经由分光镜4、785nm陷波滤光片6、第一反射镜7、成像镜头8、棱镜9和第二反射镜10到达集成相机12；样品17发出的近红外荧光依次经由分光镜4、785nm陷波滤光片6、第一反射镜7、成像镜头8、棱镜9和800nm长波通滤光片11到达集成相机12；集成相机12经由数据线13与工控机14信号连接。
优选的，内置激光同轴照明模块1还包括785nm带通滤光片3，用于对从激光扩束器2传出的785nm的激光进行过滤；可见光透射照明模块还包括770nm短波通滤光片16，用于过滤汞灯15发出的光线。
另外，激光扩束器2包括凹透镜201、凸透镜202和套筒，且凹透镜201和凸透镜202均位于套筒内；光纤束102包括多根圆角矩形截面的光纤。
固体激光器101发出的激光依次经由光纤束102、准直镜头103、激光扩束器2、分光镜4和物镜5到达样品17上，汞灯15发出的光线（优选为白光）也照射到样品17上，样品17被激发出近红外荧光，同时样品17也反射出可见光和激光；离开样品17的近红外荧光伴随着可见光和干扰的激光，进入物镜5，然后经过780nm陷波二向色镜反射掉绝大部分的激光，让可见光和荧光以及极少的激光通过，再经过785nm陷波滤光片6进一步滤除残存的激光，并让可见光和荧光通过。
进一步的，集成相机12集成了黑白相机和彩色相机；分光镜为780nm陷波二向色镜。该780nm陷波二向色镜反射785nm激光而允许可见光和近红外荧光通过，因此样品17产生的荧光依次经由物镜5、780nm陷波二向色镜、785nm陷波滤光片6、第一反射镜7、成像镜头8、棱镜9、800nm长波通滤光片11（荧光纯化）到达集成相机12的黑白相机并且形成黑白成像。
同理，样品17产生的可见光依次经由780nm陷波二向色镜、785nm陷波滤光片6、第一反射镜7、成像镜头8、棱镜9和第二反射镜10到达集成相机12的彩色相机并且形成彩色成像。
最后使集成相机12将黑白成像和彩色成像通过数据线13传送到工控机14，并且采用图像实时融合技术将荧光图像以伪彩的形式实时叠加于可见光图像之上，并可对图像荧光强度进行静态定量分析和对图中尺寸进行实时测量。
其中，具体的成像以及实时图像融合方法包括以下步骤：
步骤S1：汞灯15的白光照射样品17，从固体激光器101发出的激光也照射于样品17上，激发出近红外荧光，同时反射出可见光和激光；
步骤S2：离开样品17的荧光伴随着可见光和干扰的激光，进入物镜5，然后经过45°设置的780nm陷波二向色镜反射掉绝大部分的激光，让可见光和荧光以及极少的激光通过，再经过785nm陷波滤光片6进一步滤除残存的激光，并让可见光和荧光通过；
步骤S3：可见光和荧光经过第一反射镜7反射进入成像镜头8，可见光和荧光经过棱镜9分开，其中荧光再经过800nm长波通滤光片11纯化后到达集成相机12，可见光直接到达集成相机12；
步骤S4：工控机通过数据线读取彩色图像和荧光黑白图像，实时将黑白图像灰度值x转变为绿色分量值G，彩色图像的红、绿、蓝分量R’、G’、B’分别乘以融合系数α，然后加上绿色分量G乘以(1-α)，最终实时融合图像的红、绿、蓝分量为αR’、 αG’+(1-α)G、αB’；
步骤S5：为了减少背景绿和增强微弱荧光的显示，增加了荧光阈值t和荧光增强系数e，并且可供使用者在一定范围内调节，得到修正后的实时融合图像的红、绿、蓝分量为αR’、 αG’+e(1-α)(G-t)、αB’；
步骤S6：为了让荧光分布更直观地展示出来，实时将黑白图像灰度值x转变为伪彩，伪彩的红、绿、蓝分量分别是x的函数R(x)、G(x)、B(x)，具体函数参照开源软件Image-J中的Look-Up-Table的不同伪彩配色方案来优选；
步骤S7：将可见光图像、荧光黑白图像、实时融合图像、伪彩图像同时显示在计算机屏幕上，主窗口为四者中之一，副窗口为全部四个图像，可通过点击副窗口画面来切换主窗口显示画面；
步骤S8：为了实现实时定量分析荧光强度，采用取基点值的方法定量不同位置的荧光强度，具体为静止图像后，取目标点周围10x10至30x30方块内像素的荧光CMOS灰度值的平均值作为基点值；
步骤S9：为了实现实时测量图中尺寸的功能，事先用显微镜测微尺放在显微镜下拍摄不同物镜5倍率下的可见光画面，通过Image-J分析得到不同物镜5倍率下平均每个像素对应的尺寸γ μm，然后实际使用中先人工选取当前物镜5倍率，在静止图像后，对选取线段进行线段上像素计数n，则得到对应物镜5倍率下的线段尺寸nγ μm，或对选取面积进行面内像素计数m，则得到对应物镜5倍率下的面积mγ2 μm2。
本发明通过提供一种采用内置同轴照明的可见-近红外实时图像融合的荧光显微镜的系统设计，采用内置激光同轴照明的方式，结合45°设置的激发光波段陷波二向色镜和0°设置的激发光波段陷波滤光片实现了激发光与其他波段光（包括可见光和荧光）的分离，再通过棱镜9初步分离可见光与荧光，770nm短波通滤光片16和800nm长波通滤光片11进一步分离可见光与荧光，然后同时在集成了黑白相机和彩色相机的集成相机12上进行成像，最后使用图像实时融合技术将荧光图像以伪彩的形式实时叠加于可见光图像之上，并可对图像荧光强度进行静态定量分析和对图中尺寸进行实时测量。本发明适用于对激发峰为785±5nm，发射峰为800-900nm的近红外荧光物质（尤其适用于吲哚菁绿及其衍生物）在生物组织等生物样本中的分布进行实时双通道显微观测，能满足临床快速检测筛查的需求。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式；但本发明的保护范围并不局限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种可见-近红外实时图像融合的荧光显微镜系统，其特征在于：包括内置激光同轴照明模块（1）、可见光透射照明模块、可见光-近红外荧光双通道同步成像模块、数据线（13）和工控机（14）；内置激光同轴照明模块（1）包括固体激光器（101）、光纤束（102）、准直镜头（103）、激光扩束器（2）、分光镜（4）和物镜（5），由固体激光器（101）发出的785nm的激光依次经由光纤束（102）、准直镜头（103）、激光扩束器（2）、分光镜（4）和物镜（5）到达样品（17）；可见光透射照明模块，包括汞灯（15），汞灯（15）发出的可见光照射样品（17）；可见光-近红外荧光双通道同步成像模块，包括785nm陷波滤光片（6）、第一反射镜（7）、成像镜头（8）、棱镜（9）、第二反射镜（10）、800nm长波通滤光片（11）、集成相机（12）、数据线（13）和工控机（14），其中785nm陷波滤光片（6）用于吸收785纳米激光而允许可见光和近红外荧光通过，棱镜（9）用于全反射可见光而增强近红外荧光透射，800nm长波通滤光片（11）用于将荧光纯化；样品（17）发出的可见光依次经由分光镜（4）、785nm陷波滤光片（6）、第一反射镜（7）、成像镜头（8）、棱镜（9）和第二反射镜（10）到达集成相机（12）；样品（17）发出的近红外荧光依次经由分光镜（4）、785nm陷波滤光片（6）、第一反射镜（7）、成像镜头（8）、棱镜（9）和800nm长波通滤光片（11）到达集成相机（12）；集成相机（12）经由数据线（13）与工控机（14）信号连接。
2.根据权利要求1所述的可见-近红外实时图像融合的荧光显微镜系统，其特征在于：所述内置激光同轴照明模块（1）还包括785nm带通滤光片（3），用于对从激光扩束器（2）传出的785nm的激光进行过滤。
3.根据权利要求1所述的可见-近红外实时图像融合的荧光显微镜系统，其特征在于：所述可见光透射照明模块还包括770 nm短波通滤光片（16），用于过滤汞灯（15）发出的光线。
4.根据权利要求1所述的可见-近红外实时图像融合的荧光显微镜系统，其特征在于：所述激光扩束器（2）包括凹透镜（201）、凸透镜（201）和套筒，且凹透镜（201）和凸透镜（201）均位于套筒内。
5.根据权利要求1所述的可见-近红外实时图像融合的荧光显微镜系统，其特征在于：所述光纤束（102）包括多根圆角矩形截面的光纤。
6.根据权利要求1所述的可见-近红外实时图像融合的荧光显微镜系统，其特征在于：所述集成相机（12）集成了黑白相机和彩色相机。
7.根据权利要求1所述的可见-近红外实时图像融合的荧光显微镜系统，其特征在于：所述分光镜（4）为780nm陷波二向色镜。
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