CN112014515A - 利用质谱数据库搜索来操作质谱仪 - Google Patents
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Abstract
描述用于质谱法的实时搜索(RTS)。在一个方面，质谱仪可通过搜索质谱数据库来识别用于产物离子谱的候选肽。在执行所述质谱数据库的搜索的同时，可监测经过的搜索时间。如果识别所述候选肽的所述经过的搜索时间在达到最大值之前结束，那么所述质谱仪可执行进一步的动作。
Description
技术领域
本公开涉及用于质谱法的设备和方法，并且更具体地，涉及一种使用质谱数据库搜索的结果的质谱仪的数据相关操作。
背景技术
生物质谱法的当前焦点是肽、蛋白质和相关分子的识别、定量和结构阐明。在此类实验中，通常需要或希望进行某些离子的受控碎裂(被称作串联或MSn质谱法)以得到产物离子，其质谱提供可高度适用于确认识别或导出关于所关注的分析物的结构细节的信息。MSn质谱法的一种常用方法被称为数据相关获得(DDA，替代地被称作信息相关获得)。DDA技术利用在一个质量分析扫描中获得的数据以基于预定标准自动选择用于质量隔离和碎裂的一种或多种离子种类。举例来说，质谱仪可经配置以进行全MS(前体离子)扫描，且接着基于如强度、电荷态、质荷比(m/z)、纳入/排除列表或同位素模式等标准从所得谱选择一种或多种离子种类用于后续MSn分析扫描。DDA技术提供简化产物离子谱的益处(通过仅选择某些离子种类用于碎裂，借此避免对包含由不同前体离子产生的产物离子的复杂产物离子谱进行解卷积的需要)，且高效使用仪器时间(通过从不符合预定标准且因此可能不受研究者关注的MSn分析离子排除)。
通常通过针对质谱数据库搜索以实验方式获得的质谱来进行肽识别，所述质谱数据库包含由已知肽氨基酸或遗传序列或先前获得的和策展的谱的经验库而计算的理论质谱。历史上，在获得后(即在所有分析扫描已完成之后)进行数据库搜索。最近(参见例如Erickson等人，“用于改进样品多路复用工作流的表现的有效仪器项目管理以及实时数据库搜索(Active Instrument Engagement Combined with a Real-Time Database Searchfor Improved Performance of Sample Multiplexing Workflows)”，《蛋白质组研究期刊(J.Proteome Research)》,第18卷,第1299-1306页(2019))，其公开内容以引用的方式并入本文中)，改进的搜索算法和更大功率的处理器已使得可实施质谱数据库的实时搜索(RTS)，其中可针对质谱数据库快速搜索实验质谱，且可在相对于质谱仪内离子种类的存在的持续时间(例如色谱洗脱峰的持续时间)较短的时间内(至少尝试性地)识别存在于所述谱中的一个或多个肽离子。使用RTS，可基于涉及谱中的肽离子的识别的标准来进行数据相关获得。在蛋白质组研究实验的情形下，此技术可尤其有价值，其中样品含有所关注的肽和其它分子的复杂混合物(例如基质衍生的物质，以及可能不受关注的高丰度种类)，允许研究人员增加在生物显著肽的MSn分析上花费的仪器扫描时间)。
必须快速地进行RTS以增加用于越来越多的复杂蛋白质组研究的质谱仪的处理量。这是因为当肽被引入到质谱仪中时，用于分析的肽的可用性可能相对较短。如果RTS花费大量时间，那么可进行的扫描的数目将减少，从而导致处理量更低、所收集的数据点更少以及样品被浪费。
发明内容
本公开中所描述的主题的一个创新方面包括操作质谱仪以分析生物样品的方法。所述方法包括在引入期期间将由所述生物样品生成的肽离子引入到所述质谱仪中；将所述肽离子碎裂以形成产物离子；对所述产物离子进行质量分析以获得产物离子谱；以及在所述引入期期间，使用编程控制器来进行：执行质谱数据库的搜索以尝试识别所述质谱数据库中的匹配所述产物离子谱的候选肽，所述质谱数据库含有候选肽的产物质谱信息，在执行所述质谱数据库的搜索的同时，监测经过的搜索时间，以及在所述经过的搜索时间达到第一最大值之前识别到匹配所述产物离子谱的候选肽之后，使所述质谱仪基于识别而执行动作。
在一些实施方案中，引入肽离子包括电离所述生物样品的色谱分离组分，所述引入期由所述组分的色谱洗脱峰宽度界定。
在一些实施方案中，所述第一最大值由用户界定。
在一些实施方案中，基于在对应的经过的搜索时间达到第二最大值之前未识别到候选肽的搜索结果的历史来界定所述第一最大值，所述第二最大值小于所述第一最大值。
在一些实施方案中，将所述肽离子碎裂包括在碎裂之前将至少一种离子种类质量隔离。
在一些实施方案中，所述第一最大值小于或等于20毫秒(ms)。
在一些实施方案中，使用存储于所述质谱数据库中的氨基酸序列来识别所述候选肽。
在一些实施方案中，使用存储于所述质谱数据库中的凭经验确定的质谱来识别所述候选肽。
在一些实施方案中，待基于所述候选肽的识别而执行的所述动作包括针对产物离子种类中的一种或多种进行MSn分析的另外阶段。
在一些实施方案中，待基于所述候选肽的识别而执行的所述动作包括阻止针对产物离子种类中的一种或多种进行MSn分析的另外阶段。
在一些实施方案中，待基于所述候选肽的识别而执行的所述动作包括调节由用于将所述肽离子由第一碎裂类型碎裂成第二碎裂类型的碎裂单元实施的碎裂技术，所述第一碎裂类型和所述第二碎裂类型为不同碎裂类型。
在一些实施方案中，所述方法包括将所述肽离子碎裂以形成第二产物离子；对所述第二产物离子进行质量分析以获得第二产物离子谱；以及在所述引入期期间，使用所述编程控制器来进行：执行所述质谱数据库的第二搜索以尝试识别所述质谱数据库中的匹配所述第二产物离子谱的候选肽，在执行所述质谱数据库的搜索的同时，监测所述第二搜索的第二经过的搜索时间，且确定所述第二经过的搜索时间超出所述第一最大值，并在识别出超出所述第一最大值的所述第二经过的搜索时间后，终止所述第二搜索。
本公开中所描述的主题的另一创新方面包括一种用于分析生物样品的设备。所述设备包括：分离装置，其经配置以将所述生物样品按时序分离成组分；电离源，其经配置以接收所述生物样品的组分且在引入期期间由所述组分生成肽离子；碎裂装置，其经配置以将所述肽离子碎裂以形成产物离子；质量分析仪，其经配置以分析所述产物离子以产生产物离子谱；以及控制器，其编程有用于以下的指令：执行质谱数据库的搜索以尝试识别所述质谱数据库中的匹配所述产物离子谱的候选肽，所述质谱数据库含有候选肽的产物质谱信息，在执行所述质谱数据库的搜索的同时，监测经过的搜索时间，以及在所述经过的搜索时间达到第一最大值之前识别到匹配所述产物离子谱的候选肽之后，使所述质谱仪基于识别而执行动作。
在一些实施方案中，所述分离装置为色谱装置，并且其中所述引入期由所述组分的色谱洗脱峰宽度界定。
在一些实施方案中，所述第一最大值：(i)由用户界定，或(ii)基于在所述对应的经过的搜索时间达到第二最大值之前未识别到候选肽的搜索结果的历史来界定，所述第二最大值小于所述第一最大值。
在一些实施方案中，所述第一最大值小于或等于20毫秒(ms)。
在一些实施方案中，使用存储于所述质谱数据库中的氨基酸序列来识别所述候选肽。
在一些实施方案中，使用存储于所述质谱数据库中的凭经验确定的质谱来识别所述候选肽。
在一些实施方案中，待基于所述候选肽的识别而执行的所述动作包括针对产物离子种类中的一种或多种进行MSn分析的另外阶段。
在一些实施方案中，待基于所述候选肽的识别而执行的所述动作包括阻止针对产物离子种类中的一种或多种进行MSn分析的另外阶段。
在一些实施方案中，待基于所述候选肽的识别而执行的所述动作包括调节由用于将所述肽离子由第一碎裂类型碎裂成第二碎裂类型的碎裂装置实施的碎裂技术，所述第一碎裂类型和所述第二碎裂类型为不同碎裂类型。
在一些实施方案中，碎裂为经配置以碎裂所述肽离子以形成第二产物离子的装置，所述质量分析仪经配置以分析所述第二产物离子以产生第二产物离子谱，且所述控制器进一步编程有用于以下的指令：执行所述质谱数据库的第二搜索以尝试识别所述质谱数据库中的匹配所述第二产物离子谱的候选肽，在执行所述质谱数据库的搜索的同时，监测所述第二搜索的第二经过的搜索时间，且确定所述第二经过的搜索时间超出所述第一最大值，并在识别出超出所述第一最大值的所述第二经过的搜索时间后，终止所述第二搜索。
本公开中描述的主题的另一个创新方面包括一种设备，其包括质量分析仪，其经配置以分析产物离子以产生产物离子谱；以及控制器，其编程有用于以下的指令：使用所述产物离子谱和包括与候选肽的质谱相关的信息的数据库识别候选肽；在执行所述数据库的搜索的同时，监测经过的搜索时间，将所述经过的搜索时间与用于进行所述数据库的搜索的最大搜索时间值进行比较，以及在所述经过的搜索时间达到所述最大搜索时间值之前识别到所述候选肽之后，使所述质谱仪基于识别而执行动作。
附图说明
图1说明质谱仪的实例。
图2说明用于操作质谱仪的框图的实例。
图3说明针对质谱仪进行实时搜索(RTS)的框图的实例。
图4说明针对质谱仪进行RTS的实例。
图5说明用于调节质谱仪的操作参数的框图的实例。
图6说明调节质谱仪的操作参数的实例。
图7说明将分析物引入到质谱仪的实例。
图8说明调节RTS特征的实例。
图9和图10说明用于调节RTS特征的框图的实例。
图11说明可用于实施实例中的一些的电子装置的实例。
具体实施方式
本公开中描述的一些材料包括用于实时搜索(RTS)的质谱仪和技术。在一个实例中，可将包括肽的混合物引入到色谱系统中，使得混合物中的不同肽分离且引入到质谱仪中以用于在不同时间分析。由色谱峰宽度确定将色谱分离的肽引入到质谱仪中的引入期(即肽开始从色谱柱洗脱并递送到质谱仪入口与洗脱完成时之间的时间)且界定可用于对肽进行质谱操作的时间。
在用于蛋白质组研究的RTS中，由质谱仪生成的实验质谱用于搜索质谱数据库。质谱数据库包括电子存储的信息集合，其包括以下中的任一个或两个：(i)数据，如肽和/或蛋白质的氨基酸序列，其可用于基于预定规则(例如蛋白水解裂解、碎裂预测等)生成理论质谱，或(ii)先前针对经识别肽(即谱库)所获得的凭经验导出的谱，尽管也可存储其它类型的与肽和/或蛋白质相关的信息。包含于质谱数据库中或从质谱数据库导出的理论或凭经验导出的质谱包括离子m/z的列表和任选地对应的经测量或经预测的强度。如果实验质谱匹配数据库中的候选质谱，那么可以识别实验质谱所表示的肽。使用数据相关分析(DDA)规则，如果所述肽是所关注的，那么可以对肽的产物离子(例如可以进行MS3操作)进行质谱仪的另外操作。可替代地，可以设置DDA标准以使得连续操作的进行或省略取决于实验谱是否匹配数据库中的任何候选肽。此途径可有助于避免对样品基质中的非肽物质进行进一步扫描。在肽的引入时间或进入时间期间进行这些操作。
如稍后在本公开中所描述，可监测经过的搜索时间且将其与最大搜索时间进行比较。如果经过的搜索时间超出最大搜索时间，那么可终止质谱数据库的RTS。代替等待搜索完成，质谱仪可进行下一操作(例如将不同前体离子碎裂)，而非对产物离子执行进行另外操作(例如可避免MS3操作)。如果经过的搜索时间在达到最大搜索时间之前结束，那么质谱仪可取决于返回的搜索结果而进行后续操作。
由于过长搜索时间将减少可进行的数据相关扫描的数目，因此相对于最大搜索时间监测经过的搜索时间可通过避免与延长搜索时间相关联的延迟且替代地进行到另一操作而提供样品的更完整特征，这可得到关于在质谱仪内可用的样品的肽或其它组分的重要信息。
更详细地，图1说明质谱仪的实例。图2说明用于操作如图1的实例的质谱仪以获得产物离子质谱的框图的实例。在图2的框图中，使肽与混合物中的其它肽(和其它组分)分离(205)。举例来说，在图1中，混合物分离器105可为液相色谱(LC)、气相色谱(GC)、毛细管电泳(CE)或用于分离混合物的组分的其它类型的系统。在经历消化的蛋白质的实例中，混合物的单独组分为肽(例如蛋白质的片段)。
在图1中，混合物分离器105被描绘为将肽混合物分离成包括肽150和155的若干组分。肽150和155在空间或位置中沿着流动路径(例如在色谱柱内)分离，使得肽150和155在不同时间引入到质谱仪110中。这描绘了具有分别展示表示肽150和155的峰170和175的色谱图195。不同肽可在混合物内具有不同丰度，且因此，峰中的每一个以不同方式呈现。
返回到图2的框图，可接着将肽提供给质谱仪(205)且肽可电离以形成前体离子(207)。举例来说，在图1中，当肽150引入到质谱仪110中时，首先将所述肽提供给离子源120。离子源120可通过将电荷载运实体(例如氢核或电子)从材料中去除或添加到材料中而在分析下电离材料，以提供具有正电荷或负电荷的材料。这产生由肽150的电离形成的前体离子。离子源120将通常为电喷雾电离(ESI)类型，但可取而代之为利用任何其它合适的电离技术，包括大气压化学电离(APCI)或大气压光电离(APPI)。
接下来，在图2中，前体离子经质量隔离(210)。举例来说，在图1中，由离子源120形成的肽的前体离子经由恰当离子光学器件输送到质量选择器130。在一个实例中，质量选择器130可呈四极杆滤质器(quadrupole mass filter)的形式，其中调节射频(RF)和解析直流电(DC)电压的幅度，使得仅发射在窄范围的m/z值内的离子。可替代地，质量选择器130可为能够隔离所关注的m/z窗口内的离子的任何合适的装置，如分析型离子阱或飞行时间(TOF)质量分析器。如图1中所描绘，肽的一些前体离子因此经质量选择且向前传递到碎裂单元135。换句话说，一些前体离子种类经质量隔离。
在图2中，前体离子经碎裂以生成产物离子(215)。举例来说，在图1中，碎裂单元135从质量分析仪130接收前体离子且将前体离子碎裂或分解为更小的产物离子。通常对更大分子(如肽)进行碎裂，以允许更详细地理解肽的结构组成。碎裂单元135可使用许多不同类型的解离技术实施，所述解离技术包括碰撞诱导解离(CID)、表面诱导解离(SID)、电子捕获解离(ECD)、电子转移解离(ETD)、负电子转移解离(NETD)、电子分离解离(EDD)、光解离、更高能量C阱解离(HCD)等。
接着，在图2中，对产物离子进行质量分析以得到实验质谱(225)。举例来说，在图1中，将由碎裂单元135形成的产物离子提供给质量分析仪140，进行质量分离，且接着提供给检测器145。质量分析仪140可以是根据离子的质荷比分离离子的任何合适的装置，包括但不限于轨道静电阱、分析四极杆离子阱、傅立叶变换离子回旋共振(FTT-ICR)分析仪、TOF质量分析仪或四极杆滤质器。检测器145可检测在质量分析仪140所提供的产物离子通过或撞击检测器145的表面时产生的感应电荷或电流。因此，检测器145可生成表示产物离子的m/z的信号。可将这些信号提供给控制器115，其可接着使用检测到的信号生成质谱。
在图1中，质谱仪110为串列式质谱仪，其经配置以实施单独阶段的质量隔离和碎裂，如通过质量选择器130与质量分析仪140之间的碎裂单元135的布置所指示。这通常被称作MS/MS或MS2质谱法。在某些实施方案中，可能需要进行产物离子的生成的隔离和碎裂的进一步阶段(例如MS3、MS4、MS5等，其中n为正整数)。在这种情况下，质谱仪110的组件可经配置以实行另外的隔离/碎裂操作。举例来说，质量分析仪140可为分析四极杆离子阱质量分析仪，其除了进行用于获得质谱的质量分离功能之外还能够执行质量隔离和碎裂的步骤。
举例来说，在图1中，控制器115可为可分析使用由检测器145提供的信号生成的实验质谱的编程控制器电路。数据库160可为存储与许多不同肽的理论质谱相关的数据(例如基于氨基酸序列、凭经验确定的质谱(例如基于先前观察结果或经历)或如本文稍后所论述的其它信息)的数据库。如下文进一步详细论述，控制器115可经编程以搜索数据库来确定数据库中所含候选肽(如果存在的话)具有(理论或凭经验确定)与以实验方式获得的质谱匹配的质谱，由此以合理的置信度建立产生实验质谱为数据库中的匹配候选肽的样品组分。
使用DDA规则数据库185，控制器115可以进一步确定肽是否受关注用于进一步分析，并且如果是，对产物离子进行MS3以生成肽的另外信息。如果肽并非所关注的或如果未返回匹配肽，那么可阻止进行另外MS3操作。确切地说，可以不同方式选择或碎裂不同前体离子以形成用于分析的其它产物离子。
然而，因为肽150仅在短时间内提供到质谱仪110(如在具有峰170的色谱195中所描绘)，所以在肽150仍可用的同时必须相对较快地进行针对匹配肽的数据库160的搜索。举例来说，如图1中所描绘，在肽150的丰度可用于质谱仪110的同时执行t搜索180(指示针对可能的匹配进行数据库160搜索所经过的搜索时间)。因此，较小t搜索180(即更快的经过的搜索时间)可允许肽150的MS扫描更多，引起质谱仪110的处理量更高、所收集的数据更多以及肽150的浪费更少。
在图1中，控制器115可实施计时器165，其可用于通过在接收到实验质谱时或在搜索开始时使计数器递增来测量或确定经过的搜索时间t搜索180。如果经过的搜索时间超出最大值，那么可终止针对匹配的数据库160的搜索。这可引起跳过针对产物离子的MS3，且针对肽150的不同前体离子进行新MS2扫描。如果t搜索180小于最大值，那么继续搜索直到匹配肽返回或确定不存在匹配肽为止。当匹配肽在达到最大值之前返回时，可以指令质谱仪110基于例如进行MS3的候选肽的识别而执行动作。在MS3之后，可进行用于不同前体离子的新MS2扫描。
现将相对于图3和图4描述关于RTS技术的更多细节。图3说明针对质谱仪进行RTS的框图的实例。图4说明针对质谱仪进行RTS的实例。如参考图1所论述，可以分离具有肽的混合物，使得不同组分在不同时间(即按时序分离)被提供给质谱仪110。在图4中，待分离的混合物被描绘为肽混合物405，并且肽410为与混合物的其它肽隔离并且被提供给质谱仪110的肽。因此，在图3中，可以在引入期(305)期间将肽引入到质谱仪中并且电离以形成肽离子。肽离子可经历碎裂以形成产物离子(310)。在图4中，这被描绘为碎裂肽415。
接下来，在图3中，可对产物离子进行质量分析以获得产物离子谱(315)。在图4中，这被描绘为实验质谱420，其提供产物离子的相对丰度对产物离子的m/z的曲线图。
返回到图3，可接着执行质谱数据库的搜索以识别匹配产物离子谱(320)的候选肽。也就是说，由质谱仪110生成的产物离子的实验质谱用于搜索图1中的数据库160，以识别与质谱数据库中存储的理论或经验质谱的匹配。因为理论或经验质谱中的每一个均可与肽结合，所以识别实验质谱与理论或经验质谱之间的匹配会提供肽的识别作为引入到质谱仪110中的肽的候选物。
候选肽的识别可包括多种算法。在图4的实例中，针对存储在数据库160中的质谱中的一些或全部生成表示匹配的置信度或可能性的分数。最高分数可以用于将肽候选物识别为匹配，其在图4中描绘为肽425a，而肽425b和425c具有更低分数，并且因此不被识别为匹配。然而，其它算法可包括另外度量，例如需要在阈值范围内被识别为匹配的分数。
如先前所论述，数据库160可存储理论或经验质谱的不同类型的信息。举例来说，所述信息可包括氨基酸序列或凭经验确定或导出的质谱。另外，肽候选物的识别可以包括将x轴上的m/z位置和实验质谱420的y轴上的相对丰度与所存储的信息匹配。然而，其它应用可使用更少或更多的信息。举例来说，对于更快的搜索，仅实验质谱420的x轴上的m/z位置(或峰值列表)用于识别候选肽。可以用于蛋白质和肽识别的算法的一些实例包括SEQUEST、Mascot、MOWSE、COMET等。
返回到图3，在执行搜索时，可监视经过的搜索时间以确定其是否已达到最大搜索时间(325)，且如果经过的搜索时间已达到最大搜索时间，那么可终止搜索(330)。举例来说，在搜索终止时，质谱仪可针对不同前体离子恢复新MS2扫描。然而，如果在经过的搜索时间达到最大值之前已完成候选肽的搜索(返回实验质谱匹配候选肽质谱的结果，或替代地未发现匹配候选肽的结果)，那么可使得质谱仪基于搜索结果(例如识别到匹配候选肽(335))而执行动作。举例来说，在图4中，如果t搜索180(即经过的搜索时间)低于t最大430(即最大搜索时间)，那么肽425a可以被识别为实验质谱420的候选肽，并且因此识别肽410。
在一个实例中，最大搜索时间可为20毫秒(ms)，且平均经过的搜索时间可为10ms。因此，20ms的最大搜索时间可允许有充分的空间去识别大多数搜索的候选肽。另外，因为总引入期可在数十秒到数分钟内变化，所以最大搜索时间确保可进行许多搜索。
如将参考图5和6所描述，可以在识别候选肽后立即执行的动作包括调节质谱仪的不同操作参数。图5说明用于调节质谱仪的操作参数的框图的实例。图6说明调节质谱仪的操作参数的实例。在图5的框图中，可进行另外质量分析(505)。举例来说，图1中的质谱仪110可由控制器115配置以对产物离子进行MS3。对产物离子进行MS3包括进行质量隔离和碎裂的另外阶段以产生另一实验质谱,此时间用于碎裂产物离子。另外MS3扫描可提供关于样品组分的另外信息。
此外，可基于识别阻止进行另外MS3(或其它MSn)操作。举例来说，如果所识别的候选肽并非实验关注的候选肽(例如如DDA规则数据库185中所指示)或替代地尚未发现匹配肽，那么可阻止进行MSn。
根据本文所公开的方法的特定实施方案，可结合基于报告离子的多重肽定量技术来利用最大搜索时间限制的RTS路线，其由McAlister等人的“MultiNotch MS3实现跨越癌细胞系蛋白质组的差异表达的精确、敏感、且多重的检测(MultiNotch MS3 EnablesAccurate,Sensitive and Multiplexed Detection of Differential ExpressionAcross Cancer Cell Line Proteomes)”，《分析化学(Analytical Chemistry)》、第86卷，第7150-7158页(2014)所描述，其公开内容以引用的方式并入本文中。根据此技术，分析用化学方式标记的含肽的样品以识别样品之间或当中的肽的差异表达，其中通过测量报告离子信号来实现相对定量(每一样品都用具有相异的质荷比的报告离子的试剂用化学方式标记)。为了减少或避免干扰、共洗脱种类对相对丰度的计算的影响，利用MS3途径，其中通过样品的电离产生的前体离子经历两个连续的隔离和碎裂阶段。然而，如果MS2产物离子谱揭露不存在所关注的匹配肽，那么进行MS3可为低效的。为了解决此问题，RTS路线可用于分析MS2谱是否匹配数据库中所含有的所关注的候选肽；如果是，那么方法进行到获得MS3谱，且如果不是，那么方法进行到选择不同前体离子以用于获得产物离子谱。由最大搜索时间限制强加的时间约束确保RTS路线的使用不会过度地减少跨越色谱峰可获得的数据点的数目。
返回到图5，可调节的其它操作参数包括碎裂类型(510)、质量分析仪的分辨力(515)或调节质量分析仪类型(520)。在图6中，调节碎裂类型在简化实例中描绘为碎裂类型610。碎裂类型610描绘在待用于碎裂前体离子的不同碎裂技术当中切换的选项，但本文中所描述的所有碎裂技术可在所述技术当中切换且其它碎裂单元可用于所述技术中的一些技术。也就是说，质谱仪可包括多个碎裂单元以实施不同类型的碎裂技术。使用不同碎裂类型可允许另外数据收集与先前获得的实验质谱互补。
关于调节质量分析仪的分辨力，这在简化实例中描绘为图6中的分辨力615。增加质量分析仪140的分辨力可改进质谱仪110区分实验质谱420中的具有稍微不同的m/z的两个峰的能力。也就是说，可识别具有稍微不同的m/z的两个m/z值，其中质谱的峰单独且不同。举例来说，通过在Orbitrap质量分析仪上收集更长瞬变(例如用于收集和检测产物离子的时间)，与当收集更短瞬变时相比，质量分析仪的分辨力增加。
关于调节质量分析类型，在一些实施方案中，可使用其它质量分析仪。举例来说，可使用具有更低分辨率或更低质量准确性的质量分析仪生成第一实验质谱。如果第一实验质谱在搜索期间(且在经过的搜索时间的最大搜索时间内)产生候选肽，那么可使用具有不同性能特性(例如具有比第一质量分析仪更高的分辨率或更高的质量准确性)的另一质量分析仪进行第二次分析。在一些实施方案中，归因于所收集的数据的增加，使用第一质量分析仪的结果的最大搜索时间可比使用第二质量分析仪的结果的最大搜索时间短。在图6中，这被描绘为使用质量分析仪605而不是质量分析仪140。接着可生成第二实验质谱。因为第二质量分析仪具有更好的性能特征，所以产生可提供待用于提供候选肽的更多可靠识别的更多信息或特征的具有更高分辨率的第二实验质谱。
如先前所论述，在RTS中，在肽存在且可用于质谱仪内的实验的同时进行搜索。举例来说，在通过离子源电离肽之后，肽离子可用于质量选择和碎裂，且因此，可生成实验质谱且可通过使实验质谱与肽候选物的质谱匹配而进行MS3扫描。因此，可相对较快地进行RTS，从而确定许多实验质谱，且作出关于是否进行MS3的许多决策，并且进行MS3，同时电离肽。
图7说明将分析物引入到质谱仪的实例。在图7中，x轴表示时间，且y轴表示实验下分析物(例如如先前所论述的肽)的丰度。在图7中，t引入705表示肽离子可用的引入时间或进入时间。肽的丰度从零增加到t丰度峰710处的峰值，且接着在t引入705结束时从峰值下降到零。如果使用用于混合物分离器105的色谱技术，那么这类似于样品的色谱分离肽。因此，可以由分离的组分(例如图1中的肽150或图4中的肽410)的色谱洗脱峰宽度界定t引入705。为了改进实验质谱的质量，可以进行实验质谱的生成，而肽离子的丰度在阈值水平内产生(例如以峰值为中心)，但在一些实施方案中，可以仅对上升斜率进行生成实验质谱的各种操作。如先前所论述，经过的搜索时间中的每一个应在t最大内，否则可终止搜索。
最大搜索时间或t最大可由操作者或用户指示(例如经由使用控制器115实施的软件系统的图形用户接口(GUI))或自动设置为默认值。然而，在引入时间t引入期间或之后，控制器115还可动态调节最大搜索时间。此外，还可在引入时间期间或之后修改数据库160的内容。
更详细地，图8说明调节RTS特征的实例。图9和图10说明用于调节RTS特征的框图的实例。在图8中，控制器115实施逻辑或功能，其包括管理如何进行搜索的搜索特征805，以及使用实验质谱和数据库进行候选肽的RTS的搜索分析815。在其中最大搜索时间由用户指定的情况下，接收用户输入820且建立t最大825以匹配用户输入820。
然而，在一些实施方案中，可在引入时间期间通过识别搜索结果的历史或如何引入肽离子来调节最大搜索时间t最大825。这可允许来自用户输入820的改变且确保在用户输入820提供过短的最大搜索时间且产生许多终止搜索的情况下收集更多的数据。
举例来说，在图9中，可接收质谱数据库的搜索的结果(905)。在图8中，这被描绘为由搜索分析815提供给搜索特性805的搜索结果820。搜索结果820可指示是否在最大搜索时间内识别出候选肽，或是否由于超出最大搜索时间的经过的搜索时间而终止搜索。可接着存储(例如在如数据库的存储器装置中)搜索结果820。返回到图9的框图，接着可确定关于引入期期间的搜索历史的特征(910)。举例来说，如果连续发生了一定数目的失败搜索(例如归因于超出最大搜索时间的经过的搜索时间而终止搜索)，或如果在引入期期间失败搜索的数目已达到一定数目，那么可对此进行识别。控制器可接着调节关于如何进行质谱数据库的搜索的特征(915)。举例来说，在图8中，可以增加最大搜索时间tmax 825，使得可以花费更多时间搜索候选肽(即在终止搜索之前经过的搜索时间可以变得更长)。
另外，可修改数据库内容830以允许搜索更少的数据库内容。通过搜索更少的内容，对候选肽的搜索可能在以具有一些实验质谱为代价时会更快，所述实验质谱由于搜索中不包括可能的匹配而被指示为缺乏候选肽。在一个实例中，数据库可包括关于候选肽的另外数据，所述候选肽包括关于候选肽来源于的蛋白质或候选肽自身的标注。举例来说，可针对候选肽中的每一种标注动物(例如小鼠)或器官系统(例如肝)的类型。接着可通过仅搜索在关于标注的约束条件内符合的肽候选物来减少数据库内容830，例如仅可搜索在来自小鼠肝的蛋白质中产生的肽。
另外，可基于在引入期期间提供肽离子的方式来修改t最大825或数据库内容830。举例来说，安置于混合物分离系统内、在离子源之前或在离子源之后的传感器可用于确定如何将肽或肽离子引入到质量分析仪。这在图8中描绘为提供给搜索特征805的引入期特征810。引入期特征810可包括丰度的变化率、识别丰度是否增加或减小或已达到峰值、斜率、当前丰度或根据操作条件和参数计算的其它测定；例如可基于色谱峰宽度、谱扫描速率、待分析的前体离子种类的数目等调节t最大825。
使用此信息，可确定或估计引入期且使用所述引入期来确定最大搜索时间以确保将进行最小数目的MS扫描。然而，在其它实施方案中，可确定且使用其它时间帧来设置最大搜索时间。举例来说，可确定或估计图7中的t丰度峰710。
因此，在图10中，接收关于如何将肽离子引入到质谱仪中的信息(1005)。基于此信息，可估计引入期t引入(1010)且使用所述引入期t引入来调节关于如何进行质谱数据库的搜索的特征(1015)。举例来说，基于所估计的引入期，可估计最大搜索时间。可以设置最大搜索时间以确保引入期期间进行一定数目的搜索。另外，如关于图9类似地论述，还可调节数据库内容830。
许多实例描述用于识别肽的液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)的实施方案。然而，可使用其它类型的混合物分离，包括气相色谱(GC)或毛细管电泳(CE)。
实例描述用于候选肽的RTS的技术，然而可识别其它生物分子，且质谱仪可在识别后立即执行特定动作。举例来说，除蛋白质和其肽以外，可与所述技术一起使用的其它类型的生物分子包括脂质、核酸、代谢物、低聚糖、多醣等。此外，除小分子以外，可识别除生物分子以外的其它大分子。因此，可以针对许多不同类型的分子生成实验质谱，数据库可以存储与可能的候选物相关的信息，并且可以进行RTS以识别候选物。
在实例中描述的串联质谱仪可以是三重四极杆质谱仪(QqQ)、四极杆飞行时间质谱仪(QqTOF)或其它类型的质谱仪。另外，虽然实例描述空间中的串列质谱，但串列质谱迟早也可与本文中所描述的技术一起使用。在串列式质谱仪中，迟早可使用单个质量分析仪。此外，如还通过图6的实例所论述，可将超过两个质量分析仪安置于质量分析仪内。
在实例中描述的数据库由质谱仪的控制器系统局部存储。然而，还可使用基于云的实施方案，其中数据库存储在可由控制器接入的远程服务器上。另外，可以用RTS技术实施混合途径。举例来说，可与存储于远程服务器中的更大的数据库并联地搜索存储于质谱仪的系统中的更小的数据库。混合途径可以允许更小的数据集(包括更高可能性的候选肽)被相对较快地识别。如果未用本地数据库识别分析中的肽，那么远程数据库可搜索更大的数据集以尝试识别候选肽。
图11说明可用于实施一些实施方案的电子装置的实例。图11的电子装置可存储或使用包括一个或多个非暂时性计算机可读介质的计算机程序产品，所述非暂时性计算机可读介质具有指令存储于其中的计算机程序、经配置的计算机程序指令，从而在由一个或多个计算装置执行所述计算机程序指令时，所述计算机程序指令使得一个或多个计算装置：使得在引入期期间将由所述生物样品产生的肽离子引入到质谱仪中；将所述肽离子碎裂以形成产物离子；对所述产物离子进行质量分析以获得产物离子谱；以及在所述引入期期间，执行所述质谱数据库的搜索以尝试识别所述质谱数据库中的匹配所述产物离子谱的候选肽，所述质谱数据库含有候选肽的产物质谱信息，在执行质谱数据库的搜索的同时，监测经过的搜索时间，且在识别匹配经过的搜索时间达到第一最大值之前的产物离子谱的候选肽之后，使质谱仪基于识别而执行动作。
在图11中，计算机系统1100可实施本文中所描述的方法或技术中的任一种。举例来说，计算机系统1100可实施图1中的控制器115。因此，可根据由计算机系统1100进行的计算或确定来调节相关联的质谱仪的组件的操作。在各种实施例中，计算机系统1100可以包括总线1102或其它传达信息的通信机构，以及与总线1102耦合用于处理信息的处理器1104。在各种实施例中，计算机系统1100还可包括耦合到总线1102的存储器1106(其可为随机存取存储器(RAM)或其它动态存储装置)以及待通过处理器1104执行的指令。存储器1106也可用于在被处理器1104执行的指令的执行期间存储临时变量或其它中间信息。在各种实施例中，计算机系统1100可进一步包含耦合到总线1102以便存储用于处理器1104的静态信息和指令的只读存储器(ROM)1108或其它静态存储装置。可以提供存储装置1110(如磁盘或光盘)且将其耦合到总线1102以存储信息和指令。
在各种实施例中，计算机系统1100可以经由总线1102耦合到显示器1112，如阴极射线管(CRT)或液晶显示器(LCD)以将信息显示给计算机用户。包括字母数字键和其它键的输入装置1114可以耦合到总线1102以传达信息和命令选择到处理器1104。另一类型的用户输入装置为光标控制器1116，如鼠标、轨迹球或光标方向键，其用于传达方向信息和命令选择到处理器1104和控制显示器1112上的光标移动。这一输入装置通常在两个轴，即第一轴(即x)和第二轴(即y)上具有两个自由度，由此允许所述装置指定平面中的位置。
计算机系统1100可进行本文中所描述的技术。根据某些实施方案，计算机系统1100可以响应于处理器1104执行存储器1106中含有的一个或多个指令的一个或多个序列而提供结果。此类指令可以从另一计算机可读介质(如存储装置1110)读取到存储器1106。存储器1106中含有的指令序列的执行可以使得处理器1104执行本文所描述的方法。在各种实施例中，存储器中的指令可以对处理器内可用的逻辑门的各种组合的使用排序以执行本文描述的过程。或者，可以使用硬连线电路代替或结合软件指令以实施本传授内容。在各种实施例中，硬连线电路可包括以必要序列操作以执行本文所描述的过程的必要逻辑门。因此，本文中所描述的实施方案不限于硬件电路和软件的任何特定组合。
如本文所用的术语“计算机可读介质”是指参与将指令提供到处理器1104以供执行的任何介质。这类介质可以呈许多形式，包括(但不限于)非易失性介质、易失性介质以及传输介质。非易失性介质的实例可以包括(但不限于)光盘或磁盘，如存储装置1110。易失性介质的实例可以包括(但不限于)动态存储器，如存储器1106。传输介质的实例可包括(但不限于)同轴电缆、铜线和光纤，包含包括总线1102的电线。
非暂时性计算机可读介质的常见形式包含例如软盘、软磁盘、硬盘、磁带或任何其它磁性介质、CD-ROM、任何其它光学介质、穿孔卡、纸带、具有孔图案的任何其它物理介质、RAM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其它存储器芯片或盒带，或可被计算机读取的任何其它有形介质。
根据各种实施例，被配置成被处理器执行以进行方法的指令存储在计算机可读介质上。计算机可读介质可以是存储数字信息的装置。例如，计算机可读介质包括本领域中已知的用于存储软件的压缩光盘只读存储器(compact disc read-only memory；CD-ROM)。计算机可读介质由适合于执行配置成待执行的指令的处理器存取。
在各种实施例中，本教示的方法可以在以如C、C++等常规编程语言编写的软件程序和应用程序中实施。
虽然结合各个实施方案或实施例来描述本技术，但是并不打算将本技术限制于此类实施例。相反，所述技术涵盖所属领域的技术人员应了解的各种替代方案、修改方案以及等效物。
此外，在描述各种实施例时，本说明书可能将方法和/或过程呈现为特定步骤序列。然而，在方法或过程不依赖于本文中所阐述的步骤的特定顺序的程度上，方法或过程不应限于所描述的步骤的特定顺序。如本领域的普通技术人员将了解，步骤的其它顺序可以是可能的。因此，本说明书中所阐述的特定步骤顺序不应被解释为对权利要求的限制。另外，针对方法和/或过程的权利要求书不应限于以书写的次序执行其步骤，并且本领域技术人员可以易于了解的是顺序可以变化并且仍保持在各种实施例的精神和范围内。
本文所描述的实施例可以用包括以下的其它计算机系统配置实践：手持式装置、微处理器系统、基于微处理器或可编程消费型电子装置、微型计算机、大型主机计算机等。所述实施例还可在分布式计算环境中实践，其中由通过网络链接的远程处理装置实行任务。
还应理解，本文所描述的实施例可以使用涉及存储在计算机系统中的数据的各种计算机实施操作。这些操作为需要物理量的物理操纵的操作。通常(但未必)，这些量采用能够被存储、转移、组合、比较和以其它方式控制的电或磁信号的形式。另外，进行的操控通常以如产生、鉴别、确定或比较的术语提及。
形成本文所描述的实施例的一部分的操作中的任一个为有用的机器操作。本文所描述的实施例还涉及用于进行这些操作的装置或设备。本文所描述的系统和方法可以出于所需目的专门构建或其可以是通过存储在计算机中的计算机程序选择性地激活或配置的通用计算机。确切地说，各种通用机器可与根据本文中的教示编写的计算机程序一起使用，或可能更便于构造更专用设备来执行所需操作。
某些实施例还可以实施为计算机可读介质上的计算机可读代码。计算机可读介质是可以存储此后可以通过计算机系统读取的数据的任何数据存储装置。计算机可读介质的实例包括硬盘驱动器、网络连接存储(NAS)、只读存储器、随机存取存储器、CD-ROM、CD-R、CD-RW、磁带以及其它光学和非光学数据存储装置。计算机可读介质也可以分布在网络耦合的计算机系统上，使得计算机可读代码以分布方式存储和执行。
Claims (23)
1.一种操作质谱仪以分析生物样品的方法，其包含：
在引入期期间将由所述生物样品生成的肽离子引入到所述质谱仪中；
将所述肽离子碎裂以形成产物离子；
对所述产物离子进行质量分析以获得产物离子谱；以及
在所述引入期期间，使用编程控制器来进行：
执行质谱数据库的搜索以尝试识别所述质谱数据库中的匹配所述产物离子谱的候选肽，所述质谱数据库含有候选肽的产物质谱信息，
在执行所述质谱数据库的搜索的同时，监测经过的搜索时间，以及
在所述经过的搜索时间达到第一最大值之前识别到匹配所述产物离子谱的所述候选肽之后，使所述质谱仪基于所述识别而执行动作。
2.根据权利要求1所述的方法，其中引入肽离子包括电离所述生物样品的色谱分离组分，所述引入期由所述组分的色谱洗脱峰宽度界定。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一最大值由用户界定。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中基于在对应的经过的搜索时间达到第二最大值之前未识别到候选肽的搜索结果的历史来界定所述第一最大值，所述第二最大值小于所述第一最大值。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中将所述肽离子碎裂包括在碎裂之前将至少一种离子种类质量隔离。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述第一最大值小于或等于20毫秒(ms)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中使用存储于所述质谱数据库中的氨基酸序列识别所述候选肽。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中使用存储于所述质谱数据库中的凭经验确定的质谱识别所述候选肽。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中待基于所述候选肽的所述识别而执行的所述动作包括针对产物离子种类中的一种或多种进行MSn分析的另外阶段。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中待基于所述候选肽的所述识别而执行的所述动作包括阻止针对产物离子种类中的一种或多种进行MSn分析的另外阶段。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中待基于所述候选肽的所述识别而执行的所述动作包括调节由用于将所述肽离子由第一碎裂类型碎裂成第二碎裂类型的碎裂单元实施的碎裂技术，所述第一碎裂类型和所述第二碎裂类型为不同碎裂类型。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其进一步包含：
将所述肽离子碎裂以形成第二产物离子；
对所述第二产物离子进行质量分析以获得第二产物离子谱；以及
在所述引入期期间，使用所述编程控制器来进行：
执行所述质谱数据库的第二搜索以尝试识别所述质谱数据库中的匹配所述第二产物离子谱的候选肽，
在执行所述质谱数据库的搜索的同时，监测所述第二搜索的第二经过的搜索时间，且确定所述第二经过的搜索时间超出所述第一最大值，以及
在识别出超出所述第一最大值的所述第二经过的搜索时间后，终止所述第二搜索。
13.一种用于分析生物样品的设备，其包含：
分离装置，其经配置以将所述生物样品按时序分离成组分；
电离源，其经配置以接收所述生物样品的组分且在引入期期间由所述组分中生成肽离子；
碎裂装置，其经配置以将所述肽离子碎裂以形成产物离子；
质量分析仪，其经配置以分析所述产物离子以产生产物离子谱；以及
控制器，其编程有用于以下的指令：
执行质谱数据库的搜索以尝试识别所述质谱数据库中的匹配所述产物离子谱的候选肽，所述质谱数据库含有候选肽的产物质谱信息，
在执行所述质谱数据库的搜索的同时，监测经过的搜索时间，以及
在所述经过的搜索时间达到第一最大值之前识别到匹配所述产物离子谱的所述候选肽之后，使所述质谱仪基于所述识别而执行动作。
14.根据权利要求13所述的设备，其中所述分离装置为色谱装置，且其中所述引入期由所述组分的色谱洗脱峰宽度界定。
15.根据权利要求13或14所述的设备，其中所述第一最大值：(i)由用户界定，或(ii)基于在所述对应的经过的搜索时间达到第二最大值之前未识别到候选肽的搜索结果的历史来界定，所述第二最大值小于所述第一最大值。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的设备，其中所述第一最大值小于或等于20毫秒(ms)。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的设备，使用存储于所述质谱数据库中的氨基酸序列识别所述候选肽。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的设备，其中使用存储于所述质谱数据库中的凭经验确定的质谱来识别所述候选肽。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的设备，待基于所述候选肽的所述识别而执行的所述动作包括针对产物离子种类中的一种或多种进行MSn分析的另外阶段。
20.根据权利要求13至19中任一项所述的设备，其中待基于所述候选肽的所述识别而执行的所述动作包括阻止针对产物离子种类中的一种或多种进行MSn分析的另外阶段。
21.根据权利要求13至20中任一项所述的设备，其中待基于所述候选肽的所述识别而执行的所述动作包括调节由用于将所述肽离子由第一碎裂类型碎裂成第二碎裂类型的所述碎裂装置实施的碎裂技术，所述第一碎裂类型和所述第二碎裂类型为不同碎裂类型。
22.根据权利要求13至21中任一项所述的设备，其中碎裂为经配置以碎裂所述肽离子以形成第二产物离子的装置，所述质量分析仪经配置以分析所述第二产物离子以产生第二产物离子谱，且所述控制器进一步编程有用于以下的指令：
执行所述质谱数据库的第二搜索以尝试识别所述质谱数据库中的匹配所述第二产物离子谱的候选肽，
在执行所述质谱数据库的搜索的同时，监测所述第二搜索的第二经过的搜索时间，且确定所述第二经过的搜索时间超出所述第一最大值，以及
在识别出超出所述第一最大值的所述第二经过的搜索时间后，终止所述第二搜索。
23.一种设备，其包含：
质量分析仪，其经配置以分析产物离子以产生产物离子谱；以及
控制器，其编程有用于以下的指令：
使用所述产物离子谱和包括与候选肽的质谱相关的信息的数据库识别候选肽；
在执行所述数据库的搜索的同时，监测经过的搜索时间，
将所述经过的搜索时间与用于进行所述数据库的搜索的最大搜索时间值进行比较，以及
在所述经过的搜索时间达到所述最大搜索时间值之前识别到所述候选肽之后，使所述质谱仪基于所述识别而执行动作。
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