CN111955187B - 利用相互嫁接体定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系的方法 - Google Patents

利用相互嫁接体定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种利用相互嫁接体定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系的方法，以两个植株以及它们的相互嫁接体为分析材料，在干旱条件下，每隔预设规定时间测量土壤水分含量和蒸渗单元重量，计算瞬时蒸腾速率，以日最大蒸腾速率为纵坐标，以对应的土壤含水量为横坐标，分别绘制4个材料的日最大蒸腾速率随土壤含水量变化的散点图，通过非线性曲线拟合方法进行分段式拟合蒸腾速率变化曲线，其拐点对应的土壤含水量为植株气孔关闭时所对应的土壤水分临界值，比较4个材料的土壤水分临界值，来判断植物气孔关闭与根部基因型关系。本发明能够定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系，有利于根据不同植物的特点，有针对性的开展抗旱性精准调控和改良。

Description

利用相互嫁接体定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系的 方法
技术领域
本发明涉及植物生物技术技术领域，特别涉及植物气孔关闭与根部基因型关系技术领域，具体是指一种利用相互嫁接体定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系的方法。
背景技术
全球日益加剧的土壤干旱已对农业生产造成了巨大威胁。根和叶分别是植物地下部和地上部的主要器官，植物通过根吸收水分和矿质元素，通过叶的气孔蒸腾产生地上部-地下部水势差，维持根系吸收水分的动力；气孔同时是CO2进入植物体的通道。根和地上部相互影响，共同调节植物在不同土壤水分条件下的生理功能。
然而，研究发现不同植物以及同一植物的不同品种在水分调节机制上有不同的特征。总体上，第一类植物的气孔对土壤含水量变化的敏感性强，在土壤干旱胁迫下迅速关闭以防止失水，从而有助于降低死亡风险；但是这类植物由于气孔关闭早，造成CO2同化率也早早降低，其产量的下降较为显著。第二类植物的气孔对土壤含水量变化的敏感性较弱，表现为在干旱条件下仍保持相对较高的气孔导度，因此保持了较高的CO2同化率，从而能够积累更多的生物量(Tardieu F，Simonneau T.Variability among species of stomatalcontrol under fluctuating soil water status and evaporative demand：Modellingisohydric and anisohydric behaviours.J Exp Bot(1998)49：419-432；Aharon，R.，Shahak，Y.，Wininger，S.，Bendov，R.，Kapulnik，Y.，and Galili，G.(2003).Overexpression of a plasma membrane aquaporin in transgenic tobacco improvesplant vigor under favorable growth conditions but not under drought or saltstress.Plant Cell 15，439-447.doi：10.1105/tpc.009225；Uehlein N，Lovisolo C，Siefritz F，Kaldenhoff R.(2003)The tobacco aquaporin NtAQP1 is a membrane CO2pore with physiological functions.Nature 425：734-7)；然而这一类植物如果遇到长期、持续干旱，容易因过量蒸腾而死亡(Sade，N.，Gebretsadik，M.，Seligmann，R.，Schwartz，A.，Wallach，R.，and Moshelion，M.(2010).The role of tobacco aquaporin1in improving water-use efficiency，hydraulic conductivity and yieldproduction under salt stresses.Plant Physiol.152，1-10.doi：10.1104/pp.109.145854)。因此，从产量与抗性平衡的角度来看，气孔敏感性强的作物在严重干旱地区栽种存活率更高、更为适宜，而气孔敏感性弱的作物在土壤中低强度干旱的地区栽种更为适宜，产量更高。
根是植物感知土壤干旱最直接的器官。最新的研究表明，在土壤干旱条件下由根部合成的小肽可以长距离转移到植物叶片中，诱导ABA的合成从而引起气孔关闭反应，这表明了来自植物根的干旱胁迫信号对气孔的调控作用(Takahashi，F.，Suzuki，T.，Osakabe，Y.，Betsuyaku，S.，Kondo，Y.，Dohmae，N.，Fukuda，H.，Yamagu-chi-Shinozaki，K.，andShinozaki，K.(2018).A small peptide modulates stomatal control via abscisicacid in long-distance signalling.Nature 556，235-238)。但是，目前对土壤干旱-根信号-气孔关闭这三者间关系的研究采用的都是定性或者半定量方法，对于土壤失水过程中气孔的关闭是否仅依赖于根部传递的信号，目前还无妨判别。然而，这一问题却在生产中具有重要价值，因为如果能够明确气孔对干旱响应的敏感度单纯由根基因型决定，在农业生产中就可以选择性地对植物根部施用调节剂来调控气孔，从而平衡植物生长与抗旱性；反之，就需要考虑根与地上部的互作，并采取更加复杂的调控策略。
嫁接是一种古老的生物技术，它通过把植物地上部(称做接穗)的枝或芽嫁接到地下部(称做砧木)的茎或根上，使两部分融合长成一个完整的异源复合植株。嫁接是研究植物地上部-地下部关系的重要手段，已在植物信号转导、长距离核酸和蛋白质转移研究等方面发挥了重要作用。蒸渗系统(Lysimeters)(图1，蒸渗系统及基于蒸渗系统建立的阵列式植物水分生理分析系统原理示意图可进一步参见PlantDi-tech，Israel，www.plant-ditech.com)是一种研究植物水分平衡的重要工具，它的特点是能够量化测量裸地或有植被土地的实际水分蒸散量。目前基于蒸渗系统的原理已发展出高通量的阵列式植物水分生理蒸渗分析系统，可以实时测量数百个蒸渗单元培养容器内的土壤水分含量以及培养容器重量，并根据相关求导公式计算得到实时蒸腾速率。
因此，基于以上技术和手段，希望提供一种定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系的方法，其能够定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系，有利于在现代农业生产中根据不同植物的特点，有针对性的开展抗旱性精准调控和改良。
发明内容
为了克服上述现有技术中的缺点，本发明的一个目的在于提供一种利用相互嫁接体定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系的方法，其能够定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系，有利于在现代农业生产中根据不同植物的特点，有针对性的开展抗旱性精准调控和改良，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种利用相互嫁接体定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系的方法，其设计巧妙，操作简单方便快捷，成本低，适于大规模推广应用。
为达到以上目的，本发明提供一种利用相互嫁接体定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系的方法，其特点是，包括以下步骤：
(1)将土壤平均装载于4个培养盆中，将4个所述培养盆中的所述土壤的表面均覆盖塑料薄膜，将第一植株和第二植株相互嫁接形成第三植株和第四植株，所述第三植株为所述第一植株接穗-所述第二植株砧木，所述第四植株为所述第一植株砧木-所述第二植株接穗，将另外的所述第一植株、另外的所述第二植株、所述第三植株和所述第四植株分别栽种于4个所述培养盆中的所述土壤中分别形成4个蒸渗单元；
(2)先给予4个所述蒸渗单元充足等量浇水，然后停止浇水，对于每个所述蒸渗单元，每隔预设规定时间测量土壤水分含量和蒸渗单元重量，计算瞬时蒸腾速率Trt：
Figure BDA0002516285080000031
其中W为蒸渗单元重量，Trt是t时刻的蒸腾速率，即蒸渗单元重量在t时刻的导数
Figure BDA0002516285080000032
Wt和Wt+Δt分别是t时刻和t+Δt时刻的蒸渗单元重量，Δt为预设规定时间；
(3)以日最大蒸腾速率为纵坐标，以所述日最大蒸腾速率对应的所述土壤含水量为横坐标，分别绘制4个所述蒸渗单元的所述日最大蒸腾速率随所述土壤含水量变化的散点图，通过非线性曲线拟合方法进行分段式拟合分别获得4个所述蒸渗单元的蒸腾速率变化曲线，所述蒸腾速率变化曲线的拐点对应的土壤含水量为对应的所述蒸渗单元的植株气孔关闭时所对应的土壤水分临界值；
(4)比较该另外的所述第一植株的所述土壤水分临界值、该另外的所述第二植株的所述土壤水分临界值、所述第三植株的所述土壤水分临界值和所述第四植株的所述土壤水分临界值：如果该另外的所述第一植株的所述土壤水分临界值与所述第四植株的所述土壤水分临界值无显著性差异，说明在土壤干旱条件下所述第一植株的气孔关闭只依赖于所述第一植株的根部传递的胁迫信号；如果该另外的所述第二植株的所述土壤水分临界值与所述第三植株的所述土壤水分临界值无显著性差异，说明在土壤干旱条件下所述第二植株的气孔关闭只依赖于所述第二植株的根部传递的胁迫信号；如果该另外的所述第一植株的所述土壤水分临界值与所述第三植株的所述土壤水分临界值无显著性差异，说明在土壤干旱条件下所述第一植株的气孔关闭只依赖于所述第一植株的地上部；如果该另外的所述第二植株的所述土壤水分临界值与所述第四植株的所述土壤水分临界值无显著性差异，说明在土壤干旱条件下所述第二植株的气孔关闭只依赖于所述第二植株的地上部；否则在土壤干旱条件下所述第一植株的气孔关闭依赖于所述第一植株的根和地上部的相互作用和共同调控，所述第二植株的气孔关闭依赖于所述第二植株的根和地上部的相互作用和共同调控。
较佳地，在所述步骤(1)中，将所述第一植株的子叶上方2cm～3cm处切割成所述第一植株接穗和所述第一植株砧木，将所述第二植株的子叶上方2cm～3cm处切割成所述第二植株接穗和所述第二植株砧木，将所述第一植株接穗嫁接至所述第二植株砧木上形成所述第三植株，将所述第二植株接穗嫁接至所述第一植株砧木上形成所述第四植株。
较佳地，在所述步骤(1)中，所述相互嫁接采用贴接嫁接法。
较佳地，在所述步骤(1)中，所述第一植株、所述第二植株、该另外的所述第一植株和该另外的所述第二植株均处于幼苗期，则所述第一植株和所述第二植株相互嫁接形成的所述第三植株和所述第四植株也均处于幼苗期。
较佳地，在所述步骤(2)中，所述充足等量浇水为每天一次，持续5天。
较佳地，在所述步骤(2)中，所述预设规定时间为3分钟。
较佳地，在所述步骤(2)中，所述测量持续7天。
较佳地，在所述步骤(2)中，所述土壤水分含量采用土壤水分探头测量，所述蒸渗单元重量采用电子天平测量。
较佳地，在所述步骤(2)中，所述测量采用蒸渗系统进行。
较佳地，在所述步骤(3)中，所述日最大蒸腾速率采用每日12:00～14:00区间内所述瞬时蒸腾速率的平均值，所述日最大蒸腾速率对应的所述土壤含水量采用每日12:00～14:00区间内所述土壤含水量的平均值。
本发明的有益效果主要在于：
1、本发明的利用相互嫁接体定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系的方法以两个植株以及它们的相互嫁接体为分析材料，在干旱条件下，每隔预设规定时间测量土壤水分含量和蒸渗单元重量，计算瞬时蒸腾速率，以日最大蒸腾速率为纵坐标，以对应的土壤含水量为横坐标，分别绘制4个材料的日最大蒸腾速率随土壤含水量变化的散点图，通过非线性曲线拟合方法进行分段式拟合蒸腾速率变化曲线，其拐点对应的土壤含水量为植株气孔关闭时所对应的土壤水分临界值，比较4个材料的土壤水分临界值，来判断植物气孔关闭与根部基因型关系，因此，其能够定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系，有利于在现代农业生产中根据不同植物的特点，有针对性的开展抗旱性精准调控和改良，适于大规模推广应用。
2、本发明的利用相互嫁接体定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系的方法以两个植株以及它们的相互嫁接体为分析材料，在干旱条件下，每隔预设规定时间测量土壤水分含量和蒸渗单元重量，计算瞬时蒸腾速率，以日最大蒸腾速率为纵坐标，以对应的土壤含水量为横坐标，分别绘制4个材料的日最大蒸腾速率随土壤含水量变化的散点图，通过非线性曲线拟合方法进行分段式拟合蒸腾速率变化曲线，其拐点对应的土壤含水量为植株气孔关闭时所对应的土壤水分临界值，比较4个材料的土壤水分临界值，来判断植物气孔关闭与根部基因型关系，因此，其设计巧妙，操作简单方便快捷，成本低，适于大规模推广应用。
本发明的这些和其它目的、特点和优势，通过下述的详细说明、附图和权利要求得以充分体现，并可通过所附权利要求中特地指出的手段、装置和它们的组合得以实现。
附图说明
图1是蒸渗系统示意图。
图2是本发明的利用相互嫁接体定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系的方法的一具体实施例的流程示意图。
图3是南瓜、葫芦以及南瓜和葫芦的相互嫁接体的土壤水分临界值示意图。
具体实施方式
为了解决现有技术不能定量说明植物气孔对土壤干旱响应的敏感度是否完全决定于根部基因型的问题，本发明提出一种利用相互嫁接体定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系的方法，通过分析蒸腾速率随土壤水分下降而变化的回归曲线来定量阐释引起植物气孔关闭的土壤水分临界值，然后通过比较两种植株以及它们的相互嫁接复合体的土壤水分临界值来定量说明植物气孔对土壤干旱的响应是否完全依赖于根部基因型。
具体地，本发明的利用相互嫁接体定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系的方法包括以下步骤：
(1)将土壤平均装载于4个培养盆中，将4个所述培养盆中的所述土壤的表面均覆盖塑料薄膜，将第一植株和第二植株相互嫁接形成第三植株和第四植株，所述第三植株为所述第一植株接穗-所述第二植株砧木，所述第四植株为所述第一植株砧木-所述第二植株接穗，将另外的所述第一植株、另外的所述第二植株、所述第三植株和所述第四植株分别栽种于4个所述培养盆中的所述土壤中分别形成4个蒸渗单元；
(2)先给予4个所述蒸渗单元充足等量浇水，然后停止浇水，对于每个所述蒸渗单元，每隔预设规定时间测量土壤水分含量和蒸渗单元重量，计算瞬时蒸腾速率Trt：
Figure BDA0002516285080000061
其中W为蒸渗单元重量，Trt是t时刻的蒸腾速率，即蒸渗单元重量在t时刻的导数
Figure BDA0002516285080000071
Wt和Wt+Δt分别是t时刻和t+Δf时刻的蒸渗单元重量，Δt为预设规定时间；
(3)以日最大蒸腾速率为纵坐标，以所述日最大蒸腾速率对应的所述土壤含水量为横坐标，分别绘制4个所述蒸渗单元的所述日最大蒸腾速率随所述土壤含水量变化的散点图，通过非线性曲线拟合方法进行分段式拟合分别获得4个所述蒸渗单元的蒸腾速率变化曲线，所述蒸腾速率变化曲线的拐点对应的土壤含水量为对应的所述蒸渗单元的植株气孔关闭时所对应的土壤水分临界值；
(4)比较该另外的所述第一植株的所述土壤水分临界值、该另外的所述第二植株的所述土壤水分临界值、所述第三植株的所述土壤水分临界值和所述第四植株的所述土壤水分临界值：如果该另外的所述第一植株的所述土壤水分临界值与所述第四植株的所述土壤水分临界值无显著性差异，说明在土壤干旱条件下所述第一植株的气孔关闭只依赖于所述第一植株的根部传递的胁迫信号；如果该另外的所述第二植株的所述土壤水分临界值与所述第三植株的所述土壤水分临界值无显著性差异，说明在土壤干旱条件下所述第二植株的气孔关闭只依赖于所述第二植株的根部传递的胁迫信号；如果该另外的所述第一植株的所述土壤水分临界值与所述第三植株的所述土壤水分临界值无显著性差异，说明在土壤干旱条件下所述第一植株的气孔关闭只依赖于所述第一植株的地上部；如果该另外的所述第二植株的所述土壤水分临界值与所述第四植株的所述土壤水分临界值无显著性差异，说明在土壤干旱条件下所述第二植株的气孔关闭只依赖于所述第二植株的地上部；否则在土壤干旱条件下所述第一植株的气孔关闭依赖于所述第一植株的根和地上部的相互作用和共同调控，所述第二植株的气孔关闭依赖于所述第二植株的根和地上部的相互作用和共同调控。
在所述步骤(1)中，所述第一植株分割成所述第一植株接穗和所述第一植株砧木的位置，所述第二植株分割成所述第二植株接穗和所述第二植株砧木的位置，可以根据需要确定，在本发明的一具体实施例中，将所述第一植株的子叶上方2cm～3cm处切割成所述第一植株接穗和所述第一植株砧木，将所述第二植株的子叶上方2cm～3cm处切割成所述第二植株接穗和所述第二植株砧木，将所述第一植株接穗嫁接至所述第二植株砧木上形成所述第三植株，将所述第二植株接穗嫁接至所述第一植株砧木上形成所述第四植株。
在所述步骤(1)中，所述相互嫁接可以采用任何合适的嫁接方法，在本发明的一具体实施例中，所述相互嫁接采用贴接嫁接法。
在所述步骤(1)中，所述第一植株、所述第二植株、该另外的所述第一植株和该另外的所述第二植株可以处于任何合适的生长阶段，在本发明的一具体实施例中，所述第一植株、所述第二植株、该另外的所述第一植株和该另外的所述第二植株均处于幼苗期，则所述第一植株和所述第二植株相互嫁接形成的所述第三植株和所述第四植株也均处于幼苗期。
在所述步骤(2)中，所述充足等量浇水可以采用任何合适的方法，在本发明的一具体实施例中，所述充足等量浇水为每天一次，持续5天。
在所述步骤(2)中，所述预设规定时间可以根据需要确定，在本发明的一具体实施例中，所述预设规定时间为3分钟。
在所述步骤(2)中，所述测量持续的天数可以根据需要确定，在本发明的一具体实施例中，所述测量持续7天。
在所述步骤(2)中，所述土壤水分含量和所述蒸渗单元重量可以采用任何合适的测量装置，在本发明的一具体实施例中，所述土壤水分含量采用土壤水分探头测量，所述蒸渗单元重量采用电子天平测量。
在所述步骤(2)中，所述测量可以采用任何合适的测量系统进行，在本发明的一具体实施例中，所述测量采用蒸渗系统进行。
在所述步骤(3)中，所述日最大蒸腾速率可以是每日某一时刻的最大蒸腾速率，也可以是每日某段时间内所述瞬时蒸腾速率的平均值，在本发明的一具体实施例中，所述日最大蒸腾速率采用每日12:00～14:00区间内所述瞬时蒸腾速率的平均值，所述日最大蒸腾速率对应的所述土壤含水量采用每日12:00～14:00区间内所述土壤含水量的平均值。
将所述第一植株简称为植株A，将所述第二植株简称为植株B，则本发明的利用相互嫁接体定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系的方法的一个优选方案流程见图2所示。
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。其中：
阵列式蒸渗系统：本具体实施例中采用以色列Plant Di-Tech公司生产的蒸渗系统，每个测定单元均包含土壤水分探头和称重装置。
实施例 以南瓜、葫芦、以及南瓜和葫芦的相互嫁接体为分析材料
(1)种子处理与生长：取饱满的南瓜品种“苏梦砧木2号”(获得自江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所)和葫芦品种“浙蒲6号”(获得自浙江省农业科学院蔬菜所)种子各12粒，于35℃清水浸泡催芽。萌芽后播种于装有基质的穴盘中，在人工气候箱中16h光/8h暗的光照条件下生长，白天生长温度为28℃，夜间生长温度为22℃。
(2)相互嫁接：取10日龄的南瓜幼苗和葫芦幼苗，分别用手术刀片在子叶上方2cm～3cm处切割成上下两部分，分别获得南瓜接穗和南瓜砧木、葫芦接穗和葫芦砧木。通过贴接嫁接法产生南瓜接穗-葫芦砧木和葫芦接穗-南瓜砧木两种相互嫁接体，并用嫁接夹固定。南瓜幼苗和葫芦幼苗分别取6株，两两相互嫁接。在高湿环境下于培养箱中生长7天，保持16h光/8h暗的光照条件，控制白天生长温度为28℃，夜间生长温度为22℃，至相互嫁接体成活并生长健壮。将未嫁接的南瓜幼苗和葫芦幼苗(各6株)同步在培养箱中生长，作为对照。
(3)生长与干旱处理：将南瓜、葫芦、南瓜接穗-葫芦砧木和葫芦接穗-南瓜砧木转移到装有土壤的4L塑料盆中。用黑色塑料薄膜覆盖土壤表面防止水分从土表蒸散。将塑料盆放置于蒸渗系统，每盆置于一个测定单元中。安置完毕后，前5天于每天夜间10点给予充足灌溉，第6天起停止浇水。
(4)水分生理数据获取：从停止浇水的第一天凌晨0:00起，利用PlantArray蒸渗系统的土壤水分探头连续测定土壤含水量值，每3分钟记录一次数值；利用蒸渗系统的称重装置置于塑料盆下，以同样频率连续记录塑料盆总重值即蒸渗单元重量，测定持续1周，直至实验结束。为了简化数据处理，每3分钟测量每日12:00-14:00区间内土壤含水量值和塑料盆总重值，请见4种材料的塑料盆总重值分别见下表1、下表2、下表3和下表4，4种材料的土壤含水量值分别见下表5、下表6、下表7和下表8。
表1 6株葫芦植株的塑料盆总重值(克)
Figure BDA0002516285080000101
Figure BDA0002516285080000111
Figure BDA0002516285080000121
Figure BDA0002516285080000131
Figure BDA0002516285080000141
Figure BDA0002516285080000151
Figure BDA0002516285080000161
表2 6株南瓜植株的塑料盆总重值(克)
Figure BDA0002516285080000162
Figure BDA0002516285080000171
Figure BDA0002516285080000181
Figure BDA0002516285080000191
Figure BDA0002516285080000201
Figure BDA0002516285080000211
Figure BDA0002516285080000221
表3 6株南瓜接穗-葫芦砧木(简称南葫)的塑料盆总重值(克)
Figure BDA0002516285080000231
Figure BDA0002516285080000241
Figure BDA0002516285080000251
Figure BDA0002516285080000261
Figure BDA0002516285080000271
Figure BDA0002516285080000281
Figure BDA0002516285080000291
表4 6株葫芦接穗-南瓜砧木(简称葫南)的塑料盆总重值(克)
Figure BDA0002516285080000292
Figure BDA0002516285080000301
Figure BDA0002516285080000311
Figure BDA0002516285080000321
Figure BDA0002516285080000331
Figure BDA0002516285080000341
Figure BDA0002516285080000351
表5 6株葫芦植株的土壤含水量值(克/克)
Figure BDA0002516285080000352
Figure BDA0002516285080000361
Figure BDA0002516285080000371
Figure BDA0002516285080000381
Figure BDA0002516285080000391
Figure BDA0002516285080000401
Figure BDA0002516285080000411
Figure BDA0002516285080000421
表6 6株南瓜植株的土壤含水量值(克/克)
Figure BDA0002516285080000422
Figure BDA0002516285080000431
Figure BDA0002516285080000441
Figure BDA0002516285080000451
Figure BDA0002516285080000461
Figure BDA0002516285080000471
Figure BDA0002516285080000481
表7 6株南瓜接穗-葫芦砧木(简称南葫)的土壤含水量值(克/克)
Figure BDA0002516285080000482
Figure BDA0002516285080000491
Figure BDA0002516285080000501
Figure BDA0002516285080000511
Figure BDA0002516285080000521
Figure BDA0002516285080000531
Figure BDA0002516285080000541
Figure BDA0002516285080000551
表8 6株葫芦接穗-南瓜砧木(简称葫南)的土壤含水量值(克/克)
Figure BDA0002516285080000552
Figure BDA0002516285080000561
Figure BDA0002516285080000571
Figure BDA0002516285080000581
Figure BDA0002516285080000591
Figure BDA0002516285080000601
Figure BDA0002516285080000611
(5)回归分析：利用MATLAB中smooth方法(平滑点参数＝20)(https：//ww2.mathworks.cn/help/curvefit/smooth.html)对塑料盆总重值进行平滑，以葫芦为例，其平滑后的塑料盆总重值见下表9。
表9平滑后的葫芦的塑料盆总重值(克)
Figure BDA0002516285080000612
Figure BDA0002516285080000621
Figure BDA0002516285080000631
Figure BDA0002516285080000641
Figure BDA0002516285080000651
Figure BDA0002516285080000661
Figure BDA0002516285080000671
Figure BDA0002516285080000681
根据公式(1)使用MATLAB中的diff差分和近似求导方法(https：//ww2.mathworks.cn/help/MATLAB/ref/diff.html)对平滑后的塑料盆总重值进行一阶求导，计算瞬时蒸腾速率Trt。
Figure BDA0002516285080000691
其中W为蒸渗单元重量，Trt是t时刻的蒸腾速率，即蒸渗单元重量在t时刻的导数
Figure BDA0002516285080000692
Wt和Wt+Δt分别是t时刻和t+Δt时刻的蒸渗单元重量，Δt为预设规定时间；
以葫芦为例，其瞬时蒸腾速率Trt见下表10。
表10葫芦的瞬时蒸腾速率Trt(克/分钟)
Figure BDA0002516285080000693
Figure BDA0002516285080000701
Figure BDA0002516285080000711
Figure BDA0002516285080000721
Figure BDA0002516285080000731
Figure BDA0002516285080000741
Figure BDA0002516285080000751
Figure BDA0002516285080000761
以每日12:00-14:00区间内瞬时蒸腾速率的平均值作为日最大蒸腾速率(Trmax)，并计算区间内土壤含水量(VWC)的平均值，以葫芦为例，日最大蒸腾速率和土壤含水量平均值见表11。
表11葫芦的日最大蒸腾速率与对应的土壤含水量平均值
日最大蒸腾速率
时间 葫芦1 葫芦2 葫芦3 葫芦4 葫芦5 葫芦6
1月17日 1.522989 1.716117 1.573517 1.731539 1.641865 1.078455
1月18日 1.330812 1.518666 1.402491 1.688689 1.470695 0.982981
1月19日 1.080154 1.477296 1.343782 1.445299 1.288028 0.873505
1月20日 1.496951 1.89512 1.893716 1.887278 1.849957 1.279876
1月21日 0.898836 0.923991 0.908978 0.970447 1.026781 0.822242
1月22日 0.545666 0.59565 0.615294 0.672381 0.73478 0.549599
1月23日 1.011118 0.90015 0.910996 1.020042 1.016504 0.905339
日最大蒸腾速率对应的土壤含水量平均值
Figure BDA0002516285080000762
Figure BDA0002516285080000771
以植株日最大蒸腾速率为纵坐标，对应区间内VWC平均值为横坐标，绘制散点图，每种植株的6个重复的数据绘于同一散点图。基于散点数据，用非线性曲线方法(Origin软件，分段函数，两段，斜率参数k2＝0)进行拟合(非线性曲线拟合数据见表12)，获得蒸腾速率变化曲线，蒸腾速率变化曲线拐点处的横坐标值就表示植株气孔关闭时的土壤水分含量临界值。用此方法对南瓜、葫芦、南瓜接穗-葫芦砧木和葫芦接穗-南瓜砧木分别进行分析，蒸腾速率曲线典型形状如图3所示，根据拟合公式拐点得到各自的土壤水分临界值，南瓜的土壤水分临界值＝0.37、葫芦的土壤水分临界值＝0.29、南瓜接穗-葫芦砧木的土壤水分临界值＝0.27、葫芦接穗-南瓜砧木的土壤水分临界值＝0.35。
表12土壤体积水-日最大蒸腾速率非线性曲线拟合数据及公式
Figure BDA0002516285080000772
Figure BDA0002516285080000781
(6)比较分析与结论：对南瓜、葫芦、南瓜接穗-葫芦砧木和葫芦接穗-南瓜砧木的土壤水分临界值进行比较。在此实验条件下，南瓜接穗-葫芦砧木嫁接复合体发生气孔关闭所对应的土壤水分临界值与所用葫芦品种“浙蒲6号”无显著性差异(p＜0.05)，葫芦接穗-南瓜砧木嫁接复合体发生气孔关闭所对应的土壤水分临界值与所用南瓜品种“苏梦砧木2号”无显著性差异(p＜0.05)。由此得出结论：在土壤干旱条件下“苏梦砧木2号”和“浙蒲6号”的气孔关闭反应均完全依赖于根部传递的干旱胁迫信号，只受植株根部基因型而不受地上部基因型的影响。
因此，与现有技术相比，本发明主要具有以下有益效果：
1、通过相互嫁接方式产生一对砧木-接穗组合，再加上砧木、接穗的非嫁接对照植株，简单便捷地形成了分析所需的材料组。材料创制过程中无需特殊工具和设备，一般具有植物生长箱或者温室大棚的单位均可进行操作，所有能够成功嫁接的植物种类和品系均可进行。材料创制在幼苗期即可进行，3周左右即可获得全套材料组，时间短、成本低。
2、在商业化蒸渗系统上每日连续测定土壤水分含量和系统重量，是一种为无损和自动测量，节约人工。通过对蒸腾速率和土壤含水量的回归分析计算土壤水分临界值，通过对嫁接和对照植株土壤水分临界值的比较来定量说明植物气孔对土壤干旱的响应是否完全依赖于根部信号。方法采用常规分段回归分析，普通农业技术人员经过简单培训即可掌握，从而可以根据供试材料的分析结果采取合理的精准调控措施。
因此，本发明公开了一种利用相互嫁接体定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系的方法，主要包括：(1)相互嫁接；(2)干旱处理；(3)植物蒸腾与土壤含水量连续测定和(4)非线性曲线拟合与分析。通过异源嫁接和设置非嫁接对照，快速创造一套分析材料。通过商业化蒸渗系统自动进行灌溉、控水以及土壤水分和植株蒸腾速率的连续测定、记录。利用本发明的分析方法，对渐进式干旱胁迫下一对相互嫁接植株及其对照植株分别进行植株日最大蒸腾速率与土壤含水量的非线性曲线拟合，得到各植株气孔发生关闭时对应的土壤水分含量值，即土壤水分含量临界值；通过相互嫁接植株与对照植株间土壤水分含量临界值的两两比较，就可以明确土壤失水过程中植物气孔关闭的敏感度是否受到根和/或地上部的调控。本方法的全部分析过程在3-4周即可完成，对任意可嫁接成活的植物组合均可使用，实现了对土壤水分-气孔关闭-根部信号关系的研究方法从定性、半定量向精准定量的跨越，大大提高了研究精确度，有利于在现代农业生产中根据不同植物的特点，有针对性的开展抗旱性精准调控和改良。
综上，本发明的利用相互嫁接体定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系的方法能够定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系，有利于在现代农业生产中根据不同植物的特点，有针对性的开展抗旱性精准调控和改良，设计巧妙，操作简单方便快捷，成本低，适于大规模推广应用。
由此可见，本发明的目的已经完整并有效的予以实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中予以展示和说明，在不背离所述原理下，实施方式可作任意修改。所以，本发明包括了基于权利要求精神及权利要求范围的所有变形实施方式。

Claims (10)

1.一种利用相互嫁接体定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将土壤平均装载于4个培养盆中，在4个所述培养盆中的所述土壤的表面均覆盖塑料薄膜，将第一植株和第二植株相互嫁接形成第三植株和第四植株，所述第三植株为所述第一植株接穗-所述第二植株砧木，所述第四植株为所述第一植株砧木-所述第二植株接穗，将另外的所述第一植株、另外的所述第二植株、所述第三植株和所述第四植株分别栽种于4个所述培养盆中的所述土壤中分别形成4个蒸渗单元；
(2)先给予4个所述蒸渗单元充足等量浇水，然后停止浇水，对于每个所述蒸渗单元，每隔预设规定时间测量土壤水分含量和蒸渗单元重量，计算瞬时蒸腾速率Trt：
Figure FDA0003248622900000011
其中W为蒸渗单元重量，Trt是t时刻的蒸腾速率，即蒸渗单元重量在t时刻的导数
Figure FDA0003248622900000012
Wt和Wt+Δt分别是t时刻和t+Δt时刻的蒸渗单元重量，Δt为预设规定时间；
(3)以日最大蒸腾速率为纵坐标，以所述日最大蒸腾速率对应的所述土壤含水量为横坐标，分别绘制4个所述蒸渗单元的所述日最大蒸腾速率随所述土壤含水量变化的散点图，通过非线性曲线拟合方法进行分段式拟合分别获得4个所述蒸渗单元的蒸腾速率变化曲线，所述蒸腾速率变化曲线的拐点对应的土壤含水量为对应的所述蒸渗单元的植株气孔关闭时所对应的土壤水分临界值；
(4)比较该另外的所述第一植株的所述土壤水分临界值、该另外的所述第二植株的所述土壤水分临界值、所述第三植株的所述土壤水分临界值和所述第四植株的所述土壤水分临界值：如果该另外的所述第一植株的所述土壤水分临界值与所述第四植株的所述土壤水分临界值无显著性差异，说明在土壤干旱条件下所述第一植株的气孔关闭只依赖于所述第一植株的根部传递的胁迫信号；如果该另外的所述第二植株的所述土壤水分临界值与所述第三植株的所述土壤水分临界值无显著性差异，说明在土壤干旱条件下所述第二植株的气孔关闭只依赖于所述第二植株的根部传递的胁迫信号；如果该另外的所述第一植株的所述土壤水分临界值与所述第三植株的所述土壤水分临界值无显著性差异，说明在土壤干旱条件下所述第一植株的气孔关闭只依赖于所述第一植株的地上部；如果该另外的所述第二植株的所述土壤水分临界值与所述第四植株的所述土壤水分临界值无显著性差异，说明在土壤干旱条件下所述第二植株的气孔关闭只依赖于所述第二植株的地上部；否则在土壤干旱条件下所述第一植株的气孔关闭依赖于所述第一植株的根和地上部的相互作用和共同调控，所述第二植株的气孔关闭依赖于所述第二植株的根和地上部的相互作用和共同调控。
2.如权利要求1所述的利用相互嫁接体定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，在所述第一植株的子叶上方2cm～3cm处切割而将所述第一植株分割成所述第一植株接穗和所述第一植株砧木，在所述第二植株的子叶上方2cm～3cm处切割而将所述第二植株分割成所述第二植株接穗和所述第二植株砧木，将所述第一植株接穗嫁接至所述第二植株砧木上形成所述第三植株，将所述第二植株接穗嫁接至所述第一植株砧木上形成所述第四植株。
3.如权利要求1所述的利用相互嫁接体定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述相互嫁接采用贴接嫁接法。
4.如权利要求1所述的利用相互嫁接体定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，所述第一植株、所述第二植株、该另外的所述第一植株和该另外的所述第二植株均处于幼苗期，则所述第一植株和所述第二植株相互嫁接形成的所述第三植株和所述第四植株也均处于幼苗期。
5.如权利要求1所述的利用相互嫁接体定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述充足等量浇水为每天一次，持续5天。
6.如权利要求1所述的利用相互嫁接体定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述预设规定时间为3分钟。
7.如权利要求1所述的利用相互嫁接体定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述测量持续7天。
8.如权利要求1所述的利用相互嫁接体定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述土壤水分含量采用土壤水分探头测量，所述蒸渗单元重量采用电子天平测量。
9.如权利要求1所述的利用相互嫁接体定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述测量采用蒸渗系统进行。
10.如权利要求1所述的利用相互嫁接体定量分析植物气孔关闭与根部基因型关系的方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述日最大蒸腾速率采用每日12:00～14:00区间内所述瞬时蒸腾速率的平均值，所述日最大蒸腾速率对应的所述土壤含水量采用每日12:00～14:00区间内所述土壤含水量的平均值。
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