CN111948416A - 一种自动化免疫印迹实验装置及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种自动化免疫印迹实验装置及方法，其中装置包括框架以及固定在框架内的水平隔板，水平隔板将框架分成上下两层；框架内设有：试剂加样模块、试剂回收模块、反应盒、振荡摇篮、试剂液体分配及回收模块、程序设置处理模块和电源模块。本发明可根据实验需要利用内置模块对反应时间、分配液体、振荡与否、是否回收液体、操作循环次数等参数进行编程设置，实现转膜后所需的多步反应及多步重复洗膜步骤完全自动化。本发明装置及方法可大幅减少人工反复的重复操作、减少时间碎片化，极大提高工作效率、节省人力；同时具有试剂回收和振荡功能，可节约试剂成本并保证实验效果，无需增加额外消耗品；较传统手工操作，具有显著优点。

Description

一种自动化免疫印迹实验装置及方法
技术领域
本发明属于分子生物学实验室用品领域，尤其是涉及一种自动化的聚丙烯酰胺凝胶电泳-免疫印迹实验装置及方法。
背景技术
聚丙烯酰胺凝胶电泳-免疫印迹实验可通过已知抗体检测待测样本中是否存在抗原，是分子生物学研究常见的一种方法。该方法通常包括三个重要环节，第一个环节，对含有抗原蛋白样品进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)；第二个环节，将在凝胶中已分离的蛋白电转移至硝酸纤维素膜(NC)或聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上；第三个环节，将印有蛋白质条带的NC或PVDF依次与特异性抗体和酶标第二抗体进行抗原抗体反应之后，用相应的酶底物作用后进行酶免疫定位。
在酶免疫定位环节，为了避免膜上存在目标抗原与目标抗体之外的非特异性结合，除让目标抗原与目标抗体反应一段时间外，还需要用含有蛋白的封闭液进行封闭、同时还需要用缓冲液进行反复多次的持续不断洗膜、换液等过程。
如公开号为CN204503657U的中国专利文献公开的一种免疫印迹实验洗涤盒，公开号为CN209784374U的中国专利文献公开的一种夹取式免疫印迹分析仪，都采用便于操作人员的操作的设置来提高实验效率。
然而，上述过程通常为人工操作，洗涤的时间及步骤在每次之间也会造成误差；经常需要人为定时守候，使操作人员的时间碎片化，造成劳动强度大，工作效率低。
尽管目前有全自动免疫印迹仪可使用，但在电泳之后的检测原理，与传统的免疫印迹方法不同，而且仪器本身及其耗材其价格高昂，不是每个实验室均能负担。
因此，有必要开发一种价格低廉、简便实用的免疫印迹操作装置以减轻劳动力，极大提高工作效率，保证实验效率，节约实验成本，较传统手工操作，无需增加额外消耗品。
发明内容
本发明提供了一种自动化免疫印迹实验装置及方法，极大地提高了效率，减少人工操作，同时，节约试剂成本并保证实验效果。
一种自动化免疫印迹实验装置，包括框架以及固定在框架内的水平隔板，所述的水平隔板将框架分成上下两层；所述的框架内设有：
试剂加样模块，设置在框架的上层，包括承载试剂容器的位置及多个用于实验提供试剂的试剂容器；
试剂回收模块，设置在框架的下层，包括承载回收容器的位置及多个用于试验结束后试剂回收的回收容器，所述的回收容器数量可根据需要与试剂容器对应。
反应盒，设置在框架下层，用于载有目标蛋白的膜与相应的抗体进行反应或用不同缓冲液洗涤；
试剂液体分配及回收模块，包括多个与回收容器、试剂容器对应的电磁阀门；每个电磁阀门设有三个接口，分别通过导管连接至反应盒以及对应的试剂容器、回收容器；
程序设置处理模块，与试剂液体分配及试剂回收模块电连接，用于参数设定及实验操作步骤编程设置，根据设定的时间加注相应操作步骤的试剂至反应盒，并根据设定的时间将相应操作步骤完成的试剂从反应盒抽离到对应的回收容器内；
电源模块，与程序设置处理模块电连接，用于提供电能。
本发明装置，程序设置处理模块主要用于对分配液体、反应时间、洗涤时间、洗涤次数和回收液体进行编程和控制。在使用时，只需要对程序设置处理模块预先做编程设置，便可实现一次短时(约几分钟-十几分钟)的连续操作，替代多次长时(约几小时-2天以上)的间断重复操作，可减少人工操作，减少劳动强度，减少了操作人员时间碎片化，减少人力成本，极大提高研究效率。同时，还兼顾了试剂回收，可节约试剂成本。
进一步地，所述的试剂容器包括：洗涤液容器、封闭液容器、一抗容器、二抗容器、反应底物A容器和反应底物B容器；
所述的回收容器包括：洗涤液回收容器、封闭液回收容器、一抗回收容器、二抗回收容器、反应底物A回收容器和反应底物B回收容器。
优选地，所述反应盒的下部设有频率和时间可调的振荡摇床，所述的振荡摇床与程序设置处理模块电连接。通过给反应盒增加振荡功能，可以促进抗原-抗体反应效果；根据需要选择时间。
为了便于电磁阀门的安装，所述框架在水平隔板的下方固定有安装杆，多个电磁阀门套设固定在所述的安装杆上。
优选地，所述的程序设置处理模块和电源模块设置在框架的上层。
本发明还提供了一种自动化免疫印迹实验方法，使用上述自动化免疫印迹实验装置，包括：
(1)将所有试剂容器和回收容器用标签标记，将配制好的试剂分别加至标记有相应标签的试剂容器内；
(2)将反应盒置于振荡摇床上，将每个电磁阀门的导管连接至反应盒以及对应的试剂容器、试剂回收容器；
(3)插入电源，根据需要利用程序设置处理模块进行设定编程；
(4)将转印载有目标蛋白的膜放进反应盒，同时电磁阀门的导管接触反应盒底部；
(5)根据程序设置处理模块的设定开始实验，到实验步骤完成后，装置由系统自动关机；然后从反应盒内取出膜进行后续操作。
步骤(3)中，进行编程设定具体为：
根据需要依次设定封闭液、洗涤液、一抗、二抗、反应底物A、反应底物B的工作参数，包括：是否注入、孵育或洗涤的时间、是否振荡、是否抽干、是否回收、循环次数。
步骤(4)中，转印有目标蛋白的膜大小为0.1cm×0.1cm～50cm×50cm。
临床实验室免疫印迹的反应膜，经过前期处理过的膜呈细棒条状(3mm×12cm)；而本发明是分子生物学实验室用聚丙烯酰胺凝胶-免疫印迹，洗涤及反应的膜呈宽大(6cm×8cm)的薄膜状，也未经过前期的处理。因此在洗涤时方法及原理方面有明显区别。
本发明和传统的聚丙烯酰胺凝胶-免疫印迹方法相比，可采用相同的膜，如醋酸纤维素膜或PVDF膜，而不需要其他特殊的仪器与耗材。
本发明装置还可以拓展温度控制模块，通过设计可将装置置于所需的环境温度，如4摄氏度冰箱，室温或37摄氏度等不同环境温度内。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的装置通过一次的编程操作和加试剂后可实现封闭、多次重复洗涤、抗原-抗体、酶和底物反应等步骤的自动完成。既保留传统聚丙烯酰胺凝胶-免疫印迹的操作流程，又大幅减少了人工反复的重复操作、节省了人力及其工作时间，显著地提高工作效率；同时又兼有回收反应试剂功能，达到节约实验成本的目的；在反应过程中可经振荡提高实验效果。
附图说明
图1为本发明一种自动化免疫印迹实验装置的整体结构示意图；
图2为本发明中框架的示意图；
图3为本发明中试剂加样模块的示意图；
图4为本发明中试剂回收模块的示意图；
图5为本发明中反应盒的示意图；
图6为本发明中振荡摇床的示意图；
图7为本发明中试剂液体分配及回收模块的示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
如图1和2所示，一种自动化免疫印迹实验装置，包括框架1以及固定在框架1内的水平隔板11，水平隔板11将框架分成上下两层；框架1内设有：试剂加样模块2、试剂回收模块3，反应盒4、试剂液体分配及回收模块5、程序设置处理模块6和电源模块7。
试剂加样模块2设置在框架1的上层，包括多个在实验过程中用于提供试剂的试剂容器，试剂容器不限于大小、形状、数量及材质。具体的，如图3所示，试剂容器包括：洗涤液容器21、封闭液器22、一抗容器23、二抗容器24、反应底物A容器25和反应底物B容器26。
试剂回收模块3设置在框架1的下层，包括多个在试验结束后用于回收试剂的回收容器，回收容器数量可根据需要与试剂容器对应，回收容器不限于大小、形状、数量及材质。具体的，如图4所示，回收容器包括：洗涤液回收容器31、封闭液回收容器32、一抗回收容器33、二抗回收容器34、反应底物A回收容器35和反应底物B回收容器36。
反应盒4的结构如图5所示，设置在框架1下层，但不限于框架下层。用于载有目标蛋白的硝酸纤维膜或PVDF膜等与相应的抗体进行反应或用缓冲液进行洗涤。反应盒4的下部设有频率可调的振荡摇床8，振荡摇床8与程序设置处理模块6电连接。
试剂液体分配及回收模块5，包括多个与回收容器、试剂容器对应的电磁阀门51；每个电磁阀门51设有三个接口，分别通过导管52连接至反应盒4以及对应的试剂容器、回收容器。如图2所示，框架1在水平隔板11的下方固定有安装杆12，多个电磁阀门51套设固定在安装杆12上。
程序设置处理模块6，与试剂液体分配及回收模块5电连接，用于根据设定的时间加注相应操作步骤的试剂至反应盒4，并根据设定的时间将相应操作步骤试剂完成的试剂从反应盒4抽离到对应的回收容器内。具体的，程序设置处理模块6是由单片机及处理器组成的实验操作控制单元，能对包括分配液体、反应时间、洗涤时间、洗涤次数、回收液体等实验参数进行编程和控制。
电源模块7，与程序设置处理模块6电连接，用于提供电能。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶免疫印迹的操作步骤如下：
一、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
1.制胶；2.上样；3.电泳；4.转膜。
二、蛋白印迹(本步骤将由本发明自动化装置完成)
1.封闭：转印有目标抗原的硝酸纤维素膜(膜)：用含有脱脂奶粉的PBST封闭2小时。
2.用PBST洗涤膜：4次，每次5分钟。
3.膜与可识别的目标抗原的一抗孵育：20-37℃3小时或4℃过夜。
4.用PBST洗涤膜：4次，每次5分钟。
6.膜与辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗孵育：20-37℃1小时。
7.PBST洗涤膜：6次，5分钟/次。
8.加酶底物A。
9.加酶底物B，反应5分钟。
10.显影或拍照观察。
下面以免疫印迹法测Hsp90为例，用本发明的自动化免疫印迹实验装置进行实验操作。
实施例1
本实施例执行完整所有的免疫印迹反应及洗膜过程。
根据手工操作的步骤：
封闭2小时；洗膜4次，每次5分钟；一抗孵育6小时；涤膜4次，每次5分钟；酶标二抗孵育1小时；洗膜6次，每次5分钟；加酶底物A、B反应5分钟。
以免疫印迹法测热休克蛋白90(Hsp90)为例，用本发明进行如下操作即可完成：
1、根据需要，将所用试剂容器用标签标记：洗涤液、封闭液、抗Hsp90(一抗)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔(酶标二抗)、反应底物A、反应底物B、洗涤废液、回收封闭液、抗Hsp90(回收一抗)、回收HRP标记的羊抗兔(回收二抗)、回收的酶反应底物等。
2、将配制好的试剂分别加至标记有相应标签的试剂容器内。
3、将反应盒置于振荡摇床之上。
4、插入电源。
5、根据需要利用程序设置处理模块进行编程：
设置封闭：注入；孵育120分钟，振荡；抽干；回收；循环1次。
设置洗涤：注入；洗涤5分钟，振荡；抽干；不回收；循环4次；不保留液体。
设置一抗：注入；孵育360分钟，振荡；抽干；回收；循环1次。
设置洗涤：注入；洗涤5分钟，振荡；抽干；不回收；循环4次；不保留液体。
设置二抗：注入；孵育120分钟，振荡；抽干；不回收；循环1次。
设置洗涤：注入；洗涤5分钟，振荡；抽干；不回收；循环6次；不保留液体。
设置底物A：注入；孵育0分钟，振荡；不抽干；不回收；循环1次。
设置底物B：注入；孵育5分钟，振荡；不抽干；不回收；循环1次。
6、将转印有Hsp90的膜放进反应盒，同时管道接触反应盒底部。
7、点击开始，到实验步骤完成后，装置由系统自动关机。
8、然后从反应盒内取出膜进行后续检测等操作。
实施例2
根据需要可调整操作的步骤，在执行完整所有的免疫印迹反应及洗膜过程基础上，不需要加酶底物A、B，反应5分钟步骤，最后让洗完的膜保存在缓冲液里。
根据手工操作的步骤：
封闭2小时；洗膜4次，每次5分钟；一抗孵育6小时；涤膜4次，每次5分钟；酶标二抗孵育1小时；洗膜6次，每次5分钟。
以免疫印迹法测热休克蛋白90(Hsp90)为例，可用专利进行如下操作即可完成：
1、标签标记将所有试剂容器：洗涤液、封闭液、抗Hsp90(一抗)、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔(酶标二抗)、洗涤废液、回收封闭液、抗Hsp90(回收一抗)、回收HRP标记的羊抗兔(回收二抗)等。
2、将配制好的试剂分别加至标记有相应标签的试剂容器内。
3、将反应盒置于振荡摇床之上。
4、插入电源。
5、根据需要利用程序设置处理模块进行编程：
设置封闭：注入；孵育120分钟，振荡；抽干；回收；循环1次。
设置洗涤：注入；洗涤5分钟，振荡；抽干；不回收；循环4次；不保留液体。
设置一抗：注入；孵育360分钟，振荡；抽干；回收；循环1次。
设置洗涤：注入；洗涤5分钟，振荡；抽干；不回收；循环4次；不保留液体。
设置二抗：注入；孵育120分钟，振荡；抽干；不回收；循环1次。
设置洗涤：注入；洗涤5分钟，振荡；抽干；不回收；循环6次；保留液体。
设置7底物A：不注入；孵育0分钟，不振荡；不抽干；不回收；循环0次。
设置8底物B：不注入；孵育0分钟，不振荡；不抽干；不回收；循环0次。
6、将转印有Hsp90的膜放进反应盒，同时管道接触反应盒底部。
7、点击开始，到实验步骤完成后，装置由系统自动关机。
8、然后从反应盒内取出膜进行后续操作。
实施例3
根据需要调整操作的步骤，仅执行完整免疫印迹中某一次洗膜过程，最后让洗完的膜保存在缓冲液里。
根据手工操作的步骤：洗膜4次，每次5分钟。
以免疫印迹法测Hsp90为例，用本发明进行如下操作即可完成：
1、标签标记将所用试剂容器：洗涤液、洗涤废液。
2、将配制好的试剂分别加至标记有相应标签的试剂容器内。
3、将反应盒置于振荡摇床之上。
4、插入电源。
5、根据需要利用程序设置处理模块进行编程：
设置1封闭：不注入；孵育0分钟，不振荡；不抽干；不回收；循环0次。
设置洗涤：注入；洗涤5分钟，振荡；抽干；不回收；循环4次；保留液体。
设置一抗：不注入；孵育0分钟，不振荡；不抽干；不回收；循环0次。
设置洗涤：不注入；孵育0分钟，不振荡；不抽干；不回收；循环0次。
设置二抗：不注入；孵育0分钟，不振荡；不抽干；不回收；循环0次。
设置洗涤：不注入；洗涤0分钟，不振荡；不抽干；不回收；循环6次。
设置底物A：不注入；孵育0分钟，不振荡；不抽干；不回收；循环0次。
设置底物B：不注入；孵育0分钟，不振荡；不抽干；不回收；循环0次。
6、将转印有Hsp90的膜放进反应盒，同时管道接触反应盒底部。
7、点击开始，到实验步骤完成后，装置由系统自动关机。
8、然后从反应盒内取出膜进行后续操作。
以上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种自动化免疫印迹实验装置，包括框架以及固定在框架内的水平隔板，所述的水平隔板将框架分成上下两层；其特征在于，所述的框架内设有：
试剂加样模块，设置在框架的上层，包括承载试剂容器的位置及多个用于实验提供试剂的试剂容器；
试剂回收模块，设置在框架的下层，包括承载回收容器的位置及多个用于试验结束后试剂回收的回收容器，所述的回收容器数量根据需要与试剂容器对应；
反应盒，设置在框架下层，用于载有目标蛋白的膜与相应的抗体进行反应或用不同缓冲液洗涤；
试剂液体分配及回收模块，包括多个与回收容器、试剂容器对应的电磁阀门；每个电磁阀门设有三个接口，分别通过导管连接至反应盒以及对应的试剂容器、回收容器；
程序设置处理模块，与试剂液体分配及回收模块电连接，用于参数设定及实验操作步骤编程设置，根据设定的时间加注相应操作步骤的试剂至反应盒，并根据设定的时间将相应操作步骤完成的试剂从反应盒抽离到对应的回收容器内；
电源模块，与程序设置处理模块电连接，用于提供电能。
2.根据权利要求1所述的自动化免疫印迹实验装置，其特征在于，所述的试剂容器包括：洗涤液容器、封闭液容器、一抗容器、二抗容器、反应底物A容器和反应底物B容器。
3.根据权利要求1所述的自动化免疫印迹实验装置，其特征在于，所述的回收容器包括：洗涤液回收容器、封闭液回收容器、一抗回收容器、二抗回收容器、反应底物A回收容器和反应底物B回收容器。
4.根据权利要求1所述的自动化免疫印迹实验装置，其特征在于，所述反应盒的下部设有频率及时间可调的振荡摇床，所述的振荡摇床与程序设置处理模块电连接。
5.根据权利要求1所述的自动化免疫印迹实验装置，其特征在于，所述框架在水平隔板的下方固定有安装杆，多个电磁阀门套设固定在所述的安装杆上。
6.根据权利要求1所述的自动化免疫印迹实验装置，其特征在于，所述的程序设置处理模块和电源模块设置在框架的上层。
7.一种自动化免疫印迹实验方法，其特征在于，使用权利要求1～6任一所述的自动化免疫印迹实验装置，包括：
(1)将所有试剂容器和回收容器用标签标记，将配制好的试剂分别加至标记有相应标签的试剂容器内；
(2)将反应盒置于振荡摇床上，将每个电磁阀门的导管连接至反应盒以及对应的试剂容器、回收容器；
(3)插入电源，根据需要利用程序设置处理模块进行编程设定；
(4)将转印载有目标蛋白的膜放进反应盒，同时电磁阀门的导管接触反应盒底部；
(5)根据程序设置处理模块的设定开始实验，到实验步骤完成后，装置由系统自动关机；然后从反应盒内取出膜进行后续操作。
8.根据权利要求7所述的自动化免疫印迹实验方法，其特征在于，步骤(3)中，进行编程设定具体为：
根据需要依次设定封闭液、洗涤液、一抗、二抗、反应底物A、反应底物B的工作参数，包括：是否注入、孵育或洗涤的时间、是否振荡、是否抽干、是否回收、循环次数。
9.根据权利要求7所述的自动化免疫印迹实验方法，其特征在于，步骤(4)中，转印载有目标蛋白的膜大小为0.1cm×0.1cm～50cm×50cm。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN112684161A (zh) * 2020-12-11 2021-04-20 东南大学 任意泳道的western blot孵育与检测的装置
CN117451981A (zh) * 2023-11-14 2024-01-26 深圳臻合智造生物科技有限公司 一种蛋白印迹杂交系统以及实验方法

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