CN111944687B - 一款适用于细胞电活动调控的阵列式离体微磁磁刺激装置 - Google Patents

一款适用于细胞电活动调控的阵列式离体微磁磁刺激装置 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一款适用于细胞电活动调控的阵列式离体微磁磁刺激装置，研究其对海马区细胞Schaffer‑CA1突触可塑性的调控规律具有重要意义，首先需要完成亚毫米尺寸阵列式mMS装置的设计，该部分内容重点研究该装置的电感线圈参数和阵列排布方式，并解决该装置的生物相容性、安全性、抗干扰和驱动模块等关键问题设计，并满足在大鼠海马离体脑片上实现磁刺激和微电极阵列电生理记录(MEA2100‑60，德国)同步完成，研究单点刺激对海马区Schaffer‑CA1突触可塑性的调控规律，多点磁刺激PP‑DG‑CA3‑CA1神经通路，最终揭示mMS对海马区Schaffer‑CA1突触可塑性的调制规律。

Description

一款适用于细胞电活动调控的阵列式离体微磁磁刺激装置
技术领域
本发明设计一种新型的亚毫米尺寸阵列式离体微磁刺激装置，其可实现对细胞电活动的精准调控，具有多点协同刺激、控制灵活、靶向性强的特点，本发明归属于生物医学工程等领域。
背景技术
电磁刺激技术是目前诊断、治疗和研究神经精神疾病的一个主要手段。作为电刺激(Electrical Stimulation，ES)技术的一种形式，深部脑刺激(Deep BrainStimulation，DBS)通过立体定向手术将刺激电极精准地植入到大脑靶向区，产生刺激信号来干扰异常神经电活动，已经被证明能够在包括癫痫、重性抑郁症和强迫症等神经精神疾病的治疗中发挥作用；而经颅磁刺激(Transcranial Magnetic Stimulation，TMS)技术是一种采用磁场刺激中枢神经系统来改善脑功能的无创式神经调制手段，通过头皮上方的手持线圈来产生非常大的时变磁场来调控神经电活动，临床试验表明TMS对于治疗许多神经系统疾病，如重性抑郁症和阿尔兹海默症等都具有治疗益处。
虽然，DBS和TMS对脑活动的影响以及这些影响如何改变相应行为有了一定的认识，但是二者在应用中仍存在一些技术和生物学限制。对应用DBS进行治疗的患者进行磁共振成像检查可能导致在刺激电极末端过度发热而导致神经损伤，DBS刺激电极直接接触生物组织，组织的炎症和免疫反应可能改变治疗效果。而TMS线圈较大(尺寸：10-20cm)，磁场强度会随着场源距离的平方增大而减小，难以定位大脑深部目标区域，具有较低的空间分辨率，并且TMS装置需要足够强的磁场(例如，＞1T)穿过颅骨来激活深部神经组织，因此在实验设置中难以控制。
因此，为了更加精准的调控大脑深部脑组织(例如，海马组织)，达到更好的靶向性磁刺激，一款可实现多点协同刺激、控制灵活、靶向性强的亚毫米尺寸阵列式微磁刺激(micro-magnetic stimulation，mMS)装置亟待开发，探究其对细胞的干预作用机制，对于揭示微磁刺激技术应用十分重要的意义。本发明的成果有助于指导未来植入式微磁装置的设计参数、刺激策略、植入位置等，从而克服DBS和TMS等电磁刺激技术和生物学限制，并将有利于提高现有电磁刺激技术的扩展应用。
发明内容
本发明设计一款适合于海马区的可实现多点协同刺激、控制灵活、靶向性强的亚毫米尺寸阵列式mMS装置；探究在mMS作用下，基于BCM理论的突触可塑性频率响应函数(FRF)的变化规律及微磁调控突触可塑性的作用靶点；探究阵列式多点mMS在时间和空间上是否能表现协同性、联合性和输入特异性。
本发明的技术方案如下：设计一款可实现多点协同刺激、控制灵活、靶向性强的亚毫米尺寸阵列式mMS装置，研究其对海马区Schaffer-CA1突触可塑性的调控规律，对于神经系统疾病的诊断、治疗以及人类高级脑功能(如记忆和认知)的探测具有重要意义；首先需要完成亚毫米尺寸阵列式mMS装置的设计，该部分内容重点研究该装置的电感线圈参数和阵列排布方式，并解决该装置的生物相容性、安全性、抗干扰和驱动模块等关键问题设计，并满足在大鼠海马离体脑片上实现磁刺激和微电极阵列电生理记录(MEA2100-60，德国)同步完成；在此基础上，磁刺激海马区Schaffer侧枝神经通路，研究其对海马区Schaffer-CA1突触可塑性的调控规律，多点磁刺激PP-DG-CA3-CA1神经通路，研究其对海马区Schaffer-CA1突触可塑性在时间和空间上的协同性作用规律，最终揭示mMS对海马区Schaffer-CA1突触可塑性的调制规律。
本发明的装置设计如下
(1)微操纵器控制设计
本发明拟通过微操纵器实现对于阵列式mMS装置的各方向精确移动，微操纵器前端通过物理方式与mMS装置固定电路板连接，并设计将mMS装置的电源和信号等连接线通过微操纵器前端空心管，这样设计可避免过多的连接线影响光源通过、连接线接触溶液导致短路等不确定因素；微操纵器本身需稳定固定在平台上，因此拟根据微电极阵列平台及微操纵器的高度，加入需要的垫台，实现微操纵器精密调节的功能(如图1所示)。
(2)阵列式mMS排列方式
本发明阵列式mMS由多个微型电感器ELJ-RFR10JFB制成，电感器尺寸为1.0×0.5×0.5mm，其结构设计满足微电极阵列电生理记录系统和磁刺激的同时完成。根据海马区脑片的大小设计阵列式mMS装置的尺寸(拟设计表面积为4.9mm×4.5mm，以产生等效空间分辨率的磁通量分布)、空间排列方式和形态(拟初步设计为4×6，电感之间的间距为0.3mm，以便密集地覆盖有效区域，分为横排、竖排两种方式)；各电感线圈固定在电路板上并采取一端共地，另一端外接线到驱动模块。为保证各电极能在同一水平线平面的放置，线圈外部包裹生物相容性图层厚度严格相同，以实现对脑片紧密的贴合(如图2.A所示)。
(3)生物相容性设计
由于微磁阵列在刺激过程中要贴附于脑片上，因此为了提高微磁阵列在刺激过程中脑片组织的稳定性，研究选取的磁传感包裹材料与组织的相容性；本发明拟采用生物相容性聚合物10μm厚的聚对二甲苯-C(DPX-美国)实现对电感线圈器件的包裹，用来消除电路中的电流泄漏，在mMS装置下方为固定脑片的压片，由于压片为网状织类材料，因此对于mMS的产生无影响。
(4)有限元仿真设计
本发明采用有限元分析方法，从线圈磁场、感应电场的大小和分布角度研究微磁阵列的磁场效应机制，为微磁阵列结构设计和优化提供量化指标。本发明采用有限元的分析方法研究激励信号的频率和幅值等因素与磁场和感应电场分布的关系；根据海马区神经通路的结构和区域大小，研究微磁线圈尺寸，线圈形态、空间排放方式与磁场和感应电场大小和分布的关系；研究海马区组织的形态参数以及组织电特性与磁场和感应电场大小和分布的关系；研究各微磁电感线圈产生的磁场范围及各电感线圈之间相互影响的关系；最后，确定综合刺激指标，优化微磁阵列的结构设计。
(5)安全性设计
为了确认微磁线圈是否发热严重而影响结果，本发明拟采用T型铜-康铜热电偶(直径0.05mm，日本东京CHINO CORPORATION)监测mMS器件温度(ΔT)的变化，然后采用A/D转换器(GL100-WL-4VT，Graphtec Corporation，Yokohama，Japan)以2Hz的采样率记录温度变化，从而来评估设备的安全性，以及线圈产生温度变化的影响。
(6)抗干扰设计
从电磁屏蔽的角度，研究含有mMS装置的微电极阵列电生理记录系统的抗干扰设计，本发明通过COMSOL仿真分析各电感器可能受到干扰影响，设计优化方法，根据优化的结果，设计适合切片实验的阵列式mMS装置；分析包括显微镜金属平台等在内的潜在干扰因素的影响，如果对于磁刺激的产生存在影响，拟通过更换为亚克力玻璃来实现相应的功能。
(7)驱动模块设计：拟采用上位机软件、单片机、多路功率放大器等构成。
本发明上位机软件通过软件Qt 5.4.0的GUI Designer(界面设计器)来进行界面的布局和绘制，在该GUI中拟使用Label，Combo Box，Push Button，Line Edit四种组件，并通过Horizontal Layout与Vertical Layout相结合的方法进行布局，设计端口选择模块，通过单击刷新按钮对串口号进行刷新，并在端口选择的下拉列表框选择合适的端口；设计频率设置模块，通过单击设置按钮对在行编辑组件中输入的频率值进行设置；设计赋值设置模块，通过单击设置按钮对在行编辑组件中输入的幅值进行设置，同时可设置赋值的步进值，在设置赋值的基础上增大或减小相应的步进值，输出幅度通过程序控制数控电阻来实现。单片机拟采用芯片STM32F103C8T6，并通过与信号发生芯片AD9851(直接数字合成技术实现的数字合成器，Direct Digital Synthesis，DDS)连接输出预定信号，二者采用3.3V供电方式，通过USB接电压转换芯片AMS1117-3.3实现，其中AMS1117-3.3的输出电压为3.267～3.333V。由于信号发生器输出电流较小，不能直接驱动线圈以产生磁场，需要加入功率放大器，多路功率放大器拟通过PB717(Pyramid Inc.，USA)实现，生成mMS激励源，设计多路放大输出以满足多个电感线圈功率的需求(如图2.B所示)。
(8)微电极阵列电生理记录系统的工作方式
微电极阵列位于脑片下方处，根据电生理实验记录区域的需要，电极排列选取8×8(200/30)和6×10(500/30)两种方式，可根据实际需要选择相应型号的电极记录，任何一个点都可以作为刺激点和记录点，根据需要在软件中进行设置，本研究示意图中阐述的为6×10排列方式电极，电极距离为0.5mm，其中蓝色点为参考点。
(9)微电感线圈磁通密度的实验测量
由于本发明中电感线圈非常小，无法使用商用高斯计测量磁通量密度，因此，拟设计制造几个定制的检测线圈来测量微磁线圈产生的感应电动势，在测量实验中，界面电感的下端首先定位在搜索线圈顶部的中心，定位后，使用微操纵器将待测电感线圈插入搜索线圈相应的的深度，用模数(A/D)转换器(PCI-6259，National Instruments，USA)以200kHz的采样率记录感应电动势，多次试验后，计算电动势的平均波形，最后，对获得的波形进行数值积分以估计磁通量密度，其中所有的数据处理和数值计算拟通过使用SciPy库的定制Python程序完成对获得的波形进行数值积分以估计磁通量密度(如图2.C所示)。
(10)微电感线圈磁通密度的数值计算
为了评估上述测量电感线圈产生磁场的有效性，本发明拟根据通过数值计算得到磁通密度，首先，考虑一个理想的有限长螺线管，螺线管的匝数与实际相同，根据Biot-Savart定律，分别计算z和x轴方向上的磁通密度分量Bz和Bx，在数值计算Bz和Bx之后，使用检测线圈的参数在空间上对磁通密度分布进行平均，得到估计的磁通密度，然后将这个值与测量结果、仿真结果进行比较，以确保实验中mMS产生磁通密度的准确性。
附图说明
图1为本发明阵列mMS实验平台示意图
图2为本发明阵列mMS结构排列及驱动模块示意图
图3为本发明阵列mMS对于细胞电活动调节的刺激方式示意图
图4为本发明阵列mMS实验协议示意图
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的说明。
(1)实验手段
本发明实验选用16-18天的Sprague-Dawley幼鼠，0.1ml水合氯醛(10％)注射麻醉后断头，再以95％O2+5％CO2混合气饱和的4℃人工脑脊液(artificial cerebrospinalfluid，ACSF)持续冲洗下，迅速整体取出大脑并置于预先用ACSF湿润的滤纸上，割掉丘脑，沿中线切开两大脑半球，振动切片机(VF-200，USA)沿冠状方向将其切成400μm的脑片，每个脑半球可切出5-6片包含海马的脑片。所有脑片置于30-32℃装有ACSF的孵育槽中，并不断通入95％O2+5％CO2混合气，孵育1-2h待用。ACSF的成分为(mmol/L)：NaCl 120、KCl 2.5、NaH2PO4·2H2O 1.25、NaHCO3 26、MgSO4·7H2O 2、C6H12O6·H2O 10、CaCl2 2。
(2)多点mMS的刺激方式
本发明mMS装置拟采用4×6阵列排列方式，选择面积较小的离体海马脑片，确保微磁阵列装置可以覆盖PP-DG-CA3-CA1神经通路，为了研究阵列式多点mMS对Schaffer-CA1突触可塑性的协同作用机理，本实验方案拟采用(后续实验可以根据这个结果进行重新设计和调整)3点刺激方式，图3中的①，②，③红色表示3个使能的刺激电感，其中①表示磁刺激点位于Schaffer侧枝，②表示磁刺激点的位置位于苔藓纤维，③表示磁刺激点的位置位于穿通纤维，由于采用阵列方式，刺激位置可以灵活调整。在多点mMS方式上，记录电极选择体积小分辨率相对低的6×10结构的500/30型号电极，其大小可以覆盖海马脑片三突触神经通路。诱导电刺激电极选择在SC神经通路的辐射层上，记录电极选择在其右方相邻的的顶树突、胞体和基底树突上，可以同时进行fEPSP的记录，具体实验过程如图3.A所示。
(3)多点mMS的实验过程
取一个脑片置于电极阵列中，用移液管吸去ACSF使脑片贴附于电极上，加盖尼龙网垫片，随后持续灌流以95％O2+5％CO2混合气供氧的ACSF，控制流速为1.5-2.5ml/min，温度维持在31-32℃，倒置显微镜找到海马PP-DG-CA3-CA1通路，如图1所示，刺激电极在Schaffer侧枝辐射层，记录电极分别选在临近的顶树突、胞体和基底树突位置，准备实验，本部分的实验研究为了验证多点mMS对海马区Schaffer-CA1突触可塑性的协同性作用机理，拟采用的实验方案如图3.(B-C)所示，其中图3.B为多点微磁线圈在不同位置的同时刺激，研究不同位置和不同个数对突触可塑性的作用效果，其中√表示使能该位置，×表示该位置未使能，图3.C为多点微磁线圈在不同位置按时间先后顺序进行刺激，研究不同个数和时间先后顺序的mMS对突触可塑性的作用效果，最终确定在mMS对突触可塑性强弱作用效果下，多点的强弱组合、强强组合、弱弱组合mMS在空间和时间上对突触可塑性的协同性作用效果，揭示多点mMS与单点mMS调控机制的差异性。
(4)多点mMS协议
本发明采用刺激协议如图4.A所示，刺激方式为前磁刺激方式，磁场刺激加到基线记录之前，在进行空间协同性实验中，①、②、③位置的微磁同时进行刺激，刺激时间拟选择10min，刺激方式选择连续的正弦波，如图4.B所示，这里同时可以进行当①位置微磁关闭后，研究②，③位置同时刺激的作用效果，①位置微磁打开后，②，③位置分别打开同时作用效果。在时间协同性实验中，①，②，③位置的微磁按照不同顺序分时进行5min的刺激，磁刺激总时间为15min。如果其中一个刺激点关闭，其它两个刺激点按照不同顺序分时进行5min的刺激，总时间为10min。基线的记录在可塑性诱导之前，记录协议如图4.C所示，记录时间拟选用20min。可塑性诱导分为LTP/LTD两种方式，每一种方式也可以采用不同的诱导频率，这里以1Hz低频电刺激(Low-Frequency Stimulation，LFS)诱导的LTD参数为例(图4.D)：频率为1Hz，持续时间为15分钟，脉冲总数为900，LFS结束之后再记录60min的fEPSP，刺激协议同基线记录方式。我们还会另外选择不同的中间频率诱导可塑性，最终会确定多点mMS后新的突触可塑性的频率响应函数(FRF)。
(5)细胞活动与阵列mMS的相互影响关系
突触可塑性依赖于钙离子的活动，神经递质如谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)和甘氨酸(Gly)和受体如AMPA、NMDA受体都参与突触传递的过程，而AMPA受体是突触传递的基础，只有当AMPA受体的密度达到一定程度，NMDA受体才允许离子进入从而产生大量电位的变化，这是因为Mg2+一直占据着NMDA受体通道的结合位点。在此部分，我们拟在ACSF中分别加入Ca2+的阻断剂尼伐地平(Nilvadipine)、NMDA受体拮抗剂(MK-801)等药物，然后按照前述实验过程进行实验，以此来确定在缺乏维持突触可塑性重要条件的情况微磁能不能调控此过程以及对微磁具体作用于哪部分进行阐述。
(6)阵列mMS对双脉冲易化影响
双脉冲易化刺激协议：双脉冲易化现象是指用两个间隔较小的脉冲刺激海马Schaffer侧枝，第二个兴奋性突触后电位的幅值大于第一个的现象，一般以这种反应来衡量海马的短时程突触可塑性和NMDA受体机制。实验前需进行测试刺激，调节刺激强度使幅值为最大反应幅值的40-60％，对脉冲间隔拟选取50ms，刺激频率0.01667Hz，对照组记录20min，随后开始微磁磁刺激10min，实验组同样记录20min，实验结果以前后两个fEPSP幅值的比值呈现。

Claims (6)

1.一款适用于细胞电活动调控的阵列式离体微磁磁刺激装置，其特征是：阵列式离体微磁磁刺激装置由多个微型电感器ELJ-RFR10JFB制成，电感器尺寸为1.0×0.5×0.5mm，其结构设计满足微电极阵列电生理记录系统和细胞磁刺激的同时完成，根据海马区脑片的大小设计阵列式微磁磁刺激装置的尺寸，设计表面积为4.9mm×4.5mm，以产生等效空间分辨率的磁通量分布、空间排列方式和形态，设计为4×6，电感之间的间距为0.3mm，以便密集地覆盖有效区域，分为横排、竖排两种方式；各电感线圈固定在电路板上并采取一端共地，另一端外接线到驱动模块；为保证各电极能在同一水平线平面的放置，线圈外部包裹生物相容性图层厚度严格相同，以实现对脑片紧密的贴合。
2.根据权利要求1所述装置，其特征在于，采用有限元分析方法，从线圈磁场、感应电场的大小和分布角度研究微磁阵列的磁场效应机制，为微磁阵列结构设计和优化提供量化指标，采用有限元的分析方法研究激励信号的频率或幅值因素与磁场和感应电场分布的关系；根据海马区神经通路的结构和区域大小，研究微磁线圈尺寸，线圈形态、空间排放方式与磁场和感应电场大小和分布的关系；研究海马区组织的形态参数以及组织电特性与磁场和感应电场大小和分布的关系；研究各微磁电感线圈产生的磁场范围及各电感线圈之间相互影响的关系；最后，确定综合刺激指标，优化微磁阵列的结构设计。
3.根据权利要求1所述装置，其特征在于，生物相容性设计，由于微磁阵列在刺激过程中要贴附于脑片上，因此为了提高微磁阵列在刺激过程中脑片组织的稳定性，研究选取的磁传感包裹材料与组织的相容性，采用生物相容性聚合物10μm厚的聚对二甲苯-C实现对电感线圈器件的包裹，用来消除电路中的电流泄漏。
4.根据权利要求1所述装置，其特征在于，安全性设计，为了确认微磁刺激平台是否发热严重而影响结果，采用热电偶监测微磁刺激器件温度(ΔT)的变化，然后采用A/D转换器以一定的采样率记录温度变化，从而来评估设备的安全性，以及线圈产生温度变化的影响，抗干扰设计：从电磁屏蔽的角度，研究微电极阵列电生理记录系统的抗干扰设计，根据优化的结果，设计适合于海马切片实验的阵列式微磁磁刺激装置。
5.根据权利要求1所述装置，其特征在于，驱动模块设计，采用上位机软件、单片机和多路功率放大器构成，通过单片机控制信号发生芯片生成微磁刺激激励源，产生的激励信号连接到功率放大器，设计多路放大输出以满足多个电感线圈功率的需求。
6.根据权利要求1所述装置，其特征在于，微电感线圈磁通密度的实验测量，由于电感线圈非常小，无法使用商用高斯计测量磁通量密度，因此，设计制造几个定制的检测线圈来测量微电感线圈产生的感应电动势，最后，我们对获得的波形进行数值积分以估计磁通量。
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