CN111937199A - 制造生物传感器纳米孔的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了制造高灵敏度且高选择性的电化学生物传感器的改进方法。所述方法可以包括用铁氰化物优选铁氰化钾洗涤所述生物传感器的纳米孔阵列电极。除了铁氰化物和/或H2SO4洗涤步骤之外，或者没有铁氰化物和/或H2SO4洗涤步骤的情况下，所述方法还可以包括用亚甲蓝(即，次甲蓝)洗涤所述生物传感器的电极。

Description

制造生物传感器纳米孔的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求提交于2018年3月23日的美国临时申请序列No.62/647,280以及提交于2018年3月23日的韩国专利申请No.10-2018-0033974的优先权的权益，将它们各自的内容通过援引并入本文。
发明领域
本公开总体上涉及用于高灵敏度且高选择性的生物传感器的制造方法。更特别地，本公开涉及减少或消除来自电化学生物传感器的杂质的高灵敏度且高选择性的生物传感器的制造方法。
背景技术
生物传感器用于检测生物分子，诸如蛋白质、氨基酸(例如，包含特定碱基序列的DNA和/或RNA)，或其他有机分子的存在。生物传感器的一些实例包括妊娠测试和葡萄糖监测传感器。这些生物传感器可以检测存在于体液诸如血或尿中的生物分子诸如人绒毛膜促性腺激素(human chronic gonadotropin)(hCG)或葡萄糖。
为了检测特定的分析物(例如，生物分子)，生物传感器可以包含分析物-结合表面，其中将对分析物具有特异性的探针(例如，对目标分子具有特异性的单链DNA或抗体)固定到分析物-结合表面上。已经开发出使用不同科学原理的可以检测特定生物分子的存在的不同类型的生物传感器。
不同类型的生物传感器的实例包括电化学生物传感器、纳米悬臂梁生物传感器(nano-cantilever biosensors)以及微机电系统或纳机电系统(MEMS/NEMS)。像其他类型的生物传感器一样，电化学生物传感器包括能够与特定生物分子(例如，特定蛋白质或DNA的特定序列)相互作用和/或结合的分析物-结合表面。特别地，电化学生物传感器使用电化学分析的原理来检测特定的分析物，其中测量并分析对施加到系统的电激发的化学响应，以检测分析物是否结合到电极表面。与纳米悬臂梁生物传感器和MEMS/NEMS不同，电化学生物传感器的信号可以通过电子装置直接检测以用于分析，从而允许快速诊断。
对于电化学生物传感器的潜在未来应用包括在传统医疗和保健环境中的诊断(例如，对于特定生物分子的血和/或尿样品测试)；非医院环境的医疗诊断(例如，在作战区中的军事用途和/或自行管理的消费者诊断)，生物和/或小分子检测的非医疗检测(例如，水质测试、环境测试、食品工业中的品质控制和/或品质保证测试)；对于药物治疗的伴随诊断；其中要求检测小分子的研究应用；和/或其中需要检测生物分子的其他环境或状况。本领域技术人员将理解，尽管本公开称为“生物传感器”，但是其应用不限于生物分子的检测。换句话说，本公开可以用于检测其他小的非生物(例如，无机的、金属的、溶质、电解质和/或元素)分子。另外，尽管这里提供的实施例由在流体和/或水性环境中的检测组成，但是本领域技术人员将理解，本公开可以用于检测在其他流体环境，诸如油、溶剂、气体和/或胶体溶液中的小分子。
为了使电化学生物传感器广泛适配成宽范围的应用，生物传感器必须是高灵敏度且高选择性的，并且这样的传感器的制造成本必须是有竞争力的。具有显著改进的灵敏度和选择性的电化学生物传感器可以使这样的装置能够小型化，这进而可以减少生产成本，并且进一步有助于采用电化学生物传感器用于宽范围的应用。
在公布的美国专利申请No.US2017/0219554A1中已经描述了具体类型的高灵敏度且高选择性的生物传感器，其内容通过援引并入本文。这些生物传感器包括铺设于电化学生物传感器的电极上的穿孔的绝缘层(insulation layer)(或绝缘层(insulatinglayer))，以形成纳米孔(nanowell)(或纳米-孔(nano-well))。这样的电化学生物传感器可以高选择性地检测在生物样品中以fM范围存在的分析物。
然而，这样的生物传感器的制造在技术上具有挑战性。特别地，在制造工艺期间杂质对生物传感器的污染可致使生物传感器有缺陷或不利地影响生物传感器的灵敏度和选择性。
因此，需要制造高灵敏度且高选择性的生物传感器(具有铺设于电极上的穿孔的绝缘层的这样的生物传感器)的改进的方法，其中减少或消除了杂质对生物传感器的污染。
发明内容
本文提供了制造高灵敏度且高选择性的电化学生物传感器的改进方法。所述方法的一种示例性实施方式包括用铁氰化物优选铁氰化钾洗涤生物传感器的纳米孔(或纳米-孔)阵列电极。在另一种示例性实施方式中，所述方法包括用H2SO4洗涤所述生物传感器的电极，并另外用铁氰化物洗涤所述电极。在另一种示例性实施方式中，除了铁氰化物和/或H2SO4洗涤步骤之外，或者没有铁氰化物和/或H2SO4洗涤步骤的情况下，所述方法包括用亚甲蓝(即，次甲蓝(methylthioninium chloride))洗涤所述生物传感器的电极。
本文公开的方法导致从所述生物传感器去除杂质。在一些实施方式中，从所述电极(例如，金电极)表面去除杂质。
在一种示例性实施方式中，本发明旨在改进电化学生物传感器装置的生产。这样的电化学生物传感器装置的一种实例包括多个电极，所述电极由铺设于基底层上的缓冲层、铺设于所述缓冲层上的电极层以及铺设于所述电极层上的穿孔的绝缘体层制成，使得在所述电极层上形成多个纳米孔并且所述纳米孔的尺寸由穿孔的大小限定，所述纳米孔的壁由所述绝缘体层限定，并且所述纳米孔的底层由所述电极层的上表面限定。在一些情况下，所述生物传感器的纳米孔具有的间距比率为1:1。在其他情况下，所述生物传感器可以检测以fM浓度范围存在的分析物。
在一些实施方式中，所述电化学生物传感器可以包括玻璃基底层、硅基底层、二氧化硅绝缘体层、钛缓冲层、铬缓冲层和/或金电极层。
在又其他实施方式中，所述电化学生物传感器可以具有穿孔的绝缘体层，其中所述穿孔(例如，孔洞和/或洞)可以限定纳米孔的尺寸，使得所述纳米孔是圆柱形形状。在又一些其他实施方式中，所述纳米孔具有直径为约230nm、100nm和/或50nm的圆形开口。在另外又其他实施方式中，所述纳米孔具有的间距比率为约1:5、约1:3和/或约1:1。
在一些实施方式中，所述电化学生物传感器可以与电子装置结合操作，其中所述电化学生物传感器能够将信号发送到所述电子装置中，使得可以通过所述电子装置使用所述信号来检测在包含参比样品的电极与包含测试样品的电极之间的一种或多种电化学反应参数，以确定分析物是否存在于所述测试样品中。在示例性实施方式中，所述电化学反应包括氧化反应和还原反应。在另外示例性实施方式中，所述参数包括氧化还原电流的变化。
在一些其他实施方式中，可以通过以下来使用所述电化学生物传感器以检测样品溶液中的分析物：(1)将所述测试样品施加到所述电化学生物传感器的感测电极上，以允许可能存在于所述测试样品中的任何分析物的结合；(2)用适当的缓冲液冲洗所述感测电极，以从所述感测电极上洗去任何未结合和/或非特异性结合的分析物和/或非分析物；(3)将电流以以下方式施加到所述感测电极，使得以引起所述感测电极的化学变化；(4)使用电子装置测量所述感测电极的电化学特性；以及(5)分析在所述测试样品与所述参比样品之间的电化学特性的差异，以确定所述感测电极上分析物的存在。在示例性实施方式中，使用循环伏安法分析来测量所述感测电极的电化学特性。
在另一种示例性实施方式中，本发明提供了一种生物传感器的制造方法，所述方法包括以下步骤：形成金属层；通过使用第一光刻工艺图案化所述金属层来形成电极层；在所述电极层上形成无机绝缘体层；在所述无机绝缘体层上形成多个纳米孔，其中通过使用第二光刻工艺暴露所述电极层的一部分；以及通过使用H2SO4洗涤多个纳米孔，以从所暴露的电极层去除杂质。
在一些实施方式中，所述方法进一步包括在H2SO4洗涤步骤之后通过使用铁氰化物刻蚀(或洗涤)来洗涤纳米孔。铁氰化物刻蚀洗涤步骤通过以下进行：将所述生物传感器浸入K3Fe(CN)6和KCl溶液的混合溶液中并施加1.0-1.5V的电压。例如，所述铁氰化物刻蚀可以在15-25℃范围内的温度下进行1至10秒。
在一些实施方式中，所述电极包括金(Au)，并且所述铁氰化物刻蚀使所述电极的表面平整化。所述无机绝缘体层包括SiO2或Si3N4。
在一些实施方式中，H2SO4洗涤步骤通过以下进行：将生物传感器浸入H2SO4溶液中并施加1.0-1.5V的电压1-5分钟。
在一些实施方式中，所述纳米孔的间距比率定义为每个纳米-孔的大小与相邻纳米-孔之间的最短距离之比，并且可以是1:3或更小，优选为1:1。
在其他实施方式中，本发明提供了一种制造方法，所述方法包括以下步骤：在基底层上形成电极；在所述电极上形成无机绝缘体层；使用光刻工艺在所述绝缘体层上形成多个纳米孔，使得暴露所述电极的一部分；通过将纳米孔浸入H2SO4溶液中并施加1.5-2.0V的电压进行第一洗涤步骤；通过将纳米孔浸入K3Fe(CN)6和KCl溶液的混合溶液中并施加1.0-1.5V的电压进行第二洗涤步骤。
本公开还涉及制造使杂质对所述生物传感器的污染最小化的高灵敏度且高选择性的电化学生物传感器的方法。在一些实施方式中，在形成纳米孔之后使用硫酸溶液的所述洗涤步骤防止了对生物传感器的灵敏度和选择性的不利影响，所述不利影响是由生物传感器的污染，例如，在制造程序期间杂质对纳米孔表面上的电极的污染引起。在一些实施方式中，除了使用硫酸溶液的洗涤工艺之外，还使用铁氰化物刻蚀(或洗涤)工艺，从而更有效地去除污染物，并改进所述电极表面的平整度。因此，这些工艺改进了生物传感器的灵敏度和选择性。
根据本发明的制造方法制造的电化学生物传感器可以以高特异性来检测在生物样品中以fM浓度范围存在的分析物。
附图说明
图1A-1D呈现了本公开的实施方式的摄影图像和显微镜图像。
图2呈现了感测电极的实施方式的截面示意图。
图3呈现了本公开的实施方式的透视示意图，展示了被配置为检测不同分析物的各个感测电极。
图4呈现了如何可以将生物传感器与恒电位仪和电子装置结合使用以检测样品中的分析物的示意图。
图5A-5C呈现了展示关于生物传感器灵敏度的纳米孔的示例性间距比率的示意图。
图6A-6C呈现了展示变化的间距比率对生物传感器灵敏度的影响的代表性循环伏安法(CV)分析数据。
图7呈现了展示使用本公开的实施方式检测溶液中变化浓度的DNA分析物的代表性数据。
图8呈现了展示生物传感器的制造方法的流程图。
图9A-9H呈现了展示生物传感器的制造方法的主要步骤的示意图。
图10A-10B呈现了包括Si3N4绝缘层的生物传感器电极的代表性扫描电子显微图(SEM)和循环伏安法(CV)分析数据，其中生物传感器是在没有H2SO4洗涤或铁氰化物刻蚀(或洗涤)步骤的情况下生产的。
图11A-11B呈现了包括Si3N4绝缘层的生物传感器电极的代表性SEM和CV分析数据，其中生物传感器是使用包括H2SO4洗涤步骤的方法生产的。
图12A-12B呈现了包括Si3N4绝缘层的生物传感器电极的代表性SEM和CV分析数据，其中生物传感器是使用包括H2SO4洗涤步骤和铁氰化物刻蚀(或洗涤)步骤的方法生产的。
图13A-13B呈现了包括SiO2绝缘层的生物传感器电极的代表性SEM和CV分析数据，其中生物传感器是在没有H2SO4洗涤或铁氰化物刻蚀(或洗涤)步骤的情况下生产的。
图14A-14B呈现了包括SiO2绝缘层的生物传感器电极的代表性SEM和CV分析数据，其中生物传感器是使用包括H2SO4洗涤步骤的方法生产的。
图15A-15B呈现了包括SiO2绝缘层的生物传感器电极的代表性SEM和CV分析数据，其中生物传感器是使用包括H2SO4洗涤步骤和铁氰化物刻蚀(或洗涤)步骤的方法生产的。
图16A-16B呈现了使用光刻法制造的生物传感器电极的代表性SEM和CV分析数据，其中生物传感器是在没有H2SO4洗涤或铁氰化物刻蚀(或洗涤)步骤的情况下生产的。
图17A-17B呈现了使用光刻法制造的生物传感器电极的代表性SEM和CV分析数据，其中生物传感器是使用包括H2SO4洗涤步骤的方法生产的。
图18A-18B呈现了使用光刻法制造的生物传感器电极的代表性SEM和CV分析数据，其中生物传感器是使用包括H2SO4洗涤步骤和铁氰化物刻蚀(或洗涤)步骤的方法生产的。
尽管本发明包括许多不同形式的实施方式，但是在附图中示出并且将在本文中详细描述几种特定实施方式，应当理解本公开被认为是本技术原理的范例，且并不旨在将本发明限制为所展示的实施方式。
具体实施方式
为了提供对本文公开的方法的原理的全面理解，现将描述某些示例性实施方式。这些实施方式中的一种或多种实例在附图中展示。本领域技术人员将理解，本文中特别描述和附图中展示的方法是非限制性示例性实施方式，并且本公开的范围仅由权利要求限定。在具有一种示例性实施方式的集中所展示或描述的特征可以与其他实施方式的特征组合。这样的修改和变化旨在被包括在本申请的范围内。
另外，附图不一定是按比例的，并且就所公开的装置和方法的描述中使用的线性或圆形尺寸而言，这样的尺寸并不旨在限制可以与这样的装置和方法结合使用的形状和大小的类型。本领域技术人员将认识到，对于任何几何形状，可以容易地确定这样的线性和圆形尺寸的等效物。更进一步，装置及其部件的大小和形状可以至少取决于将使用该装置的受试者的解剖结构、将与该装置一起使用的部件的大小和形状以及将使用该装置的方法和程序。
此外，尽管本文提供的示例性实施方式描述了能够检测生物分子(例如，蛋白质和/或核酸分子)的装置的生产方法，但是本领域技术人员将认识到，可以采用该装置用来检测非生物分子和/或不是生物样品的样品的存在。作为实例，可以利用使用本发明制造的生物传感器来检测无机材料的存在，以用于其他工业环境中的水质测试、环境测试和/或品质控制/品质保证测试。
为了在广泛范围的应用，诸如在传统医疗、药物和/或保健环境中的诊断(例如，对于特定生物分子的血和/或尿样品测试)，非医院环境中的医疗诊断(例如，在作战区中的军事用途、自行管理的消费者诊断诸如妊娠测试或血糖监测)，生物和/或小分子检测的非医疗检测(例如，水质测试、环境测试、食品工业中的品质控制和/或品质保证测试)，对于药物治疗的伴随诊断；其中要求检测小分子的研究应用；和/或其中需要检测生物分子的其他环境或状况中采用电化学传感器，该电化学传感器必须是灵敏的(即，能够检测低浓度的分析物)、选择性的(即，在存在其他组分的情况下能够辨别和区分目标分析物)、易于使用(即，操作简单，要求少量的测试样品)以及对于用户容易地可获得(即，能够可缩放地、大量地和/或以低成本制造)。
本公开涉及制造使杂质对所述生物传感器的污染最小化的高灵敏度且高选择性的电化学生物传感器的方法。
电化学生物传感器的详细描述
描述了电化学生物传感器的各种实施方式。本文所描述的制造方法可以用于改进电化学生物传感器诸如下文所描述的以及在美国专利申请No.US2017/0219554A1中公布的那些的生产。
图1A-1D展示了电化学生物传感器100的一种实施方式的摄影图像和显微镜图像。如图1A所示，可以在单个基底层110诸如玻璃或硅基底层(例如，晶片)上产生本公开的一种实施方式的多个100。图1B是包括多个感测电极120的单个电化学生物传感器100的摄影图像。图1C是图1B的感测电极的扫描电子显微镜图像，该感测电极包括具有的间距比率(纳米孔开口的直径与相邻纳米孔之间的最短距离之间的比率)为大约1:1且纳米孔开口直径为大约230nm的多个纳米孔130。在其他实施方式中，纳米孔间距比率和/或纳米孔开口直径可以是不同的值，如本公开的后部分中所公开的。图1D是单个纳米孔130的透视原子力显微镜图像，示出了具有由电极层的顶表面限定的底板140的纳米孔130的圆柱形尺寸。
图2展示了图1B的感测电极，图2是图1D的纳米孔部分的截面示意性表示。在一种实施方式中，感测电极可以包括玻璃或硅基底层210、铺设于基底层上的缓冲层220、铺设于基底层上的电极层230以及铺设于电极层上的绝缘体层240。
在一种实施方式中，基底层210可以由玻璃制成。基底层还可以包括硅、二氧化硅(例如，石英)、硼硅酸盐和/或半导体制造中使用的其他玻璃组合物。在其他实施方式中，玻璃或硅基底层210可以是圆形晶片。在又其他实施方式中，玻璃或硅基底层210可以被配置为容纳多个电化学生物传感器，如图1A所示。
感测电极120的缓冲层220可以提供电极层230与基底层210的增强的结合，从而最小化电极层230从基底层210分离的风险。换句话说，缓冲层220允许电极层230和基底层210形成更紧密的密封。电极层230与基底层210之间的这样的增强的结合或密封的形成可以使电化学生物传感器能够更容易且更可靠地制造和/或降低制造成本。在一种优选的实施方式中，缓冲层可以包括钛、铬和/或者钛或铬的合金。
可以将感测电极120的绝缘体层240穿孔，使得绝缘体层240包括多个孔洞241(即，洞)。在图1C中还展示出了多个孔洞，这些孔洞形成纳米孔130。在优选的实施方式中，孔洞241限定多个纳米孔242的内部尺寸。在一些实施方式中，孔洞241是圆柱形形状，如图1D所示，使得其尺寸由孔洞241限定的纳米孔242具有圆形开口，并且绝缘体层形成圆柱形纳米孔242的壁243。因为穿孔的绝缘体层240铺设于电极层230上，由于两层之间的相对位置，未被绝缘体层240覆盖的电极层的顶表面231可以形成纳米孔231a的底表面。在一种优选的实施方式中，感测电极的绝缘体层240可以包括氮化硅(Si3N4)，因为与某些替代物(诸如有机或无机聚合物)相比，氮化硅是更加有回弹力的且更稳定的。在另一种优选的实施方式中，感测电极的绝缘体层240可以包括二氧化硅(SiO2)。特征诸如氮化硅的回弹性和稳定性可以使能够更可靠且更一致地制造本公开的感测电极部分，从而导致减少了缺陷产品的出现和降低了制造成本。
在一些实施方式中，其中纳米孔的开口是圆形，纳米孔242的圆形开口的直径可以小于1000nm。在其他实施方式中，纳米孔242的圆形开口的直径可以小于300nm。在又其他实施方式中，纳米孔242的圆形开口的直径可以为大约230nm、100nm和/或50nm。尽管上述实施方式具有带有圆形开口的圆柱形形状的纳米孔242，但是本领域技术人员将认识到，纳米孔242可以具有各种其他开口形状，诸如矩形、椭圆形和/或多边形形状。在具有带有各种其他开口形状的纳米孔242的这些实施方式中，开口的尺寸可以小于1000nm或300nm，或者可以为大约230nm、100nm和/或50nm。另外，本领域技术人员还将认识到，本发明不限于上述组成和结构，而是还可以包括具有相似特征或改进特征的组成和结构。
在其他实施方式中，纳米孔242的底表面231a(例如，未被绝缘体层覆盖的电极层的顶表面)可以包括能够与特定分析物结合的探针分子245。作为实例，如图2所示，可以通过使用中间结合分子244诸如抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白将对分析物具有特异性的生物素化抗体245固定到纳米孔的底表面231a上。本领域技术人员将理解，固定分析物探针245的其他众所周知的方法可以并入本公开中，并且落入本发明的范围内，如下讨论的。在又另一种优选的实施方式中，具有多个孔洞241的绝缘体层240可以限制分析物与其探针245结合到纳米孔242的底表面231a，同时防止分析物与绝缘体层240的结合和/或聚集。
图3展示了电化学生物传感器100的一种实施方式的透视示意性表示，其中每个单独的感测电极310涂覆有特定的分析物探针311-317(例如，抗体)，使得不同的分析物321-327(例如，蛋白质)可以结合到固定在单独的感测电极310上的不同探针311-317(例如，通过蛋白质-蛋白质相互作用、DNA-DNA杂交和/或其他分子间结合)。术语“固定”意指通过以下将特定的分析物探针(例如，311)结合到感测电极310的表面，例如，通过共价键合、氢键合、离子键合和/或范德华力(Van der Walls forces)将探针结合到电极表面。在一种优选的实施方式中，电化学生物传感器包括能够感测非常低量的分析物(例如，浓度小于1000fM、浓度小于500fM、浓度小于100fM、浓度小于10fM和/或浓度小于1fM)的多个电极310。
图4展示了如何可以将电化学生物传感器410的一种优选实施方式与恒电位仪440和电子装置450结合使用以检测样品中的分析物的示意性表示。在一种实施方式中，用户(例如，将本公开用作部件或步骤的消费者、实验室人员、护士、医生、计算机系统、机器或机器人装置)可以使用本公开通过进行以下步骤来测量样品中的分析物：(1)将测试样品施加到感测电极上，以允许分析物与分析物探针结合；(2)冲洗感测电极以从感测电极上去除未结合和/或非特异性结合的分子(分析物和/或非分析物)，(3)对感测电极进行电化学测量和分析。
本公开的优选实施方式使用循环伏安法来测量溶液中分析物的电化学特性，如图4示出。图4是如何可以使用生物传感器来检测样品中的分析物的示意图。
在这样的实施方式中，电化学生物传感器(工作电极)410与电化学室400、恒电位仪440和电子装置450诸如计算装置(例如，个人计算机、服务器、膝上计算机、智能手机、专用电子装置和/或可以能够接收和分析来自本公开的电信号的任何其他装置)结合使用。电化学室400包括储液器405、参比电极420、对电极430和工作电极(工作电极是电化学生物传感器的部件)410。参比电极420、对电极430和工作电极410可以浸没在电解质460的溶液中，使得当将电激发施加到系统400时，电激发引起可以由电子装置450检测和分析的化学响应(例如，氧化和/或还原反应)。更特别地，当在工作电极410与对电极430之间施加电流以流动时，可以通过恒电位仪440来控制工作电极410相对于参比电极420的电势。在这种情况下，无论由电极反应产生的电流如何，都可以精确地测量工作电极410与参比电极420之间的电势。本领域技术人员将理解，本公开还可以采用其他替代的电化学测量方法，并且这些方法因此落入本公开的范围内。
图5A-5C展示了在感测电极500上具有不同分布的纳米孔520的本公开的各种实施方式的截面示意性表示。纳米孔520的分布就相邻纳米孔520之间的间距比率525而言表示。间距比率525由纳米孔520的开口直径530与两个相邻的纳米孔之间的最近距离535、545、555之间的比率来定义。在图5A中可以发现最近距离535、545、555的另一个展示，在图5A中，相邻纳米孔之间的最近距离示出为230nm。
图5A展示了优选的实施方式，其中纳米孔520的间距比率525为1:1。在该实施方式中，纳米孔520开口具有的直径530为230nm，并且相邻纳米孔520之间的最短距离535为230nm。因此，纳米孔开口直径530与相邻纳米孔之间的最短距离535之间的比率为230nm:230nm或1:1。图5B展示了又另一种实施方式，其中间距比率525为1:3。在该实施方式中，纳米孔520开口具有的直径530为230nm，并且相邻纳米孔520之间的最短距离545为690nm。因此，纳米孔开口直径530与相邻纳米孔之间的最短距离545之间的比率为230nm:690nm或1:3。图5C展示了还又另一种实施方式，其中间距比率525为1:5。在该实施方式中，纳米孔520开口具有的直径530为230nm，并且相邻纳米孔520之间的最短距离550为1150nm。因此，纳米孔开口直径530与相邻纳米孔之间的最短距离550之间的比率为230nm:1150nm或1:5。最短距离(535、545、555)的另一种实施方式在图5A、5B和5C中示出。图5B表明相邻纳米孔之间的最短距离是230nm。
本领域技术人员将认识到，如本公开中先前所讨论的，这些是示例性实施方式，并且纳米孔的其他大小和/或间距比率也在本公开的范围内。例如，纳米孔开口直径可以为大约1000nm、大约500nm、大约100nm、大约50nm、大约20nm或小于20nm。类似地，间距比率范围可以是在100:1至1:100之间的任何比率，包括50:1、10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5、1:10或1:50。另外，尽管实施方式中的纳米孔分布呈栅格状均匀图案，但是纳米孔的其他类似图案或不均匀分布和/或可以进一步改进本发明的灵敏度和/或特异性的布置的其他类似、等效和/或进一步改进也落入本公开的范围内。
图6A-6C展示了具有不同纳米孔间距比率(即，相邻纳米孔之间的距离)的电化学生物传感器的灵敏度的差异。通常，改变纳米孔之间的间距比率会导致检测灵敏度的变化。特别地，进行了本发明的循环伏安法测量，其中与图6A(4.4x10-8的阴极峰值，具有的纳米孔间距比率为1:5的生物传感器)或图6B(7.9x10-8的阴极峰值，具有的纳米孔间距比率为1:3的生物传感器)相比，图6C示出了对于具有的纳米孔间距比率为1:1的生物传感器，最高灵敏度(1.75x10-7 nA的阴极峰值)。本领域技术人员将理解，纳米孔420开口大小、间距比率，和/或纳米孔的其他尺寸、形貌和/或物理属性两者都可以影响本公开的灵敏度，并且纳米孔的可变配置落入本公开的范围内。
图7示出了显示通过本公开的实施方式测量的氧化还原电流比率用来检测不同浓度的DNA分析物的代表性数据。通过测量氧化还原电流的变化(以百分比表示)进行检测分析物在具有分析物浓度范围是从mM(10-4M)范围至fM(10-15M)范围的样品中的存在。该实施例说明，本公开的实施方式可以通过检测统计学上显著的氧化还原电流比率来检测fM范围的DNA分析物。
生物传感器制造方法的详细描述
通常，本公开涉及电化学生物传感器的生产方法，该方法包括用于从电化学生物传感器去除和/或减少杂质的步骤。在某些实施方式中，本公开包括从电化学生物传感器的电极表面去除杂质的步骤。例如，图8和图9A-9H示出了使杂质对生物传感器(例如，电极表面)的污染最小化的电化学传感器的制造方法的本发明的一些实施方式。图8是展示生物传感器的制造方法的一种实施方式的流程图，并且图9A-9H是展示生物传感器的制造方法的主要步骤的一些实施方式的示意图。
在本发明的一种实施方式中，生物传感器的制造方法包括在基底层上形成缓冲层(S610)以及在缓冲层上形成金属层(S620)。特别地，如图9A所描述的，在基底层210上顺序形成缓冲层220和金属层230。
基底层210可以由在半导体制造中使用的玻璃、硅酮、二氧化硅(例如，石英)和/或硼硅酸盐制成。缓冲层220提供了金属层230'和基底层210的增强的结合。例如，缓冲层220包括钛(Ti)、铬(Cr)和/或其合金。在某些实施方式中，可以使用Cr/Ti。金属层230′被提供用于电极并且可以包括例如金(Au)。作为沉积工艺，可以使用各种沉积工艺，诸如溅射和电子束沉积。
本发明的方法进一步包括通过使用第一光刻工艺图案化金属层230′来形成期望的图案化的电极230。特别地，可以通过图9B和9C示出的工艺来进行上述工艺。
参照图9B，在金属层230’上涂覆光致抗蚀剂材料，使用曝光设备诸如具有期望图案的KrF光刻机和掩模版M1进行选择性曝光，从而形成期望的第一光致抗蚀剂图案PR1。接下来，如图9C所示，可以通过使用第一光致抗蚀剂图案PR1作为掩模来选择性地去除金属层230’来形成具有期望图案的电极230。
如图9B所示，在电极230上形成绝缘体层240(S640)。提供在该步骤中形成的绝缘体层240作为用于形成纳米孔的结构。在该实施方式中，使用具有恢复性和稳定性的无机绝缘体层240。例如，氮化硅(Si3N4)或氧化硅(SiO2)可以用作无机绝缘层240。特别地，可以优选使用氮化硅(Si3N4)或氧化硅(SiO2)，而不是聚合材料诸如光致抗蚀剂，因为在随后的工艺中施加洗涤工艺诸如硫酸洗涤和/或铁氰化物刻蚀。
接下来，可以使用第二光刻工艺在绝缘体层中形成多个洞(S650)。提供在该工艺中形成的多个洞作为纳米孔，并且暴露在纳米孔的底表面上的电极可以用作感测电极。特别地，可以通过图9E和9F示出的工艺来进行该工艺。
参照图9E，在绝缘体层240上涂覆光致抗蚀剂材料，类似于先前步骤，使用曝光设备诸如具有纳米级洞图案的掩模版M2进行选择性曝光，从而形成期望的第二光致抗蚀剂图案PR2。接下来，如图9F所示，通过使用第二光致抗蚀剂图案PR2作为掩模选择性地去除绝缘体层240来形成期望的洞h1，其中可以提供该洞h1作为纳米孔结构241。然而，在形成纳米孔(241)的工艺中生成杂质(CP)，这些纳米孔使电极(230)的一部分暴露在绝缘体层(240)中。CP可能留在电极表面上，并且大大降低生物传感器的可靠性。
为了解决这个问题，可以在形成纳米孔之后引入各种有效的洗涤工艺，如图9G示出。除了使用硫酸溶液的洗涤工艺之外，还可以使用铁氰化物刻蚀工艺。每个工艺可以单独进行，但可以并行进行。特别地，通过在硫酸洗涤步骤之后进行铁氰化物刻蚀(S670)，可以预期最优选的效果。特别地，可以使用硫酸(H2SO4)溶液清洁多个纳米孔，以从由多个纳米孔暴露的电极去除杂质(S660)。通过将包括纳米孔的生物传感器浸入硫酸中并施加电压预定时间来进行硫酸洗涤。尽管不限于此，所施加的电压在1.5至2.0V的范围内，并且可以进行1至5分钟。
在硫酸洗涤后，可以使用铁氰化物刻蚀来清洁多个纳米孔。通过将生物传感器浸入K3Fe(CN)6和KCl的混合溶液中并施加1.0至1.5V的电压来进行铁氰化物刻蚀。
通常，已知由金制成的电极是不利的，因为当在铁氰化物溶液中施加1V或更高的电压时的反应。然而，在本发明中，通过有意地施加1.0-1.5V的电压，可以快速处理暴露在纳米孔的底表面上的电极表面，以有效地去除残留的杂质并大大改进电极表面的平整度。尽管不限于此，但铁氰化物刻蚀在15至25℃的范围内的温度下进行1至10秒。
根据图9H，洗涤工艺从位于纳米孔241的底表面上的电极去除杂质(CP)，使电极区域平整化，使得可以确保高选择性。
在下文中，将参考以下实施例更详细地描述本发明。然而，阐述这些实施例是为了说明本发明，并且本发明的范围不限于此。
实施例
实施例1.用H2SO4和/或K3Fe(CN)6洗涤具有Si3N4或绝缘层的电极的效果。
制备硅酮基底层，并将具有300nm厚度的Cr层和具有10nm厚度的Ti层沉积到硅酮基底层上作为缓冲层。分别使用溅射设备和电子束沉积设备形成Cr层和Ti层。顺序地，使用电子束沉积设备形成具有200nm厚度的Au层作为用于电极的金属层。最后，在Au层上涂覆光致抗蚀剂材料，并且使用曝光设备、KrF光刻机和掩模版形成与期望的图案化的电极相对应的光致抗蚀剂图案。使用光致抗蚀剂图案作为掩模，在电感耦合等离子体(ICP)刻蚀设备中选择性地去除Au，并且以相同的图案选择性地去除Ti层。通过使用丙酮将其浸入超声烧杯中3-4分钟来去除光致抗蚀剂图案。
接下来，为了形成用于纳米孔阵列的绝缘层，使用等离子体增强化学气相沉积(PECVD)来沉积具有150nm厚度的Si3N4层，并且类似于前述光刻工艺，选择性地去除Si3N4层，使得洞具有的开口直径为230nm，其中间距比率为1:1。然而，使根据实施例1制造的生物传感器经受如下表1所述的不同洗涤工艺：
表1
实施例 硫酸(H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)洗涤 铁氰化物刻蚀
实施例1A X X
实施例1B O X
实施例1C O O
通过将生物传感器浸入H2SO4溶液中并在CV分析之前在+1.8V处预处理3分钟来进行硫酸洗涤。通过将生物传感器浸入铁氰化物溶液中并在室温下以100mV/s的扫描速率处理K3Fe(CN)6来进行铁氰化物刻蚀。5mM K3Fe(CN)6和0.1M KCl溶液的混合溶液用作铁氰化物溶液。另外，将实心的Ag/AgCl棒(具有3M KCl)和铂丝用作参比电极和对电极。特别地，在下表2中描述的条件下进行CV分析、硫酸洗涤和铁氰化物刻蚀。
在一种示例性实施方式中，生产高灵敏度且高选择性的电化学生物传感器的方法包括用K3Fe(CN)6溶液洗涤电极的步骤。优选地，洗涤步骤在表2中描述的条件下进行。
在另一种示例性实施方式中，生产高灵敏度且高选择性的电化学生物传感器的方法包括与用H2SO4洗涤电极的步骤组合的用K3Fe(CN)6溶液洗涤电极的步骤。优选地，这些洗涤步骤在表2中描述的条件下进行。
表2：用于循环伏安法(CV)分析、H2SO4洗涤步骤和Fe(CN)6洗涤步骤的示例性条件。
CV H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> Fe(CN)<sub>6</sub>
初始E(V) -0.6 0 -1.2
高E(V) 0.4 1.8 1.2
低E(V) -0.6 0 -1.2
初始P/N P P P
扫描速率(V/s) 0.1 0.1 0.1
段 5 4 3
样品间隔(V) 0.01 0.01 0.01
静止时间(Sec) 2 2 2
灵敏度(A/V) 1e-5 1e-4 0.001
在某些实施方式中，使用5mM K3Fe(CN)6和0.1M KCl溶液进行Fe(CN)6洗涤步骤。
在某些实施方式中，在CV分析之前，将电极在H2SO4溶液中在+1.7-1.8V处预处理3分钟。然后在室温下以100mV/s的扫描速率在包含K3Fe(CN)6的溶液中测量电化学数据。
在某些实施方式中，将实心的Ag/AgCl棒(具有3M KCl)和铂丝用作参比电极和对电极。
在某些实施方式中，本文公开的生产方法导致具有改进的电化学特性的生物传感器的电极。在一种优选的实施方式中，使用循环伏安法分析来测量电化学特性。
在某些实施方式中，Fe(CN)6洗涤步骤的扫描循环包括一个循环或两个循环。在某些其他实施方式中，Fe(CN)6洗涤步骤的扫描循环包括多于两个循环。
本领域中众所周知的是，包括施加具有大于1V的电压的电流的Fe(CN)6洗涤条件可能不利地影响电极的表面完整性。然而，在本公开的某些实施方式中，施加具有大于1V的电压的电流持续短的持续时间以产生出乎意料地有利的结果，诸如去除杂质和生物传感器的电极的增强的电化学特性。在某些其他实施方式中，用包括施加具有0.9-1.5V、1.0-1.4V、1.1-1.3V或1.15-1.25V的电压的电流的Fe(CN)6洗涤条件可发生类似的出乎意料有利的结果。
如前所述，包括具有纳米孔的绝缘层的电化学生物传感器可以由在Fe(CN)6洗涤步骤期间不反应的材料诸如无机材料组成。本公开的一些实施方式尤其很好地适合用于包括由Si3N4或SiO2制成的绝缘层的电化学生物传感器。在一些实施方式中，本公开不很好地适合用于包括具有纳米孔的绝缘层的电化学生物传感器的光刻法(由于金与绝缘层之间的弱结合)。
在一些实施方式中，例如关于铁氰化物刻蚀步骤，本公开可适配成与磷酸盐缓冲盐水溶液一起使用。
通过SEM对所得生物传感器，例如，由实施例1A-1C制造的生物传感器的纳米孔阵列进行拍照，并且对每种生物传感器进行CV分析。
在一些实施方式中，除了铁氰化物和/或H2SO4洗涤之外，或者没有铁氰化物和/或H2SO4洗涤的情况下，本公开可以适配成使用亚甲蓝(即，次甲蓝)作为洗涤溶液使用。
如图10A-15B示出,用H2SO4和/或K3Fe(CN)6洗涤具有Si3O4或SiO2绝缘层的电极的效果。
图10A示出了由Si3N4抗蚀剂层形成的纳米孔阵列表面的SEM图像。在此实施例中，不进行通过H2SO4或铁氰化物刻蚀的清洁。示出了均匀阵列的纳米孔。如下方的面板中示出的，每个纳米孔的直径大约为230nm，并且纳米孔以1:1间距比率隔开(SEM照片中的比例尺条：200nm)。
图10B示出了图10A中例示的纳米孔阵列电极的CV分析数据。
图11A示出了由Si3N4抗蚀剂层形成的纳米孔阵列表面的SEM图像。在此实施例中，进行了H2SO4洗涤步骤。示出了均匀阵列的纳米孔。如下方的面板中示出的，每个纳米孔的直径大约为230nm，并且纳米孔以1:1间距比率隔开(SEM照片中的比例尺条：200nm)。
图11B示出了图11A中例示的纳米孔阵列电极的CV分析数据。
图12A示出了由Si3N4抗蚀剂层形成的纳米孔阵列表面的SEM图像。在此实施例中，进行了H2SO4洗涤步骤和铁氰化物刻蚀(或洗涤)步骤。示出了均匀阵列的纳米孔。如下方的面板中示出的，每个纳米孔的直径大约为230nm，并且纳米孔以1:1间距比率隔开(SEM照片中的比例尺条：200nm)。
图12B示出了图12A中例示的纳米孔阵列电极的CV分析数据。
CV分析数据揭示了缺乏界限清晰的氧化还原峰，如图10A和16A示出的，表明在电极表面上存在显著的杂质。
在图13A中，CV分析数据还揭示了正常的氧化电流峰但不规则的还原电流峰，表明在电极表面上存在一些杂质。
图16B、17B和18B的CV分析数据示出了界限不清的氧化还原峰，这指示与用Si3N4或SiO2抗蚀剂层形成的纳米孔阵列电极相比，电极表面被杂质污染的水平更高。
在一些实施方式中，例如关于铁氰化物刻蚀步骤，本公开可适配成与磷酸盐缓冲盐水溶液一起使用。
例如，在包含100mM磷酸盐缓冲盐水溶液(pH 7.4)的溶液中以100mV/s的扫描速率测量CV分析，其中初始E为-0.6V并且高E为+0.4V。
在一些实施方式中，除了铁氰化物和/或H2SO4洗涤之外，或者没有铁氰化物和/或H2SO4洗涤的情况下，本公开可以适配成使用亚甲蓝(即，次甲蓝)作为洗涤溶液使用。
如实施例1所示，通过使用包含氮化硅(Si3N4)的绝缘层形成均匀且稳定的纳米孔阵列表面。来自暴露于这样的纳米孔的电极的信号可以精确地被量化，从而大大改进了生物传感器的灵敏度和选择性。
同时，如图10B、11B和12B示出的，在实施例1A中氧化还原峰很少展现，而在实施例1B中展现了相对界限清晰的氧化还原峰。尤其，在其中在硫酸洗涤后包括铁氰化物刻蚀的实施例1C中，展现出界限最清晰的氧化还原峰。因此，似乎在不包括洗涤工艺的实施例1A的情况下，在电极表面上存在显著的杂质，使得电极表面没有很好地暴露。通过比较，可以理解，在包括洗涤工艺的实施例1B和1C中，去除了纳米孔的底层上的杂质，并且因此正常暴露了电极表面。
实施例2.用H2SO4和/或K3Fe(CN)6洗涤具有SiO2绝缘层的电极的效果。
在实施例2中，根据实施例1中描述的相同方法制造生物传感器，除了用SiO2代替Si3N4形成纳米孔的绝缘层之外。另外，使根据实施例2制造的生物传感器经受如下表3所述的不同洗涤工艺。每个洗涤工艺均在与实施例1中所述的相同条件下进行。
表3
实施例 硫酸(H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)洗涤 铁氰化物刻蚀
实施例2A X X
实施例2B O X
实施例2C O O
通过SEM对所得生物传感器，例如，由实施例2A-2C制造的生物传感器的纳米孔阵列进行拍照，并且对每种生物传感器进行CV分析。
图13A、14A和15A示出了通过采用不同的洗涤工艺制造的生物传感器(实施例2A-2C)的SEM图像，并且图13B、14B和15B是分别示出图13A、14A和15A的生物传感器的CV分析数据的图。
图13A示出了由SiO2抗蚀剂层形成的纳米孔阵列表面的SEM图像。在此实施例中，不进行通过H2SO4或铁氰化物刻蚀的清洁。示出了均匀阵列的纳米孔。如下方的面板中示出的，每个纳米孔的直径大约为230nm，并且纳米孔以1:1间距比率隔开(SEM照片中的比例尺条：200nm)。
图13B示出了图13A中例示的纳米孔阵列电极的CV分析数据。
图14A示出了由SiO2抗蚀剂层形成的纳米孔阵列表面的SEM图像。在此实施例中，进行了H2SO4洗涤步骤。示出了均匀阵列的纳米孔。如下方的面板中示出的，每个纳米孔的直径大约为230nm，并且纳米孔以1:1间距比率隔开(SEM照片中的比例尺条：200nm)。
图14B示出了图14A中例示的纳米孔阵列电极的CV分析数据。
图15A示出了由SiO2抗蚀剂层形成的纳米孔阵列表面的SEM图像。在此实施例中，进行了H2SO4洗涤步骤和铁氰化物刻蚀(或洗涤)步骤。如下方的面板中示出的，每个纳米孔的直径大约为230nm，并且纳米孔以1:1间距比率隔开(SEM照片中的比例尺条：200nm)。
图15B示出了图15A中例示的纳米孔阵列电极的CV分析数据。
首先，图13A、14A和15A示出了根据所有实施例的生物传感器具有均匀阵列的纳米孔。尤其，如下方的面板中示出的，每个纳米孔开口的直径大约为230nm，并且纳米孔以1:1间距比率隔开(参见SEM图像，其中比例尺条为200nm)。
这样，类似于如实施例1中所述的Si3N4绝缘层，可以通过使用SiO2形成均匀且稳定的纳米孔阵列表面。来自暴露于这样的纳米孔的电极的信号可以精确地被量化，从而大大改进了生物传感器的灵敏度和选择性。
如图13B、14B和15B所示，展现出相对正常的氧化电流峰，但是在实施例2A中未展现出还原电流峰。通过比较，在包括硫酸洗涤的实施例2B中，也展现出相对界限清晰的还原电流峰。尤其，在其中在硫酸洗涤后包括铁氰化物刻蚀的实施例2C中，展现出界限最清晰的氧化还原峰。因此，可以理解，通过洗涤工艺，去除了纳米孔的底层上的杂质，并且因此正常暴露了电极表面。
对比实施例.用H2SO4和/或K3Fe(CN)6洗涤具有通过光刻法形成的绝缘层的电极的效果。
在对比实施例中，根据实施例1和2中描述的相同的方法制造生物传感器，除了通过使用光致抗蚀剂材料形成纳米孔的绝缘层代替无机绝缘体层(诸如SiO2或Si3N4)之外。另外，使根据对比实施例制造的生物传感器经受如下表4所述的不同洗涤工艺。每个洗涤工艺均在与实施例1和2中所述的相同条件下进行。
表4
实施例 硫酸(H<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>)洗涤 铁氰化物刻蚀
对比实施例A X X
对比实施例B O X
对比实施例C O O
通过SEM对所得生物传感器，例如，由对比实施例A-C制造的生物传感器的纳米孔阵列进行拍照，并且对每种生物传感器进行CV分析。
图16A、17A和18A示出了通过采用不同的洗涤工艺制造的生物传感器(对比实施例A-C)的SEM图像，并且图16B、17B和18B是分别示出图16A、17A和18A的生物传感器的CV分析数据的图。
如图14A-16B示出,用H2SO4和/或K3Fe(CN)6洗涤具有通过光刻法形成的绝缘层的电极的效果。
图16A示出了使用光刻法形成的纳米孔阵列表面的SEM图像。在此实施例中，不进行通过H2SO4或铁氰化物刻蚀的清洁。示出了均匀阵列的纳米孔。如下方的面板中示出的，每个纳米孔的直径大约为230nm，并且纳米孔以1:1间距比率隔开(SEM照片中的比例尺条：200nm)。
图16B示出了图16A中例示的纳米孔阵列电极的CV分析数据。
图17A示出了使用光刻法形成的纳米孔阵列表面的SEM图像。在此实施例中，进行了H2SO4洗涤步骤。示出了均匀阵列的纳米孔。如下方的面板中示出的，每个纳米孔的直径大约为230nm，并且纳米孔以1:1间距比率隔开(SEM照片中的比例尺条：200nm)。
图17B示出了图17A中例示的纳米孔阵列电极的CV分析数据。
图18A示出了使用光刻法形成的纳米孔阵列表面的SEM图像。在此实施例中，进行了H2SO4洗涤步骤和铁氰化物刻蚀(或洗涤)步骤。示出了均匀阵列的纳米孔。如下方的面板中示出的，每个纳米孔的直径大约为230nm，并且纳米孔以1:1间距比率隔开(SEM照片中的比例尺条：200nm)。
图18B示出了图18A中例示的纳米孔阵列电极的CV分析数据。
首先，类似于其他实施例，图16A、17A和18A示出了根据对比实施例1的生物传感器具有均匀阵列的纳米孔，每个纳米孔开口的直径为大约230nm，并且纳米孔以1:1的间距比率隔开。然而，在包括洗涤工艺的实施例B和C中，光致抗蚀剂绝缘层的纳米孔是塌陷的或损坏的。这样，有机绝缘体层，诸如光致抗蚀剂不适合用于引入本发明的洗涤工艺，因为它与施加到洗涤工艺的溶液引起化学反应。
在图16B、17B和18B中，没有展现出界限清晰的氧化还原峰，这指示由于显著的杂质，电极表面没有很好地暴露。
在某些实施方式中，本文公开的生产方法导致具有改进的电化学特性的生物传感器的电极。在一种优选的实施方式中，使用循环伏安法分析来测量电化学特性。
在某些实施方式中，Fe(CN)6洗涤步骤的扫描循环包括一个循环或两个循环。在某些其他实施方式中，Fe(CN)6洗涤步骤的扫描循环包括多于两个循环。
本领域中众所周知的是，通常，包括施加具有大于1V的电压的电流的Fe(CN)6洗涤条件可能不利地影响电极的表面完整性。然而，在本公开的某些实施方式中，施加具有大于1V的电压的电流持续短的持续时间以产生出乎意料地有利的结果，诸如去除杂质和生物传感器的电极的增强的电化学特性。在某些其他实施方式中，用包括施加具有0.9-1.5V、1.0-1.4V、1.1-1.3V或1.15-1.25V的电压的电流的Fe(CN)6洗涤条件可发生类似的出乎意料有利的结果。
如前所述，提供纳米孔的绝缘层可以由在Fe(CN)6洗涤步骤进行洗涤期间不反应的材料诸如无机材料组成。在一些实施方式中，可以使用无机材料代替有机材料，诸如光致抗蚀剂材料形成绝缘层。尤其，本公开的一些实施方式尤其很好地适合用于包括由Si3N4或SiO2制成的绝缘层的电化学生物传感器。在一些实施方式中，由于电极(例如，金)与绝缘层之间的弱结合，本公开不很好地适合用于包括具有纳米孔的绝缘层的电化学生物传感器的光刻法。
在一些实施方式中，除了例如关于铁氰化物刻蚀步骤所描述的溶液之外，本公开可适配成与磷酸盐缓冲盐水溶液一起使用。
生物传感器的示例性实施方式及其用途
一种用于感测溶液中分子的存在的电化学生物传感器装置，所述装置包括：
基底层；以及
多个电极，所述电极进一步包括：
铺设于所述基底层上的缓冲层，所述缓冲层被配置为提供所述多个电极与所述基底层的结合；
铺设于所述缓冲层上的电极层，所述电极层被配置为提供用于分析物的结合位点；以及
具有多个孔洞的绝缘体层，所述绝缘体层铺设于所述电极层上，并且所述绝缘体具有被配置为形成多个纳米孔的多个孔洞，所述纳米孔具有由所述绝缘体层限定的侧壁并且具有由未被所述绝缘体层覆盖的所述电极层的顶表面限定的底层，
其中将分析物探针固定到所述纳米孔的底层上，所述分析物探针被配置为结合至分析物，并且
其中所述绝缘体层被配置为基本上将所述分析物限制结合至所述电极层的顶表面，所述电极层的顶表面限定了所述多个纳米孔的底层。
根据权利要求1所述的电化学生物传感器装置，其中，所述基底层包括玻璃。
根据权利要求1所述的电化学生物传感器装置，其中，所述基底层包括硅。
根据权利要求1所述的电化学生物传感器装置，其中，所述绝缘体层包括氮化硅。
根据权利要求1所述的电化学生物传感器装置，其中，所述绝缘体层包括二氧化硅。
根据权利要求1所述的电化学生物传感器装置，其中，所述缓冲层包括钛。
根据权利要求1所述的电化学生物传感器装置，其中，所述缓冲层包括铬。
根据权利要求1所述的电化学生物传感器装置，其中，所述电极层包括金。
根据权利要求1所述的电化学生物传感器装置，其中，所述纳米孔是圆柱形形状，并且具有直径为约230nm的圆形纳米孔开口。
根据权利要求1所述的电化学生物传感器装置，其中，所述纳米孔是圆柱形形状，并且具有直径为约100nm的圆形纳米孔开口。
根据权利要求1所述的电化学生物传感器装置，其中，所述纳米孔是圆柱形形状，并且具有直径为约50nm的纳米孔开口。
根据权利要求1所述的电化学生物传感器装置，其中，所述多个纳米孔之间的间距比率小于1:5。
根据权利要求1所述的电化学生物传感器装置，其中，所述多个纳米孔之间的间距比率小于1:3。
根据权利要求1所述的电化学生物传感器装置，其中，所述多个纳米孔之间的间距比率为约1:1。
根据权利要求1所述的电化学生物传感器装置，其中，所述装置能够将信号发送到电子装置中，使得可以通过所述电子装置使用所述信号来检测在包含参比样品的电极与包含测试样品的电极之间的一种或多种电化学反应参数的差异，以确定所述分析物是否存在于所述测试样品中。
根据权利要求9所述的电化学生物传感器装置，其中，所述电化学反应包括氧化反应和还原反应。
根据权利要求9所述的电化学生物传感器装置，其中，所述参数包括氧化还原电流的变化。
使用根据权利要求1所述的生物传感器装置检测测试样品中分析物的方法，所述方法包括以下步骤：
将所述测试样品以以下方式施加到所述电化学生物传感器装置的感测电极，使得能够存在于所述测试样品中的分析物能够结合到所述分析物探针；
用适当的缓冲液以以下方式冲洗所述感测电极，使得洗去待从所述感测电极去除的未结合和/或非特异性结合的分析物和/或非分析物；
将电流以以下方式施加到所述感测电极，使得以引起所述感测电极的化学变化；
使用电子装置测量所述感测电极的电化学特性；以及
分析在所述测试样品与所述参比样品之间的电化学特性的差异，以确定所述感测电极上分析物的存在。
根据权利要求12所述的方法，其中，使用循环伏安法测量所述感测电极的电化学特性。
尽管前面的描述已经涉及特定的实施方式，但将显而易见的是，可以对所描述的实施方式进行其他变化和修改，其中获得其优点的一些或全部。因此，此描述仅是通过举例的方式，并不以其他方式限制本文的实施方式的范围。因此，所附权利要求的目的是涵盖如进入本文所述实施方式的真实精神和范围内的所有这样的变化和修改。最后，本文引用的所有的出版物和参考文献均清楚地通过援引以其全文并入。
本领域技术人员将理解，尽管本公开称为“生物传感器”，但是其应用不限于生物分子的检测。换句话说，本公开可以用于检测其他小的非生物(例如，无机的、金属的、溶质、电解质和/或元素)分子。另外，尽管这里提供的实施例由在流体和/或水性环境中的检测组成，但是本领域技术人员将理解，本公开可以用于检测在其他流体环境，诸如油、溶剂、气体和/或胶体溶液中的小分子。

Claims (10)

1.一种从高灵敏度且高选择性的电化学生物传感器的电极表面去除杂质的方法，所述方法包括：用铁氰化物溶液或亚甲蓝溶液洗涤所述生物传感器的电极表面，其中所述洗涤步骤增加了所述电化学生物传感器的灵敏度或选择性。
2.一种制造生物传感器的方法，所述方法包括：
在基底层上形成缓冲层；
在所述缓冲层上形成金属层；
通过使用第一光刻工艺图案化所述金属层来形成期望的图案化的电极；
在所述电极上形成无机绝缘层；
通过使用第二光刻工艺暴露所述电极的区域，在所述无机绝缘层上形成多个纳米孔；以及
用硫酸(H2SO4)溶液洗涤所述多个纳米孔，以从通过所述多个纳米孔暴露的电极去除杂质。
3.根据权利要求2所述的方法，进一步包括：
在用所述硫酸(H2SO4)溶液洗涤之后，通过铁氰化物刻蚀来洗涤所述多个纳米孔。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，通过将所述生物传感器浸入K3Fe(CN)6和KCl的混合溶液中并施加0.9-1.5V的电压来进行所述铁氰化物刻蚀。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述铁氰化物刻蚀在15-25℃的范围内的温度下进行1至10秒。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的方法，其中，所述电极包括金(Au)。
7.根据权利要求2所述的方法，其中，所述无机绝缘层包括SiO2或Si3N4。
8.根据权利要求2所述的方法，所述方法进一步包括以下：通过将所述生物传感器浸入所述硫酸(H2SO4)溶液中并施加1.0-1.5V的电压1-5分钟来用所述硫酸(H2SO4)溶液洗涤所述多个纳米孔。
9.根据权利要求2所述的方法，其中，所述纳米孔的间距比率定义为每个纳米孔的大小与相邻纳米孔之间的最短距离之比，其中所述间距比率为1:3或更小。
10.一种制造生物传感器的方法，所述方法包括：
在基底层上形成电极；
在所述电极上形成无机绝缘层；
通过使用光刻工艺暴露所述电极的区域，在所述无机绝缘层上形成多个纳米孔；
通过将所述多个纳米孔浸入H2SO4溶液中并施加1.5-2.0V的电压进行第一洗涤；以及
通过将所述多个纳米孔浸入K3Fe(CN)6和KCl的混合溶液中并施加1.0-1.5V的电压进行第二洗涤。
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