CN111933219B

CN111933219B - 一种分子标志物肿瘤缺失突变负荷的检测方法

Info

Publication number: CN111933219B
Application number: CN202010971654.4A
Authority: CN
Inventors: 孙大伟; 辛琳; 承康平; 蔡丽丽; 段小红; 梁占超; 王东亮
Original assignee: Beijing Qiuzhen Medical Laboratory Co Ltd
Current assignee: Beijing Qiuzhen Medical Laboratory Co Ltd
Priority date: 2020-09-16
Filing date: 2020-09-16
Publication date: 2021-06-08
Anticipated expiration: 2040-09-16
Also published as: CN111933219A

Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及一种分子标志物肿瘤缺失突变负荷的检测方法；包括以下步骤：S1：采集肿瘤患者的样本；S2：利用探针捕获或者扩增子技术进行针对人类基因组目标区域的富集；S3：对人基因组中与肿瘤发生发展相关的特定目标基因区域进行测序；S4：针对所有捕获区域，使用生物信息算法，经过样本数据质控、低质量数据过滤、比对参考基因组、变异检测、变异过滤以及变异注释后，获得TDB数值。本发明提供了一种全新的TDB的计算机算法，其中TDB与微卫星不稳定性（Microsatellite Instability，MSI）金标准的检测结果一致性显著高于TMB与MSI检测结果的一致性，可以更好地预测免疫治疗疗效。

Description

一种分子标志物肿瘤缺失突变负荷的检测方法

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及一种分子标志物肿瘤缺失突变负荷的检测方法。

背景技术

近年来，随着生活节奏的加快、生活和工作压力的增大及环境问题的日益严峻，肿瘤患者的数量呈上升趋势，肿瘤是一种发病率和死亡率极高的疾病，给患者和其家属带来了极大的生理痛苦和非常繁重的经济负担。特别是对于晚期肿瘤患者，他们的生活质量极低。为了减轻这类人群的痛苦，改善他们的生活质量，有效延长他们的生命，对他们进行个性化、规范化的对症治疗显得尤为重要。

肿瘤免疫治疗法是肿瘤治疗领域中最具前景的研究方向之一，这种治疗方法能极大地改善晚期肿瘤患者的生存质量，提高它们的生存率。近两年来，多个免疫药物如帕博利珠单抗（Pembrolizumab）等获批用于肿瘤患者的一线治疗。但是免疫治疗整体响应率偏低，寻找一些合适的分子标志物，筛选出免疫治疗的优势人群迫在眉睫。

肿瘤突变负荷(Tumor Mutation Burden，TMB)作为潜在的预测免疫治疗疗效的分子标志物，日益受到临床医生的关注。TMB定义为所评估体细胞基因的目标富集区域中每兆碱基中发生置换和插入/缺失突变的总数。体细胞的突变可转录/表达成RNA/蛋白水平，产生新的抗原、蛋白片段或多肽段等，这些新的蛋白被自身免疫系统识别为非自身抗原，激活T细胞，引起免疫反应。因此，肿瘤突变负荷越高，产生新抗原的概率越高，从而更能被免疫系统识别。当使用了免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitor，ICI）来对抗免疫逃逸的肿瘤细胞，TMB水平越高的患者可能接受免疫治疗效果越好。

为此，提出一种分子标志物肿瘤缺失突变负荷的检测方法，并利用检测出的肿瘤突变负荷准确地预测免疫治疗疗效显得尤为重要，对促进肿瘤对症治疗，减轻患者痛苦和经济负担相当有益。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分子标志物肿瘤缺失突变负荷的检测方法，该方法针对目标捕获区域测序，使用生物信息算法计算每百万个碱基的平均缺失（deletion）的位点个数，获得肿瘤缺失突变负荷（Tumor Deletion mutation Burden,TDB)数值；使用MSIsensor算法作为对比方法，模拟出TDB的阈值，预测免疫治疗疗效；并且TDB与微卫星不稳定性（Microsatellite Instability，MSI）金标准的检测结果一致性显著高于TMB与MSI检测结果的一致性，可以更好地预测免疫治疗疗效。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种分子标志物肿瘤缺失突变负荷的检测方法，包括以下步骤：

S1：采集肿瘤患者的样本；

S2：利用探针捕获或者扩增子技术进行针对人类基因组目标区域的富集；

S3：对人基因组中与肿瘤发生发展相关的特定目标基因区域进行测序；

S4：针对所有捕获区域，使用生物信息算法，经过样本数据质控、低质量数据过滤、比对参考基因组、变异检测、变异过滤以及变异注释后，最终得到可信的插入缺失变异InDel、计算编码区CDS每百万个碱基缺失突变位点的个数过程，获得TDB数值。

具体的，所述S1中肿瘤患者的样本为组织样本或者外周血液样本，其中，所述组织样本包括福尔马林固定、石蜡包埋组织、新鲜组织、冰冻组织以及由前述样本提取的DNA标本；所述外周血液样本包括外周血全血、从外周血中分离的血浆以及从血浆中提取的游离DNA样本。

具体的，所述S3中测序为下一代测序，即为二代测序NGS。

具体的，所述S4中样本数据质控的具体过程包括根据设计的单核苷酸多态性位点，计算肿瘤组织和对照样本是否来自于同一个患者；若肿瘤组织和对照样本质控位点不同，则表示二者来自于不同个体，质控不通过；若肿瘤组织和对照样本质控位点相同，则表示二者来自于相同个体，质控通过。

具体的，所述S4中低质量数据过滤的具体过程包括去除含有接头的序列，去除N含量大于5个的序列，去除碱基平均质量小于15的序列，选择过滤后的数据进行后续分析。

具体的，所述S4中比对参考基因组的具体过程为使用比对软件BWA-MEM比对到参考基因组上，并筛选平均测序深度大于1000X，1000X覆盖率大于95%的序列，以此为质控标准进行后续分析。

具体的，所述S4中变异检测的具体过程为使用变异检测软件mutect2、vardict和varScan，对肿瘤组织和对照样本的数据同时进行变异检测，得到原始体细胞变异检测结果。

具体的，所述S4中变异过滤是对原始体细胞变异检测结果进行过滤，包括以下步骤：a、保留蛋白编码区CDS的突变；b、过滤肿瘤组织中突变频率<5%的位点，过滤支持突变的序列<8条的位点，过滤掉位点深度<50X的位点，过滤掉肿瘤突变频率/对照突变频率<5X的位点；c、过滤由于对比造成的假阳性突变；d、过滤黑名单中存在的位点；e、过滤COSMIC数据库中记录出现次数≥2的位点；f、过滤人群频率数据库中出现频率>5%的位点。

进一步的，本发明涉及的人群频率数据库为1000g2015aug_all、1000g2015aug_eas、1000g2015aug_sas、1000g2015aug_afr、1000g2015aug_amr、1000g2015aug_eur。

具体的，所述S4中变异注释的具体过程为使用软件ANNOVAR、SNPEFF和VEP，对突变位点进行注释，得到基因名称、转录本编号、位点信息、人群频率以及相关疾病信息。

具体的，所述S4中TDB数值的计算公式为TDB=C/S，其中，所述S为计算达到高深度标准的外显子区域大小，所述C为该区域内缺失突变的数量。

进一步的，本发明涉及的一种所述肿瘤缺失突变负荷在预测免疫治疗疗效上的应用，包括如下步骤：

步骤D1：对外显子区域或者特定目标区域的样本集进行数据分析，以MSI检测作为对比方法，通过统计学模型计算出TDB的阈值(cut-off)；阈值可能是与特定癌症种类相关，也可能是与特定癌症种类不相关；

步骤D2：根据统计学模型计算的阈值(cut-off)，将TDB数值判定为对应预测结果。

进一步的，本发明涉及的上述步骤D1中TDB阈值（cut-off），为23个/Mb；TDB<23个/Mb，评价为TDB-Low肿瘤缺失突变负荷低；TDB ≥23个/Mb，评价为TDB-High肿瘤缺失突变负荷高。

进一步的，本发明涉及的上述步骤D2中TDB数值判定为对应预测结果是，TDB-High肿瘤缺失突变负荷高表示患者可能从免疫治疗中获得较大收益；TDB-Low肿瘤缺失突变负荷低表示患者可能无法从免疫中获得较大收益。

本发明的有益效果为：本发明提供了一种全新的TDB的计算机算法，针对目标捕获区域测序，使用生物信息算法计算每百万个碱基的平均缺失（deletion）的位点个数，获得肿瘤缺失突变负荷（Tumor Deletion mutation Burden,TDB)数值；使用MSIsensor算法作为对比方法，模拟出TDB的阈值，预测免疫治疗疗效；并且TDB与微卫星不稳定性（Microsatellite Instability，MSI）金标准的检测结果一致性显著高于TMB与MSI检测结果的一致性，可以更好地预测免疫治疗疗效。

附图说明

图1为本发明实施例1的插入（Insertion）、缺失（deletion）和插入缺失（InDel）数值与MSIsensor score关系图；

图2包括左图和右图，其中左图是缺失（deletion）数值与MSI score的相关性图，右图是插入（Insertion）数值与MSI score的相关性图；

图3包括左图和右图，其中左图是缺失（deletion）数值与MSI分组关系图；右图是插入（Insertion）数值与MSI分组关系图；

图4为本发明实施例1的肿瘤突变负荷（TMB）与缺失（deletion）、插入（insertion）的数值相关性图；

图5为本发明实施例2的缺失（deletion）突变在微卫星不稳定的位点集MSS和微卫星不稳定的位点集MSI-H的分布图；

图6为本发明实施例2的TDB与MSI score的相关性图；

图7为本发明实施例3的一种分子标志物肿瘤缺失突变负荷的检测方法及其在预测免疫治疗疗效上的流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例公开了用MSI的检测来佐证，TDB是否可以用来预测免疫治疗的疗效；样本集为113例胃癌患者的组织样本；测序方式为外显子组测序；选用的分析方法为使用MSIsensor生物信息分析工具计算MSI score；针对外显子区域进行插入（insertion）和缺失（deletion）的突变位点数计算；针对外显子区域进行肿瘤突变负荷（TMB）计算，计算公式为TMB=T/S，其中S为计算达到高深度测序标准的外显子区域大小，T为该区域内体细胞突变的数量，这里的体细胞突变包括编码区域所有非同义突变，但不包括肿瘤基因驱动突变。

由图1可知，Insertion插入、deletion缺失和InDel插入缺失数值与MSI score一致；由图2可知，deletion burden缺失突变负荷与MSI score的数值相关性更高；由图3可知，deletion缺失突变数值在不同MSI分组具有显著差异性，Insertion插入突变数值在不同MSI分组不具有显著差异性；由图4可知，TMB与deletion缺失、insertion插入的数值不具有显著的相关性；以上结果综合说明用MSI的检测来佐证，TDB与MSI的检测结果具有高度一致性，可以用来预测免疫治疗的疗效。

实施例2

本实施例公开了扩大癌种，评估TDB相较TMB是否具有更好的免疫治疗预测效果。样本集：选取TCGA数据库中1561例样本数据，包含结肠癌431例（COAD）、直肠腺癌157例（READ)、子宫内膜癌532例（UCEC）、胃癌441例（STAD）；测序方式：外显子组测序；分析方法：使用MSIsensor生物信息分析工具计算MSI score；针对外显子区域进行insertion插入和deletion缺失的突变位点数计算；使用标准生物信息流程，计算TMB。

由图5可知，deletion缺失突变（被包含于体细胞突变somatic variant）程度在微卫星稳定的位点集MSS和微卫星不稳定的位点集MSI-H中具有明显差异，并且在微卫星不稳定MSI-H的位点集中，deletion缺失突变的程度更高；而非体细胞突变（non-somaticvariant)在微卫星稳定的位点集MSS和微卫星不稳定的位点集MSI-H中没有明显差异；由图6表明扩大癌肿后，与MSI的一致性分析结果显示，TDB的相关性显著高于TMB，提示TDB可能是一种更好的免疫治疗疗效预测指标可用于多癌肿。针对MSI位点的deletion缺失突变程度分析显示，MSI-H位点相较于MSS位点其deletion缺失突变的程度更高，提示deletion缺失突变的程度可能与肿瘤产生新抗原的机制相关，与免疫治疗的疗效可能也具有一定的关联。

实施例3

本实施例公开了针对目标区域捕获的测序方式，评估TDB是否可以作为预测免疫治疗效果的指标；样本集：选取180例肿瘤样本；测序方式：目标区域捕获测序（ChosenOne599Ⓡ）；分析方法：使用MSIsensor生物信息分析工具计算MSI score；针对目标捕获区域区域进行deletion缺失的突变位点数计算；结论：使用目标区域捕获测序方法，与MSI的一致性分析结果显示，TDB可能是一种很好的免疫治疗疗效预测指标；其中，一种分子标志物肿瘤缺失突变负荷的检测方法及其在预测免疫治疗疗效上的流程图见图7。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种分子标志物肿瘤缺失突变负荷的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：采集肿瘤患者的样本，所述S1中肿瘤患者的样本为组织样本或者外周血液样本，其中，所述组织样本包括福尔马林固定、石蜡包埋组织、新鲜组织、冰冻组织以及由前述样本提取的DNA标本；所述外周血液样本包括外周血全血、从外周血中分离的血浆以及从血浆中提取的游离DNA样本；

S4：针对所有捕获区域，使用生物信息算法，经过样本数据质控、低质量数据过滤、比对参考基因组、变异检测、变异过滤以及变异注释后，最终得到可信的插入缺失变异InDel、计算编码区CDS每百万个碱基缺失突变位点的个数过程，获得TDB数值；所述S4中样本数据质控的具体过程包括根据设计的单核苷酸多态性位点，计算肿瘤组织和对照样本是否来自于同一个患者；若肿瘤组织和对照样本质控位点不同，则表示二者来自于不同个体，质控不通过；若肿瘤组织和对照样本质控位点相同，则表示二者来自于相同个体，质控通过；所述S4中低质量数据过滤的具体过程包括去除含有接头的序列，去除N含量大于5个的序列，去除碱基平均质量小于15的序列，选择过滤后的数据进行后续分析；所述S4中比对参考基因组的具体过程为使用比对软件BWA-MEM比对到参考基因组上，并筛选平均测序深度大于1000X，1000X覆盖率大于95%的序列，以此为质控标准进行后续分析；所述S4中变异检测的具体过程为使用变异检测软件mutect2、vardict和varScan，对肿瘤组织和对照样本的数据同时进行变异检测，得到原始体细胞变异检测结果；所述S4中变异过滤是对原始体细胞变异检测结果进行过滤，包括以下步骤：a、保留蛋白编码区CDS的突变；b、过滤肿瘤组织中突变频率<5%的位点，过滤支持突变的序列<8条的位点，过滤掉位点深度<50X的位点，过滤掉肿瘤突变频率/对照突变频率<5X的位点；c、过滤由于对比造成的假阳性突变；d、过滤黑名单中存在的位点；e、过滤COSMIC数据库中记录出现次数≥2的位点；f、过滤人群频率数据库中出现频率>5%的位点；所述S4中变异注释的具体过程为使用软件ANNOVAR、SNPEFF和VEP，对突变位点进行注释，得到基因名称、转录本编号、位点信息、人群频率以及相关疾病信息。

2.根据权利要求1所述的一种分子标志物肿瘤缺失突变负荷的检测方法，其特征在于，所述S3中测序为下一代测序，即为二代测序NGS。

3.根据权利要求1所述的一种分子标志物肿瘤缺失突变负荷的检测方法，其特征在于，所述S4中TDB数值的计算公式为TDB=C/S，其中，所述S为计算达到高深度标准的外显子区域大小，所述C为该区域内缺失突变的数量。