CN111926006B - 一种自组装免标记磁性纳米cyp2c9*3基因探针及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种自组装免标记磁性纳米CYP2C9*3基因探针及其制备方法。该探针为一种Fe3O4/Fe2O3@Au‑PNA/MCH/DNA纳米CYP2C9*3基因探针；该探针可检测浓度的线性范围为1 pM‑1µM，峰值电流范围为55‑89µA，检测限为0.95 pM（S/N=3），定量限为3.18 pM（S/N=10）。本发明制备的纳米DNA探针操作简单、快速、特异性强，检测周期短，所需设备价格低廉，应用性强。
Description
技术领域
本发明涉及一种自组装免标记磁性纳米CYP2C9*3基因探针及其制备方法，属于生物分析技术领域。
背景技术
自2011年美国医学界提出“精准医学”的概念以来，基因检测受到了高度关注。单纯的通过年龄、性别和健康状况等角度出发进行所谓的“个体化用药”已远远不能满足医学需求。遗传因素是导致用药个体化差异的源头，以医疗诊断与基因组学为依据进行“量体裁衣”的用药方式成为新的医疗模式，具有更高的科学性。而精准临床诊断、预防与治疗的关键就是选择精准的分子标记物。
细胞色素P450（CYP450）是参加药物代谢的重要酶类，其表达和功能的遗传差异导致药物和营养吸收、清除的不同。在CYP450的众多亚型中，CYP2C9是第二亚家族的重要成员，占肝脏微粒体CYP450总量的20%。许多临床药物需要CYP2C9代谢，但CYP2C9基因存在多种类型的单碱基突变。其中除野生型CYP2C9*1外，CYP2C9*3基因型是主要基因型，可以影响多种药物的维持剂量。
临床上已开展了CYP2C9*3的基因检测项目，但由于定价相对偏高，应用受到很大限制。传统的基因检测手段耗时长、成本高、检测限高、需要昂贵的仪器。因此，推出一种快速、准确、价格低廉的新型检测手段成为单核苷酸多态性（SNP）检测的迫切需要。
发明内容
为克服现有SNP检测技术手段的缺陷，本发明提供了一种自组装免标记磁性纳米CYP2C9*3基因探针。
本发明另一目的是提供上述探针的制备方法。
本发明还提供上述探针的应用。
本发明的具体技术方案如下：
一种自组装免标记磁性纳米CYP2C9*3基因探针，该探针为一种Fe3O4/Fe2O3@Au-PNA/MCH/DNA纳米CYP2C9*3基因探针；该探针可检测浓度的线性范围为1 pM - 1 µM，峰值电流范围为55-89 µA，检测限为0.95 pM（S/N = 3），定量限为3.18 pM（S/N = 10）。
进一步地，所述探针PNA序列为5’-SH-(CH2)6-GAGATACCTTGACC-3’；靶DNA序列为5’-GGTCAAGGTATCTC-3’。
上述自组装免标记磁性纳米CYP2C9*3基因探针的制备方法，包括以下步骤：
（1）将10 µL Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物悬浊液滴加至磁性玻碳电极表面，待液体干燥后，电极表面形成一层均匀的Fe3O4/Fe2O3@Au膜；
（2）将5 µL包含三（2-羧乙基）膦的巯基修饰的PNA水溶液滴加至电极表面，4oC孵育12 h；
（3）使用3 µL，浓度为1 mM 6-巯基己醇封闭电极表面非特异性位点，阻止非特异性吸附。
进一步地，所述Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物由Fe3O4/Fe2O3异质体纳米棒和氯金酸制备得到，其中Fe3O4/Fe2O3异质体纳米棒的制备方法如下：
将5.40 g FeCl3·6H2O溶解于200 mL双蒸水中，90oC静置搅拌2 h。反应结束后，将悬浊液离心，所得沉淀水洗3次，无水乙醇洗2 次。将沉淀分散于50 mL无水乙醇并转移至坩埚中，点火。待火焰熄灭后，将坩埚转移至程序控温炉中，300oC煅烧2 h，得到Fe3O4/Fe2O3异质体纳米棒。
进一步地，所述Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物的制备方法如下：
a、将190 mL，浓度为4 mM的柠檬酸三钠溶液置于三颈烧瓶中，在磁力搅拌及回流条件下加热至沸腾；
b、将10 mg Fe3O4/Fe2O3异质体纳米棒超声分散于1 mL双蒸水中并滴加至沸腾的柠檬酸三钠溶液中；
c、反应5 min后，滴加10 mL，浓度为10 mM氯金酸溶液，反应至溶液变为紫红色；将溶液离心，并将沉淀物水洗五次，干燥，即得Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物。
进一步地，步骤（1）中所述的Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物悬浊液的浓度为5-25 mg/mL。
进一步地，步骤（2）中所述巯基修饰的PNA浓度为0.8-1.8 µM。
上述自组装免标记磁性纳米CYP2C9*3基因探针的应用。
在检测靶DNA方面的应用，检测时，
将靶DNA溶液滴加至电极表面，在40-80oC温度下孵育5-60 min，使其与PNA通过碱基互补配对原则相结合；
在包含浓度为0.1 M KCl和浓度为5 mM [Fe(CN)6]3-/4-的水溶液中，利用电化学工作站进行差分脉冲伏安法检测；
进一步地，靶DNA溶液的体积为5 µL，浓度为1 pM - 1 µM。
本发明具有如下有益效果：
1.本发明针对现有检测技术，提供一种自组装免标记磁性纳米CYP2C9*3基因探针，弥补了现有SNP检测技术手段的缺陷，提供一种高效、快速、价格低廉、特异性强、实用性好的CYP2C9*3基因多态性检测探针；
2.本发明将Fe3O4/Fe2O3@Au棒状纳米复合物用于信号放大策略，更好地对靶DNA进行检测，有较低的检测限（0.95 pM）、较广的线性范围（1 pM - 1 µM）以及较好的灵敏度；
3.Fe3O4/Fe2O3@Au棒状纳米复合物具有磁性，可通过磁力诱导自组装技术将Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物修饰至电极表面；对所需设备要求不高，操作简单，方便携带；
4. 本发明通过自组装技术将巯基修饰的PNA通过Au-S键连接至Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物表面，操作快速、简单，不需使用其余材料；
5.该基因探针无需标记，无需预处理，不会造成靶DNA损伤；检测过程快速，便捷，几分钟即可得到检测结果；
6.该基因探针引入肽核酸（PNA），PNA比DNA具有更强的亲和性、稳定性和特异性，显著增强了探针检测靶DNA的特异性，甚至可识别单碱基错配DNA；
7.每次检测所需探针量极少，成本低廉；反应条件温和，过程容易控制，无需对操作人员进行培训。
附图说明
图1为实施例1制备的Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物的透射电镜照片，其中图中标尺大小为100 nm；
图2为实施例1中磁性Fe3O4/Fe2O3@Au-PNA/MCH/DNA纳米CYP2C9*3基因探针制备过程的循环伏安法图；
图3为实施例1中磁性Fe3O4/Fe2O3@Au-PNA/MCH/DNA纳米CYP2C9*3基因探针制备过程的交流阻抗谱图；
图4为实施例1中磁性Fe3O4/Fe2O3@Au-PNA/MCH/DNA纳米CYP2C9*3基因探针检测靶DNA、单碱基错配DNA，双碱基错配DNA，完全不匹配DNA的峰值电流。
图5为实施例1中磁性Fe3O4/Fe2O3@Au-PNA/MCH/DNA纳米CYP2C9*3基因探针所能检测的浓度及线性范围图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图内容对本发明作进一步的阐述，以使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案。
以下实例中：
三（2-羧乙基）膦，简称TCEP；6-巯基己醇，简称MCH；
靶DNA序列从生工生物工程（上海）股份有限公司购买，靶DNA序列为5’-GGTCAAGGTATCTC-3’；
巯基修饰的PNA溶液从杭州泰禾生物技术有限公司购买，探针PNA序列为5’-SH-(CH2)6-GAGATACCTTGACC-3’。
准备实例：Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物的制备
1）将5.40 g FeCl3·6H2O溶解于200 mL双蒸水中，90oC静置搅拌2 h。反应结束后，将悬浊液离心，所得沉淀水洗3次，无水乙醇洗2 次。将沉淀分散于50 mL无水乙醇并转移至坩埚中，点火。待火焰熄灭后，将坩埚转移至程序控温炉中，300oC煅烧2 h，得到Fe3O4/Fe2O3异质体纳米棒；
2）将190 mL，4 mM的柠檬酸三钠溶液置于三颈烧瓶中，在磁力搅拌及回流条件下加热至沸腾。将10 mg Fe3O4/Fe2O3纳米棒超声分散于1 mL双蒸水中并滴加至沸腾的柠檬酸三钠溶液中，反应5 min。反应结束后，滴加10 mL，10 mM氯金酸溶液，反应至溶液变为紫红色。将悬浊液离心，并将沉淀物水洗五次，干燥，即得Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物。
图1为本实施例所述条件下制备的Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物的透射电镜照片；从电镜照片中可以看出，Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物的平均长度为190 nm，平均直径为46 nm，金壳厚度约为9 nm。
实施例1
本发明的Fe3O4/Fe2O3@Au-PNA/MCH/DNA纳米CYP2C9*3基因探针的制备：
1）将准备实例制备的Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物超声分散于超纯水中，配制成浓度为15 mg/mL Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物混悬液，备用；
2）将10 µL，浓度为15 mg/mL Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物悬浊液滴加至磁性玻碳电极（MGCE）表面，待液体干燥后，电极表面形成一层均匀的Fe3O4/Fe2O3@Au膜。
3）将浓度为48 µM的TCEP与浓度为1.6 µM巯基修饰的PNA水溶液混合，制得包含TCEP的巯基修饰的PNA溶液，备用；
4）将3）中5 µL包含TCEP的巯基修饰的PNA溶液滴加至电极表面，4oC孵育12 h。
5）使用3 µL，浓度为1 mM MCH封闭电极表面非特异性位点，阻止非特异性吸附。即得自组装免标记磁性Fe3O4/Fe2O3@Au-PNA/MCH/DNA纳米CYP2C9*3基因探针。
检测过程如下：
1）将5 µL，浓度为1 µM靶DNA溶液滴加至实施例一制得修饰的电极表面，70oC孵育30 min，使其与PNA通过碱基互补配对原则相结合。
2）在包含浓度为0.1 M KCl和浓度为5 mM [Fe(CN)6]3-/4-的水溶液中，利用电化学工作站（上海辰华仪器有限公司购买，CHI660E）进行循环伏安法（CV）和差分脉冲伏安法（DPV）检测。
3）在包含浓度为0.1 M KCl和浓度为5 mM [Fe(CN)6]3-/4-的PBS溶液中，利用电化学工作站（上海辰华仪器有限公司购买，CHI660E）进行交流阻抗谱（EIS）检测，DPV测量所得峰值电流为89 µA。
图2的本实施例所述条件下磁性Fe3O4/Fe2O3@Au-PNA/MCH/DNA纳米CYP2C9*3基因探针制备过程的循环伏安法图中，从a-f分别为裸电极、Fe3O4/Fe2O3、Fe3O4/Fe2O3@Au、Fe3O4/Fe2O3@Au-PNA、Fe3O4/Fe2O3@Au-PNA/MCH、Fe3O4/Fe2O3@Au-PNA/MCH/DNA的循环伏安曲线；从图中可以看出，Fe3O4/Fe2O3修饰Au后峰值电流增加，是由于Au良好的导电性能；d和e的峰值电流减小，是由于PNA和MCH的空间位阻；Fe3O4/Fe2O3@Au-PNA/MCH/DNA峰值电流减小，是因为DNA的空间位阻以及DNA带负电荷产生静电斥力。
图3的本实施例所述条件下磁性Fe3O4/Fe2O3@Au-PNA/MCH/DNA纳米CYP2C9*3基因探针制备过程的交流阻抗谱图中，从a-f分别为裸电极、Fe3O4/Fe2O3、Fe3O4/Fe2O3@Au、Fe3O4/Fe2O3@Au-PNA、Fe3O4/Fe2O3@Au-PNA/MCH、Fe3O4/Fe2O3@Au-PNA/MCH/DNA的交流阻抗谱图；从图中可以看出，Fe3O4/Fe2O3@Au的电子转移电阻减小；d-f的电子转移电阻依次增加，与图2所述结果一致，证明Fe3O4/Fe2O3@Au-PNA/MCH/DNA纳米探针制备成功。
图4为本实施例所述条件下中磁性Fe3O4/Fe2O3@Au-PNA/MCH/DNA纳米CYP2C9*3基因探针检测靶DNA（tDNA）、单碱基错配DNA（smDNA），双碱基错配DNA（dmDNA），完全不匹配DNA（comDNA）的峰值电流。将靶DNA序列分别替换一个碱基、两个碱基和全部碱基得到smDNA、dmDNA和comDNA；实验过程与实施例中一致，只将靶DNA分别用smDNA、dmDNA和comDNA进行替换即可。从图中可以看出，该纳米探针的选择性较好，可较好地识别单碱基错配序列，具有良好的选择性。
图5为本实施例所述条件下磁性Fe3O4/Fe2O3@Au-PNA/MCH/DNA纳米CYP2C9*3基因探针所能检测的浓度及线性范围图。从图中可以看到，该纳米探针所能检测的浓度为1 pM- 1 µM，峰值电流范围为55-89 µA，通过线性拟合数据计算可得检测限为0.95 pM（S/N =3），定量限为3.18 pM（S/N = 10）。
实施例2
本发明的Fe3O4/Fe2O3@Au-PNA/MCH/DNA纳米CYP2C9*3基因探针的制备：
1）将上述准备实例制备的Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物超声分散于超纯水中，配制成浓度为13 mg/mL Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物混悬液；
2）将10 µL，13 mg/mL Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物悬浊液滴加至磁性玻碳电极（MGCE）表面，待液体干燥后，电极表面形成一层均匀的Fe3O4/Fe2O3@Au膜。
3）将浓度为48 µM的TCEP与浓度为0.8 µM巯基修饰的PNA水溶液混合，制得包含TCEP的巯基修饰的PNA溶液。
4）取5 µL上述包含TCEP的巯基修饰的PNA溶液滴加至电极表面，4oC孵育12 h。
5）使用3 µL，浓度为1 mM MCH封闭电极表面非特异性位点，阻止非特异性吸附。
检测时，将5 µL，浓度为50 nM靶DNA溶液滴加至电极表面，40oC孵育5 min，使其与PNA通过碱基互补配对原则相结合。
在包含浓度为0.1 M KCl和浓度为5 mM [Fe(CN)6]3-/4-的水溶液中，利用电化学工作站（上海辰华仪器有限公司购买，CHI660E）进行差分脉冲伏安法（DPV）检测，DPV测量所得峰值电流为67 µA。
实施例3
本发明的Fe3O4/Fe2O3@Au-PNA/MCH/DNA纳米CYP2C9*3基因探针的制备：
1）将上述准备实例制备的Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物超声分散于超纯水中，配制成浓度为5 mg/mL Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物混悬液；
2）将10 µL，5 mg/mL Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物悬浊液滴加至磁性玻碳电极（MGCE）表面，待液体干燥后，电极表面形成一层均匀的Fe3O4/Fe2O3@Au膜。
3）将浓度为48 µM的TCEP与浓度为1.6 µM巯基修饰的PNA水溶液混合，制得包含TCEP的巯基修饰的PNA溶液，备用。
4）取5 µL上述包含TCEP的巯基修饰的PNA溶液滴加至电极表面，4oC孵育12 h。
5）使用3 µL，浓度为1 mM MCH封闭电极表面非特异性位点，阻止非特异性吸附。
检测时，将5 µL，浓度为10 nM靶DNA溶液滴加至电极表面，45oC孵育60 min，使其与PNA通过碱基互补配对原则相结合。
在包含浓度为0.1 M KCl和浓度为5 mM [Fe(CN)6]3-/4-的水溶液中，利用电化学工作站（上海辰华仪器有限公司购买，CHI660E）进行差分脉冲伏安法（DPV）检测，DPV测量所得峰值电流为73 µA。
实施例4
本发明的Fe3O4/Fe2O3@Au-PNA/MCH/DNA纳米CYP2C9*3基因探针的制备：
1）将上述准备实例制备的Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物超声分散于超纯水中，配制成浓度为25 mg/mL Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物混悬液；
2）将10 µL，25 mg/mL Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物悬浊液滴加至磁性玻碳电极（MGCE）表面，待液体干燥后，电极表面形成一层均匀的Fe3O4/Fe2O3@Au膜。
3）将浓度为48 µM的TCEP与浓度为1.0 µM巯基修饰的PNA水溶液混合，制得包含TCEP的巯基修饰的PNA溶液。
4）取5 µL包含TCEP的巯基修饰的PNA溶液滴加至电极表面，4oC孵育12 h。
5）使用3 µL，1 mM MCH封闭电极表面非特异性位点，阻止非特异性吸附。
检测时，将5 µL，浓度为1 nM靶DNA溶液滴加至电极表面，50oC孵育40 min，使其与PNA通过碱基互补配对原则相结合。
在包含浓度为0.1 M KCl和浓度为5 mM [Fe(CN)6]3-/4-的水溶液中，利用电化学工作站（上海辰华仪器有限公司购买，CHI660E）进行差分脉冲伏安法（DPV）检测，DPV测量所得峰值电流为58 µA。
实施例5
本发明的Fe3O4/Fe2O3@Au-PNA/MCH/DNA纳米CYP2C9*3基因探针的制备：
1）将上述准备实例制备的Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物超声分散于超纯水中，配制成浓度为10 mg/mL Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物混悬液，备用；
2）将10 µL，10 mg/mL Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物悬浊液滴加至磁性玻碳电极（MGCE）表面，待液体干燥后，电极表面形成一层均匀的Fe3O4/Fe2O3@Au膜。
3）将浓度为48 µM的TCEP与浓度为1.5 µM巯基修饰的PNA水溶液混合，制得包含TCEP的巯基修饰的PNA溶液，备用。
4）取5 µL上述包含TCEP（48 µM）的巯基修饰的PNA溶液滴加至电极表面，4oC孵育12 h。
5）使用3 µL，浓度为1 mM MCH封闭电极表面非特异性位点，阻止非特异性吸附。
检测时，将5 µL，浓度为1 pM靶DNA溶液滴加至电极表面，80oC孵育10 min，使其与PNA通过碱基互补配对原则相结合。
在包含浓度为0.1 M KCl和浓度为5 mM [Fe(CN)6]3-/4-的水溶液中，利用电化学工作站（上海辰华仪器有限公司购买，CHI660E）进行差分脉冲伏安法（DPV）检测，DPV测量所得峰值电流为81 µA。
实施例6
本发明的Fe3O4/Fe2O3@Au-PNA/MCH/DNA纳米CYP2C9*3基因探针的制备：
1）将上述准备实例制备的Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物超声分散于超纯水中，配制成浓度为8 mg/mL Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物混悬液，备用；
2）将10 µL，8 mg/mL Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物悬浊液滴加至磁性玻碳电极（MGCE）表面，待液体干燥后，电极表面形成一层均匀的Fe3O4/Fe2O3@Au膜。
3）将浓度为48 µM的TCEP与浓度为1.2 µM巯基修饰的PNA水溶液混合，制得包含TCEP的巯基修饰的PNA溶液，备用。
4）取5 µL上述包含TCEP的巯基修饰的PNA溶液滴加至电极表面，4oC孵育12 h。
5）使用3 µL，浓度为1 mM MCH封闭电极表面非特异性位点，阻止非特异性吸附。
检测时，将5 µL，浓度为100 nM靶DNA溶液滴加至电极表面，65oC孵育50 min，使其与PNA通过碱基互补配对原则相结合。
在包含浓度为0.1 M KCl和浓度为5 mM [Fe(CN)6]3-/4-的水溶液中，利用电化学工作站（上海辰华仪器有限公司购买，CHI660E）进行差分脉冲伏安法（DPV）检测，DPV测量所得峰值电流为55 µA。
实施例7
本发明的Fe3O4/Fe2O3@Au-PNA/MCH/DNA纳米CYP2C9*3基因探针的制备：
1）将上述准备实例制备的Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物超声分散于超纯水中，配制成浓度为20 mg/mL Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物混悬液，备用；
2）将10 µL，20 mg/mL Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物悬浊液滴加至磁性玻碳电极（MGCE）表面，待液体干燥后，电极表面形成一层均匀的Fe3O4/Fe2O3@Au膜。
3）将浓度为48 µM的TCEP与浓度为1.8 µM巯基修饰的PNA水溶液混合，制得包含TCEP的巯基修饰的PNA溶液。
4）取5 µL上述包含TCEP的巯基修饰的PNA溶液滴加至电极表面，4oC孵育12 h。
5）使用3 µL，1 mM MCH封闭电极表面非特异性位点，阻止非特异性吸附。
检测时，将5 µL，10 µM靶DNA溶液滴加至电极表面，60oC孵育25 min，使其与PNA通过碱基互补配对原则相结合。
在包含浓度为0.1 M KCl和浓度为5 mM [Fe(CN)6]3-/4-的水溶液中，利用电化学工作站（上海辰华仪器有限公司购买，CHI660E）进行差分脉冲伏安法（DPV）检测，DPV测量所得峰值电流为63 µA。
实施例8
本发明的Fe3O4/Fe2O3@Au-PNA/MCH/DNA纳米CYP2C9*3基因探针的制备：
1）将上述准备实例制备的Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物超声分散于超纯水中，配制成浓度为19 mg/mL Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物混悬液，备用；
2）将10 µL，19 mg/mL Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物悬浊液滴加至磁性玻碳电极（MGCE）表面，待液体干燥后，电极表面形成一层均匀的Fe3O4/Fe2O3@Au膜。
3）将浓度为48 µM的TCEP与浓度为1.4 µM巯基修饰的PNA水溶液混合，制得包含TCEP的巯基修饰的PNA溶液，备用。
4）取5 µL上述包含TCEP的巯基修饰的PNA溶液滴加至电极表面，4oC孵育12 h。
5）使用3 µL，浓度为1 mM MCH封闭电极表面非特异性位点，阻止非特异性吸附。
检测时，将5 µL，浓度为100 µM靶DNA溶液滴加至电极表面，75oC孵育20 min，使其与PNA通过碱基互补配对原则相结合。
在包含浓度为0.1 M KCl和浓度为5 mM [Fe(CN)6]3-/4-的水溶液中，利用电化学工作站（上海辰华仪器有限公司购买，CHI660E）进行差分脉冲伏安法（DPV）检测，DPV测量所得峰值电流为78 µA。
Claims (6)
1.一种自组装免标记磁性纳米CYP2C9*3基因探针，其特征在于，该探针为一种Fe3O4/Fe2O3@Au-PNA/MCH/DNA纳米CYP2C9*3基因探针；该探针可检测浓度的线性范围为1 pM - 1µM，峰值电流范围为55-89 µA，检测限为0.95 pM，S/N = 3，定量限为3.18 pM，S/N = 10；
所述探针PNA序列为5’-SH-(CH2)6-GAGATACCTTGACC-3’；靶DNA序列为5’-GGTCAAGGTATCTC-3’；
该自组装免标记磁性纳米CYP2C9*3基因探针的制备方法，包括以下步骤：
（1）将10 µL Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物悬浊液滴加至磁性玻碳电极表面，待液体干燥后，电极表面形成一层均匀的Fe3O4/Fe2O3@Au膜；
（2）将5 µL包含三（2-羧乙基）膦的巯基修饰的PNA水溶液滴加至电极表面，4℃孵育12h；
（3）使用3 µL，浓度为1 mM 6-巯基己醇封闭电极表面非特异性位点，阻止非特异性吸附；
所述Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物由Fe3O4/Fe2O3异质体纳米棒和氯金酸制备得到，其中Fe3O4/Fe2O3异质体纳米棒的制备方法如下：
将5.40 g FeCl3·6H2O溶解于200 mL双蒸水中，90℃静置搅拌2 h；反应结束后，将悬浊液离心，所得沉淀水洗3次，无水乙醇洗2 次；将沉淀分散于50 mL无水乙醇并转移至坩埚中，点火；待火焰熄灭后，将坩埚转移至程序控温炉中，300℃煅烧2 h，得到Fe3O4/Fe2O3异质体纳米棒；
所述Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物的制备方法如下：
a、将190 mL，浓度为4 mM的柠檬酸三钠溶液置于三颈烧瓶中，在磁力搅拌及回流条件下加热至沸腾；
b、将10 mg Fe3O4/Fe2O3异质体纳米棒超声分散于1 mL双蒸水中并滴加至沸腾的柠檬酸三钠溶液中；
c、反应5 min后，滴加10 mL，浓度为10 mM氯金酸溶液，反应至溶液变为紫红色；将溶液离心，并将沉淀物水洗五次，干燥，即得Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物。
2.根据权利要求1所述的自组装免标记磁性纳米CYP2C9*3基因探针，其特征在于，步骤（1）中所述的Fe3O4/Fe2O3@Au纳米复合物悬浊液的浓度为5-25 mg/mL。
3.根据权利要求1所述的自组装免标记磁性纳米CYP2C9*3基因探针，其特征在于，步骤（2）中所述的巯基修饰的PNA浓度为0.8-1.8 µM。
4.权利要求1-3任一所述的自组装免标记磁性纳米CYP2C9*3基因探针在制备CYP2C9*3基因多态性检测试剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的基因探针在制备CYP2C9*3基因多态性检测试剂中的应用，检测过程如下：将靶DNA溶液滴加至电极表面，在40-80℃温度下孵育5-60 min，使其与PNA通过碱基互补配对原则相结合；在包含浓度为0.1 M KCl和浓度为5 mM [Fe(CN)6]3-/4-的水溶液中，利用电化学工作站进行差分脉冲伏安法检测。
6.根据权利要求5所述的基因探针在制备CYP2C9*3基因多态性检测试剂中的应用，其中靶DNA溶液的体积为5 µL，浓度为1 pM - 1 µM。
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