CN111925419B - 一种多肽作为嗅觉受体Olfr109拮抗剂配体的应用 - Google Patents
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Abstract
本公开属于抗代谢性疾病药物技术领域，具体涉及一种多肽作为嗅觉受体Olrfr109拮抗剂配体的应用。现有研究表明，嗅觉受体Olfr109在血糖稳态维持方面具有重要的作用，对胰岛素分泌水平也具有影响。基于该研究背景，本公开提供了一种针对嗅觉受体Olfr109的拮抗剂配体，该多肽可通过与Olfr109的结合抑制下游Gi，β‑arrestin1及β‑arrestin2信号通路，可用于制备代谢性疾病模型药物，拮抗剂的功能是缓解由于Olfr109的过度激活而导致的胰岛素分泌障碍，促进胰岛素分泌，作为良好的临床药物或研究工具，具有推广意义。
Description
技术领域
本公开属于抗代谢性疾病药物技术领域，具体涉及一段多肽作为嗅觉受体Olfr109拮抗剂配体及Gi、β-arrestin-1和β-arrestin-2信号通路抑制剂的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
糖尿病是以血糖升高为特征的代谢性疾病，胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗是糖尿病发生的关键因素。目前临床常用降糖药物，如双胍类、噻唑烷二酮类和磺脲类药物等，虽然短期疗效显著，但长期使用通常伴有多种副作用，如胃肠不适和骨质疏松等。因此，新型有效且安全的糖尿病治疗方法亟待建立。
嗅觉受体基因是脊椎动物中最大的基因超家族，其编码的嗅觉受体属于七次跨膜的G蛋白偶联受体。人类具有约350种功能性嗅觉受体，主要分布在鼻腔内的嗅觉上皮细胞，通过结合不同的气味分子，使机体产生嗅觉(Zhang and Firestein,2002；Young,et al.,2002)。最近的研究表明，嗅觉受体除了具有调控嗅觉的功能之外，还在机体的能量稳态维持过程中起到关键作用。例如嗅觉受体OR1A1在肝细胞中表达，被配体香芹酮(carvone)激活后，可以降低肝细胞内甘油三酯水平和脂肪堆积(Wu,et al.,2015)。而另一种在肝脏中表达的嗅觉受体OLFR734，通过结合其配体白脂素(asprosin)，促进肝脏葡萄糖生成，对于空腹和肥胖状态的血糖稳态具有重要的调控作用(Li,et al.,2019)。
发明人研究团队前期研究结果，嗅觉受体Olfr109在糖尿病模型小鼠的胰岛中的表达水平相较于野生小鼠均呈现显著差异，表明Olfr109是血糖稳态维持过程中的关键因子。在小鼠整体水平、小鼠离体胰岛水平以及MIN6小鼠胰岛β细胞系中，Olfr109激活均可以显著抑制由高糖引起的胰岛素分泌，启示Olfr109在血糖调控中具有重要作用。
发明内容
基于上述研究背景，发明人认为嗅觉受体Olfr109是治疗糖尿病等内分泌代谢疾病的新型靶点。针对性发展Olfr109的特异性拮抗剂，有望开发成为糖尿病等内分泌代谢疾病的治疗药物。
本公开第一方面，提供一种多肽，所述多肽具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
本公开第二方面，提供一种基因序列，所述基因序列：
(1)用于编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(2)用于编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列；
优选的，所述修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或糖基化。
本公开第三方面，提供一种表达盒，所述表达盒包含第二方面所述基因序列。
本公开第四方面，提供一种重组载体，所述重组载体中包括第三方面所述表达盒或第二方面所述基因序列的完整编码阅读框序列。
优选的，所述载体为质粒或病毒载体。
进一步优选的，所述病毒载体为慢病毒载体、腺相关病毒载体或腺病毒载体。
本公开第五方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒包括第二方面所述基因序列、第三方面所述表达盒或第四方面所述的重组载体。
本公开第六方面，提供第一方面所述多肽为Olfr109拮抗剂配体的应用。
本公开第七方面，提供第一方面所述多肽、第二方面所述基因序列、第三方面所述表达盒、第四方面所述重组载体或第五方面所述试剂盒作为Gi、β-arrestin-1或β-arrestin-2拮抗剂的应用。
优选的，所述应用包括在制备代谢性疾病模型药剂中的应用。
进一步的，所述代谢性疾病为糖尿病、肥胖症等。
发明人研究团队的在先研究证实了，β-arrestin-1和β-arrestin-2与胰岛素信号通路具有密切的联系，对胰岛素信号传递、胰岛素代谢功能及胰岛素β细胞的凋亡等多个方面具有重要的作用。本公开提供了嗅觉受体Olfr109在胰岛素代谢通路中的应用，明确了Olfr109作为糖尿病作用靶点的机制，启示针对Olfr109开发的激动剂或抑制剂有望通过调节Gi、β-arrestin-1或β-arrestin-2产生相应的效果。
本公开研究结果证实了第一方面所述多肽能够与Olfr109产生特异性结合并对Olfr109产生拮抗作用，抑制下游Gi、β-arrestin-1或β-arrestin-2信号通路的表达，提供了该多肽可作为Olfr109拮抗剂配体，通过抑制β-arrestin-1或β-arrestin-2，用于制备模型动物、缓解Olfr109过度激活引发的胰岛素分泌障碍或抗代谢性药物评价实验等方面。
与现有技术相比，本公开的有益效果是：
本公开通过筛选提供了对嗅觉受体Olfr109具有拮抗作用的配体多肽，基于目前研究提供了Olfr109在胰岛素信号通路及糖尿病等代谢性疾病中的作用，本领域技术人员可通过该拮抗剂配体多肽实现对Olfr109及下游通路的调节作用，是一种特异性良好且成本经济的工具。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1为实施例1中多肽拮抗嗅觉受体Olfr109下游Gi信号通路效果图；
图2为实施例1中多肽拮抗嗅觉受体Olfr109下游β-arrestin-1信号通路效果图；
图3为实施例1中多肽拮抗嗅觉受体Olfr109下游β-arrestin-2信号通路效果图；
图4为实施例1中多肽缓解由嗅觉受体Olfr109激活而引发的胰岛素分泌障碍效果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有研究表明嗅觉受体Olfr109是血糖稳态维持的关键因子，与胰岛素的分泌具有密切的联系。本公开提出了一种针对嗅觉受体Olfr109的拮抗剂配体。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。
实施例1多肽特异性拮抗Olfr109下游信号通路并抑制Olfr109功能
实验步骤：
1.采用431A肽合成器(Perkin Elmer)合成下述多肽：
Arg-Phe-Val-Ala-Ile-Cys-Ser-Pro-Leu-Arg-Tyr-Thr-Ala-Ile-Met
2.采用分子生物学方法，构建基因重组的Olfr109重组质粒，以HEK293细胞过表达Olfr109，利用Glosensor方法可以检测第二信使cAMP的原理，以腺苷酸环化酶的激动剂Forskolin刺激细胞产生cAMP，同时给予Olfr109的激动剂InsB刺激，以引起细胞内cAMP浓度降低的程度来表征Olfr109下游Gi信号通路的激活，在此基础上给予多肽拮抗剂，以细胞内cAMP浓度的恢复程度来表征多肽对于Olfr109下游Gi信号通路的拮抗作用；利用Olfr109与β-arrestin-1的生物发光共振能量转移方法可以检测Olfr109对β-arrestin-1招募的原理，以Olfr109激动剂InsB刺激引起生物发光共振能量转移，在此基础上给予多肽拮抗剂，以生物发光共振能量转移的抑制程度表征多肽对于Olfr109下游β-arrestin-1信号通路的拮抗作用；利用Olfr109与β-arrestin-2的生物发光共振能量转移方法可以检测Olfr109对β-arrestin-2招募的原理，以Olfr109激动剂InsB刺激引起生物发光共振能量转移，在此基础上给予多肽拮抗剂，以生物发光共振能量转移的抑制程度表征多肽对于Olfr109下游β-arrestin-2信号通路的拮抗作用。
3.缓解胰岛素分泌实验原理。
胰岛在高糖刺激下胰岛素分泌量明显增加，激动剂insB作用于olfr109激活下游Gi信号通路抑制cAMP水平从而抑制胰岛素的分泌，在此基础上给予多肽拮抗剂，从而恢复配体insB作用于受体引起的cAMP水平的下降来表征多肽对于Olfr109下游Gi信号通路的拮抗作用，从而缓解配体作用下的胰岛素分泌的减少。
将待测多肽拮抗剂用PBS配制成工作浓度为10-11M、10-10M、10-9M、10-8M、10-7M、3*10-7M、10-6M、3*10-6M、10-5M，在过表达Olfr109和Glosensor的HEK293细胞中，在给予10mMForskolin刺激的基础上，给予不同浓度(10-11-10-5M)的多肽拮抗剂预孵育，在给予100nM配体insB刺激，阴性对照为表达空载体pcDNA和Glosensor的HEK293细胞，利用多功能酶标仪实时记录荧光值，对结果进行统计分析作图，结果见图1。
将待测多肽拮抗剂用PBS配制成工作浓度为10-11M、10-10M、10-9M、10-8M、10-7M、10- 6M、10-5M，在过表达Olfr109和β-arrestin-1的HEK293细胞中，给予不同浓度(10-11-10-5M)的多肽拮抗剂预孵育，37℃恒温孵育5分钟，然后用激动剂insB刺激，37℃恒温孵育10分钟，利用Mithras LB 940检测，对结果进行统计分析作图，结果见图2。
将待测多肽拮抗剂用PBS配制成工作浓度为10-11M、10-10M、10-9M、10-8M、10-7M、10- 6M、10-5M，在过表达Olfr109和β-arrestin-2的HEK293细胞中，给予不同浓度(10-11-10-5M)的多肽拮抗剂预孵育，37℃恒温孵育5分钟，然后用激动剂insB刺激，37℃恒温孵育10分钟，利用Mithras LB 940检测，对结果进行统计分析作图，结果见图3。
将待测胰岛均分4组，每组30个，MKRBB缓冲液饥饿胰岛半小时；对照组为3mM葡萄糖MKRBB，实验组分别为：20mM葡萄糖MKRBB，20mM葡萄糖MKRBB给予激动剂insB刺激；20mM葡萄糖MKRBB给予多肽拮抗剂预孵育后再用激动剂insB刺激，刺激时间10分钟。取上清，稀释5倍后用elisa试剂盒检测胰岛素分泌情况，多功能酶标仪检测发光值，对结果进行统计分析图，结果见图4。
实验结果表明，多肽化合物能够有效拮抗嗅觉受体Olfr109下游Gi，β-arrestin-1和β-arrestin-2信号通路，其中拮抗Gi信号通路的半数抑制浓度EC50为240.4nM，拮抗β-arrestin-1信号通路的半数抑制浓度EC50为237.2nM，拮抗β-arrestin-2信号通路的半数抑制浓度EC50为344.6nM。
上述实验结果表明本发明提供的多肽能够靶向Olfr109成为其特异性拮抗剂，有效拮抗Olfr109下游的Gi，β-arrestin-1和β-arrestin-2信号通路，并能有效缓解由Olfr109激活而导致的胰岛素分泌障碍。从而本申请提供了有前景的化合物，可构成干预糖尿病等内分泌代谢性疾病用药的基础。
以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> 一种多肽作为嗅觉受体Olfr109拮抗剂配体的应用
<130> 2010
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Arg Phe Val Ala Ile Cys Ser Pro Leu Arg Tyr Thr Ala Ile Met
1 5 10 15
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
N-pal-Arg Phe Val Ala Ile Cys Ser Pro Leu Arg Tyr Thr Ala Ile Met-NH2
1 5 10 15
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgatttgtgg ccatctgcag cccacttcgc tacactgcta tcatg 45
Claims (9)
1.一种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种基因序列，其特征在于，所述基因序列为：用于编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的一种基因序列，其特征在于，所述修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化或糖基化。
4.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求2所述基因序列。
5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体中包括权利要求4所述表达盒或权利要求2所述基因序列的完整编码阅读框序列。
6.如权利要求5所述的一种重组载体，其特征在于，所述载体为质粒或病毒载体。
7.如权利要求6所述的一种重组载体，其特征在于，所述病毒载体为慢病毒载体、腺相关病毒载体或腺病毒载体。
8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述基因序列、权利要求4所述表达盒或权利要求5所述的重组载体。
9.权利要求1所述多肽作为Olfr109拮抗剂配体的应用，所述应用用于拮抗Gi、β-arrestin-1或β-arrestin-2信号通路，所述应用不包括疾病的诊断和治疗。
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