CN111905086A - 保育仔猪用的复方中草药粉剂、其制备方法、饲料及应用 - Google Patents

保育仔猪用的复方中草药粉剂、其制备方法、饲料及应用 Download PDF

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Abstract

本发明适用于保育仔猪养殖技术领域，提供了一种保育仔猪用的复方中草药粉剂、其制备方法、饲料及应用，该复方中草药粉剂包括以下组分：饴糖、芍药、桂枝、生姜、炙甘草、大枣、白术、苍术、黄连、茯苓。将本复方中草药粉剂添加到保育仔猪的基础日粮中，可以促进保育仔猪对基础日粮营养的吸收，并可以显著提高保育仔猪对养分的表观消化率和生长性能，同时还可以降低保育仔猪结肠和盲肠的pH，下调结肠TLR4/MyD88/NF‑κB炎症通路，改善肠道菌群多样性和结构，提高肠道有益菌属丰度以及降低有害菌属丰度，从而缓解肠道炎症反应，降低保育仔猪腹泻率。此复方中草药粉剂在生猪生产中具有较好的推广前景。

Description

保育仔猪用的复方中草药粉剂、其制备方法、饲料及应用
技术领域
本发明属于保育仔猪养殖技术领域，尤其涉及一种保育仔猪用的复方中草药粉剂、其制备方法、饲料及应用。
背景技术
保育仔猪是猪生长发育的重要阶段，其生长发育快、对疾病的易感性高等特点，保育仔猪断奶后易产生应急综合征，表现为腹泻、拒食和生长停滞，所以需要精心喂养。其中保育仔猪因肠道发育不完全，且易受到病原微生物的侵害而产生肠道炎症而发生腹泻。上述问题以往都是采用饲料中添加抗生素解决的，但是中国农业部从2017年开始逐步减少饲料中添加抗生素的种类和剂量并计划到2020年禁止将抗生素作为饲料添加剂使用。因此，利用科学手段生产出可代替抗生素缓解保育仔猪肠道炎症和腹泻率是亟待解决的重要问题。
虽然近年来，中草药因其资源丰富、疗效显著、毒副作用少等优势在替代抗生素研究中取得一定效果。但是对于其作用机理依然存在许多疑惑。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种保育仔猪用的复方中草药粉剂，旨在解决背景技术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的，一种保育仔猪用的复方中草药粉剂，其包括以下按照重量份计的组分：饴糖15~30份、芍药8~20份、桂枝8~20份、生姜2~10份、炙甘草1~8份、大枣1~8份、白术5~15份、苍术8~20份、黄连1~8份、茯苓5~15份。
作为本发明实施例的一种优选方案，所述复方中草药粉剂包括以下按照重量份计的组分：饴糖17~25份、芍药10~16份、桂枝10~16份、生姜4~8份、炙甘草2~6份、大枣2~6份、白术8~12份、苍术11~17份、黄连2~6份、茯苓8~12份。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述复方中草药粉剂包括以下按照重量份计的组分：饴糖20~22份、芍药12~14份、桂枝12~14份、生姜5~7份、炙甘草3~5份、大枣3~5份、白术9~11份、苍术13~15份、黄连3~5份、茯苓9~11份。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述复方中草药粉剂的制备方法，其包括以下步骤：
按照上述各组分的重量份，称取饴糖、芍药、桂枝、生姜、炙甘草、大枣、白术、苍术、黄连、茯苓，备用；
将饴糖、芍药、桂枝、生姜、炙甘草、大枣、白术、苍术、黄连、茯苓进行混合后，再粉碎成粒径为0.5~2mm的粉末，得到所述复方中草药粉剂。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的制备方法制得的复方中草药粉剂。
本发明实施例的另一目的在于提供一种保育仔猪用的饲料，其包括基础日粮以及上述的复方中草药粉剂。
本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的复方中草药粉剂在养殖保育仔猪中的应用。
作为本发明实施例的另一种优选方案，所述复方中草药粉剂用于提高保育仔猪对养分的表观消化率生长性能，和/或降低保育仔猪结肠和盲肠的pH，和/或改善保育仔猪的肠道菌群多样性和结构，和/或缓解保育仔猪的肠道炎症反应及降低保育仔猪腹泻率。
本发明实施例提供的一种保育仔猪用的复方中草药粉剂，是在中兽医理论的指导基础上，针对保育仔猪阶段肠道炎症及肠道菌群结构，经过科学的组方配伍制得的。将该复方中草药粉剂添加到保育仔猪的基础日粮中，可以促进保育仔猪对基础日粮营养的吸收，并可以显著提高保育仔猪对养分的表观消化率和生长性能，同时还可以降低保育仔猪结肠和盲肠的pH，下调结肠TLR4/MyD88/NF-κB炎症通路，改善肠道菌群多样性和结构，提高肠道有益菌属丰度以及降低有害菌属丰度，从而缓解肠道炎症反应，降低保育仔猪腹泻率。此复方中草药粉剂在生猪生产中具有较好的推广前景。
附图说明
图1为不同组仔猪的腹泻率对比图。
图2为不同组仔猪的结肠组织中炎症相关基因的表达情况对比图。
图3~4为不同组仔猪的肠组织NF-κB信号通路中炎症相关蛋白的表达水平对比图。
图5为不同组仔猪的结肠组织中炎症因子（IL-6，IL-8，IL-10和TNF-α）的mRNA水平对比图。
图6为不同组间OTU的韦恩图。
图7为OTU划分和分类地位鉴定结果统计图。
图8为不同组样品稀疏曲线图。
图9为不同组Alpha多样性指数的对比图。
图10为不同组的PLS-DA判别分析图。
图11为不同组的基于门水平的群落结构组成图。
图12为不同组的基于属水平的群落结构组成图。
图13为不同组的基于门水平的菌群组成差异对比图。
图14为不同组的基于属水平的菌群组成差异对比图。
图15为盲肠菌群的线性判别分析效度(LEFse)分析图。
图16为LEfSe分类进化分枝图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
该实施例提供了一种保育仔猪用的复方中草药粉剂，其制备方法包括以下步骤：
S1、称取饴糖15kg、芍药8kg、桂枝8kg、生姜2kg、炙甘草1kg、大枣1kg、白术15kg、苍术20kg、黄连8kg、茯苓15kg，备用；其中，各个组分在称取前均需进行清洗晾干处理。
S2、将上述称取的饴糖、芍药、桂枝、生姜、炙甘草、大枣、白术、苍术、黄连、茯苓进行混合后，再置于粉碎机中粉碎成粒径为0.5mm的粉末，即可得到复方中草药粉剂。
实施例2
该实施例提供了一种保育仔猪用的复方中草药粉剂，其制备方法包括以下步骤：
S1、称取饴糖30kg、芍药20kg、桂枝20kg、生姜10kg、炙甘草8kg、大枣8kg、白术5kg、苍术8kg、黄连1kg、茯苓5kg，备用；其中，各个组分在称取前均需进行清洗晾干处理。
S2、将上述称取的饴糖、芍药、桂枝、生姜、炙甘草、大枣、白术、苍术、黄连、茯苓进行混合后，再置于粉碎机中粉碎成粒径为2mm的粉末，即可得到复方中草药粉剂。
实施例3
该实施例提供了一种保育仔猪用的复方中草药粉剂，其制备方法包括以下步骤：
S1、称取饴糖16kg、芍药9kg、桂枝9kg、生姜3kg、炙甘草2kg、大枣2kg、白术14kg、苍术18kg、黄连7kg、茯苓14kg，备用；其中，各个组分在称取前均需进行清洗晾干处理。
S2、将上述称取的饴糖、芍药、桂枝、生姜、炙甘草、大枣、白术、苍术、黄连、茯苓进行混合后，再置于粉碎机中粉碎成粒径为0.8mm的粉末，即可得到复方中草药粉剂。
实施例4
该实施例提供了一种保育仔猪用的复方中草药粉剂，其制备方法包括以下步骤：
S1、称取饴糖28kg、芍药18kg、桂枝18kg、生姜9kg、炙甘草7kg、大枣7kg、白术6kg、苍术9kg、黄连2kg、茯苓6kg，备用；其中，各个组分在称取前均需进行清洗晾干处理。
S2、将上述称取的饴糖、芍药、桂枝、生姜、炙甘草、大枣、白术、苍术、黄连、茯苓进行混合后，再置于粉碎机中粉碎成粒径为1.5mm的粉末，即可得到复方中草药粉剂。
实施例5
该实施例提供了一种保育仔猪用的复方中草药粉剂，其制备方法包括以下步骤：
S1、称取饴糖17kg、芍药10kg、桂枝10kg、生姜4kg、炙甘草2kg、大枣2kg、白术12kg、苍术17kg、黄连6kg、茯苓12kg，备用；其中，各个组分在称取前均需进行清洗晾干处理。
S2、将上述称取的饴糖、芍药、桂枝、生姜、炙甘草、大枣、白术、苍术、黄连、茯苓进行混合后，再置于粉碎机中粉碎成粒径为1mm的粉末，即可得到复方中草药粉剂。
实施例6
该实施例提供了一种保育仔猪用的复方中草药粉剂，其制备方法包括以下步骤：
S1、称取饴糖25kg、芍药16kg、桂枝16kg、生姜8kg、炙甘草6kg、大枣6kg、白术8kg、苍术11kg、黄连2kg、茯苓8kg，备用；其中，各个组分在称取前均需进行清洗晾干处理。
S2、将上述称取的饴糖、芍药、桂枝、生姜、炙甘草、大枣、白术、苍术、黄连、茯苓进行混合后，再置于粉碎机中粉碎成粒径为1.5mm的粉末，即可得到复方中草药粉剂。
实施例7
该实施例提供了一种保育仔猪用的复方中草药粉剂，其制备方法包括以下步骤：
S1、称取饴糖20kg、芍药12kg、桂枝12kg、生姜5kg、炙甘草3kg、大枣3kg、白术11kg、苍术15kg、黄连5kg、茯苓11kg，备用；其中，各个组分在称取前均需进行清洗晾干处理。
S2、将上述称取的饴糖、芍药、桂枝、生姜、炙甘草、大枣、白术、苍术、黄连、茯苓进行混合后，再置于粉碎机中粉碎成粒径为1.2mm的粉末，即可得到复方中草药粉剂。
实施例8
该实施例提供了一种保育仔猪用的复方中草药粉剂，其制备方法包括以下步骤：
S1、称取饴糖22kg、芍药14kg、桂枝14kg、生姜7kg、炙甘草5kg、大枣5kg、白术9kg、苍术13kg、黄连3kg、茯苓9kg，备用；其中，各个组分在称取前均需进行清洗晾干处理。
S2、将上述称取的饴糖、芍药、桂枝、生姜、炙甘草、大枣、白术、苍术、黄连、茯苓进行混合后，再置于粉碎机中粉碎成粒径为1.2mm的粉末，即可得到复方中草药粉剂。
实施例9
该实施例提供了一种保育仔猪用的复方中草药粉剂，其制备方法包括以下步骤：
S1、称取饴糖24kg、芍药13kg、桂枝13kg、生姜6kg、炙甘草4kg、大枣4kg、白术10.5kg、苍术14kg、黄连4kg、茯苓10.5kg，备用；其中，各个组分在称取前均需进行清洗晾干处理。
S2、将上述称取的饴糖、芍药、桂枝、生姜、炙甘草、大枣、白术、苍术、黄连、茯苓进行混合后，再置于粉碎机中粉碎成粒径为1.2mm的粉末，即可得到复方中草药粉剂。
动物试验：
一、试验方法：
1、试验选用40日龄体重为17.37±1.32 kg且个体间无明显差异的公母各半“杜×长×大”三元保育仔猪20只作为试验动物，采用单因子完全随机设计，将其分为2个组，对照组（Control 组），饲喂基础日粮；试验组（TCM1 组），在基础日粮的基础上添加1%上述实施例9制得的复方中草药粉剂。预试验7d，正试期60d。
2、试验猪的基础日粮参照NRC（2012）制订的标准配制。试验前按程序对猪只进行常规免疫和栏舍消毒，饲养一周猪健康无病症方进行正式试验。每日饲喂三次分别为7:00、12:00和18:00，自由饮水。试验期间每日清粪早晚2次。其中，基础日粮的配方以及营养水平如表1所示。
表1
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表1中的预混料为每kg日粮提供Vit A 8000 IU，Vit D 2500 IU，Vit E 15 mg，Vit B24.00 mg，Vit B1 2.00 mg，Vit B12 0.02 mg，生物素0.06 mg，胆碱0.50 g，叶酸0.20 mg，烟酸20 mg，泛酸10.00 mg，Fe 110 mg，Cu 165 mg，Mn 80 mg，Zn 330 mg，Se 0.20 mg。
3、试验期间每日定时记录腹泻仔猪的头数。通过四分法分别采集不同组日粮样品1kg 左右，混匀后装入洁净的密闭塑料袋，标记后置于-20℃保存待测。在试验最后三天，每天上午7时至下午7时，随机采集每头仔猪的新鲜粪便，一天采集三次，每次约200g左右，采集的新鲜粪便做好标记装入密封袋内，存放于-80℃冰箱中。试验结束后将每一个样本的粪便混匀，放入65℃烘干箱中风干至恒重，测定营养物质表观消化率；试验第60 d时对所有试验仔猪进行屠宰取样，取中段结肠组织样品放于灭菌的离心管后立即放入液氮中保存；用无菌棉签采集盲肠内容物放置于冻存管中，置于-80℃冰箱中保存。
4、生长性能的测定。记录每日饲料摄入量，并在实验期第1天和第60天测定空腹仔猪体重。 在这些数据基础上计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料肉比(F:G)。
5 表观消化率、肠道相关指标、16S rRNA测序和生物信息学分析的测定
5.1 腹泻指数评分与肠道pH测定
腹泻指数评分按照 Bhandari 的描述，按以下标准进行评分：0分：正常；1分：不成型团状；2分：软便；3分：腹泻；4分：严重腹泻。试验期间每天记录仔猪腹 泻指数评分，随后按照腹泻评分（腹泻指数评分≥3）计算仔猪腹泻率。
肠道pH值的测定使用 pH-STAR 型直插式 pH 计测定，在屠宰结束后，立即用pH计插入盲肠和结肠中段内容物内，测定盲肠，结肠内容物pH值。
5.2 营养表观消化率的测定
采用部分收粪法收集粪便样品，用内源指示剂法测量试验猪营养物质表观消化率，参照《饲料分析级饲料质量检测技术（第三版）》中的常规分析方法进行测定。粗蛋白用凯氏定氮法，磷含量用钼黄比色法，钙含量用高锰酸钾滴定法。测定的数据用于计算试验牛饲料养分表观消化率，其计算方法为：
养分表观消化率=（食入饲料某养分含量-粪中某养分含量）/食入饲料中某养分含量。
5.3 结肠中炎症相关基因的测定
结肠中炎症信号通路相关因子 TLR4、MyD88 和 NF-κB，以及下游炎症因子 IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α的基因表达水平采用RT-qPCR 检测。
（1）结肠总RNA的提取
结肠中总RNA的提取和分离使用 TransZol Up试剂（TransGen Biotech 公司），操作和使用严格按照说明书进行，整个试验过程均在冰上操作。提取到的总RNA使用 NanoDrop-2000 测定 RNA 的浓度和纯度，OD260/230在1.7-2.0 之间且 OD260/280在1.8-2.0 之间方为合格 RNA 样品，可进行下一步发转录，否者需要重新提取。
（2）反转录合成 cDNA
cDNA使用TransScript® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMixreagent kit 试剂盒合成。将上述结肠总 RNA 统一稀释至 1000 ng/μL，反转录反应体系同样参照反转录试剂盒（TransGen Biotech 公司）的操作说明。PCR反应程序为42℃ 15min，85℃ 5s，4℃保存。得到的cDNA存放于-20℃用于荧光定量PCR测定。
（3）实时荧光定量 PCR
利用 ABI 7500 型实时荧光 PCR 扩增仪器进行荧光定量 PCR 的测定，引物如表第2所示，引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。采用SYBR Green 染料法进行RT-qPCR反应，采用10 μL的反应体系使用TRANS 公司 TransStart Tip Green qPCR SuPerMix 试剂盒进行 PCR 扩增，按表3所示的实时定量PCR反应体系，依次在96孔板加入各组分（冰上操作）；加样完毕后经排式离心机瞬时离心，将体系混匀沉底。PCR 反应程序如下:95℃ 10分钟，95℃ 15秒40 个循环，60℃60 秒，95℃延伸15秒。基因的相对表达量使用 2-△△CT法计算，将GAPDH作为内参基因进行归一化处理。
表2
Figure 662380DEST_PATH_IMAGE002
表3
Figure DEST_PATH_IMAGE003
5.4 结肠中炎症通路蛋白检测
结肠中NF-κB、p-NF-κB、IκB-α和 p-IκB-α蛋白表达水平参照现有方法，使用WesternBlot 检测。用RIPA裂解缓冲液(APPLYGEN，Beijing，China)提取总蛋白。用 10% SDS-PAGE分离蛋白上清，转移到 PVDF 膜上。用 5%脱脂奶粉封闭后，用适当的一抗在 4℃孵育过夜，然后在室温下与相应的二抗孵育 1 小时。膜被冲洗三 次，每次 10 分钟，与超级信号化学发光衬底（Pierce）孵育，并由 ChemiDoc XRS+ 成像系统（Bio-Rad）成像，并使用 Image J软件分析条带灰度值。
5.5 16S rRNA测序
5.5.1 基因组DNA的提取
盲肠总DNA的提取按照《Evaluation and optimization of DNA extraction andpurification procedures for soil and sediment samples》文中的方法进行操作，并进行了一定的优化。
5.5.2 16S rRNA 扩增及测序
采用V3-V4特异引物，上游引物：563F5′-AYTGGGYDTAAAGNG3′（如序列表SEQ ID NO:17所示）和下游引物：802R5′-TACNVGGGTATCTAATCC3′（如序列表SEQ ID NO:18所示），通过PCR扩增细菌16S rRNA的V3-V4区，并添加特异性Barcode序列进行PCR扩增和测序，PCR产物经凝胶电泳分离，采用AP-GX-500 DNA凝胶提取试剂盒纯化（Axygen，Corning，USA），用获得的产品建立文库，然后在MiSeq测序平台（Illumina，USA）上进行测序。
5.6 生物信息学分析
5.6.1 原始数据处理
为整合原始双端测序数据，采用滑动窗口法对FASTQ格式的双端序列逐一作质量筛查；随后，将通过质量初筛的序列按照引物和Barcode信息，识别分配入对应样本，并去除嵌合体等疑问序列，获得最终的有效数据。
5.6.2 划分OTU和鉴定物种分类地位
可操作分类单元OTU（Operational Taxonomic Unit），用于简化数据结构和确定分类水平，是根据人为设定的序列相似度阈值，将来自不同样本的序列归并为一个OTU，相似度高于该阈值的序列都将归并为一个OTU。对上述获得的高质量序列应用QIIME软件的UCLUST这一序列比对工具（Edgar，2010）按97%相似度阈值进行合并和OTU划分。然后在QIIME软件将OTU代表序列与对应数据库（Greengenes 16S rRNA 数据库）的模板序列相比对，获取每个OTU所对应的分类学信息。
5.6.3 Alpha多样性分析
生成维恩图来比较组间的OTU，使用R软件绘制Rarefaction稀疏曲线。Chao1指数、ACE指数和Shannon指数用来评估Alpha多样性，使用QIIME软件对每个样本计算上述四种多样性指数。
5.6.4 Beta多样性分析
使用偏最小二乘判别分析（Partial Least Squares Discriminant Analysis，PLS-DA）和NMDS分析方法对仔猪盲肠菌群进行Beta多样性进行评估。
5.6.5 菌群的分类学组成和差异分析
根据OTU划分和分类地位鉴定的结果，使用QIIME软件获取各样本不同分类水平上的组成和丰度分布表，以获得每个样本在个分类水平上的具体组成。菌群分类组成差异分析采用线性判别分析（LEfSe）效果大小方法，一种基于线性判别分析与非参数的Kruskal-Wallis以及Wilcoxon秩和检验相结合的方法，从而筛选关键的生物标记菌群。最后使用Mothur软件，调用Metastats（http://metastats.cbcb.umd.edu/）的统计学算法，对门和属水平的各个分类单元在样本（组）之间的序列量（即绝对丰度）差异进行两两比较检验。
6 数据处理
试验原始数据利用 SPSS 17.0 软件进行单因素方差分析和LSD多重比较，所有数据结果均以平均数±标准差（Mean±SD）表示，且用GraphPad Prism 8.0.1软件对分析之后的数据绘制试验结果图，其中P<0.05表示组间差异显著，P<0.01 表示组间差异极显著，P>0.05表示组间无显著差异性。
二、试验结果
1、添加复方中草药粉剂对保育仔猪的腹泻和肠道pH的影响：
仔猪腹泻率结果如图1所示，与Control组相比，TCM1极显著降低仔猪的腹泻率（P<0.01），其表明本发明实施例制得的复方中草药粉剂可以降低仔猪的腹泻率。其中，注：“*”或“**”分别表示处理组间存在显著性差异(P<0.05)或极显著性差异(P<0.01)，下同。
盲肠和结肠的pH值如表4所示，与Control组比较，TCM1组的盲肠pH（P<0.01）和结肠pH（P<0.05）值均呈现显著或极显著降低，其表明本发明实施例制得的复方中草药粉剂可以降低仔猪的盲肠和结肠的pH值。
表4
Figure 205619DEST_PATH_IMAGE004
注：表中同一行数值上标有相同小写字母表示组内差异不显著（P>0.05），不同小写字母表示组内差异显著（P<0.05）；同一列数值上标有相同大写字母表示组间差异不显著（P>0.05），不同大写字母表示组间差异显著（P<0.05）。下同。
2、添加复方中草药粉剂对保育仔猪表观消化率的影响：
中药复方添加剂对仔猪养分消化率的影响如表5所示。TCM1组各物质的表观消化率与Control组相比，CP提高了5.31%（P<0.01），CF提高了7.10%（P<0.01），NDF提高了13.69%（P<0.01），ADF提高了20.66%（P<0.01），Ca提高了7.02%（P<0.01），P提高了6.74%（P<0.05）。
表5
Figure DEST_PATH_IMAGE005
Figure 109990DEST_PATH_IMAGE006
3、添加复方中草药粉剂对保育仔猪生长性能的影响：
为了评价复方中草药粉剂对保育仔猪生长性能的影响，我们测量了ADG、ADFI和F:G比值，其结果如表6所示。与Control组相比，ADG和F:G比值在TCM1组中有明显的增加(P<0.05或P<0.01)，而两组ADFI无差异。
表6
Figure DEST_PATH_IMAGE007
4、添加复方中草药粉剂对保育仔猪结肠炎症相关基因表达的影响：
RT-qPCR检测了结肠组织中炎症相关基因的表达情况如图2所示，从图2中可以看出，添加复方中草药粉剂的试验组有效抑制了结肠TLR4/MyD88/NF-κB炎症信号通路的活性。与Control组比较，TCM1组显著下调了TLR4和MyD88的基因表达水平（P<0.05），下调了NF-κB的mRNA水平但是差异不显著（P>0.05）。
5、添加复方中草药粉剂对保育仔猪结肠炎症信号通路的影响：
利用Western Blot测定结肠组织NF-κB信号通路中炎症相关蛋白的表达水平，其灰度扫描结果如附图3~4所示，从图中可以看出，与Control组相比，TCM1组极显著（ P<0.01）降低了NF-κB，p-NF-κB和p-IκB-α的蛋白表达水平，升高IκB-α的蛋白表达量。并且，与Control组比较，TCM1组极显著降低p-NF-κB/NF-κB和p-IκB-α/IκB-α的比值，提示TCM1可以通过下调NF-κB信号通路，缓解育肥仔猪的结肠炎症。
6、 添加复方中草药粉剂对保育仔猪结肠炎症因子表达的影响
利用RT-qPCR检测结肠组织中炎症因子（IL-6，IL-8，IL-10和TNF-α）的mRNA水平，其检测结果如附图5所示，从图中可以看出，复方中草药粉剂显著抑制促炎症因子的基因表达，显著提高抑炎症因子的基因表达。具体的，与对Control组比较，TCM1组IL-6，IL-8和TNF-α的基因表达均极显著下降（P<0.01）,抑炎症因子IL-10的mRNA表达量极显著（P<0.01）升高。
7、原始数据统计
为了评价复方中草药粉剂对盲肠菌群的影响，我们在每个处理组中随机挑选4个样本的盲肠内容物进行16S rRNA测序，通过Illumina平台的高通量测序得到16S rRNA 原始数据。所有样品的DNA样品浓度均在20 ng/μL以上，符合检测要求。根据序列97%相似度分成3939 OTU，平均每个样本获得362条OTU，对获得的OTU利用R软件进行Venn图分析，其分析结果如附图6所示，从图中发现，各组之间既有相同的OTU，也有各自特有的OTU，两个组共享2003个OTU，占总OTU的50.85%。其中Control组、TCM1组特有的OTU数为分别为1041（占26.43%），895（占22.72%）。
在QIIME软件上将OTU代表序列与Greengenes16S rRNA 数据库的模板序列进行比对，获取每个OTU所对应的分类学信息，如附图7所示，各样本中的OTU均能分类至门、纲、目、科、属五个地位，只有极少数无法归类的OTU。
8、Alpha多样性分析
利用OTU丰度矩阵，可以评价每个样本的群落多样性，即Alpha多样性。稀疏分析如图8所示，随着测序深度的增加，各组稀疏曲线逐渐趋于平缓，表明当前测序深度足以覆盖每个样本中所有微生物的多样性。
对于菌群群落而言，有多种计算指数来反映群落的Alpha多样性。在微生态学研究中，通常用Chao1指数和ACE指数来体现群落丰富度，而Shannon指数和Simpson指数既可以反映群落丰富度和均匀度，它们的数值越高代表菌群的多样性越高。如图9所示，与Control组比较，TCM1显著提高了Chao1指数和ACE指数（P<0.05），而对代表菌群多样性的Shannon和Simpson指数虽呈现升高趋势但差异不显著（P>0.05）。
9、Beta多样性分析
Beta多样性分析用于比较菌群整体结构的相似性。由图10可知，各组样品之间组间距离较小，表明分类模型处理较好。PLS-DA分析显示仔猪盲肠菌群在TCM1组和Control组之间有明显的距离，表明TCM1组与Control组相比在盲肠微生物菌群结构的相似性方面存在显著差异。
10、菌群分类学组成分析
10.1 基于门水平进行分析
基于门水平对样品进行物种注释分析，8个样品共获得12个菌门。如图11所示，在门水平上对各样本进行过分类组成学分析发现，相对丰度最大的是厚壁菌门Firmicutes，其中Control组为85.6%，TCM1组为88.8%；排第二位的是拟杆菌门Bacteroidetes，其中Control占10.5%，TCM1组占6.9%；相对丰度排第三位的是放线菌门Actinobacteria，Control组和TCM1组分别为0.7%和2.0%；其次是螺旋体门Spirochaetes，Control组和TCM1相对丰度分别是2.1%和0.8%。
10.2 基于属水平进行分析
基于属水平对样品进行物种注释分析。如图12，经过统计学分析发现，在相对丰度>1%的菌属且在命名的基础上，Control组的菌属按相对丰度从大到小分别为乳杆菌属Lactobacillus（36.6%），链球菌属Streptococcus（2.0%），毛螺菌属Lachnospira（3.2%），巨球形菌属Megasphaera（3.9%），瘤胃球菌属Ruminococcus（1.6%），密螺旋体属Treponema（2.1%）和梭菌属Clostridium（1.2%）；TCM1组在属水平上的分布分别为乳杆菌属Lactobacillus（28.9%），链球菌属Streptococcus（4.5%），毛螺菌属Lachnospira（2.5%），巨球形菌属Megasphaera（1.2%），瘤胃球菌属Ruminococcus（1.9%），罗氏菌属Roseburia（1.3%），梭菌属Clostridium（1.2%），双歧杆菌属Bifidobacterium（1.1%）和粪杆菌属Faecalibacterium（1.2%）。
10.3 基于Metastats分析不同组间盲肠菌群差异性
为探究不同中药复方添加剂对盲肠菌群在门和属水平组成的差异性，利用Metastats分析在门和属水平上对各个分类单元在各组间的绝对丰度差异进行两两比较检验。如表7所示，Control组和TCM1组在门水平有显著差异的分类单元个数为2个，在属水平上有5个。
表7
组别 Group 门 Phylum 属 genus
Control-TCM1 2 5
如图13所示，基于门水平，与Control组比较，TCM1组放线菌门Actinobacteria和蓝藻菌门Cyanobacteria的丰度极显著升高（P<0.01）。
在属水平上，如图14所示，与对照组相比，TCM1组的优杆菌属Eubacterium，双歧杆菌属Bifidobacterium、链球菌属Streptococcus、不动杆菌属Acinetobacter（P<0.05）和Bulleidia菌属的绝对丰度均显著或极显著上升（P<0.05或P<0.01）。
10.4 基于LEfSe分析不同组间盲肠菌群关键群落
LEfSe是一种基于评价LDA效应量的分析方法，将LDA与非参数的Kruskal-Wallis以及Wilcoxon秩和检验相结合，从而筛选关键的群落成员，即生物标记物。如图15所示，LDA评分高于2，说明对应组相对丰度显著高于其他两组（P<0.05），不同组间的菌群群落相对丰度差异显著的使用分类等级树展示（图16）。结果显示，TCM1组中蓝藻菌门Cyanobacteria（LDA得分3.74）和放线菌门Actinobacteria（LDA得分3.82）相对丰度相比于Control具有显著差异（P<0.05）；在属水平上，TCM1对优杆菌属Eubacterium、Bulleidia菌属和Catenibacterium菌属具有显著的选择富集性（P<0.05），LAD得分分别为3.31、3.16、2.88。
三、讨论
根据中兽医学理论，仔猪气血未充、稚阳之体，若寒热不调、饲养管理不当，易导致脾胃功能失调从而引起腹泻。其次，由于自身的消化系统以及免疫系统等均未发育完好，在外界环境应激和自身免疫、营养等应激因素下，仔猪阶段极易发生消化不良和腹泻等症状，导致饲料利用率降低以及生产性能下降，甚至死亡，会直接影响养殖效益。
因此，促进仔猪肠道的消化能力以及肠道免疫机能具有非常重要的意义。一些中药如本试验处方中用到的白术，大枣和茯苓历来就具有促进消化和提高动物采食量的作用。通过对营养成分的表观消化率的结果分析发现，与Control组相比，TCM1组在CP、CF、NDF、ADF、Ca和P的消化率方面提升效果最优，分别提高了5.31%，7.10%，13.69%，20.66%，7.02%，6.74%。研究表明，饲料中的粗蛋白是动物主要的蛋白质来源，CP的利用率低下容易造成氮素污染。同时氨基酸也是与机体多种免疫球蛋白和抗体合成的必须成分，因此CP的利用率会影响仔猪的生产性能和免疫性能。本试验中TCM1显著提高了仔猪CP的表观消化率，提示中药复方可能可以通过提高CP的消化率进而提高动物的生产和免疫性能。NDF和ADF是动物粗饲料中主要的能量来源之一，粗纤维的消化率是影响动物能量摄入的首要原因。并且，粗纤维中的碳水化合物也是肠道菌群利用的基底原料之一，NDF和ADF的表观消化率在TCM1处理组中也显著提高，提示TCM1可能通过提高饲料纤维的消化率，进而提高动物的能量摄入，影响生长性能。本试验中仔猪的生长性能结果表明TCM1可以显著提高仔猪的ADG，显著降低仔猪的料肉比，而各处理组的采食量之间没有显著差异。
肠道是一个非常复杂的生物学系统，是机体消化吸收的主要器官，同时肠道也是机体最大的免疫器官，机体80%的免疫细胞都在肠道之中。肠道免疫在仔猪对抗肠道抗原和其他应激因素引发的炎症反应发挥着极其重要的作用。肠道免疫系统在维持肠道粘膜对食物抗原的免疫耐受的基础上，也发挥着肠道正常菌群和外来致病菌的免疫监视和防御作用。由营养、环境等应激因素导致的腹泻使得仔猪肠道的功能和形态受损，肠腔内的细菌、LPS或者一些毒素易进入肠道粘膜的下层，引发炎症反应，造成肠道免疫系统紊乱和肠道屏障完整性和功能受损。仔猪的胃肠道是机体消化饲料中营养物质的主要场所，胃肠道内pH值的高低与胃肠道消化吸收功能密切相关。肠道pH不仅影响胃肠道消化酶的分泌和活性，也是抑制肠道某些致病菌的增殖、改善有益菌群的多样性和丰度，促进有益菌增殖、维持肠道微生态平衡的重要因素。本试验选用的中药复方作为益脾健胃的中药复方，其有效成分包含多种有机酸、生物碱和生物多糖等成分。其中有机酸具有降低肠道pH的作用，多糖和生物碱等可以增强机体免疫性能和维持肠道微生态稳态，提高肠道有益菌的数量。而肠道有益菌利用糖类物质代谢分泌多种可以降低pH和对肠道有益的物质，如乳酸、短链脂肪酸等。在本试验中，TCM1组小建中加减复方可以有效降低仔猪结肠和盲肠的pH值，提示中药复方可能通过改善仔猪结肠或者盲肠的内环境，通过降低pH值抑制病原菌的增殖和促进一些有益菌的增殖。
虽然引起腹泻的原因多种多样，但往往都伴随着肠道炎症的存在和涉及，肠道炎症信号通路的激活和肠道细胞因子的表达升高是肠道炎症反应的特征之一。TLR4/MyD88/NF-κB信号通路是介导肠道炎症反应的主要通路之一。在本试验中，我们检测了结肠中炎症通路相关基因和蛋白的表达。结果表明，TCM1组可以显著降低TLR4和MyD88的基因表达。并且，Western Blot的结果同样支持了上述结果，中药复方可以降低NF-κB总蛋白和NF-κB和IκB-α的磷酸化蛋白水平，并且显著升高IκB-α的蛋白表达水平。最重要的是，我们的结果表明，TCM1组干预后，仔猪的结肠中促炎症因子IL-6、IL-8和TNF-α的基因表达显著下降，而抑炎症因子IL-10的表达量显著升高。上述结果表明TCM1可以通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB炎症信号通路活性，通过调节炎症因子的表达发挥抗炎作用。
哺乳动物的胃肠道中存在着数万亿的微生物，称为肠道菌群。肠道益生菌可以通过以下四种主要机制对宿主发挥其有益作用：干扰潜在的病原体、改善屏障功能、免疫调节和产生神经递质。许多研究证实了肠道微生物、炎症、宿主反应和健康之间的重要关系，也发现了许多疾病与肠道微生物菌群的失调有关。更重要的是，无论是菌群的多样性还是菌群丰度，肠道菌群紊乱已被发现与肠道炎症性疾病的病理发生发展密切相关。在本研究中，根据对ACE、Chao1、Shannon和Simpson多样性指数的分析发现，中药复方显著提高了盲肠菌群的丰富度。此外，根据NMDS和PLS-DA分析，我们发现TCM1与Control组相比盲肠菌群发生了显著的结构变化。这些变化在菌群分类组成学分析的结果中也得到了进一步的佐证。基于门水平和属水平分类学组成分析的结果表明，仔猪盲肠菌群中以厚壁菌门为主，其次为拟杆菌门。但是基于属水平，在命名的基础上且相对丰度>1%的菌属中，我们发现Control组中包括密螺旋体属Treponema（占2.1%），而TCM1中不包括；TCM1组中包括罗氏菌属Roseburia、双歧杆菌属Bifidobacterium和粪杆菌属Faecalibacterium（1.2%）。众所周知，密螺旋体属中含有多种肠道致病细菌，如猪痢疾密螺旋体是引起仔猪腹泻的主要病原体之一。研究报道罗氏菌属Roseburia是一类专性革兰氏阳性厌氧菌，它们是产生短链脂肪酸尤其是丁酸盐的肠道共生细菌，可以影响结肠运动、免疫维持和抗炎特性[95]。同时，罗氏菌属Roseburia作为肠道有益菌群恢复的标志益生菌，也可以作为一些病理症状，如胆石症发生的生物标记物。双歧杆菌属是当今许多益生菌产品的主要成分，作为一种公认的对机体有益的益生菌，它能够利用碳水化合物来产生短链脂肪酸，进而发挥抑制肠道内炎症反应的作用。此外，作为一种潜在的益生菌，粪杆菌属Faecalibacterium被证实可以改善断奶犊牛的胃肠道健康和生长发育。这些证据提示本试验中使用的中药复方可以提高仔猪肠道菌群的丰度或多样性，并且具有提高肠道益生菌如菌罗氏菌属Roseburia和双歧杆菌属Bifidobacterium的相对丰度，改善肠道菌群结构的潜力。
基于Metastats分析的结果显示，Control组与TCM1组在门水平和属水平上均含有显著差异的分类单元，这进一步证实了中药复方对菌群结构的干预作用。中药复方组的放线菌门Actinobacteria和蓝藻菌门Cyanobacteria的丰度均显著升高。在属水平上，中药复方组较Control组的优杆菌属Eubacterium，双歧杆菌属Bifidobacterium和链球菌属Streptococcus的绝对丰度均显著升高。研究发现Bulleidia菌属可以发酵葡萄糖产生乙酸、乳酸和少量的琥珀酸等物质，这些物质可以降低肠道内pH，抑制肠道炎症反应。Turicibacter菌属被报道可能会加速结肠的老化和肠道屏障的损伤，在DSS诱导的溃疡性结肠炎老年小鼠模型中，有害菌属Turicibacter的比例要高于幼龄小鼠。基于以上前人的研究和Metastats的分析结果，TCM1组发挥抑炎作用的机制可能是通过提高肠道有益菌属丰度和降低有害菌属丰度。
基于LEfSe分析发现，在门水平上TCM1组盲肠微生物关键群落为蓝藻菌门Cyanobacteria和放线菌门Actinobacteria，在属水平，TCM1组差异显著的盲肠微生物关键群落包括优杆菌属Eubacterium、Bulleidia菌属和Catenibacterium菌属。现有的关于研究Catenibacterium菌属的报道较少，因此其作用还需要进一步的研究。链球菌属Streptococcus常见于动物鼻咽部和肠道内，虽有少部分为致病菌，但是大多数为肠道正常菌群。以上结果表明TCM1组的干预后仔猪盲肠中优杆菌属Eubacterium和Bulleidia菌属等有益菌属丰度提高作用显著。显然，中药复方通过不同的作用成分调控仔猪盲肠微生物菌群结构，提高不同种类的有益菌属的群落丰度，从而间接发挥抑制肠道炎症的作用。
综上所述，将本发明实施例提供的复方中草药粉剂添加到保育仔猪基础饲粮中，通过提高仔猪营养物质的表观消化率而提升了保育仔猪的生长性能。且通过降低保育仔猪盲肠、结肠pH值；抑制TLR4/MyD88/NF-κB炎症通路，下调炎症因子的表达，减小肠道的炎症应激；提高肠道有益菌属丰度以及降低有害菌属丰度而起到降低保育仔猪腹泻率的作用。此复方中草药粉剂在保育仔猪生产中具有较好的推广前景。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 江西农业大学
<120> 保育仔猪用的复方中草药粉剂、其制备方法、饲料及应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
actcactctt ccacttttga tgct 24
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgttgctgta gccaaattca 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccatcgctg ctaacatcat c 21
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcatactca aagatacacc atcgg 25
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tggtagtggt tgtctctgat ga 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tggagagagg ctgagtgcaa 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctcgcacaag gagacatgaa 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
actcagccgg aaggcattat 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
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Claims (8)

1.一种保育仔猪用的复方中草药粉剂，其特征在于，包括以下按照重量份计的组分：饴糖15～30份、芍药8～20份、桂枝8～20份、生姜2～10份、炙甘草1～8份、大枣1～8份、白术5～15份、苍术8～20份、黄连1～8份、茯苓5～15份。
2.根据权利要求1所述的一种保育仔猪用的复方中草药粉剂，其特征在于，所述复方中草药粉剂包括以下按照重量份计的组分：饴糖17～25份、芍药10～16份、桂枝10～16份、生姜4～8份、炙甘草2～6份、大枣2～6份、白术8～12份、苍术11～17份、黄连2～6份、茯苓8～12份。
3.根据权利要求2所述的一种保育仔猪用的复方中草药粉剂，其特征在于，所述复方中草药粉剂包括以下按照重量份计的组分：饴糖20～22份、芍药12～14份、桂枝12～14份、生姜5～7份、炙甘草3～5份、大枣3～5份、白术9～11份、苍术13～15份、黄连3～5份、茯苓9～11份。
4.一种如权利要求1～3中任一项所述复方中草药粉剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
按照上述各组分的重量份，称取饴糖、芍药、桂枝、生姜、炙甘草、大枣、白术、苍术、黄连、茯苓，备用；
将饴糖、芍药、桂枝、生姜、炙甘草、大枣、白术、苍术、黄连、茯苓进行混合后，再粉碎成粒径为0.5～2mm的粉末，得到所述复方中草药粉剂。
5.一种如权利要求4所述的制备方法制得的复方中草药粉剂。
6.一种保育仔猪用的饲料，包括基础日粮，其特征在于，还包括如权利要求1～3和权利要求5中任一项所述的复方中草药粉剂。
7.一种如权利要求1～3和权利要求5中任一项所述的复方中草药粉剂在养殖保育仔猪中的应用。
8.根据权利要求7所述的一种应用，其特征在于，所述复方中草药粉剂用于提高保育仔猪对养分的表观消化率生长性能，和/或降低保育仔猪结肠和盲肠的pH，和/或改善保育仔猪的肠道菌群多样性和结构，和/或缓解保育仔猪的肠道炎症反应及降低保育仔猪腹泻率。
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CN104799109A (zh) * 2015-05-11 2015-07-29 中国科学院东北地理与农业生态研究所 一种降低仔猪腹泻率的饲料添加剂

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鲁必均等: "益气健脾法试治仔猪白痢", 《中兽医学杂志》 *

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