CN111904983B - 地衣芽孢杆菌用于制造缓解精神疾病的药物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生命科学领域，具体涉及地衣芽孢杆菌用于制造缓解精神疾病如焦虑症和抑郁症的药物的用途，采用高架十字迷宫实验和强迫游泳实验证明了地衣芽孢杆菌有缓解改善抑郁、焦虑症状的作用，并初步研究了其通过降低血清皮质酮和血清TNF‑α含量实现。相比传统的化学药物，本发明采用地衣芽孢杆菌这种益生菌与机体适应性更强、更加安全、具有可靠的缓解效果的同时，副作用更小。

Description

地衣芽孢杆菌用于制造缓解精神疾病的药物的用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域的一种地衣芽孢杆菌活菌的新用途，用于缓解抑郁症与焦虑症的应用。

背景技术

据世界卫生组织的统计，2016年在全世界范围内，精神疾病占全球疾病负担的7％，并且这一比例还将逐年升高。抑郁症作为最主要的精神疾病之一，常和焦虑症相伴而生，严重影响人们的精神健康，降低人的生活质量。最近研究表明，肠道菌群和精神疾病有着密切的联系。肠道菌群指定植在人体肠道中对健康至关重要的一个细菌群，其细菌数量近100万亿。随着研究的进展，肠道菌群也是一个日益被认可的可以通过微生物群-肠道-大脑(BGM)轴来影响大脑、塑造大脑的环境因素。这些微生物通过帮助分解作为饮食一部分摄入的复杂多糖，或者直接刺激肠壁等方式来影响大脑，其双向交流的信号途径包括HPA轴、免疫调节、色氨酸和血清素代谢、短链脂肪酸合成、产生神经活性化合物等。肠道菌群失调可能导致包括抑郁症在内的慢性神经炎症疾病增加，而肠道菌群平衡可能会促进神经的恢复力，特别是在特定的脆弱神经发育时期。

随着“精神益生菌”(Psychobiotics，定义为当被摄入足够量时赋予精神健康益处的活细菌)逐渐被人们所重视，其在相关临床前实验中不断显示出令人激动的结果，这些益生菌(株)在改善动物焦虑样行为、抑郁样行为、社会交互认知记忆方面都表现出了显著的效果。有研究发现鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的慢性治疗可以减少焦虑和抑郁相关的行为，并减少应激诱导的皮质酮分泌，还可以导致大脑GABA受体mRNA的区域依赖性改变，脑内GABA和谷氨酸水平增高。嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)联合补充可以显著改善动物受损的空间记忆，恢复基本突触传递功能和海马长时程增强(LTP)功能，还可提高血清超氧化物歧化酶的活性。干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)可抵消大部分由于服用过量抗生素引起的肠道炎症增加、抑郁样行为、神经生化和功能改变等。使用双歧杆菌处理经过社会挫败后的小鼠，能显著增加这些小鼠的恢复能力等等。这些精神益生菌通常可以将不易消化的碳水化合物水解成单糖，在肠道厌氧环境中发酵产生短链脂肪酸(SCFAs)。SCFAs是一组由1-6C构成的化合物，其中C2-C4(分别为乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐)占SCFAs总量的95％以上。实验发现，短链脂肪酸可以促进人的情绪健康、调节小胶质细胞功能、改善动物的抑郁样行为，并且可以增加动物脑部神经营养素的表达和记忆认知能力。因此，通过调节肠道微生物组成来改善和治疗神经精神疾病正逐渐成为今后的发展趋势。

地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是一种在自然界分布非常广泛的芽孢杆菌，为革兰氏阳性菌，菌落呈圆形扁平状、表面无光泽,灰白不透明，兼性厌氧，可分解葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇以产生短链脂肪酸乙酸以及乳酸。研究发现，地衣芽孢杆菌的耐胃酸、耐胆盐能力都极强，其可以耐受0.3％胆盐浓度，且在人工胃液处理30min内仍可生长。地衣芽孢杆菌可以有效改善肠道菌群失衡状态，且其本身还可产生乙酸、丙酸等短链脂肪酸及乳酸等对精神健康有益的益生元。地衣芽孢杆菌在临床上主要用于菌群失调等多种原因引起的多种肠道疾病，并且应用范围仍在不断扩宽。近些年对地衣芽孢杆菌的拓展研究发现，地衣芽孢杆菌不仅可以对肠道疾病有治疗效果，还有降低患者体内炎症因子水平，提高血液中5-HT含量等作用。这些功能为其调节情绪提供了可能性。

迄今为止，还未见有研究报道地衣芽孢杆菌用于缓解精神疾病的应用，因此研究地衣芽孢杆菌用于缓解精神疾病具有重要意义。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种地衣芽孢杆菌用于制造缓解精神疾病的药物的应用。

上述制造缓解精神疾病的药物的应用具体为制造缓解抑郁症与焦虑症的药物的应用。上述抑郁症与焦虑症可由微生物-肠-脑轴失调引起，包括肠道菌群失调、炎症以及HPA轴失调等因素。

上述地衣芽孢杆菌是活细胞形式，拉丁名为Bacillus licheniformis，地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌BL20389，购买于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCCNO.0298。

上述药物中含有有效量的地衣芽孢杆菌和/或其代谢产物，以及药学上可接受的载体；上述地衣芽孢杆菌和/或其代谢产物的有效量为每千克体重的CFU值，具体为1*10⁶～1*10¹⁰CFU/Kg，优选1*10⁸CFU/Kg；上述药物剂型可为但不限于为：颗粒剂、胶囊、片剂、粉末剂、口服液、混悬液、或乳剂。

本发明制得的药物缓解抑郁症、焦虑症的一种或组合是通过降低TNF-α炎症因子血清含量或者通过降低皮质酮血清含量的作用实现。该药物通过喂食的方式使用该种药物。

本发明使用慢性不可预知刺激诱导大鼠出现焦虑及抑郁等行为，再使用地衣芽孢杆菌灌胃处理以验证地衣芽孢杆菌对精神疾病的缓解作用，通过高架十字迷宫实验和强迫游泳实验来研究地衣芽孢杆菌有关缓解抑郁症与焦虑症的作用，发现地衣芽孢杆菌能够减少抑郁模型大鼠在强迫游泳实验中的静止时间与静止次数，在高架十字迷宫实验中降低闭合臂时间并增加开放臂时间，从而得到地衣芽孢杆菌能够缓解抑郁症与焦虑症的作用。

本发明针对目前没有易于使用和存储并适用于缓解精神疾病的益生菌，以动物实验为依据，提供了一种地衣芽孢杆菌用于制造缓解精神疾病的药物的新的使用用途，具体为制造缓解抑郁症与焦虑症的药物，相比传统的化学药物，本发明的方法与机体适应性更强、更加安全、具有可靠的缓解效果的同时，副作用更小。

附图说明

为了更清楚的说明本发明实施例的技术方案，下面结合附图对本发明进行详细说明。

图1为地衣芽孢杆菌平板培养图。

图2为对照组高架十字迷宫实验动物运动轨迹图(上下为开放臂，左右为闭合臂)。

图3为抗生素处理造模组高架十字迷宫实验动物运动轨迹图(上下为开放臂，左右为闭合臂)。

图4为抗生素处理造模+地衣芽孢杆菌组高架十字迷宫实验动物运动轨迹图(上下为开放臂，左右为闭合臂)。

图5为仅造模组高架十字迷宫实验动物运动轨迹图(上下为开放臂，左右为闭合臂)。

图6为仅造模+地衣芽孢杆菌组对照组高架十字迷宫实验动物运动轨迹图(上下为开放臂，左右为闭合臂)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明动物实验方案如下。动物观察对象为慢性不可预知刺激(CUMS)法诱导的抑郁模型大鼠，使用慢性不可预知刺激诱导大鼠出现焦虑及抑郁等行为，再使用地衣芽孢杆菌灌胃处理，检测其行为学等变化，以验证地衣芽孢杆菌对精神疾病的缓解作用。

(一)、材料和方法

动物实验对象为无特定病原体(SPF)级(SD)IGS白化大鼠74只，雄性，体重150-170g，随机分为两个大组：对照组，造模组。造模组又随机分为抗生素处理造模组，抗生素处理造模+地衣芽孢杆菌组，仅造模组，仅造模+地衣芽孢杆菌组。地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌BL20389，购买于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC NO.0298，本实施例中mg/kg是指每kg体重的药物用量。

具体动物分组如下：

对照组：正常饲养8周

抗生素处理造模组：CUMS法造模4周，且在最后一周每12小时灌胃浓度为7mg/ml的盐酸万古霉素(35mg/kg)、浓度为14mg/ml的硫酸新霉素(70mg/kg)和浓度为14mg/ml的甲硝唑(70mg/kg)的混合抗生素溶液一次，并在饮水中加入1g/L氨苄西林钠。造模结束后每日灌胃无菌水1ml共4周。

抗生素处理造模+地衣芽孢杆菌组：CUMS法造模4周，且在最后一周每12小时灌胃浓度为7mg/ml的盐酸万古霉素(35mg/kg)、浓度为14mg/ml的硫酸新霉素(70mg/kg)和浓度为14mg/ml的甲硝唑(70mg/kg)的混合抗生素溶液一次，并在饮水中加入1g/L氨苄西林钠。造模结束后每日灌胃地衣芽孢杆菌1×10⁸CFU共4周。

仅造模组:CUMS造模4周，造模结束后每日灌胃无菌水1ml共4周。

仅造模+地衣芽孢杆菌组:CUMS造模4周，造模结束后每日灌胃地衣芽孢杆菌1×10⁸CFU共4周。

大鼠采用慢性不可预知轻度刺激法进行改良后得出的方法进行抑郁模型的建立，方法如下：

建立模型使用的慢性不可预知刺激法为每日从7种轻度刺激(冰水游泳5min、烘箱50℃10min、摇晃170rpm 1h、禁食24h、禁水24h、夹尾1min、昼夜颠倒)中随机抽取两种处理大鼠，相邻的两天的刺激完全不相同，持续28天，具体如表1所述。

表1慢性不可预知刺激排布表

本实验所述地衣芽孢杆菌为活菌，用无菌水调整其浓度为1×10⁸CFU/ml的细菌悬液。

本实验所用行为测试包括

1、高架十字迷宫实验(EPM)

高架十字迷宫是利用动物对新异环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐惧形成矛盾冲突行为来考察动物的焦虑状态。实验在一个高1m的十字迷宫装置中进行，迷宫分为十字交叉的开放臂(臂长500×臂宽100mm)和闭合臂(臂长500×臂宽100×臂高300mm)。实验开始时将大鼠从中央格面向开放臂放入迷宫，记录5分钟内的活动情况。观察指标包括：进入开放臂次数，开放臂停留时间，进入闭合臂次数，闭合臂停留时间，开放臂停留时间比例，进入开放臂次数比例，高架十字迷宫中总进入次数等。实验完成后将大鼠取出，将两臂清理干净，喷洒酒精除去气味。

2、强迫游泳实验(FST)

强迫游泳实验用于评估大鼠抑郁样行为，其基本原理是当大鼠放进一个有限的空间使之游泳，开始时拼命游泳力图逃脱，很快就变成漂浮不动状态，仅露出鼻孔保持呼吸，四肢偶尔划动以保持身体不至于沉下去，实际是动物放弃逃脱的希望，属于行为绝望。实验开始将大鼠放进一个高700m直径400m的有限空间使之游泳，内有足够深(17-30cm)的水，记录其5分钟内的静止时间、静止次数等，实验完成后将大鼠取出擦干，不同处理组间更换新水。

(二)、本发明实验结果如下：

a)采用强迫游泳实验(FST)对对照组、仅造模组、和仅造模+地衣芽孢杆菌组进行动物抑郁样行为学测试，得到的结果如下表2所示。

表2动物抑郁样行为学测试结果

注：*与仅造模组相比p＜0.05。

强迫游泳实验中，仅造模+地衣芽孢杆菌组大鼠在水中的静止持续时间以及静止次数显著低于仅造模组(p<0.05)，同时观察到仅造模+地衣芽孢杆菌组的测试结果优于正常饲养的对照组，表明地衣芽孢杆菌可以显著减少大鼠抑郁样行为，缓解并改善抑郁症状。

b)采用高架十字迷宫实验(EPM)对对照组、抗生素处理造模组、和抗生素处理造模+地衣芽孢杆菌组进行动物焦虑样行为学测试，得到的结果如下表3所示。

表3动物焦虑样行为学测试结果

注：#与抗生素处理造模组相比p＜0.05。

高架十字迷宫实验记录了大鼠在高架十字迷宫闭合臂和开放臂的活动时间。与抗生素处理造模组大鼠相比，抗生素处理造模+地衣芽孢杆菌组大鼠在闭合臂时间有所下降，并且在开放臂的时间显著增加(p＜0.05)。同时观察到表明抗生素处理造模+地衣芽孢杆菌组大鼠相比正常饲养的对照组也观察到了相同的趋势，结果表明，地衣芽孢杆菌可以显著减少大鼠焦虑样行为，缓解并改善焦虑症状。

c)采用血清ELISA检测大鼠血清中的皮质酮与炎症因子TNF-α。

血清ELISA检测步骤：

取大鼠股动脉血液，静置4小时，等血液分层后3000rpm离心10min，取上清液备用。

在酶标包被板上每空加入样品50μl，然后加入生物素抗原工作液50μl。轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育60min。

第一次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

加入50μl亲和素-HRP到标准品孔和样品孔中，轻轻摇晃，盖上封板膜，37℃培养箱中孵育60min。

第二次洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟。

终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。

测定：以空白孔调零，在450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。

大鼠血清中皮质酮的含量见表4。

表4血清皮质酮含量

注：#与抗生素处理造模组相比p＜0.05。

抗生素处理造模+地衣芽孢杆菌组大鼠血清中的皮质酮含量显著低于抗生素处理造模组(p＜0.05)，仅造模+地衣芽孢杆菌组大鼠血清中的皮质酮含量显著低于仅造模组(p＝0.057)。证明地衣芽孢杆菌可通过降低大鼠血清中的皮质酮缓解大鼠抑郁及焦虑的症状。

大鼠血清中TNF-α的含量见表5。

表5血清TNF-α含量。

注：#与抗生素处理造模组相比p＜0.05。

抗生素处理造模+地衣芽孢杆菌组大鼠血清中的TNF-α含量显著低于抗生素处理造模组(p＜0.05)，仅造模+地衣芽孢杆菌组大鼠血清中的TNF-α含量略低于仅造模组，证明地衣芽孢杆菌可通过降低大鼠血清中的TNF-α缓解大鼠的焦虑症状。

以上结果表明，地衣芽孢杆菌具有缓解抑郁症与焦虑症的作用，并且初步推断地衣芽孢杆菌可以通过降低血清中的皮质酮和TNF-α缓解抑郁症与焦虑症，因此提出其具有制造缓解抑郁症与焦虑症的药物的能力，相比传统的化学药物，本发明采用地衣芽孢杆菌这种益生菌与机体适应性更强、更加安全、具有可靠的缓解效果的同时，副作用更小。

Claims (2)

1.一种地衣芽孢杆菌用于制造缓解精神疾病的药物的用途，其特征在于：所述精神疾病为抑郁症、焦虑症的一种或组合，所述地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌BL20389，购买于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC NO.0298。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述地衣芽孢杆菌是活细胞形式。

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