CN111903605A - 一种诱导的sd大鼠激素依赖性皮炎模型及其测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于模型评估技术领域，公开了一种诱导的SD大鼠激素依赖性皮炎模型及其测定方法，包括：配置外用丙酸氯倍他索(CP)试剂、观察皮肤变化并统计SD大鼠搔抓行为。通过对不同实验组大鼠分别外用不同时间的CP，进行筛选预实验，确定外用0.05％CP在正常皮肤上诱导激素依赖性皮炎时长；量化SD大鼠搔抓行为观察指标；量化SD大鼠皮肤体征；当出现戒断反应后采集皮肤组织样本进行生化实验分析；基于量化的SD大鼠皮肤症状及体征、病理表现，判断是否满足标准，若满足，则判定激素依赖性皮炎造模成功。本发明成功诱导出了激素依赖性皮炎，并建立了完整的评估指标，对建立的模型进行的评估，对于研究激素依赖性皮炎的发病机制有重要应用价值。
Description
技术领域
本发明属于模型评估技术领域，尤其涉及一种诱导的SD大鼠激素依赖性皮炎模型及其测定方法。
背景技术
目前，外用糖皮质激素制剂是治疗过敏和变应性皮肤病的重要手段之一，但糖皮质激素的长期不规范使用可引起皮肤屏障破坏的一系列表现，如导致激素依赖性皮炎(Corticosteroid Dependent Dermatitis,CDD)，玫瑰痤疮样皮炎(Corticosteroid-Induced Rosacea-Like Dermatitis，CIRD)等皮质类固醇相关的皮炎，目前国外皮肤专著中尚未将激素依赖性皮炎作为独立疾病加以描述，而国内较多文献将外用糖皮质激素产生的副作用也归于CDD。已有研究提示，短期外用糖皮质激素可延迟皮肤渗透屏障的恢复，并提高角质层异常剥离发生率,长期局部使用糖皮质激素可抑制表皮的增殖和分化。临床发现，长期外用糖皮质激素可出现皮肤厚度变薄和弹性降低，毛细血管扩张和紫癜等症状，同时伴有不同程度的肿胀，瘙痒及灼热等糖皮质激素的戒断反应，导致激素依赖性皮炎。激素依赖性皮炎的发生机制尚未十分明确。虽然国内已经有学者报道在香猪和豚鼠身上构建激素依赖性皮炎模型，但没有建立完整的评估指标，尤其是动物主观行为指标没有得到体现，而这个恰恰是临床患者寻求诊治的主要原因，所以，成功构建激素依赖性皮炎的动物模型，对于研究激素依赖性皮炎的发病机制有重要应用价值。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
目前国内有关激素依赖性皮炎的模型报道包括豚鼠和香猪模型，但均在只有临床体征和病理变化的探讨，因此不全面，也不太严谨，而且均在正常皮肤基础上诱导激素依赖性皮炎。本发明在结合了大鼠皮肤皮损变化、病理组织改变的基础上，再利用大鼠的搔抓行为评估大鼠的症状，造模更为科学，更接近临床。
解决以上问题及缺陷的难度为：激素依赖性皮炎是皮肤病患者在超范围、超浓度、超疗程使用外用糖皮质激素制剂后出现的亚急性皮肤炎症性疾病，表现为皮肤灼热感、紧绷感和刺痒等激匿症状(难受三联征)，但动物模型中难于评估此临床表现。所以，以往报道的动物模型基本没有探讨此类问题
解决以上问题及缺陷的意义为：1、通过症状评估，体征和病理变化，了解大鼠激素依赖性皮炎自我不适的程度，临床表现、病理特征，使模型更接近临床实例。2、在DNCB诱导的皮炎，然后过度治疗诱导CDD、以及正常皮肤基础上诱导CDD模型，可有助于探讨皮肤屏障保护药物的机制和作用。3、有利于开展屏障保护、抗炎抗过敏药物筛选及疗效评估。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种诱导的SD大鼠激素依赖性皮炎模型及其测定方法。
本发明是这样实现的，一种诱导的SD大鼠激素依赖性皮炎模型的测定方法，所述诱导的SD大鼠激素依赖性皮炎模型测定方法包括：
筛选致SD大鼠激素依赖性皮炎所需的外用0.05％CP时间；
量化SD大鼠搔抓行为观察指标；
量化SD大鼠皮肤体征；
当出现戒断反应后采集皮肤组织样本进行生化实验分析；
基于量化的SD大鼠皮肤症状及体征、病理表现，判断是否满足标准，若满足，则判定激素依赖性皮炎造模成功。
进一步，所述致SD大鼠激素依赖性皮炎所需的外用0.05％CP时间筛选方法包括：
(1)配置外用CP试剂：将终浓度所需质量的CP粉末加入30ml 75％酒精中预混，添加甘油定容至100ml，最终得到0.05％的CP；
(2)观察皮肤变化并统计SD大鼠搔抓行为，以红斑、丘疹脱屑、表皮萎缩、毛细血管扩张及相关皮肤变化为依据，判断是否出现激素戒断或激素依赖；
(3)通过对不同大鼠分别外用不同时间的CP，进行筛选预实验，确定外用0.05％CP在正常皮肤上诱导激素依赖性皮炎时长。
进一步，所述激素戒断或激素依赖判断标准为：以红斑、丘疹脱屑、表皮萎缩、毛细血管扩张及相关皮肤变化为依据，若停止外用CP后出现皮损或皮损加重，则判断为出现激素戒断；若外用CP后缓解症状，再次停药后症状反复，即为激素依赖。
进一步，所述外用0.05％CP在正常皮肤上诱导激素依赖性皮炎时长为20天。
进一步，所述SD大鼠搔抓行为观察指标量化方法为：根据搔抓频率反应瘙痒程度在0次～20次，结合皮肤症状，给与严重程度加权：每20min内，无瘙痒0分＝无搔抓；轻微不适1分＝1次～2次搔抓；轻度瘙痒2分＝3次～6次搔抓；中度瘙痒3分＝7次～10次；重度瘙痒4分＝11次～14次，严重瘙痒5分＝15次及以上，进行SD大鼠搔抓行为观察指标量化。
进一步，所述SD大鼠皮肤体征量化方法为：从用药第一天开始，统一时间每用药5天进行一次皮肤图像获取，并基于图像进行特征评分量化；
评分标准为：红斑＝1分、水肿＝2分、丘疹及脱屑＝3分、糜烂＝4分、皮肤萎缩血管扩张＝3分。
进一步，所述激素依赖性皮炎造模成功判定标准包括：
1)连续外搽CP过程中出现红斑、表皮变薄、血管扩张即毛细血管外露，大鼠出现搔抓行为、烦躁不安，伴有皮肤抓痕，则判定出现外用激素不良反应；
2)连续外搽CP后停药3天，SD大鼠出现局部红斑加重，脱屑，搔抓行为增加，则表示存在激素戒断反应；
3)激素戒断反应后，重复外用CP后症状改善，则判定为激素依赖性皮炎。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：
(1)同一SD大鼠外用0.05％CP后不同时长，皮肤出现渐进性变化，如丘疹、抓痕、紫癜、血管扩张等，如下图所示：
(2)部分SD大鼠于外用CP 15d开始出现激素戒断现象。外用激素20d后所有大鼠均出现激素戒断现象。本发明数据分析发现将是否出现皮肤红斑、血管扩张、搔抓行为分别与CP干预时间是否≥15d、≥20d、≥25d进行卡方分析，使用Fisher确切概率法进行统计分析。卡方分析显示红斑与外用CP≥20天显著相关，表皮毛细血管扩张与外用CP≥15天及≥20天均显著相关，停药后瘙痒与外用CP≥15天显著相关(p均＜0.05)。
(3)不同皮肤基础上的CDD模型中外用CP和桉树脑对皮肤的影响
I)接触性皮炎模型组(ACD组)探讨外用CP、桉树脑Cin对大鼠皮肤的影响
①基质对照组：用药15d与5d的体征评分无显著差异(p＞0.05)，用药20d体征评分较用药15d显著下降(p＜0.05)，提示基质组皮肤炎症在第20天开始消退。
②CP的干预作用：与对照组比较，用药15d较5d体征评分显著下降(p＜0.05)，表现为水肿、丘疹、糜烂的改善，但开始出现毛细血管扩张。用药20d的体征评分较15d显著上升(p＜0.05)，表现为红斑无改善，新增局部丘疹及咬痕。提示CP在第15天局部炎症已经缓解，但在外用第20天开始出现激素不良反应。
II)出现了激素依赖性皮炎病理特征。
本发明成功诱导出了激素依赖性皮炎，并建立了完整的评估指标，对建立的模型进行的评估，对于研究激素依赖性皮炎的发病机制有重要应用价值。
1、研究了桉树脑对SD大鼠CDD的保护作用：
①NS-D-2组大鼠连续外用CP后出现激素戒断现象及激素依赖现象(如图5)。
②NS-D-2自体对照实验中，对比左侧基质，右侧外用Cin后红斑及毛细血管扩张均有所缓解，同时可见局部毛发再生(如图6)；
③对NS-D组大鼠皮损(体征)及搔抓行为(症状)作评分(如表2)，与停用CP 3d后(激素依赖性皮炎状态)对比，后续外用Cin可显著减少体征及症状评分，外用基质可显著减少体征评分(均p＜0.05)。与外用基质相比，Cin可显著减少体征评分(p＜0.05)。提示单独外用Cin可减少激素依赖性皮炎的皮损及瘙痒症状。
2、研究了激素依赖性皮炎CDD皮肤细胞外相关基质蛋白透明质酸/透明质酸合成酶转录/表达。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的诱导的SD大鼠激素依赖性皮炎模型测定方法流程图。
图2是本发明实施例提供的诱导的SD大鼠激素依赖性皮炎模型测定方法原理图。
图2中：Pre-b1表示外用CP10d后停药前、停药3天后症状反跳伴随的皮肤外观表现示意图；Pre-b2表示外用CP15d后停药前、停药3天后症状反跳伴随的皮肤外观表现示意图；Pre-b3表示外用CP20d后停药前、停药3天后症状反跳伴随的皮肤外观表现示意图；Pre-b4表示外用CP25d后停药前、停药3天后症状反跳伴随的皮肤外观表现示意图。
图3是本发明实施例提供的初次致敏后不同浓度DNCB激发SD大鼠接触性皮炎皮肤外观示意图；
图3中：Pre-d1：0.1％DNCB激发24h后出现红斑、肿胀，激发5天后肿胀好转，仍有红斑；Pre-d2：1％DNCB激发24h后出现红斑、肿胀、水泡、表皮剥脱等接触性皮炎症状，激发5天后水泡消退，仍有肿胀、红斑局部皮损结痂。
图4是本发明实施例提供的外用0.05％CP不同时长后停药前后皮损变化示意图；
图5是本发明实施例提供的不同皮肤基础上的CDD模型中外用CP和桉树脑对皮肤的影响I)接触性皮炎模型组(ACD组)探讨外用CP、桉树脑Cin对大鼠皮肤的影响示意图。
图6是本发明实施例提供的不同干预措施对HA mRNA和HAS2蛋白表达的影响示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种诱导的SD大鼠激素依赖性皮炎模型及其测定方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的诱导的SD大鼠激素依赖性皮炎模型测定方法包括：
S101，筛选致SD大鼠激素依赖性皮炎所需的外用0.05％CP时间；
S102，量化SD大鼠搔抓行为观察指标；
S103，量化SD大鼠皮肤体征；
S104，当出现戒断反应后采集皮肤组织样本进行生化实验分析；
S105，基于量化的SD大鼠皮肤症状及体征、病理表现，判断是否满足标准，若满足，则判定激素依赖性皮炎造模成功。
本发明提供的诱导SD大鼠激素依赖性皮炎模型及其测定方法业内的普通技术人员还可以采用其他的步骤实施，图1的本发明提供的诱导SD大鼠激素依赖性皮炎模型及其测定方法仅仅是一个具体实施例而已。
步骤S101中，本发明实施例提供的致SD大鼠激素依赖性皮炎所需的外用0.05％CP时间筛选方法包括：
(1)配置外用CP试剂：将终浓度所需质量的CP粉末加入30ml 75％酒精中预混，添加甘油定容至100ml，最终得到0.05％的CP；
(2)观察皮肤变化并统计SD大鼠搔抓行为，以红斑、丘疹脱屑、表皮萎缩、毛细血管扩张及相关皮肤变化为依据，判断是否出现激素戒断或激素依赖；
(3)通过对不同大鼠分别外用不同时间的CP，进行筛选预实验，确定外用0.05％CP在正常皮肤上诱导激素依赖性皮炎时长。
步骤(2)中，本发明实施例提供的激素戒断或激素依赖判断标准为：
以红斑、丘疹脱屑、表皮萎缩、毛细血管扩张及相关皮肤变化为依据，若停止外用CP后出现皮损或皮损加重，则判断为出现激素戒断；若外用CP后缓解症状，再次停药后症状反复，即为激素依赖。
步骤(3)中，本发明实施例提供的外用0.05％CP在正常皮肤上诱导激素依赖性皮炎时长为20天。
步骤S102中，本发明实施例提供的SD大鼠搔抓行为观察指标量化方法为：
根据搔抓频率反应瘙痒程度在0次～20次之间，结合皮肤症状，给与严重程度加权：每20min内，无瘙痒0分＝无搔抓；轻微不适1分＝1次～2次搔抓；轻度瘙痒2分＝3次～6次搔抓；中度瘙痒3分＝7次～10次；重度瘙痒4分＝11次及以上，进行SD大鼠搔抓行为观察指标量化。
步骤S103中，本发明实施例提供的SD大鼠皮肤体征量化方法为：
从用药第一天开始，统一时间每用药5天进行一次皮肤图像获取，并基于图像进行特征评分量化；
评分标准为：红斑＝1分、水肿＝2分、丘疹及脱屑＝3分、糜烂＝4分、皮肤萎缩血管扩张＝3分。
步骤S105中，本发明实施例提供的激素依赖性皮炎造模成功判定标准包括：
1)连续外搽CP过程中出现红斑、表皮变薄、血管扩张即毛细血管外露，大鼠出现搔抓行为、烦躁不安，伴有皮肤抓痕，则判定出现外用激素不良反应；
2)连续外搽CP后停药3天，SD大鼠出现局部红斑加重，脱屑，搔抓行为增加，则表示存在激素戒断反应；
3)激素戒断反应后，重复外用CP后症状改善，则判定为激素依赖性皮炎。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1：
本发明中激素依赖性皮炎泛指长期外用激素引起的皮炎，涵盖了因长期超剂量、超疗程、超范围外用糖皮质激素引起的局部皮炎，其概念包括但不限于局部糖皮质激素戒断皮炎(Topical Corticosteroids Withdrawal Dermatitis)。
1、目的和内容
(1)在正常皮肤状态下、以及通过DNCB诱导大鼠接触性皮炎基础上建立激素依赖性皮炎模型，以CP作为干预对照，通过检测细胞外基质ECM相关蛋白表达，探讨屏障保护剂在皮肤屏障保护方面的作用。
(2)内容：主要为以下五个方面。进行屏障保护剂的皮肤毒性实验研究，确定最适屏障保护剂浓度。SD大鼠正常皮肤上外用CP诱导的CDD模型，确定最适实验时长。建立SD大鼠接触性皮炎动物模型，并0.05％CP治疗，诱导CDD建立SD大鼠皮炎的皮肤症状、体征评价方法。分组基础上，检测各实验SD大鼠皮肤6种皮肤屏障ECM相关蛋白及3种炎症物质的表达
2、方法及技术路线
2.1、动物处理
(1)动物检疫：①检查运送SPF级SD大鼠的隔离运输盒的密闭情况；②确认运输盒无破损。运输盒经外包装消毒，紫外线消毒后转移至隔离区；③隔离环境中观察一周，无特殊后转移至动物饲养间。
(2)动物饲养环境：①SPF级屏蔽环境，饲养室温度保持在21～25℃，相对湿度在50％～65％。②持续提供高压消毒灭菌的全价营养颗粒饲料及饮用水，消毒灭菌处理的玉米芯垫料每周更换1～2次，保持干净卫生；
(3)动物及样本处理：①参与实验大鼠的大鼠均需饲养至体重大于300g，同期实验选取体重相近的大鼠作随机分组。②根据实验计划，提前3天进行腹腔注射2％戊巴比妥钠30mg/kg麻醉；③麻醉后剃除颈后大于3cm×3cm区域的毛发，并进行脱毛处理作为后续外用药物区域；④外用药物阶段前对实验区域外用生理盐水，作为外用药物行为训练，共3天。⑤采用过量麻醉处死法对大鼠进行处死，对需提取蛋白或mRNA的组织样本，在取出新样本后立刻加入保存液，4℃过夜后转移至-80℃保存。
(4)遵循动物伦理学3R原则：replacemen(替代)、reduction(减少)和refinement(优化)，在无实验干扰因素的情况下减少动物的损耗及对动物的伤害，下列实验均基于该原则。
2.2、0.05％CP诱导激素依赖性皮炎评估体系及使用
(1)筛选致SD大鼠激素依赖性皮炎所需的外用0.05％CP时间。
①外用CP试剂的配置：将终浓度所需质量的CP粉末加入30ml 75％酒精中预混，添加甘油定容至100ml，最终得到0.05％(m/v)CP。
②SD大鼠激素依赖性皮炎临床特征评估：观察皮肤变化及统计SD大鼠搔抓行为。以红斑、丘疹脱屑、表皮萎缩、毛细血管扩张等皮肤变化为依据。如停止外用CP后出现皮损或皮损加重，则判断为出现激素戒断现象。如外用CP后缓解症状，再次停药后症状反复，即为激素依赖现象。
③筛选时间：设有4组，共4只SD大鼠，每组1只。各预实验大鼠分组命名如下(命名采用Pre+小写字母命名与正式实验区分)：Pre-b1：外用0.05％CP 10d；Pre-b2：外用0.05％CP 15d；Pre-b3：外用0.05％CP 20d；Pre-b4：外用0.05％CP 25d；
通过上述预实验，确定外用0.05％CP在正常皮肤上诱导激素依赖性皮炎时长为20天。
(2)SD大鼠搔抓行为(症状)观察指标量化
搔抓的定义：利用同一动作抓绕皮肤达到1秒记为即为搔抓(如连续搔抓≥6秒，表示瘙痒剧烈，计2次)，仅计算前肢搔抓颈后，弯腰啃咬背部或后肢搔抓侧腹部等针对颈后实验区域的搔抓行为。
症状评分：根据本实验中搔抓频率反应瘙痒程度(连续观察，记录每20分钟内搔抓次数)在0次～20次之间，结合皮肤症状，给与严重程度加权：每20min内，无瘙痒0分＝无搔抓；轻微不适1分＝1次～2次搔抓；轻度瘙痒2分＝3次～6次搔抓；中度瘙痒3分＝7次～10次；重度瘙痒4分＝11次及以上。
(3)SD大鼠皮肤表现(体征)量化
定期皮肤拍照计分：拍照从用药第一天开始，随后每用药5天进行一次，统一在下午6时至7时之间进行。
体征评分：红斑＝1分、水肿＝2分、丘疹及脱屑＝3分、糜烂＝4分、皮肤萎缩血管扩张＝3分。
(4)及时采集SD大鼠皮肤组织进行病理检查：
结合上述大鼠行为及症状观察的结果，大鼠激素依赖性皮炎停用激素后的戒断反应在停药3天后出现，本试验选取该时间点采集样本作生化实验分析，为保持实验条件一致，所有实验组的样品均在停药3天后采集。
(5)基于SD大鼠皮肤症状及体征、病理表现，符合下列条件确认激素依赖性皮炎造模成功。
1)连续外搽CP过程中出现红斑、表皮变薄、血管扩张(毛细血管外露)，大鼠出现搔抓行为、烦躁不安，伴有皮肤抓痕，说明出现外用激素不良反应。
2)连续外搽CP后停药3天，SD大鼠出现局部红斑加重，脱屑，搔抓行为增加，说明出现激素戒断反应，Ⅲ)激素戒断反应后，重复外用CP后症状改善，是典型的激素依赖性皮炎症状。
2.3实验一、在大鼠正常皮肤上制作SD大鼠激素依赖性皮炎模型，并研究皮肤屏障保护剂的作用
(1)实验设计：①分5组：NS-A组：基质对照组，酒精甘油搽剂(基质)，每天2次×20d，1只用于采集样本；NS-B组：单纯CP组，0.05％CP搽剂，每天2次×20d，1只用于采集样本；NS-C组：屏障保护剂组，外用屏障保护剂(搽剂)，每天2次×20d，1只用于采集样本；NS-D组：先用CP后用屏障保护剂干预组，CP每天2次×20d/至激素依赖性皮炎，随后屏障保护剂每天2次×20d；4只大鼠。NS-D-1大鼠：1只用于摄影观察并记录搔抓行为、症状评分及采集样本；NS-D-2大鼠：3只用于拍照记录皮损并作体征评分(分别编号NS-D-2a，NS-D-2b，NS-D-2c)。在引起激素戒断现象及激素依赖现象，即成功诱导激素依赖性皮炎后，在NS-D-2背部备皮区域的左侧外用基质，同时右侧外用屏障保护剂，10天后对比两侧皮肤状况(自体左右对照)。NS-E组：屏障保护剂+CP混合组，屏障保护剂+0.05％CP复方搽剂，每天2次×20d；NS-E-1：1只用于摄影观察并记录搔抓行为(症状)及采集样本；NS-E-2：1只用于拍照记录皮损并作体征评分。
(2)外用用药及随访观察：涂抹于各SD大鼠背部试验区域中央2cm×2cm的区域每日2次，连续外用0.05％(m/v)CP溶液10d、15d、20d、25d，期间每5日记录一次搔抓行为及皮肤症状；所有实验组SD大鼠按计划停药后，均在次日早上拍照并观察皮损，随后停药3天后，再次拍照并观察皮损。NS-D-1、NS-E-1为避免频繁麻醉操作影响行为，不参与照相记录。NS-D-2、NS-E-2每次拍照前均进行麻醉操作。摄影从用药第一天开始，随后每用药5天进行一次，统一在下午6时至7时之间进行。
2.4实验二：接触性皮炎模型组(ACD组)，在DNCB诱导的接触性皮炎基础上，通过0.05％CP单独或联合屏障保护剂过度治疗，诱导激素依赖性皮炎，探讨屏障保护剂对大鼠皮肤症状及体征、
确定利用DNCB诱导变应性接触性皮炎模型所需DNCB浓度。
(1)设置2只SD大鼠，均首次一次性外用7％(m/v)DNCB的丙酮溶液初次致敏并在24小时后拍照记录皮损。
(2)致敏2周后分别对2只大鼠外用0.1％DNCB及1％DNCB进行再次激发，并在24小时后记录皮损，诱发5天后再次记录皮损，通过观察并对比用药前后皮肤变化，评估变应性接触性皮炎激发试验是否成功。
(3)各预实验大鼠分组命名如下(命名采用Pre+小写字母命名与正式实验区分)：Pre-d1：外用7％(m/v)DNCB诱导，2周后外用0.1％DNCB激发。Pre-d2：外用7％(m/v)DNCB诱导，2周后外用1％DNCB激发。
(2)动物实验在DNCB诱导的接触性皮炎基础上，0.05％过度治疗，诱导激素依赖性皮炎。
(1)实验设计：在进行分组实验前统一利用7％及0.1％DNCB诱发变应性接触性皮炎(ACD)，在成功诱导接触性皮炎。
①分4组：ACD-A：接触性皮炎后酒精甘油搽剂，每天2次×20d，；ACD-B：接触性皮炎后外用0.05％CP搽剂，每天2次×20d，；ACD-C：接触性皮炎后外用屏障保护剂搽剂，每天2次×20d；ACD-E：接触性皮炎后外用屏障保护剂+0.05％CP复方搽剂，每天2次×20d。
上述每组3只，在进行分组实验前统一利用DNCB构建变应性接触性皮炎，在成功诱导接触性皮炎次日开始外用各组制剂。DNCB诱导及外用药物最后一天(第20天)均经麻醉后脱毛处理，其余各阶段均无脱毛处理。
②大鼠的皮肤症状观察：每组3只大鼠均进行皮损拍照记录，记录第一天后，随后每用药5天进行一次记录，为统一记录时间，记录均在下午6时至7时之间进行。
2.5、动物处理时间轴及技术路线图(见表1)(8％Cin为屏障保护剂)
表1：动物处理时间表
注：每日处理及每5日处理在动物处死前均重复进行。“-”表示无特殊处理，常规进行每日处理及每5日处理。
四、结果
1、预实验：①屏障保护剂最佳实验浓度为8％；②正常SD大鼠皮肤外用激素0.05％CP 20d后所有大鼠均出现激素戒断现象(图3、表2)，选择20天作为实验时长；③变应性接触性皮炎选择首次7％DNCN诱导，2周后0.1％DNCB激发(图4，表3)。
表2不同观察时间点出现CAD相关表现与行为SD大鼠(只)
表5-1注：将是否出现皮肤红斑、血管扩张、搔抓行为分别与CP干预时间是否≥15d、≥20d、≥25d进行卡方分析，使用Fisher确切概率法进行统计分析。
表3 ACD组中不同干预措施对SD大鼠皮肤症状评分
本发明在正常SD大鼠正常皮肤、以及DNCB诱导的SD大鼠接触性皮炎模型病理皮肤两种模式下，通过对大鼠皮肤研究，成功诱导出了激素依赖性皮炎。
下面结合实验对本发明的技术效果作详细的描述。
一、外用Cin及CP对大鼠皮肤表达Caspase-14、AQP3、MMP-9、HAS2蛋白表达的影响
(1)外用Cin及CP对Caspase-14蛋白的影响
①正常皮肤组：对比基质组，CP可显著下调Casepase-14蛋白表达水平达36.2％(p＜0.05)，Cin、CP后Cin干预、CP+Cin均轻微上调Csapase-14蛋白表达，分别上调4.0％、22.8％、10.5％，但差异不显著(p＞0.05)；②接触性皮炎模型组：对比基质组，CP、Cin、CP+Cin均出现了Casepase-14蛋白表达水平下调(均P＜0.05)，分别下调42.7％、46.3％、56.0％。
(2)外用Cin及CP对AQP3蛋白的影响
①正常皮肤组：对比基质组，外用CP、外用Cin、外用CP+Cin均显著上调AQP3蛋白表达，分别上调54.5％、62.8％、95.4％(均P＜0.05)。②接触性皮炎模型组：对比基质组，外用Cin、CP+CP均显著上调AQP3蛋白表达，分别上调51.2％、71.2％(均P＜0.05)而CP同样上调AQP3蛋白表达20.0％，但不显著(p＞0.05)。
(3)外用Cin及CP对MMP-9蛋白的影响
①正常皮肤组：对比基质组，CP+Cin、CP后Cin干预均显著上调MMP-9的蛋白表达水平，分别上调87.4％、220.6％(均P＜0.05)，此外，单独CP、Cin同样上调MMP-9蛋白表达，分别34.8％、43.8％，但差异不显著(p＞0.05)。②接触性皮炎模型组：对比基质组，外用CP+Cin下调MMP-9的蛋白表达水平16.0％，具有统计学意义(均P＜0.05)。
(4)外用Cin及CP对Per蛋白的影响
①正常皮肤组：对比基质组，外用CP、Cin、CP后Cin、CP+Cin均显著上调Per的表达，分别上调60.3％、28.4％、49.8％、35.0％(均P＜0.05)。②接触性皮炎模型组：对比基质组，外用CP、Cin、CP+Cin均上调Per蛋白表达，分别上调24.3％、234.1％、140.8％(均P＜0.05)。
(5)外用Cin及CP对HAS2蛋白的影响
①正常皮肤组：对比基质组，外用CP、CP+Cin均显著下调HAS2的表达，分别下调37.3％、22.0％(均P＜0.05)。外用Cin、CP后Cin干预均可显著上调HAS2的表达，分别上调60.9％、130.2％。②接触性皮炎模型组：对比基质组，外用CP、Cin、CP+Cin均下调HAS2蛋白表达，分别下调91.0％、83.2％、88.6％(均P＜0.05)。
二、桉树脑Cin及CP对实验SD大鼠CDD皮肤NF-κB p65表达的影响：
①NF-κB p65定位特点：各组NF-κB p65均在KC胞浆中普遍表达并局限在表皮层内。
ACD-A：NF-κB p65均质弥散分布于角质层内，无明显核转移现象(少于10％)；
ACD-B：因表皮层较薄，NF-κB p65呈带状均质分布，73.6％的角质层细胞出现细胞核与NF-κB p65阳性区域重叠，即发生了NF-κB p65的核内转移，；
ACD-C：NF-κB p65主要在表皮颗粒层中聚集，部分在基底层/乳头层聚集，无明显核转移现象(少于10％)。
ACD-E：NF-κB p65普遍均质分布，局部发生表皮颗粒层聚集与ACD-B相比，ACD-E角质层细胞约29.7％发生核转移，显著减少(p＜0.05)。
②NF-κB p65表达水平：与基质对照组相比，外用CP可显著降低NF-κB p65的表达(p＜0.05)，CP及CP+Cin无显著差异(p＞0.05)。
三、桉树脑Cin及CP对实验SD大鼠CDD皮肤IκBa表达的影响
①IκBa定位特点：IκBa在KC胞浆中普遍表达，但基底层的KC的表达最为活跃，IκBa在胞浆主要分布于细胞核周，IκBa在胞浆的分布基本与NF-κB p65互斥。
②IκBa表达水平(如表5-6)：与基质对照组相比，CP、Cin、CP+Cin混合制剂均可上调IκBa的表达(p＜0.05)。其中单独外用Cin显色程度显著高于CP及CP+Cin(p＜0.05)。
(1)同一SD大鼠外用0.05％CP后不同时长，皮肤出现渐进性变化，如丘疹、抓痕、紫癜、血管扩张等。
(2)部分SD大鼠于外用CP 15d开始出现激素戒断现象。外用激素20d后所有大鼠均出现激素戒断现象。本发明数据分析发现将是否出现皮肤红斑、血管扩张、搔抓行为分别与CP干预时间是否≥15d、≥20d、≥25d进行卡方分析，使用Fisher确切概率法进行统计分析。卡方分析显示红斑与外用CP≥20天显著相关，表皮毛细血管扩张与外用CP≥15天及≥20天均显著相关，停药后瘙痒与外用CP≥15天显著相关(p均＜0.05)。
(3)如图5所示，不同皮肤基础上的CDD模型中外用CP和桉树脑对皮肤的影响I)接触性皮炎模型组(ACD组)探讨外用CP、桉树脑Cin对大鼠皮肤的影响
①基质对照组：用药15d与5d的体征评分无显著差异(p＞0.05)，用药20d体征评分较用药15d显著下降(p＜0.05)，提示基质组皮肤炎症在第20天开始消退。
②CP的干预作用：与对照组比较，用药15d较5d体征评分显著下降(p＜0.05)，表现为水肿、丘疹、糜烂的改善，但开始出现毛细血管扩张。用药20d的体征评分较15d显著上升(p＜0.05)，表现为红斑无改善，新增局部丘疹及咬痕。提示CP在第15天局部炎症已经缓解，但在外用第20天开始出现激素不良反应。
II)出现了激素依赖性皮炎病理特征
本发明成功诱导出了激素依赖性皮炎，并建立了完整的评估指标，对建立的模型进行的评估，对于研究激素依赖性皮炎的发病机制有重要应用价值。
1、研究了桉树脑的SD大鼠DPD①NS-D-2组大鼠连续CP后出现激素戒断现象及激素依赖现象。
②NS-D-2自体对照实验中，对比左侧基质，右侧外用Cin后红斑及毛细血管扩张均有所缓解，同时可见局部毛发再生；
③对NS-D组大鼠皮损(体征)及搔抓行为(症状)作评分，与停用CP 3d后(激素依赖性皮炎状态)对比，后续外用Cin可显著减少体征及症状评分，外用基质可显著减少体征评分(均p＜0.05)。与外用基质相比，Cin可显著减少体征评分(p＜0.05)。提示单独外用Cin可减少激素依赖性皮炎的皮损及瘙痒症状。
2、研究了激素依赖性皮炎CDD皮肤细胞外相关基质蛋白透明质酸/透明质酸合成酶转录/表达，如图6所示，
正常皮肤模型中，CP抑制HAS2表达；Cin单用或序贯干预后均促进HA转录及HAS2表达。ACD诱导模型中，CP抑制HA/HAS2的转录/表达。Cin抑制HAS2表达。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种诱导的SD大鼠激素依赖性皮炎模型测定方法，其特征在于，所述诱导的SD大鼠激素依赖性皮炎模型的测定方法包括：
筛选致SD大鼠激素依赖性皮炎所需的外用0.05％CP时间；
量化SD大鼠搔抓行为观察指标；
量化SD大鼠皮肤体征；
当出现戒断反应后采集皮肤组织样本进行生化实验分析；
基于量化的SD大鼠皮肤症状及体征、病理表现，判断是否满足标准，若满足，则判定激素依赖性皮炎造模成功。
2.如权利要求1所述的诱导的SD大鼠激素依赖性皮炎模型测定方法，其特征在于，所述致SD大鼠激素依赖性皮炎所需的外用0.05％CP时间筛选方法包括：
(1)配置外用CP试剂：将终浓度所需质量的CP粉末加入30ml 75％酒精中预混，添加甘油定容至100ml，最终得到0.05％的CP；
(2)观察皮肤变化并统计SD大鼠搔抓行为，以红斑、丘疹、脱屑、表皮变薄、甚至萎缩、毛细血管扩张及相关皮肤变化为依据，判断是否出现激素戒断或激素依赖；
(3)通过对不同实验组大鼠分别外用不同时间的CP，进行筛选预实验，确定外用0.05％CP在正常皮肤上诱导激素依赖性皮炎时长。
3.如权利要求2所述的诱导的SD大鼠激素依赖性皮炎模型测定方法，其特征在于，所述激素戒断或激素依赖判断标准为：以红斑、丘疹、脱屑、表皮变薄、甚至萎缩、毛细血管扩张及相关皮肤变化为依据，若停止外用CP后出现皮损或皮损加重，则判断为出现激素戒断；若外用CP后缓解症状，再次停药后症状反复，即为激素依赖。
4.如权利要求2所述的诱导的SD大鼠激素依赖性皮炎模型测定方法，其特征在于，所述外用0.05％CP在正常皮肤上诱导激素依赖性皮炎时长为20天，诱导激素依赖性皮炎是一个渐进过程，时长20天应理解为大致时间。
5.如权利要求1所述的诱导的SD大鼠激素依赖性皮炎模型及其测定方法，其特征在于，所述SD大鼠搔抓行为观察指标量化方法为：根据搔抓频率反应瘙痒程度在0次～20次，结合皮肤症状，给与严重程度加权：每20min内，无瘙痒0分＝无搔抓；轻微不适1分＝1次～2次搔抓；轻度瘙痒2分＝3次～6次搔抓；中度瘙痒3分＝7次～10次；重度瘙痒4分＝11次～14次，严重瘙痒5分＝15次及以上，进行SD大鼠搔抓行为观察指标量化。
6.如权利要求1所述的诱导的SD大鼠激素依赖性皮炎模型测定方法，其特征在于，所述SD大鼠皮肤体征量化方法为：从用药第一天开始，统一时间每用药5天进行一次皮肤图像获取，并基于图像进行特征评分量化；
评分标准为：红斑＝1分、水肿＝2分、丘疹及脱屑＝3分、糜烂＝4分、皮肤萎缩血管扩张＝3分。
7.如权利要求1所述的诱导的SD大鼠激素依赖性皮炎模型测定方法，其特征在于，所述激素依赖性皮炎造模成功判定标准包括：
1)连续外搽CP过程中出现红斑、表皮变薄、血管扩张即毛细血管外露，大鼠出现搔抓行为、烦躁不安，伴有皮肤抓痕，则判定出现外用激素不良反应；
2)连续外搽CP后停药3天，SD大鼠出现局部红斑加重，脱屑，搔抓行为增加，则表示存在激素戒断反应；
3)激素戒断反应后，重复外用CP后症状改善，则判定为激素依赖性皮炎。
8.一种如权利要求1～7任意一项所述诱导的SD大鼠激素依赖性皮炎模型测定方法使用的诱导SD大鼠激素依赖性皮炎模型。
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2020
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