CN111870693B - 一种黑磷促进精氨酸快速释放no的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种黑磷促进精氨酸快速释放NO的方法，取4‑二甲氨基吡啶、含胍基化合物和黑磷反应；分离得到保护的黑磷BP‑含胍基化合物；取1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺(EDC)、N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)和葡萄糖氧化酶(GOx)在PB中反应；加入BP‑含胍基化合物，离心得到GOx和BP‑含胍基化合物偶联物BP‑含胍基化合物‑GOx；将BP‑含胍基化合物‑GOx溶解于葡萄糖溶液中，用近红外光照射黑磷，产生过氧化氢(H2O2)，H2O2氧化含胍基化合物快速产生NO。用黑磷光热效应，促进葡萄糖氧化酶产生过氧化氢、精氨酸氧化快速产生NO。产品稳定性好，酶活高，NO释放快速，产量高。

Description

一种黑磷促进精氨酸快速释放NO的方法
技术领域
本发明涉及二维材料制备方法，特别涉及一种黑磷促进精氨酸快速释放NO的方法。
背景技术
一氧化氮(nitric oxide，NO)是生物体内一种重要的生物信号分子和效应分子，是由NO合酶(NOS)催化精氨酸产生，生物体内各组织中起到各种生理作用如扩张血管，抗肿瘤等，但受限于内源性NO的产生量，往往难以满足机体应对病变的需要，所以外源性NO供体已被开发作为其主要来源。NO供体类型主要分为有机硝酸酯、S-亚硝基硫醇、硝普盐、呋咱N-氧化物、偶氮鎓二醇盐等。这些小分子NO供体在疾病治疗中已经有广泛的应用，但也存在半衰期短，特异性差，代谢产物毒副作用大等缺点。这些都在不同程度上阻碍了其在生物医药领域的应用，因此，为了弥补外源性NO供体带来的不足，对于内源性NO的开发极为重要。
精氨酸在体内是一种重要的氨基酸，精氨酸不仅可以在NOS的作用下产生NO，在H2O2作用下，精氨酸也能被氧化产生NO。A.R.Ray等(Journal of Molecular Catalysis A：Chemical，2007：207-214.)设计一种简单易行的负载铁(III)卟啉催化剂，用铁(III)卟啉模拟一氧化氮合酶的作用来催化L-Arg与H2O2的仿生氧化产生NO。Fan等(Angew.Chem.Int.Ed.2016(55)：1-6.)设计一种新型的葡萄糖反应体系(L-Arg-HMON-GOx)，利用中空介孔有机二氧化硅纳米粒子(HMON)作为载体，在葡萄糖氧化酶(GOx)的作用下将其转化为葡萄糖酸和H2O2，H2O2进一步氧化L-精氨酸产生NO。
精氨酸作为NO供体已被用于各种抗菌及抗肿瘤治疗中，但该过程存在释放缓慢且释放量少等缺陷，因此亟需一种有效策略来弥补现存不足。黑磷(BP)由于其紫外到近红外光的宽吸收，近红外消光系数大和光热转换效率高等特点，可以作为良好的光热试剂。
发明内容
发明目的：本发明目的是提供加速H2O2与Arg反应快速产生大量NO的方法。
技术方案：本发明提供一种黑磷促进精氨酸快速释放NO的方法，包括如下步骤：
(1)取4-二甲氨基吡啶(DMAP)、含胍基化合物和黑磷，常温下在有机溶剂和水的混合液中反应；
(2)上述反应完成后，去除未反应的含胍基化合物；
(3)将反应后的分散液离心分离得到保护的黑磷(BP-含胍基化合物)；
(4)取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和葡萄糖氧化酶(GOx)，在PB中常温反应；
(5)将BP-含胍基化合物加入上步反应中，反应后离心得到GOx和BP-含胍基化合物偶联物(BP-含胍基化合物-GOx)；
(6)将BP-含胍基化合物-GOx溶解于葡萄糖溶液中，用近红外光照射黑磷，促进GOx产生过氧化氢(H2O2)，H2O2氧化含胍基化合物快速产生NO。
BP-含胍基化合物-GOx的分子结构式如下：
Figure BDA0002628719590000021
进一步地，所述含胍基化合物为精氨酸(Arg)、刀豆氨酸。
进一步地，所述步骤(1)中的有机溶剂为N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)或二甲亚砜。
进一步地，所述步骤(2)中用透析袋去除未反应的可发生亲核取代的化合物。
进一步地，所述近红外光波长为808nm。
进一步地，所述近红外光照射后黑磷的温度范围为37℃-60℃。
有益效果：本发明基于黑磷纳米片(BPNSs)的GOx和含胍基化合物(如精氨酸)共负载体系(BP-含胍基化合物-GOx)，利用BPNSs优异的光热性能，在近红外光照射下，提升GOx酶活性，有效地将光能转化为热能，促进GOx催化葡萄糖生成H2O2，加快氧化含胍基化合物产生NO，该体系稳定性好，NO释放量高，光热效果好。共价偶联物生物相容性高，黑磷稳定性提高，且不影响其光热性能。
附图说明
图1为二维黑磷TEM图谱；
图2为BP-Arg-GOx的TEM图谱；
图3为二维黑磷的粒径图谱；
图4为BP-Arg-GOx粒径图谱；
图5为BP-Arg-GOx粒径稳定性图谱；
图6为BP-Arg-GOx的NO释放图谱。
具体实施方式
本发明缩写含义列于下表1
表1化合物定义
DMAP 4-二甲氨基吡啶
EDC 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺
NHS N-羟基琥珀酰亚胺
GOx 葡萄糖氧化酶
Arg 精氨酸
DMF N，N’-二甲基甲酰胺
实施例1
BP-Arg-GOx的合成与表征
(1)BP-Arg合成：量取1mg/mL黑磷的DMF(或为二甲亚砜)溶液2mL，加入6mg精氨酸(还可以使用刀豆氨酸等能氧化产生NO的含胍基化合物)和3mgDMAP，再加入200μL去离子水，该混合液过夜反应8h。反应完成后将混合液透析6h除去未反应的精氨酸，透析完成后，将所得产物17000g离心4min，并用去离子水清洗三遍，最后将所得产物重悬于去离子水中保存。
(2)BP-Arg-GOx合成：称取2mg GOx，加入5mg EDC和10mg NHS，在PB中活化GOx上的羧基，30min后向活化好的GOx里加入5mg BP-Arg，过夜反应后，离心取沉淀，重悬于PB中，以备后续使用。
将BP-Arg-GOx溶解于葡萄糖溶液中，用近红外光(波长为808nm)照射黑磷，促进GOx产生过氧化氢(H2O2)，H2O2氧化Arg快速产生NO。
实施例2
粒径图谱测定：各取适量的黑磷、BP-Arg-GOx，分别测定其在PB 7.4中的水动力直径。另外，在第1、5、10天时测定BP-Arg的水动力直径，监测其稳定性。
实施例3
NO释放图谱测定：取一定量BP-Arg-GOx，测定其NO释放量。
如附图1-4所示，修饰后的产物BP-Arg-GOx与原料BP经TEM和DLS分析可知，修饰后的BP表面表现出与原料BP明显的不同，DLS结果也证明，BP-Arg-GOx与BP相比，粒径有一定的增大。
如附图5所示，修饰后的产物BP-Arg-GOx经DLS分析可知，BP-Arg-GOx在PBS溶液中5天后依然保持了良好的稳定性。
如附图6所示，修饰后的产物BP-Arg-GOx经近红外光照后显示了与游离GOx相似的酶活力，表明BP-Arg-GOx修饰的成功性以及对酶活力的最大保留。

Claims (6)

1.一种黑磷促进精氨酸快速释放NO的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）取4-二甲氨基吡啶（DMAP）、含胍基化合物和黑磷，常温下在有机溶剂和水的混合液中反应；
（2）上述反应完成后，去除未反应的含胍基化合物；
（3）将反应后的分散液离心分离得到保护的黑磷BP-含胍基化合物；
（4）取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和葡萄糖氧化酶(GOx)，在PB中常温反应；
（5）将BP-含胍基化合物加入上步反应中，反应后离心得到GOx和BP-含胍基化合物偶联物BP-含胍基化合物-GOx；
（6）将BP-含胍基化合物-GOx溶解于葡萄糖溶液中，用近红外光照射黑磷，促进GOx产生过氧化氢(H2O2)，H2O2氧化含胍基化合物快速产生NO。
2.根据权利要求1所述的黑磷促进精氨酸快速释放NO的方法，其特征在于：所述含胍基化合物为精氨酸、刀豆氨酸。
3.根据权利要求1所述的黑磷促进精氨酸快速释放NO的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的有机溶剂为N, N’-二甲基甲酰胺（DMF）或二甲亚砜。
4.根据权利要求1所述黑磷促进精氨酸快速释放NO的方法，其特征在于：所述步骤（2）中用透析袋去除未反应的可发生亲核取代的化合物。
5.根据权利要求1所述的黑磷促进精氨酸快速释放NO的方法，其特征在于：所述近红外光波长为808 nm。
6.根据权利要求1所述的黑磷促进精氨酸快速释放NO的方法，其特征在于：所述近红外光照射后黑磷的温度范围为37 ℃-60 ℃。
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