CN111863127A - 一种构建植物转录因子对靶基因遗传调控网络的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种构建植物转录因子对靶基因遗传调控网络的方法，属于分子遗传学技术领域。获得植物待测转录因子在群体中每一个体的SNP基因型数据、植物待测转录因子在群体中每一个体的特定组织的表达量数据和植物待测候选靶基因在群体中每一个体的相同组织的表达量数据后；确定与候选靶基因表达量显著关联的SNP；确定与待测转录因子表达量高度相关的候选靶基因；当同时满足确定条件时，表明待测转录因子调控了候选靶基因表达，可依此构建转录因子对靶基因的遗传调控网络。本发明所述方法可高通量、精准鉴定植物转录因子与下游靶基因的调控关系，构建转录因子对靶基因的遗传调控网络。

Description

一种构建植物转录因子对靶基因遗传调控网络的方法

技术领域

本发明涉及分子遗传学技术领域，具体涉及一种构建植物转录因子对靶基因遗传调控网络的方法。

背景技术

植物大多数性状为复杂性状，受到了基因组上多层次、多基因遗传调控的影响，其遗传调控机制非常复杂。其中，转录水平的调控是基因调控中最重要的环节。特别是，转录调控网络可直观反映基因的表达调控关系，已成为生物学研究的热点问题。研究表明，转录因子是转录调控网络的关键节点，可通过广泛调控下游基因的表达，实现对植物复杂性状的调控作用。目前鉴定转录因子与下游基因的调控关系及其转录调控网络构建方法有以下两种：1)基于生物信息学预测，此方法大多仅考虑转录因子与下游基因启动子结合区域的序列特征，准确性低，假阳性高；2)依托分子生物学实验，该方法耗时长，消费高，难以实现大规模的鉴定。因此，现有技术缺少一种高通量、准确地鉴定植物转录因子对下游靶基因遗传调控网络的方法，增加了解析调控植物复杂性状遗传调控网络的难度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种构建植物转录因子对靶基因遗传调控网络的方法。本发明所述方法能够准确、高通量地鉴定植物转录因子与下游靶基因之间的转录调控关系，构建转录因子对下游靶基因的遗传调控网络。

本发明提供了一种构建植物转录因子对靶基因遗传调控网络的方法，包括以下步骤：

1)获得植物待测转录因子在群体中每一个体的SNP基因型数据；

2)获得植物待测转录因子在群体中每一个体的特定组织的表达量数据，得到待测转录因子的群体表达量；

3)获得植物待测候选靶基因在群体中每一个体的与步骤2)相同组织的表达量数据，得到候选靶基因的群体表达量；

4)将所述步骤1)中植物待测转录因子在群体中每一个体的SNP基因型数据与步骤3)中候选靶基因的群体表达量进行关联分析，确定与候选靶基因的表达量显著关联的SNP；

所述确定的条件包括：待测转录因子内任一SNP与候选靶基因的表达量显著关联；

5)计算所述步骤2)中待测转录因子的群体表达量与所述步骤3)中候选靶基因的群体表达量之间的皮尔森相关性系数r，检测待测转录因子与候选靶基因之间的表达相关性，确定与待测转录因子表达量高度相关的候选靶基因；

所述确定的条件包括：皮尔森相关性系数r>0.9或r<-0.9；

6)同时满足所述步骤4)和所述步骤5)的确定条件的候选靶基因为在所述特定组织中受待测转录因子调控的候选靶基因，依此构建待测转录因子对靶基因的遗传调控网络；

所述步骤1)、2)和3)之间没有时间先后顺序的限定；所述步骤4)和5)之间没有时间先后顺序的限定。

优选的是，所述步骤1)植物待测转录因子在群体中每一个体的SNP基因型数据是基于植物全基因组重测序获得的。

优选的是，所述步骤1)植物待测转录因子在群体中每一个体的SNP基因型数据的获得方法包括：

对所选群体的所有个体进行全基因组重测序，获得每一个体基因组序列；

将所获得的每一个体基因组序列与参考基因组进行比对，获得全基因组SNP基因型数据及其在基因组中的位置；

将待测转录因子的序列与参考基因组进行比对，获得其在基因组中的位置；结合全基因组SNP数据获得植物待测转录因子在群体中每一个体的SNP基因型数据。

优选的是，所述步骤1)植物待测转录因子在群体中的SNP基因型的频率大于10％。

优选的是，所述步骤1)～3)中，所述植物群体中个体的数量大于200株。

优选的是，所述步骤4)中关联分析使用的软件包括TASSELv5.0中的混合线性模型。

优选的是，所述关联分析的方法包括：

利用软件TASSELv5.0检测植物待测转录因子在群体中每一个体的SNP基因型数据与每一候选靶基因在群体中每一个体特定组织中表达量之间关联的显著性水平，得到P值；

使用Q-value软件对P值进行FDR多重检测，得到Q值，排除假阳性结果；

筛选P≤0.01且Q≤0.1的SNP位点，以此确定与候选靶基因的表达量显著关联的SNP。

优选的是，所述步骤5)计算皮尔森相关性系数r的软件包括SPSS v19.0。

本发明提供了一种构建植物转录因子对靶基因遗传调控网络的方法。现有技术基于生物信息学预测的方法，大多仅考虑转录因子与候选靶基因间结合区域的序列特征，准确性低，假阳性高；依托分子生物学实验方法，耗时长，消费高，难以实现大规模鉴定。本发明提供了一种构建植物转录因子对靶基因遗传调控网络的方法，获得植物待测转录因子在群体中每一个体的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms，简称SNP)基因型数据；获得植物待测转录因子在群体中每一个体的特定组织的表达量数据；同时获得植物待测候选靶基因在群体中每一个体的与上述特定组织相同组织的表达量数据；将待测转录因子群体SNP基因型数据与候选靶基因的群体表达量进行关联分析，确定与候选靶基因表达量显著关联的SNP；计算待测转录因子与候选靶基因的群体表达量之间的皮尔森相关性系数r，确定与待测转录因子表达量高度相关的候选靶基因；当同时满足确定条件时，即待测转录因子内SNP与候选靶基因表达具有显著关联，且待测转录因子与候选靶基因具有在某一相同的特定组织高度相关的表达相关性，表明待测转录因子调控了候选靶基因表达，可依此构建转录因子对靶基因的遗传调控网络，本发明所述方法可高通量、精准鉴定植物转录因子与下游靶基因的调控关系，构建转录因子对靶基因的遗传调控网络，对解析植物复杂性状的转录调控机制具有重要科学价值。

本发明实施例结果显示：采用本发明提供的方法，得出毛白杨Pto-HD-ZIP57转录因子与6个基因之间存在调控关系，并成功构建Pto-HD-ZIP57对靶基因的遗传调控网络。

附图说明

图1为本发明提供的毛白杨转录因子Pto-HD-ZIP57的遗传调控网络图；

图2为本发明提供的构建方法的分析流程图。

具体实施方式

本发明提供了一种构建植物转录因子对靶基因遗传调控网络的方法，包括以下步骤：

1)获得植物待测转录因子在群体中每一个体的SNP基因型数据；

2)获得植物待测转录因子在群体中每一个体的特定组织的表达量数据，得到待测转录因子的群体表达量；

3)获得植物待测候选靶基因在群体中每一个体的与步骤2)相同组织的表达量数据，得到候选靶基因的群体表达量；

4)将所述步骤1)中植物待测转录因子在群体中每一个体的SNP基因型数据与步骤3)中候选靶基因的群体表达量进行关联分析，确定与候选靶基因的表达量显著关联的SNP；

所述确定的条件包括：待测转录因子内任一SNP与候选靶基因的表达量显著关联；

5)计算所述步骤2)中待测转录因子的群体表达量与所述步骤3)中候选靶基因的群体表达量之间的皮尔森相关性系数r，检测待测转录因子与候选靶基因之间的表达相关性，确定与待测转录因子表达量高度相关的候选靶基因；

所述确定的条件包括：皮尔森相关性系数r>0.9或r<-0.9；

6)同时满足所述步骤4)和所述步骤5)的确定条件的候选靶基因为在所述特定组织中受待测转录因子调控的候选靶基因，依此构建待测转录因子对靶基因的遗传调控网络；

所述步骤1)、2)和3)之间没有时间先后顺序的限定；所述步骤4)和5)之间没有时间先后顺序的限定。

在本发明中，所述植物群体中个体的数量大于200株，且所述SNP基因型数据、待测转录因子的群体表达量和候选靶基因的群体表达量的获得所针对的群体优选保持一致。本发明对所述植物的种类没有特殊限定，在本发明实施例中，所述植物优选为毛白杨。

本发明获得植物待测转录因子在群体中每一个体的SNP基因型数据。在本发明中，所述植物待测转录因子在群体中每一个体的SNP基因型数据是基于植物全基因组重测序获得的。

在本发明中，所述植物待测转录因子在群体中每一个体的SNP基因型数据的获得方法优选包括：

对所选群体的所有个体进行全基因组重测序，获得每一个体基因组序列；本发明优选对所述群体中的个体分别进行全基因组测序，分别获得基因组序列。本发明对所述全基因组测序的方法没有特殊限定，采用常规测序方法即可。

将所获得的每一个体基因组序列与参考基因组进行比对，获得全基因组SNP基因型数据及其在基因组中的位置；本发明对所述比对的方法没有特殊限定，采用常规序列比对的方法即可。

将待测转录因子的序列与参考基因组进行比对，获得其在基因组中的位置；

结合全基因组SNP数据获得植物待测转录因子在群体中每一个体的SNP基因型数据。

在本发明中，所述植物待测转录因子在群体中的SNP基因型的频率优选大于10％。

本发明获得植物待测转录因子在群体中每一个体的特定组织的表达量数据，得到待测转录因子的群体表达量。

本发明获得植物待测候选靶基因在群体中每一个体的与上述技术方案所述特定组织相同的组织的表达量数据，得到候选靶基因的群体表达量。即本发明待测转录因子的群体表达量与候选靶基因的群体表达量检测时，待测转录因子和候选靶基因测定的是所述群体中每一个体的同一特定组织的表达量。本发明对植物待测转录因子与候选靶基因群体表达量数据的获取方法没有特殊限定，采用常规获取组织的群体表达量数据的方法即可。

本发明将植物待测转录因子在群体中每一个体的SNP基因型数据与候选靶基因的群体表达量进行关联分析，确定与候选靶基因的表达量显著关联的SNP；所述确定的条件包括：待测转录因子内任一SNP与候选靶基因的表达量显著关联。在本发明中，所述关联分析使用的软件优选包括TASSEL v5.0中的混合线性模型。当所述关联分析使用TASSELv5.0软件进行时，本发明所述关联分析的方法优选包括：利用软件TASSELv5.0检测植物待测转录因子在群体中每一个体的SNP基因型数据与每一候选靶基因在群体中每一个体特定组织中表达量之间关联的显著性水平，得到P值；使用Q-value软件对P值进行FDR多重检测，得到Q值，以此排除假阳性关联数据；筛选P≤0.01且Q≤0.1的SNP位点，以此确定与候选靶基因的表达量显著关联的SNP。本发明得到的与候选靶基因表达显著关联的SNP位点为待测转录因子内任意位点，但对于SNP位点的数量及属性不做限制。

本发明计算所述待测转录因子的群体表达量与所述候选靶基因的群体表达量之间的皮尔森相关性系数r，检测待测转录因子与候选靶基因之间的表达相关性，确定与待测转录因子表达量高度相关的候选靶基因；所述确定的条件包括：皮尔森相关性系数r>0.9或r<-0.9。在本发明中，所述计算皮尔森相关性系数r的软件优选包括SPSS v19.0。在本发明中，所述相关性系数r>0.9或r<-0.9，代表待测转录因子与候选靶基因表达量之间的相关性为高度相关；所述相关性系数r值的区间在-0.9～0.9，表明两者表达的相关性一般或较低，本发明不予考虑。

同时满足上述技术方案所述的两个确定条件的候选靶基因为在所述特定组织中受待测转录因子调控的候选靶基因，依此构建待测转录因子对靶基因的遗传调控网络。同时满足上述技术方案所述的两个确定条件即待测转录因子内SNP与候选靶基因表达具有显著关联，且待测转录因子与候选靶基因具有高度相关的表达相关性，表明待测转录因子调控了候选靶基因表达。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种构建植物转录因子对靶基因遗传调控网络的方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

使用本发明的一种构建植物转录因子对靶基因遗传调控网络的方法，鉴定毛白杨Pto-HD-ZIP57转录因子调控的基因，构建Pto-HD-ZIP57对靶基因的遗传调控网络。

步骤S1，获得Pto-HD-ZIP57转录因子在毛白杨自然群体中每一个体的SNP基因型数据，具体步骤如下：

首先，以毛白杨自然群体中435株个体为材料，提取所有个体的DNA用于重测序，以毛白杨基因组作为参考基因组进行序列比对，获得全基因组SNP数据及其所在基因组中的位置。其次，利用bioedit软件，将毛白杨Pto-HD-ZIP57的基因组序列与参考基因组进行序列比对，获得Pto-HD-ZIP57基因的位置信息，结合全基因组SNP数据，获得Pto-HD-ZIP57的群体SNP基因型数据。筛选基因型频率大于10％的SNP，最终检测到Pto-HD-ZIP57内的53个SNP，详细信息见表1。

表1 Pto-HD-ZIP57内SNP信息表

步骤S2，收集毛白杨自然群体中435株个体的叶片，采集完后立即置于液氮环境(-196℃)中保存。利用Plant Qiagen RNAeasy kit(Qiagen China,Shanghai,China)试剂盒对采集的叶片RNA进行提取，质量评估之后送至生物公司进行转录组测序，获得Pto-HD-ZIP57与15个候选靶基因在叶片中的群体表达量。15个候选靶基因分别为：Pto-4CL3、Pto-C4H3、Pto-CCR10、Pto-CCR29、Pto-CCR33、Pto-COMT2、Pto-COMT25、Pto-COMT30、Pto-COMT34、Pto-F5H2、Pto-HCT12、Pto-PAL2、Pto-PO54、Pto-CCoAOMT1、Pto-LAC25。

步骤S3，利用TASSELv5.0中的混合线性模型，将毛白杨Pto-HD-ZIP57内53个SNP与15个候选靶基因的群体表达量进行关联分析，鉴定与15个候选靶基因表达量显著关联的SNP，所述确定的条件包括：毛白杨Pto-HD-ZIP57内任意SNP与15个候选靶基因的群体表达量显著关联，即P≤0.01，Q≤0.1的关联结果。结果发现Pto-HD-ZIP57内17个SNPs与10个候选靶基因表达性状之间形成了32个显著的关联，具体结果如表2所示。

表2 Pto-HD-ZIP57内SNP与10个候选靶基因表达量关联分析结果

步骤S4，利用SPSS v19.0软件，计算Pto-HD-ZIP57的群体表达量与15个候选靶基因的群体表达量之间的皮尔森相关性系数r，结果发现，有8个候选靶基因的表达量与Pto-HD-ZIP57高度相关(r>0.9或r<-0.9)，具体信息见表3。

表3 Pto-HD-ZIP57与15个候选靶基因之间的表达相关性

步骤S5，综合考虑步骤S3与S4的结果，Pto-HD-ZIP57内SNP影响了10个候选靶基因的表达量，表明Pto-HD-ZIP57对这10个候选靶基因的表达具有显著遗传效应；且发现Pto-HD-ZIP57的表达与8个候选靶基因的表达量具有高度相关性。综合上述两个结果，发现Pto-HD-ZIP57内SNP既与6个候选靶基因表达量显著关联，且Pto-HD-ZIP57与这6个基因具有高度的表达相关性，表明Pto-HD-ZIP57调控了6个候选靶基因的表达，这6个候选靶基因分别为Pto-4CL3、Pto-C4H3、Pto-HCT12、Pto-CCR33、Pto-COMT2、Pto-COMT30，并依此构建了Pto-HD-ZIP57的遗传调控网络(图1，毛白杨转录因子Pto-HD-ZIP57的遗传调控网络)。

由上述可见，毛白杨转录因子Pto-HD-ZIP57与6个靶基因之间的调控关系，并构建了Pto-HD-ZIP57对靶基因的遗传调控网络。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种构建植物转录因子对靶基因遗传调控网络的方法，包括以下步骤：

1)获得植物待测转录因子在群体中每一个体的SNP基因型数据；

2)获得植物待测转录因子在群体中每一个体的特定组织的表达量数据，得到待测转录因子的群体表达量；

3)获得植物待测候选靶基因在群体中每一个体的与步骤2)相同组织的表达量数据，得到候选靶基因的群体表达量；

4)将所述步骤1)中植物待测转录因子在群体中每一个体的SNP基因型数据与步骤3)中候选靶基因的群体表达量进行关联分析，确定与候选靶基因的表达量显著关联的SNP；

所述确定的条件包括：待测转录因子内任一SNP与候选靶基因的表达量显著关联；

5)计算所述步骤2)中待测转录因子的群体表达量与所述步骤3)中候选靶基因的群体表达量之间的皮尔森相关性系数r，检测待测转录因子与候选靶基因之间的表达相关性，确定与待测转录因子表达量高度相关的候选靶基因；

所述确定的条件包括：皮尔森相关性系数r>0.9或r<-0.9；

6)同时满足所述步骤4)和所述步骤5)的确定条件的候选靶基因为在所述特定组织中受待测转录因子调控的候选靶基因，依此构建待测转录因子对靶基因的遗传调控网络；

所述步骤1)、2)和3)之间没有时间先后顺序的限定；所述步骤4)和5)之间没有时间先后顺序的限定。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)植物待测转录因子在群体中每一个体的SNP基因型数据是基于植物全基因组重测序获得的。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤1)植物待测转录因子在群体中每一个体的SNP基因型数据的获得方法包括：

对所选群体的所有个体进行全基因组重测序，获得每一个体基因组序列；

将所获得的每一个体基因组序列与参考基因组进行比对，获得全基因组SNP基因型数据及其在基因组中的位置；

将待测转录因子的序列与参考基因组进行比对，获得其在基因组中的位置；结合全基因组SNP数据获得植物待测转录因子在群体中每一个体的SNP基因型数据。

4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤1)植物待测转录因子在群体中的SNP基因型的频率大于10％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)～3)中，所述植物群体中个体的数量大于200株。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中关联分析使用的软件包括TASSELv5.0中的混合线性模型。

7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述关联分析的方法包括：

利用软件TASSELv5.0检测植物待测转录因子在群体中每一个体的SNP基因型数据与每一候选靶基因在群体中每一个体特定组织中表达量之间关联的显著性水平，得到P值；

使用Q-value软件对P值进行FDR多重检测，得到Q值，排除假阳性结果；

筛选P≤0.01且Q≤0.1的SNP位点，以此确定与候选靶基因的表达量显著关联的SNP。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5)计算皮尔森相关性系数r的软件包括SPSS v19.0。

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