CN111856031B - 通过测定外周血中性粒细胞中蛋白的表达来鉴定烟碱暴露的潜在生物标志物的方法 - Google Patents

通过测定外周血中性粒细胞中蛋白的表达来鉴定烟碱暴露的潜在生物标志物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过测定外周血中性粒细胞中蛋白的表达来鉴定烟碱暴露的潜在生物标志物的方法，所述方法包括：基于条件性位置偏爱(CPP)装置建立大鼠烟碱CPP获得模型，最终获得无烟碱摄入大鼠和烟碱依赖大鼠；分别从获得的两组大鼠中提取外周血，提取外周血中性粒细胞的总蛋白；通过Western Blotting分别检测获得的两组总蛋白中特定蛋白的表达；通过统计学分析检测得到的特定蛋白的表达在两组之间是否具有显著性差异，当具有显著性差异时，所述蛋白被鉴定为烟碱暴露的潜在生物标志物。本方法可模拟吸烟依赖和不吸烟的两种吸烟状态，对外周血中性粒细胞中蛋白水平进行测定，对于烟碱暴露生物标志物的相关研究具有较高应用价值。

Description

通过测定外周血中性粒细胞中蛋白的表达来鉴定烟碱暴露的潜在生物标志物的方法
技术领域
本发明属于生命科学研究领域，具体而言涉及一种基于模拟吸烟成瘾和不吸烟的两种吸烟状态的大鼠模型，通过检测特定蛋白的表达来鉴定烟碱暴露的潜在生物标志物的方法。
背景技术
在致瘾性药物的研究过程中，动物成瘾模型的构建起关键作用。条件性位置偏爱(conditioned place preference,CPP)是1979年建立并逐步完善的用于检测药物依赖性的经典行为学实验方法，通过训练使动物建立药物奖赏效应与某种特定环境之间的联系，通过测定动物对给予药物奖赏的环境是否产生偏爱，来评价动物对药物的渴求程度。
烟碱(尼古丁)是烟草中含量最高的生物碱，具有重要的药理学活性，也是烟草烟气中主要致瘾物质。因此，可以考虑尝试建立烟碱成瘾的动物模型，通过模拟吸烟成瘾和不吸烟的两种吸烟状态，来鉴定烟碱暴露相关的生物标志物。
发明内容
本发明的目的是建立一种烟碱成瘾的动物模型，通过模拟吸烟成瘾和不吸烟的两种吸烟状态来鉴定烟碱暴露的潜在生物标志物的方法。特别是，该方法基于模拟吸烟成瘾和不吸烟两种不同吸烟状态的大鼠模型的外周血中性粒细胞中的蛋白表达情况，通过统计学分析发现可能存在的烟碱暴露的潜在生物标志物。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明提供一种通过测定外周血中性粒细胞中蛋白的表达来鉴定烟碱暴露的潜在生物标志物的方法，所述方法包括：基于条件性位置偏爱(CPP)装置建立大鼠烟碱获得模型，最终获得无烟碱摄入大鼠和烟碱依赖大鼠，检测两种大鼠的外周血中性粒细胞中蛋白的表达，当所述蛋白的表达在两种大鼠之间具有显著性差异时，即被鉴定为烟碱暴露的潜在生物标志物。
本发明提供的方法包括以下步骤：
1)基于条件性位置偏爱(CPP)装置建立大鼠烟碱CPP获得模型，最终获得无烟碱摄入大鼠和烟碱依赖大鼠；
2)分别从步骤1)获得的两组大鼠中提取外周血，进一步提取外周血中性粒细胞的总蛋白；
3)通过Western Blotting分别检测步骤2)获得的两组总蛋白中特定蛋白的表达；
4)分析步骤3)检测得到的特定蛋白的表达在两组之间是否具有显著性差异，当具有显著性差异时，所述蛋白被鉴定为烟碱暴露的潜在生物标志物。
优选地，所述步骤1)包括：
将大鼠随机分成实验组和对照组，每组大鼠的数量≥8只；
每2天1个给药周期，在奇数日对实验组大鼠皮下注射烟碱溶液，给药剂量为0.6mg/kg，对照组大鼠注射相同体积的生理盐水，注射后立即放入CPP装置的白箱中让大鼠自由活动40min，然后放回笼中常规饲养；在偶数日对实验组和对照组的大鼠均皮下注射相同体积的生理盐水，注射后立即放入CPP装置的黑箱中让大鼠自由活动40min，然后放回笼中常规饲养；
在开始给药后的第11天开始进行CPP测试，测试时间为当日注射烟碱溶液之前，所述测试包括：将各组的大鼠分别放入CPP箱中并去掉两侧隔板，使其在两侧黑白箱中自由活动10min，记录其在白箱中停留的时间；
在开始给药后第13天，实验组与对照组的大鼠在白箱中停留的时间形成显著差异(通过单因素方差分析确定)，处死实验组和对照组大鼠，获得烟碱依赖大鼠和无烟碱摄入大鼠。
在本发明的方法的步骤1)中，优选地，所述大鼠为7周龄、体重200g±20g的SD雄性大鼠；
在开始建立模型之前，将大鼠分装于独立通气笼具中进行饲养，提供充足的食物和水，保持12小时的明暗交替，饲养环境温度为22℃，相对湿度为40-60％，适应环境2d；
优选地，在开始建立模型之前，对大鼠进行为期5天的CPP基准值测试，包括：将待测试的大鼠依次单独装入CPP装置中，去掉两侧黑白箱的隔板，允许其自由活动，记录其10min内在黑箱与白箱中自由穿梭活动的路程与时间，以大鼠在白箱中所停留的时间百分比为测试指标，根据测试结果剔除在白箱中停留时间超过测试总体时间50％和不足10％的大鼠。
优选地，所述步骤2)包括：
分别从步骤1)获得的两组大鼠中提取2mL外周血，在2h内22℃下1500r/min离心15min获得云雾白细胞层，用与外周血等体积的无菌PBS稀释；
在15mL离心管中依次加入2mL 1.093g/mL Percoll细胞分离液、2mL1.089g/mLPercoll细胞分离液和2mL所述PBS稀释液，在不混合的情况下，22℃下2000r/min离心20min，吸取中性粒细胞层，6-8mL无菌PBS重悬细胞后22℃下300g离心10min以洗脱Percoll胶粒，重复洗脱2-3次；
使细胞恢复至室温，向得到的细胞中加入100-200uL细胞裂解液(上海碧云天生物技术有限公司，货号P0013B)，混匀，置于冰上裂解30min，然后在4℃下12000g离心7min，吸取上清即为外周血中性粒细胞的总蛋白提取液。
在本发明的方法的步骤2)中，优选地，如下配制所述Percoll细胞分离液：按照9:1的体积比，向18mL Percoll原液(美国Sigma Aldrich，货号P1644)中加入2mL灭菌的1.5mol/L氯化钠溶液配制成20mL Percoll稀释液；取6.400mL所述Percoll稀释液加入3.600mL 0.9％的无菌生理盐水配制成1.089g/mL Percoll分离液；取6.708mL所述Percoll稀释液加入3.292mL 0.9％的无菌生理盐水配制成1.093g/mLPercoll分离液。
在本发明的方法的步骤2)中，可选地，在细胞裂解之前，加入红细胞裂解液来裂解其中掺杂的红细胞；
优选地，加入步骤2)中获得的细胞2倍体积的红细胞裂解液(上海歌凡生物科技有限公司，货号GM02)轻轻吹打混匀，置于冰上裂解1-2min，每次裂解结束后加入10mL无菌PBS终止，在22℃下300g离心10min，弃红色上清，得到中性粒细胞。
优选地，所述步骤3)包括：
检测步骤2)得到的总蛋白提取液中的蛋白浓度，蛋白浓度<1000ug/mL时加入1/4体积的上样缓冲液，蛋白浓度≥1000ug/mL时加入1/3体积的上样缓冲液，煮沸5min进行蛋白变性；
冷却后以30-40ul直接上样到浓缩胶的加样孔中，在冰浴中进行电泳，设置电压为80V，待示踪染料接近或刚跑出电泳胶的底端时即可停止电泳，切下待测蛋白分子量区域使用PVDF膜进行转膜，转膜电压为100-120V，转膜后进行印迹膜的封闭、洗涤，分别加入待测蛋白和内参蛋白的一抗，孵育、洗涤后加入二抗，孵育、洗涤后显影。例如，转膜后将印迹膜放入无蛋白封闭缓冲液中，于摇床上常温封闭3h，然后用TBST缓冲液洗膜5min×3次，然后分别加入TBST稀释的待测蛋白和内参蛋白的一抗，4℃孵育过夜，用TBST缓冲液洗膜5min×6次，加入TBST稀释的二抗，4℃孵育3h后洗膜5min×6次，然后进行显影。
优选地，所述步骤4)包括：
将检测出的蛋白和内参蛋白的灰度比值作为所述蛋白的表达量，通过SPSS统计学分析软件将烟碱成瘾和无烟碱摄入大鼠中所述蛋白的表达的测定结果进行单因素方差分析(Analysis of variance，ANOVA)，具有显著性差异的蛋白为烟碱暴露的潜在生物标志物。
根据本发明的具体实施方式，本发明的方法详细描述如下：
一种通过测定外周血中性粒细胞中蛋白的表达研究烟碱暴露的潜在生物标志物的方法，具体包括以下工艺步骤：
A、建立大鼠烟碱CPP获得模型，具体包括如下步骤：
a、实验动物的选择：选择周龄约7周，体重约200±20g的SD雄性大鼠作为模型构建的大鼠。将大鼠分装于独立通气笼具中进行饲养，提供充足的食物和水，保持12小时的明暗交替，饲养环境温度为22℃，相对湿度为40％-60％。适应环境2d后开始实验。
在实验前对大鼠进行为期5天的CPP基准值测试，将待测试的大鼠依次单独装入CPP装置中，去掉两侧黑白箱的隔板，允许其自由活动，使用视频分析软件记录其10min内在黑箱与白箱中自由穿梭活动的路程与时间。以大鼠在白箱中所停留的时间百分比为测试指标，根据测试结果剔除在白箱中停留时间超过测试总体时间50％及不足10％的大鼠。
b、烟碱CPP获得模型构建：筛选大鼠并随机分2组，每组大鼠不少于8只。然后，以皮下注射的方式对大鼠进行给药，每两天为一个给药周期。在奇数日(第1，3，5……天)对实验组大鼠皮下注射烟碱溶液，给药剂量为0.6mg/kg，对照组注射生理盐水，然后立即放入CPP装置的白箱中让其自由活动40min，之后取出放回动物房内笼中常规饲养；在偶数日(第2，4，6……天)对实验组和对照组大鼠均注射生理盐水，并放入CPP装置的黑箱中让其自由活动40min，之后取出放回动物房内笼中常规饲养。于第11天开始进行CPP测试，测试时间为当日给药之前，将大鼠放入CPP箱中并去掉两侧隔板，使其在两侧黑白箱自由活动10min，记录其在白箱中停留的时间(当实验组与对照组形成显著差异时表明实验组大鼠产生烟碱依赖，即获得大鼠烟碱CPP，反之则未产生烟碱依赖)。结果显示，第11天即5次给药周期后，实验组和对照组未形成显著差异，对实验组继续给烟碱，对照组继续给生理盐水，发现在第13天即6次给药周期后成功构建大鼠成瘾模型，处死实验组和对照组大鼠获得外周血样本，所有外周血样本在2h内分离出中性粒细胞。
B、采用Percoll分离液分离外周血中性粒细胞，分别对分离液配制及分离参数进行了优化。优化步骤如下：
a、配制中性粒细胞分离液：按照9:1的比例，向18mL Percoll原液(美国SigmaAldrich，货号P1644)中加入2mL灭菌的1.5mol/L氯化钠溶液配制成20mL Percoll稀释液。取6.400mL Percoll稀释液加入3.600mL 0.9％的无菌生理盐水配制成1.089g/mL Percoll分离液，取6.708mL Percoll稀释液加入3.292mL 0.9％的无菌生理盐水配制成1.093g/mLPercoll分离液。
b、中性粒细胞的分离：获取血液样本在2h内处理。2mL外周血离心15min(1500r/min，22℃)，吸取富含中性粒细胞的云雾白细胞层，用2mL无菌PBS稀释。向15mL离心管中依次加入2mL 1.093g/mL Percoll分离液、2mL 1.089g/mL Percoll分离液、2mL PBS稀释的中性粒细胞，离心20min(2000r/min，22℃)，离心管内出现明显分层，由上而下分别为血浆、分离液、中性粒细胞层、分离液以及少量红细胞层。吸取中性粒细胞层，用6～8mL无菌PBS重悬细胞，离心10min(300g，22℃)，洗脱Percoll胶粒，重复洗脱2～3次。若细胞中掺杂少量红细胞，加入中性粒细胞2倍体积的红细胞裂解液轻轻吹打混匀，置于冰上裂解1-2min，每次裂解结束后加入10mL无菌PBS终止，离心10min(300g，22℃)，弃红色上清，得到的中性粒细胞置于-80℃冰箱保存。此步骤通过对样本存放时间、分离液体积、离心速率、离心时间以及红细胞裂解液体积和裂解时间等实验参数对中性粒细胞分离过程进行了优化。
C、将待测的细胞样品恢复至室温，加入细胞裂解液(上海碧云天生物技术有限公司，货号P0013B)100-200μl，吹打混匀(必要时超声混匀)，置于冰上裂解30min，离心7min(12000g，4℃)，小心吸取上清转移至1.5mL离心管中，切勿接触离心产生的白色沉淀，获得的上清液即为外周血中性粒细胞的总蛋白提取液。
D、使用BCA试剂盒检测样品蛋白质的浓度，根据样品蛋白浓度加入蛋白1/3或1/4体积的loading buffer后煮沸5min进行变性(蛋白浓度低于1000ug/mL选择加入1/4的loading buffer，反之则1/3)，冷却后直接上样到浓缩胶的加样孔中进行电泳，将电泳槽放于冰浴中，设置电压为80V，待示踪染料接近或刚跑出电泳胶的底端时即可停止电泳，结束后切下待测蛋白分子量区域使用PVDF膜进行转膜，转膜电压为100-120V，根据蛋白分子量确定转膜时间(min)。转膜后将印迹膜放入无蛋白封闭缓冲液(Takara)，于摇床上常温封闭3h，然后用TBST缓冲液洗膜5min×3次。向封闭后的印迹膜分别加入TBST稀释的待测蛋白和内参蛋白的一抗，4℃孵育过夜，用TBST缓冲液洗膜5min×6次，加入TBST稀释的二抗，4℃孵育3h后洗膜5min×6次，然后使用化学发光成像系统进行显影并定量分析。
E、将检测出的蛋白和内参蛋白的灰度比值作为所述蛋白的表达量，通过SPSS软件对Western Blotting的测试结果进行ANOVA(SPSS软件中包括的一种分析方法)分析，即可得出烟碱成瘾和生理盐水组大鼠外周血中性粒细胞中蛋白的差异表达，具有显著性差异的蛋白能够成为烟碱暴露的潜在生物标志物。
本发明方法是一种研究烟碱暴露的潜在生物标志物的方法。本发明中通过对CPP的获得、外周血中性粒细胞分离、细胞蛋白提取、WB实验等实验流程进行优化。与现有技术相比，本发明具有以下技术改进：
(1)选择了大鼠作为实验动物基于CPP装置建立烟碱获得模型，获得无烟碱摄入大鼠和烟碱依赖大鼠，来模拟吸烟成瘾和不吸烟的两种吸烟状态；并且，本发明的发明人创造性地发现，大鼠外周血中性粒细胞及其蛋白可以良好响应烟碱暴露并反映其带来的影响，因此选择了大鼠外周血中性粒细胞作为目标细胞群，并以该外周血中性粒细胞中特定蛋白的表达差异作为检测目标。由此相应地，为之确定了CPP获得阶段的最佳剂量(0.6mg/kg)，构建的大鼠CPP模型可以很好模拟吸烟成瘾和不吸烟两种不同吸烟状态；
(2)筛选了细胞分离液密度(1.089和1.093g/mL)，由于外周血不同细胞间的密度差异很小，构建合适的细胞分离液密度梯度是分离外周血中性粒细胞的关键，大鼠外周血中性粒细胞的密度在1.090g/ml左右，构建1.089g/ml和1.093g/ml的细胞分离液通过密度梯度离心能很好地获得所需细胞；相比于其他中性粒细胞的分离方法，本方法能够将大鼠外周血中性粒细胞和红细胞很好地分离；
(3)在大鼠外周血中性粒细胞的分离过程中，还就样本存放时间、分离液体积、离心速率、离心时间以及红细胞裂解液体积和裂解时间等实验参数进行了优化；
(4)WB实验中蛋白上样体积(30-40ul)、电泳电压(80V)及时间、转膜电压(100-120V)及时间(稍多于蛋白分子量)、封闭(3h)及洗膜时间(5min×6min)、一抗(过夜)和二抗(3h)孵育时间等最佳实验参数，确保了对蛋白表达的检测准确、可靠、重复性好。
由此，本发明的方法基于该大鼠模型对外周血中性粒细胞中蛋白的表达进行检测，并通过统计学分析差异表达蛋白，进而将差异蛋白作为潜在的烟碱暴露生物标志物。与仅关注脑区蛋白表达水平相比，外周血具有易获得、易储存、对人体无侵害性且可重复获取等优点，检测更为简便；同时对外周血中性粒细胞中蛋白的测定可以实现实时的人体监测，而且有助于脑区与外周桥梁的搭建，为外周标志物的研究打下基础，对于探究烟碱暴露生物标志物以及开发烟碱戒断治疗措施等均有重要指导作用。
附图说明
图1：CPP获得阶段不同给药周期后的测试结果(*为p<0.05)。
图2：实验组和对照组大鼠的外周血中性粒细胞中CREB和内参α-tubulin的蛋白条带。
图3：实验组和对照组大鼠的CREB蛋白水平显著差异柱状图。
图4：实验组和对照组大鼠的外周血中性粒细胞中α4*nAChRs和内参α-tubulin的蛋白条带。
图5：实验组和对照组大鼠的α4*nAChRs蛋白水平显著差异柱状图。
图6：实验组和对照组大鼠的外周血中性粒细胞中β2*nAChRs和内参GAPDH的蛋白条带。
图7：实验组和对照组大鼠的β2*nAChRs蛋白水平显著差异柱状图。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1
实验目的：构建大鼠烟碱CPP获得模型，考察给烟碱依赖和不给烟碱的大鼠外周血中性粒细胞中CREB的表达量变化。
A、构建大鼠烟碱CPP获得模型。
a、动物筛选：
选择周龄约7周，体重约200g±20g的48只SD雄性大鼠，将大鼠分装于独立通气笼具中进行饲养，提供充足的食物和水，保持12小时的明暗交替，饲养环境温度为22℃，相对湿度为40％-60％。适应环境2天后开始实验。
在实验前对大鼠进行为期5天的CPP基准值测试，将待测试的大鼠依次单独装入CPP装置中，去掉两侧黑白箱的隔板，允许其自由活动，使用视频分析软件记录其10min内在黑箱与白箱中自由穿梭活动的路程与时间。以大鼠在白箱中所停留的时间百分比为测试指标，根据测试结果剔除在白箱中停留时间超过测试总体时间50％及不足10％的大鼠，依据5次基准值测试结果的标准偏差进行排序，选择标准偏差较小的16只SD雄性大鼠，分为2个组，每组8只，分别为实验组和对照组。
b、烟碱CPP获得模型构建：
以皮下注射的方式对所有大鼠进行给药，每两天为一个给药周期。在奇数日(第1，3，5……天)对实验组大鼠皮下注射烟碱溶液，给药剂量为0.6mg/kg，对照组注射生理盐水，然后立即放入CPP装置的白箱中让其自由活动40min；在偶数日(第2，4，6……天)对实验组和对照组大鼠均注射生理盐水，并放入CPP装置的黑箱中让其自由活动40min，之后取出放回动物房内笼中常规饲养。于第11天开始进行CPP测试，测试时间为当日给药之前，将大鼠放入CPP箱中并去掉两侧隔板，使其在两侧黑白箱自由活动10min，记录其在白箱中停留的时间。第11天即第5次给药周期后，实验组与对照组白箱停留时间均无显著差异，对实验组继续给烟碱，对照组继续给生理盐水，在第13天即6次给药周期后成功构建大鼠成瘾模型(见图1)，处死对照组和实验组，每次获取的外周血常温保存并在2h内分离出中性粒细胞。
B、采用Percoll法分离外周血中性粒细胞。
a、配制中性粒细胞分离液：
按照9:1的比例，向18mL Percoll原液中加入2mL灭菌的1.5mol/L氯化钠溶液配制成20mL Percoll稀释液。取6.400mL Percoll稀释液加入3.600mL 0.9％的无菌生理盐水配制成1.089g/mL Percoll分离液，取6.708mL Percoll稀释液加入3.292mL 0.9％的无菌生理盐水配制成1.093g/mL Percoll分离液。
b、外周血中性粒细胞的分离：
2mL外周血1500r/min离心15min，吸取富含中性粒细胞的云雾白细胞层，用2mL无菌PBS稀释。向15mL离心管中依次加入2mL 1.093g/mL Percoll分离液、2mL 1.089g/mLPercoll分离液、2mL PBS稀释的中性粒细胞，离心20min(2000r/min，22℃)，离心管内出现明显分层，由上而下分别为血浆、分离液、中性粒细胞层、分离液以及少量红细胞层。吸取中性粒细胞层，用6-8mL无菌PBS重悬细胞，离心10min(300g，22℃)，洗脱Percoll胶粒，重复洗涤2-3次。若细胞中掺杂少量红细胞，加入2mL红细胞裂解液轻轻吹打混匀，置于冰上裂解1-2min，每次裂解结束后加入10mL无菌PBS终止，离心10min(300g，22℃)，弃红色上清，得到的中性粒细胞置于-80℃冰箱保存。
C、获取中性粒细胞的总蛋白。
将待测的细胞样品恢复至室温，加入细胞裂解液200μl，吹打混匀(必要时超声混匀)置于冰上裂解30min，离心7min(12000g，4℃)，小心吸取上清转移至1.5mL离心管中，切勿接触离心产生的白色沉淀，获得的上清液即为外周血中性粒细胞总蛋白提取液。
D、Western Blotting检测。
使用BCA试剂盒检测样品蛋白质的浓度在800μg/mL左右，加入1/4体积的loadingbuffer后煮沸5min进行变性，冷却后直接上样30-40uL到浓缩胶的加样孔中进行电泳，将电泳槽放于冰浴中，设置电压为80V，待示踪染料接近或刚跑出电泳胶的底端时即可停止电泳，结束后切下30-50Da区域使用PVDF膜进行转膜，转膜电压为100V，转膜时间为40-45min。转膜后将印迹膜放入无蛋白封闭缓冲液(Takara)中常温封闭3h，然后用TBST缓冲液洗膜5min×3次。向封闭后的印迹膜加入TBST稀释1000倍的一抗Anti-CREB抗体[9197s](CellSignaling Technology)，4℃孵育过夜，用TBST缓冲液洗膜5min×6次，加入TBST稀释10000倍的二抗HRP-羊抗兔IgG(博士德)，4℃孵育3h后洗膜5min×6次，然后使用化学发光成像系统进行显影并定量分析。同样进行内参α-tubulin的Western Blotting检测。见图2。
E、将检测出的蛋白和内参的灰度比值作为该蛋白的表达量，通过SPSS统计学分析软件将烟碱依赖和生理盐水对照组中所述蛋白的表达的测定结果进行单因素方差分析(Analysis of variance，ANOVA)，即可得出烟碱依赖和未摄入烟碱大鼠外周血中性粒细胞中CREB的差异表达。见图3。
实施例2
(1)
参考实施例1的实验过程，唯一区别是将其中的步骤“A、建立大鼠烟碱CPP获得模型”做如下修改：所有外周血样本分别在4、6、8和24h内分离中性粒细胞。
结果发现：外周血样本存放时间4h时提取细胞，细胞产生粘连效应，形态发生改变，无明显云雾白细胞层；存放时间达到6h甚至超过6h时，除无明显云雾白细胞层外，经离心后无明显细胞层。
(2)
参考实施例1的实验过程，唯一区别是将其中的步骤“B、采用Percoll法分离外周血中性粒细胞”做如下修改：
取6.092mL Percoll稀释液加入3.908mL 0.9％的无菌生理盐水配制成1.085g/mLPercoll分离液；取6.554mL Percoll稀释液加入3.446mL 0.9％的无菌生理盐水配制成1.091g/mL Percoll分离液。
结果发现：离心后，离心管内未出现明显分层，无明显细胞层。
(3)
参考实施例1的实验过程，唯一区别是将其中的步骤“B、采用Percoll法分离外周血中性粒细胞”做如下修改：向15mL离心管中依次加入3mL1.093g/mL Percoll分离液、3mL1.089g/mL Percoll分离液、3mL PBS稀释的中性粒细胞。
结果发现：离心后，离心管内未出现明显分层，无明显细胞层。
(4)
参考实施例1的实验过程，唯一区别是将其中的步骤“D、Western Blotting检测”做如下修改：设置电泳电压为100V。
结果显示：蛋白条带宽且有拖尾现象，不能准确进行半定量分析。
实施例3
实验目的：构建大鼠烟碱CPP获得模型，考察给烟碱依赖和不给烟碱的大鼠外周血中性粒细胞中α4*nAChRs的表达量变化。
参考实施例1的实验过程，唯一区别是将其中的步骤“D、Western Blotting检测”做如下修改：电泳结束后，切下65-80Da区域使用PVDF膜进行转膜，转膜时间为70-75min。转膜结束后，向封闭的印迹膜加入TBST稀释10000倍的一抗Anti-α4*nAChRs抗体[ab124832](Abcam)。见图4所示。
结果显示：实验组和对照组大鼠外周血中性粒细胞中α4*nAChRs蛋白水平无显著差异，见图5所示。
实施例4
实验目的：构建大鼠烟碱CPP获得模型，考察给烟碱依赖和不给烟碱的大鼠外周血中性粒细胞中β2*nAChRs的表达量变化。
参考实施例1的实验过程，唯一区别是将其中的步骤“D、Western Blotting检测”做如下修改：电泳结束后，切下30-50Da区域使用PVDF膜进行转膜，转膜时间为48-53min。转膜结束后，向封闭的印迹膜加入TBST稀释的终浓度为2.5ug/mL的一抗Anti-β2*nAChRs抗体[ab55980](Abcam)。同样进行内参GAPDH的Western Blotting检测。见图6所示。
结果显示：相比于对照组，实验组大鼠外周血中性粒细胞中β2*nAChRs水平显著下调，见图7所示。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (7)

1.一种通过测定外周血中性粒细胞中蛋白的表达来鉴定烟碱暴露的潜在生物标志物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1) 基于条件性位置偏爱（CPP）装置建立大鼠烟碱CPP获得模型，最终获得无烟碱摄入大鼠和烟碱依赖大鼠，包括：
将大鼠随机分成实验组和对照组，每组大鼠的数量≥8只；
每2天1个给药周期，在奇数日对实验组的大鼠皮下注射烟碱溶液，给药剂量为0.6 mg/kg，对照组大鼠注射相同体积的生理盐水，注射后立即放入CPP装置的白箱中让大鼠自由活动40 min，然后放回笼中常规饲养；在偶数日对实验组和对照组的大鼠均皮下注射相同体积的生理盐水，注射后立即放入CPP装置的黑箱中让大鼠自由活动40 min，然后放回笼中常规饲养；
在开始给药后第13天，处死实验组和对照组的大鼠，获得烟碱依赖大鼠和无烟碱摄入大鼠；
2) 分别从步骤1)获得的两组大鼠中提取外周血，进一步提取外周血中性粒细胞的总蛋白，包括：
分别从步骤1)获得的两组大鼠中提取2 mL外周血，在2 h内22℃下1500 r/min离心15min获得云雾白细胞层，用与外周血等体积的无菌PBS稀释；
在15mL离心管中依次加入2mL 1.093g/mL Percoll细胞分离液、2mL 1.089g/mLPercoll细胞分离液和2mL所述PBS稀释液，在不混合的情况下，22℃下2000 r/min离心20min，吸取中性粒细胞层，6-8 mL所述无菌PBS重悬细胞后22℃下300 g离心10 min以洗脱Percoll胶粒，重复洗脱2-3次；
使细胞恢复至室温，向得到的细胞中加入100-200 uL细胞裂解液，混匀，置于冰上裂解30 min，然后在4℃下12000 g离心7 min，吸取上清即为外周血中性粒细胞的总蛋白提取液；
3) 通过Western Blotting分别检测步骤2)获得的两组总蛋白中特定蛋白的表达，包括：
检测步骤2)得到的总蛋白提取液中的蛋白浓度，蛋白浓度<1000ug/mL时加入1/4体积的上样缓冲液，蛋白浓度≥1000ug/mL时加入1/3体积的上样缓冲液，煮沸5min进行蛋白变性；
冷却后以30-40 ul直接上样到浓缩胶的加样孔中，在冰浴中进行电泳，设置电压为80V，待示踪染料接近或刚跑出电泳胶的底端时即可停止电泳，切下待测蛋白分子量区域使用PVDF膜进行转膜，转膜电压为100-120 V，转膜后进行印迹膜的封闭、洗涤，分别加入待测蛋白和内参蛋白的一抗，孵育、洗涤后加入二抗，孵育、洗涤后显影；
4) 分析步骤3)检测得到的特定蛋白的表达在两组之间是否具有显著性差异，当具有显著性差异时，所述蛋白被鉴定为烟碱暴露的潜在生物标志物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大鼠为7周龄、体重200g±20g的SD雄性大鼠；
在开始建立模型之前，将大鼠分装于独立通气笼具中进行饲养，提供充足的食物和水，保持12小时的明暗交替，饲养环境温度为22℃，相对湿度为40-60%，适应环境2 d。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在开始建立模型之前，对大鼠进行为期5天的CPP基准值测试，包括：将待测试的大鼠依次单独装入CPP装置中，去掉两侧黑白箱的隔板，允许其自由活动，记录其10 min内在黑箱与白箱中自由穿梭活动的路程与时间，以大鼠在白箱中所停留的时间百分比为测试指标，根据测试结果剔除在白箱中停留时间超过测试总体时间50%和不足10%的大鼠。
4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，如下配制所述Percoll细胞分离液：按照9:1的体积比，向18mL Percoll原液中加入2mL灭菌的1.5mol/L氯化钠溶液配制成20mL Percoll稀释液；取6.400mL所述Percoll稀释液加入3.600mL 0.9%的无菌生理盐水配制成1.089g/mL Percoll分离液；取6.708 mL所述Percoll稀释液加入3.292mL0.9%的无菌生理盐水配制成1.093g/mL Percoll分离液。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，在细胞裂解之前，加入红细胞裂解液来裂解其中掺杂的红细胞。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，加入权利要求1获得的细胞2倍体积的红细胞裂解液轻轻吹打混匀，置于冰上裂解1-2 min，每次裂解结束后加入10 mL无菌PBS终止，在22℃下300 g离心10 min，弃红色上清，得到中性粒细胞。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤4)包括：
将检测出的蛋白和内参蛋白的灰度比值作为所述蛋白的表达量，通过SPSS统计学分析软件将烟碱依赖和对照组大鼠中所述蛋白的表达的测定结果进行单因素方差分析（Analysis of variance，ANOVA），具有显著性差异的蛋白为烟碱暴露的潜在生物标志物。
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