CN111850090A - 一种有效保存病毒样品的病毒保存液 - Google Patents

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Abstract

本发明一种有效保存病毒样品的病毒保存液，属于医学生物技术领域；包括以下成分：解偶联剂0.5‑6M，氨基酸类表面活性剂0.01‑0.5％，β‑巯基乙醇0.001‑0.15M，两性离子缓冲液10‑30mM，DTT 0‑10mM，糖原10‑40μg/mL，酚红0.004‑0.2g/L，PH为7‑8。本发明对采集的病毒进行快速的灭活；强烈降解病毒的蛋白，高效保存病毒的核酸；免除检测前的灭活处理，提高检测效率；有助于提取低浓度病毒核酸，提高检测敏感性。

Description

一种有效保存病毒样品的病毒保存液
技术领域
本发明属于医学生物技术领域，尤其涉及一种有效保存病毒样品的病毒保存液。
背景技术
2019年在人体中发现了一类冠状病毒新毒株，被称为新型冠状病毒(SARS-CoV-2)，其具有很强的传染性，在潜伏期即可传染。针对其强有力的传染能力，对每位疑似患者和密切接触者要进行严密严谨的检测，而目前最常用的检测方法是核酸检测，但在实际采样过程中一些保存液并未有效的保存样品，导致部分感染者在核酸检测结果中出现较高的阴性率，让漏诊病例助推疫情蔓延。
病毒的核酸检测从采样到RT-qPCR检测的一系列过程中，每一个步都至关重要，特别是在采集样品和运输过程中对样品的保存，直接关系到后续的核酸提取和检测结果，如何控制这些环节的出错率，确保样品的有效性，提升检测的准确性和灵敏度，是亟待解决的问题。
灭活型病毒保存液能否将所采集样品完全灭活，也是面临的一个风险。未能完全灭活的病毒样品在运输和核酸提取过程中，对工作人员存在二次感染的风险，特别是采集高传染性、高致病性的新型冠状病毒；此外，大多数采集后的样本都需要低温运输，否则会对样本核酸组分造成降解，直接影响检测结果，低温运输也大大增加了成本。
因此，开发能完全灭活病毒、常温稳定保存病毒核酸组分的保存液，为后续病毒的核酸检测提供质量保证，也可大大降低低温运输的成本。
发明内容
本发明目的在于提供一种有效保存病毒样品的病毒保存液，以解决实际采样过程中一些保存液并未有效的保存样品的技术问题。
为实现上述目的，本发明的一种有效保存病毒样品的病毒保存液的具体技术方案如下：
一种有效保存病毒样品的病毒保存液，所述病毒保存液由以下成分组成，且其具体摩尔浓度如下：
解偶联剂0.5-6M，氨基酸类表面活性剂0.01-0.5％，β-巯基乙醇0.001-0.15M，两性离子缓冲液10-30mM，DTT 0-10mM，糖原10-40μg/mL，酚红0.004-0.2g/L，PH为7-8。
进一步，所述解偶联剂0.79M，氨基酸类表面活性剂0.5％，β-巯基乙醇0.1M，两性离子缓冲液20mM，DTT 5mM，糖原20μg/mL，酚红0.0125g/L，PH为7-8，优选的，保存液PH为7.5。
进一步，所述两性离子缓冲液为Tris-HCl，且Tris-HCl的PH为6-7，优选的，保存液PH为6.5。
进一步，所述解偶联剂为异硫氰酸胍。
进一步，所述氨基酸类表面活性剂为十二烷基肌氨酸钠。
进一步，所述病毒保存液的适用样本包括咽拭子、鼻拭子、呼吸道抽取物、肛拭子、人组织的离体样本、动植物组织的离体样本、血液、体液。
本发明的一种有效保存病毒样品的病毒保存液具有以下优点：
1、能在3min的裂解时间内快速提取病毒RNA。
2、能在6min的短时间里迅速将病毒彻底灭活。
3、在采集病毒后，常温或37℃下放置24h，样品均有效。
4、该新型病毒保存液保存病毒样品后，可用该保存液直接提取病毒RNA，也适用于其它类有效试剂盒的裂解液进行病毒RNA提取。
对采集的病毒进行快速的灭活；强烈降解病毒的蛋白，高效保存病毒的核酸；免除检测前的灭活处理，提高检测效率；有助于提取低浓度病毒核酸，提高检测敏感性；
新型病毒保存液能在很短时间内(6min)将病毒完全灭活，并能在常温甚至高温(37℃)环境下有效保存病毒样品至少24h。
附图说明
图1为实施例1使用病毒保存液对采集病毒进行快速裂解提取RNA的验证及对比实验数据。
图2为实施例1中进行验证病毒保存液对采集病毒进行快速灭活的实验数据，具体表示大肠杆菌静置6min的实验数据。
图3为实施例1中进行验证病毒保存液对采集病毒进行快速灭活的实验数据，具体表示白色念珠静置6min的实验数据。
图4为实施例1中进行验证病毒保存液对采集病毒进行快速灭活的实验数据，具体表示大肠杆菌静置10min的实验数据。
图5为实施例1中进行验证病毒保存液对采集病毒进行快速灭活的实验数据，具体表示白色念珠静置10min的实验数据。
图6为实施例1中进行采集病毒后，病毒保存液在常温和37℃下放置24h，提取RNA的验证实验数据。
图中标记说明：1、Marker DL5000；2、病毒保存液裂解3min；3、天根裂解液裂解3min；4、病毒保存液裂解6min；5、天根裂解液裂解6min；6、病毒保存液裂解裂解10min；7、天根裂解液裂解6min；8、常温放置1h；9、37℃放置1h；10、常温放置2h；11、37℃放置2h；12、常温放置24h；13、37℃放置24h；14、培养基空白组；15、病毒保存液+大肠杆菌；16、病毒保存液；17、PBS+大肠杆菌；18、病毒保存液+白色念珠菌；19、PBS+白色念珠菌。
具体实施方式
为了更好地了解本发明的目的、结构及功能，下面结合附图和实施例，对本发明一种有效保存病毒样品的病毒保存液做进一步详细的描述。
实施例1：
一种有效保存病毒样品的病毒保存液的配方主要包括以下组分：异硫氰酸胍0.79M，十二烷基肌氨酸钠0.5％，β-巯基乙醇0.1M，Tris-HCl(PH＝6.5)20mM，DTT 5mM，糖原20μg/mL，酚红0.0125g/L，PH调至7.5。
上述保存液的适用样本优选为病毒，来源包括咽拭子、鼻拭子、呼吸道抽取物、肛拭子、人组织的离体样本、动植物组织的离体样本、血液、体液等。
一、病毒保存液对采集病毒进行快速裂解提取RNA的验证及对比实验：
第一步：病毒RNA提取。
(1)称取0.0125g的鸡新城疫活疫苗，溶于1mL PBS中，裂解液选用本申请中的病毒保存液，天根裂解液做对比；参照天根试剂盒说明书进行操作。
(2)取560μL病毒保存液RL于1.5mL离心管中，再加入5.6μL Carrier RNA，混匀；
(3)向离心管中加入140μL鸡新城疫活疫苗(步骤1)溶液(0.0125g/mL)，振荡15s；
(4)在室温(15-25℃)孵育3mim、6mim、10mim；
(5)简短离心收集附着在管壁及管盖的液体；
(6)加入560μL无水乙醇，盖上盖子，振荡15s，简短离心收集附着在管壁及管盖的液体；
(7)将管内的反应液分两次转到RNase-Free吸附柱CR2(柱内的收集管中)，每次630μL，600g(8000rpm)离心1mim，弃废液；
(8)加入500μL溶液GD，600g(8000rpm)离心1mim，弃废液；
(9)加入500μL溶液RW，600g(8000rpm)离心1mim，重复1次，弃废液；
(10)1340g(12000rpm)离心3mim，弃废液，打开盖子，室温放置5mim；
(11)将柱子转到一个RNase-Free离心管上，向柱子中心部位滴加60μL RNase-Free ddH2O，盖上盖子，600g(8000rpm)离心1mim，完成RNA提取。
第二步：将上述RNA进行逆转录反应，按天根试剂盒的操作步骤进行。
(1)反应体系
5×FastKing-RT SuperMix 4μL
提取RNA 50ng-2μg(1μL)
RNase-Free ddH2O 补充到20μL
(2)反应程序
42℃15mim去除基因组及反转录反应
95℃3mim酶灭活过程
第三步：普通PCR检测
(1)反应体系
Figure BDA0002618760800000051
(2)反应程序
Figure BDA0002618760800000052
第四步：琼脂糖凝胶电泳检测
(1)制胶：琼脂糖凝胶(1％)：30mL+0.3g琼脂糖，摇匀，加热至溶解，待冷却60℃左右，加入染料Gene Green核酸染料5μL，摇匀，倒入制胶板，插入梳子。
(2)冷却凝固后的凝胶，拔掉梳子，将胶放入电泳槽内；
(3)加样：6×上样loading buffer 3μL+7μL PCR产物，混匀，加入胶孔内；
(4)电泳：电压3-5V/cm，约80-90V；
(5)观察：紫外线分析仪(波长254nm)下查看，具体实验结果见说明书附图1。
从说明书附图1可以看出：鸡新城疫活疫苗在病毒保存液分别灭活3min、6min和10min后(分别是双条带2、4、6)，跑PCR，凝胶电泳均检测出清晰的单一条带，与其它公司病毒保存液的电泳结果相比(分别是条带3、5、7)，在灭活6min和10min时的电泳条带更亮更清晰。因此得出结论：病毒保存液在很短时间就能将病毒灭活，并能更好更稳定的保存病毒RNA。
二、验证病毒保存液对采集病毒进行快速灭活的实验
利用培养至对数生长期的大肠杆菌和白色念珠菌代替病毒，进行完全灭活实验验证。
实验步骤：
(1)取培养至对数生长期的大肠杆菌和白色念珠菌各200μL加入到800μL病毒保存液，震荡混匀，微型离心机离心数秒，静止6min时，取混合液200μL加入到TSA液体培养基中培养；静止10min时，再分别取混合液200μL加入到TSA液体和固体培养基中培养；
(2)6h后观察液体培养基生长情况，隔天观察平板中细菌的生长情况；
(3)PBS和空白病毒保存液组也按上述步骤同步进行，每组实验2个重复。
实验数据见说明书附图2-图5，从图2中可以看出：灭活6min时，病毒保存液+大肠杆菌组(标号15)的OD值与TSA空白组(标号14)无差别，而PBS+大肠杆菌组(标号17)的OD值与TSA空白组表现出明显差别；同样，从图3中可以看出：灭活6min时，病毒保存液+白色念珠菌组(标号18)的OD值与TSA空白组(标号14)无差别，而PBS+白色念珠菌组(标号19)的OD值与TSA空白组(标号14)表现出明显差别；表明与病毒保存液混合的大肠杆菌和白色念珠菌均未生长。类似的，灭活10min时，从图4和图5中可看出：与病毒保存液混合的大肠杆菌和白色念珠菌均未生长，而与PBS混合的大肠杆菌和白色念珠菌均正常生长。
病毒的结构比细菌和真菌更简单，且必须依赖宿主才能繁殖。因此推导出结论：病毒保存液可在6min内快速的彻底的灭活病毒。
三、验证采集病毒后，病毒保存液在常温和37℃下放置24h，提取RNA
称取0.0125g的鸡新城疫活疫苗，溶于1mL新型病毒保存液中，分别在常温和37℃放置24h，参照天根试剂盒说明书进行后续操作，实验数据见说明书附图6。具体步骤参照病毒保存液对采集病毒进行快速裂解提取RNA的验证及对比实验。
从图6中可以看出：(1)鸡新城疫活疫苗加入到病毒保存液后的24h内，均可提出病毒RNA并扩增出条带，表明病毒在加入病毒保存液后的24h内，在常温或37℃条件下，样品均有效；(2)在1h时，37℃条件的扩增条带浓度略大于常温条件的，表明在1h内，37℃存放的样品裂解效果更好；(3)在2h时，常温条件的扩增条带浓度略大于37℃条件的，表明在2h内，常温存放的样品裂解效果更好，37℃条件，可能已经造成病毒RNA的小程度降解；(4)在24h时，常温条件的扩增条带浓度略大于37℃条件的，表明在24h内，常温存放的样品裂解效果更好，37℃条件，可能已经造成病毒RNA的降解。
结论：样品采集后，病毒保存液保存的24h内样品均有效；高温环境下，保存液保存的样品在较短时间内提取RNA效果最佳。
可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。

Claims (6)

1.一种有效保存病毒样品的病毒保存液，其特征在于，所述病毒保存液由以下成分组成，且其具体摩尔浓度如下：
解偶联剂0.5-6M，氨基酸类表面活性剂0.01-0.5％，β-巯基乙醇0.001-0.15M，两性离子缓冲液10-30mM，DTT 0-10mM，糖原10-40μg/mL，酚红0.004-0.2g/L，PH为7-8。
2.根据权利要求1所述的有效保存病毒样品的病毒保存液，其特征在于，所述解偶联剂0.79M，氨基酸类表面活性剂0.5％，β-巯基乙醇0.1M，两性离子缓冲液20mM，DTT 5mM，糖原20μg/mL，酚红0.0125g/L，PH为7-8。
3.根据权利要求1所述的有效保存病毒样品的病毒保存液，其特征在于，所述两性离子缓冲液为Tris-HCl，且Tris-HCl的PH为6-7。
4.根据权利要求1所述的有效保存病毒样品的病毒保存液，其特征在于，所述解偶联剂为异硫氰酸胍。
5.根据权利要求1所述的有效保存病毒样品的病毒保存液，其特征在于，所述氨基酸类表面活性剂为十二烷基肌氨酸钠。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的有效保存病毒样品的病毒保存液，其特征在于，所述病毒保存液的适用样本包括咽拭子、鼻拭子、呼吸道抽取物、肛拭子、人组织的离体样本、动植物组织的离体样本、血液、体液。
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