CN111849841B - 一种提高风化煤中腐殖酸含量的复合菌剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种提高风化煤中腐殖酸含量的复合菌剂及制备方法,适用于煤炭清洁利用领域使用。由以下质量百分含量的原料组成:混合微生物菌剂培养液9.1%、风化煤81.8%和稻壳9.1%。活化里氏木霉、微紫青霉、白腐真菌后活化枯草芽孢杆菌。其有效降解风化煤生产有机肥料,有效提高固态发酵的腐殖酸含量,从而达到腐殖酸肥料的缓释作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种复合菌剂及其制备方法,尤其适用于煤炭清洁利用领域使用的一种提高风化煤腐殖酸含量的复合菌剂及其制备方法。
背景技术
我国风化煤资源丰富,其中以山西、新疆储量最大、质量最好,总腐殖酸含量较高。然而风化煤长期经受大气、阳光、雨雪、地下水以及矿物质侵蚀等综合作用,机械强度、粘结性、发热量、着火点都降低,其中富含的腐殖酸不及时开采利用,会在强风化环境下被分解为二氧化碳和水,内层的有机质也会因淋滤和残积作用而消失。因此风化煤资源的合理开发和充分利用是煤炭清洁利用领域一个急需解决的问题。
腐殖酸作为一种多羟基、多羧基的含有不同分子量的混合物,对土壤改良,作物生长和环境保护等均有积极影响,已广泛应用于工、农、畜、医等领域中,并取得了初步成效。目前生产腐殖酸多以风化煤和褐煤为主要原料,因其煤化程度低,稠环结构少,脂肪链状结构多,含有更多类木质素结构,结构更趋近于原始植物残体,使其易于被微生物降解。提取风化煤中腐殖酸的方法主要包括碱提取法、酸提取法、微生物溶解法。碱提取腐殖酸操作简单,被广泛采用,但缺点是费时,同时产生约20%的腐殖质。酸提取法工艺简单,易于操作,生产周期短,但提取产物含有较多杂质该方法受到限制。微生物溶解法具有清洁无污染,反应条件温和,产品生化活性高等优点,但其生长周期长且效率低。由于微生物法清洁环保、产品效果显著的优势,并且符合绿色化发展的新时代政策,符合现代农业可持续发展的要求。因此寻找高效降解风化煤的菌种,提高风化煤中腐殖酸含量,缩短生产周期是我国矿源腐殖酸研究的一项重要任务。
目前关于煤与微生物复配制备肥料的研究主要有两大类,一部分工作集中在筛选煤转化的菌种上,然后将菌种制成菌剂进行施肥;另一部分工作是将一些本身并不参与煤的降解但是对土壤有改良作用的微生物与煤混合;鲜有工作将对煤降解产腐殖酸的菌种与煤同时复合制成混合菌剂来施肥的产品。
发明内容
针对上述技术的不足之处,提供一种提高风化煤中腐殖酸含量的复合菌剂及其制备方法,其方法简单,能够降解风化煤,提高风化煤中的腐殖酸含量,降解风化煤生产有机肥料效果好。
为实现上述技术目的,本发明的提高风化煤中腐殖酸含量的复合菌剂,由以下质量百分含量的原料组成:混合微生物菌剂培养液9.1%、风化煤81.8%和稻壳9.1%;所述的混合微生物菌剂包括:活化后并菌液浓度满足1.6×109cfu/mL——2.0×109cfu/mL(OD600=0.8-1.0)的里氏木霉(Trichoderma reesei)、微紫青霉(Penicillium janthinellum)、白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),按体积比里氏木霉:微紫青霉:枯草芽孢杆菌:白腐真菌=4:1:3:1配制。
一种提高风化煤中腐殖酸含量的复合菌剂的制备方法,其步骤如下:
a使用PDA培养基常规方式活化里氏木霉、微紫青霉、白腐真菌;
b使用LB培养基常规方式活化枯草芽孢杆菌;
c将活化后的里氏木霉、微紫青霉、白腐真菌和枯草芽孢杆菌进行液体培养至培养液在600nm处的吸光值达到OD600=0.8-1.0(1.6×109cfu/mL——2.0×109cfu/mL),之后按照菌液的体积比混合获得混合微生物菌剂——里氏木霉:微紫青霉:枯草芽孢杆菌:白腐真菌=4:1:3:1;
d称取与混合好的混合微生物菌剂的质量比匹配的破碎筛分后的风化煤与稻壳粉,并按照质量百分含量为81.8%的破碎筛分后的风化煤和9.1%的破碎筛分后的稻壳粉加入PDA培养基混匀,接入质量百分含量为9.1%的混合微生物菌剂,于28℃的恒温培养箱中发酵培养,干燥后冷却研磨,获得复合菌剂,复合菌剂需置于4℃下保存。
所述的PDA培养基具体配比为:马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂18g,蒸馏水1000mL。
所述的LB培养基具体配比为:胰蛋白胨10g,酵母粉5g,氯化钠10g,琼脂20g,去离子水1000mL。
所述的风化煤和稻壳通过破碎筛分后选取粒径低于0.125mm的颗粒,风化煤和稻壳使用前需要加入PDA培养基混匀,经高压蒸汽灭菌后使用。
有益效果为:本发明的复合菌剂能够降解风化煤,提高风化煤中的腐殖酸含量,与原煤相比,发酵前后风化煤总腐殖酸增长率高达73.67%,专用于降解风化煤生产有机肥料,实现风化煤资源化利用。本发明将不同微生物组合配伍并同时复合风化煤制成复合菌剂,利用微生物的固态发酵来持续提高其腐殖酸含量,达到腐殖酸肥料的缓释作用。
附图说明:
图1为本发明中使用的里氏木霉、微紫青霉、白腐真菌和枯草芽孢杆菌400倍显微图;
图2为本发明中使用的里氏木霉、微紫青霉、白腐真菌和枯草芽孢杆菌固态溶煤实验图;
图3为本发明中使用的里氏木霉、微紫青霉、白腐真菌和枯草芽孢杆菌拮抗实验图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施例做进一步说明
本发明的提高风化煤中腐殖酸含量的复合菌剂,由以下质量百分含量的原料组成:混合微生物菌剂9.1%、风化煤81.8%和稻壳9.1%;所述的混合微生物菌剂包括:活化后并满足OD600=0.8-1.0的里氏木霉、微紫青霉、白腐真菌和枯草芽孢杆菌,里氏木霉:微紫青霉:枯草芽孢杆菌:白腐真菌的活化菌液体积比为4:1:3:1。
一种提高风化煤中腐殖酸含量的复合菌剂的制备方法,其步骤如下:
a使用PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基常规方式活化里氏木霉、微紫青霉、白腐真菌;所述的PDA培养基的具体质量配比为:马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂18g,蒸馏水1000mL。
b使用LB(Luria-Bertani)培养基常规方式活化枯草芽孢杆菌;LB培养基的具体质量配比为:胰蛋白胨10g,酵母粉5g,氯化钠10g,琼脂20g,去离子水1000mL。
c将活化后的里氏木霉、微紫青霉、白腐真菌和枯草芽孢杆菌进行液体培养至培养液在600nm处的吸光值达到OD600=0.8-1.0,之后按照菌液的体积比混合获得混合微生物菌剂:里氏木霉:微紫青霉:枯草芽孢杆菌:白腐真菌=4:1:3:1;
d将风化煤与稻壳粉进行破碎筛分,选取粒径低于0.125mm的风化煤颗粒与稻壳粉颗粒,然后将风化煤颗粒与稻壳粉颗粒加入PDA培养基混匀后高压蒸汽灭菌,称取与混合好的混合微生物菌剂的质量比匹配的破碎筛分后的风化煤与稻壳粉,并按照质量百分含量为81.8%的破碎筛分后的风化煤和9.1%的破碎筛分后的稻壳粉加入PDA培养基混匀,接入质量百分含量为9.1%的混合微生物菌剂,于28℃的恒温培养箱中发酵培养,干燥后冷却研磨,获得复合菌剂,复合菌剂需置于4℃下保存。
实施例一、可降解山西风化煤生产腐殖酸的菌种培养及降解效果
将购买的里氏木霉(Trichodermalixii)、微紫青霉(Penicilliumjanthinellum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、白腐真菌(Hyprocrealixii)经富集培养后,稀释104—107倍,各取50μL稀释液涂布在PDA培养基和LB培养基上,于20℃培养3d。
将培养得到的目标菌株,接种到初始发酵培养基中,以180r/min,20℃摇床培养至OD600=0.8-1.0。再将4种菌按照体积比4:1:3:1接种量进行液体培养,培养基采用PD水培养基:马铃薯200g,葡萄糖20g,蒸馏水1000mL,获得微生物混合菌液。
如图1所示,微生物400倍显微图,a为里氏木霉,b为微紫青霉,c为白腐真菌,d为枯草芽孢杆菌。从图2液化效果来看,图中a为枯草芽孢杆菌,b为里氏木霉,c为微紫青霉,d为白腐真菌,以上四种微生物均对山西霍州风化煤有液化效果,其中a效果最为明显;其次是b,对风化煤具有一定的液化效果,液滴呈球状,分布在菌丝表面;c对处理后的风化煤稍有作用,有少许黑色液滴在菌丝表面;d对风化煤作用效果不太明显,二者作用会使菌丝及风化煤变潮湿。
如图3所示,图中a是以里氏木霉为本底菌,b是以枯草芽孢杆菌为本底菌,c是以微紫青霉为本底菌四株菌之间,没有出现明显的抑菌圈,说明菌株间无拮抗作用,可以作为功能菌株进行菌种配伍实验。
采用平板固体溶煤的方法研究混合菌剂对风化煤的降解效果。
对煤进行预处理,具体方法为:将风化煤过0.125mm筛,称取20g煤粉,加入100mL蒸馏水,搅拌30min以上,2h后,抽滤,121℃灭菌20min,70℃烘干备用。用PD水培养基(马铃薯20g,葡萄糖2g,蒸馏水100mL)于28℃培养混合菌液3d后撒上经预处理过后的风化煤(5g),5d后根据GB/T34766-2017《矿物源总腐殖酸含量的测定》和GB/T35106-2017《矿物源游离腐殖酸含量的测定》来检测残煤和滤液中的腐殖酸。
表1处理前后煤组分变化
根据表1数据分析,经微生物处理过的煤与原煤相比,灰分和挥发分含量稍有降低,固定碳含量增加,说明微生物会降解一部分的煤产生腐殖酸碳,从而使固定碳含量增加。
表2原煤以及处理后煤中主要元素含量变化
根据表2可知,经微生物处理过的残煤与原煤的元素进行比较,发现处理前后Rb、Br、Ni、Cu、Sr元素含量没有明显变化,而Cl、S、Al、Ca、Mg、Fe等元素的含量与原煤相比都有降低。
表3风化煤经混合菌降解后腐殖酸含量
根据表3可知,与原煤相比,残煤总腐殖酸含量高达43.23%,总腐殖酸增长率为68.14%,风化煤降解效果显著。
实施例2复合菌剂的制备,用成品复合菌剂进行增殖中试模型试验:
固态发酵模型:采用约4L的塑料盒,接入功率为12W的通风泵,用于强制通风。将煤、稻壳粉按81.8%:9.1%的质量比添加,再加入9.1%的复合微生物培养液,进行堆肥,每个堆肥材料混匀的初始质量约为2.5kg左右。盒体包八层纱布,起到保温及防止真菌孢子扩散的作用。
经测量,菌剂的含水量为17.4%,细度为80.11%,pH为5.73,细菌有效活菌数为0.42亿个/g,混合真菌有效活菌数为10亿个/g,微生物菌剂的外观、含水量、细度及有效活菌数均符合国家农用微生物菌剂标准。微生物菌剂主体呈黑色,有少许白色颗粒;整体呈粉末状,较为干燥,明显有刺鼻腐臭味道。菌剂含水量约为17.4%,菌剂细度约为80.11%,pH为5.73。
微生物发酵15天后总腐殖酸含量测定为44.65%,而原煤总腐殖酸含量测定为25.71%,总腐殖酸增加率高达73.67%(测定按《GB/T34766-2017矿物源总腐殖酸含量的测定》方法进行)。高于目前用微生物降解风化煤技术使其腐殖酸含量增高至32.04%的数据(王春颖,田瑞华,段开红,万永青,罗建辉,王振宇.一株放线菌降解风化煤的工艺研究[J].内蒙古农业大学学报(自然科学版),2011,32(02):166-169.)
表4发酵前后NPK含量变化
由此可见,复合菌剂对风化煤具有良好的降解效果,且发酵前后原煤的全氮含量增加约1.2倍,可以作为有机肥料在农业生产中大幅度推广。
Claims (5)
1. 一种提高风化煤中腐殖酸含量的复合菌剂,其特征在于:由以下质量百分含量的原料组成:混合微生物菌剂9.1%、风化煤81.8%和稻壳9.1%;所述的混合微生物菌剂包括:活化后并满足OD600=0.8-1.0的里氏木霉(Trichoderma reesei)、微紫青霉(Penicillium janthinellum)、白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),按体积比里氏木霉:微紫青霉:枯草芽孢杆菌:白腐真菌=4:1:3:1配制。
2.权利要求1所述的提高风化煤中腐殖酸含量的复合菌剂的制备方法,其特征在于步骤如下:
a使用PDA培养基常规方式活化里氏木霉、微紫青霉、白腐真菌;
b使用LB培养基常规方式活化枯草芽孢杆菌;
c将活化后的里氏木霉、微紫青霉、白腐真菌和枯草芽孢杆菌进行液体培养至OD600=0.8-1.0,之后按照菌液的体积比混合获得混合微生物菌剂:里氏木霉:微紫青霉:枯草芽孢杆菌:白腐真菌=4:1:3:1;
d 称取与混合好的混合微生物菌剂的质量比匹配的破碎筛分后的风化煤与稻壳粉,并按照质量百分含量为81.8%的破碎筛分后的风化煤和9.1%的破碎筛分后的稻壳粉加入PDA培养基混匀,接入质量百分含量为9.1%的混合微生物菌剂,于28℃的恒温培养箱中发酵培养,干燥后冷却研磨,获得复合菌剂,复合菌剂需置于4℃下保存。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:所述的PDA培养基具体配比为:马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂18g,蒸馏水1000mL。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:所述的LB培养基具体配比为:胰蛋白胨10g,酵母粉5g,氯化钠10g,琼脂20g,去离子水1000mL。
5.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:所述的风化煤和稻壳通过破碎筛分后选取粒径低于0.125mm的颗粒,风化煤和稻壳使用前需要加入PDA培养基混匀,经高压蒸汽灭菌后使用。
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