CN111848717A - 靶向调控线粒体能量代谢的化合物及其应用和药物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了靶向调控线粒体能量代谢的化合物及其应用和药物，药物领域。本发明公开的化合物具有如下结构式：
Figure DDA0002623855490000011
本发明首次发现，该化合物可靶向调控线粒体能量代谢，可用于治疗线粒体能量代谢依赖的疾病，该化合物原料来源于天然植物，具有资源丰富、安全性高等优点，在线粒体能量代谢异常的相关疾病的治疗中具有潜在的应用前景，为此类疾病的治疗提供了新的策略。

Description

靶向调控线粒体能量代谢的化合物及其应用和药物
技术领域
本发明涉及药物领域，具体而言，涉及靶向调控线粒体能量代谢的化合物及其应用和药物。
背景技术
线粒体是细胞进行氧化磷酸化、ATP合成的主要场所和产能中心，被称为细胞的“动力工厂”。在多种生物学过程中线粒体均扮演着重要角色，如细胞内的物质代谢、氧化还原平衡、钙平衡、信号传导、细胞的衰老与凋亡等，其功能异常必然导致多种疾病的发生，例如糖尿病、高血压、神经源性疾病、肿瘤等。因此，线粒体靶向药物的开发具有重要的研究意义。
氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation，OXPHOS)是有氧生物一种高效的能量获得方式，发生在真核细胞线粒体内膜的一系列蛋白复合物中。电子通过氧化还原反应由电子供体传递到电子受体，其中释放的能量用于ATP形成。研究表明，氧化磷酸化过程异常与多种疾病相关，如亨廷顿病、家族性帕金森病、阿尔兹海默症、高血压、脂肪肝等。
脂肪酸β-氧化(β-oxidation)是哺乳动物产生能量的重要来源之一。在由于禁食、能量摄入减少或疾病等因素引起的能量需求增加而需用到脂肪作为能源时，脂肪酸被释放进入β-氧化过程中作为能量来源。在这个过程中，肉碱转运途径的中断或线粒体β-氧化过程中断都可能会引发脂肪酸氧化失调(Fatty acid oxidation disorders,FAODs)。长链脂肪酸需要肉碱运输入线粒体内膜，肉碱棕榈酰转移酶(Carnitine palmitoyltransferase，CPT)参与这一过程。其中，CPT1将肉碱与长链脂肪酰辅酶A共价连接，通过肉碱酰基肉碱转位酶(Carnitine-acylcarnitine translocase,CACT)转运到内膜。而后，酰基肉碱被位于线粒体内膜的CPT2转换回酰基辅酶A，从而进入线粒体基质进行β-氧化。研究表明，CPT蛋白失调会引发代谢紊乱或线粒体相关疾病。
目前临床上常用的靶向线粒体代谢的药物都有着一定局限性，例如抗叶酸类药物常伴随较为严重的毒副作用如骨髓抑制、脱发、皮疹等。因此，人们逐渐将研究重点聚焦在特定的代谢酶中。目前，此类靶向的药物研究都还处于起步阶段。天然药物结构新颖独特，是新型先导化合物开发的重要源泉。近30年的数据统计显示，美国FDA批准的癌症相关药物约50％来源于天然产物或其衍生物，比如，长春花生物碱类，紫杉烃类，蒽环类等抗肿瘤药物。甘草次酸(Glycyrrhetinic Acid,GA)是天然植物甘草的主要活性成分，具有悠久的用药历史。已有文献报道，GA及其衍生物具有广泛的生物活性，包括抗过敏、抗炎、抗病毒、抗肿瘤和保肝作用等。在抗癌活性研究中发现，GA在体外具有广谱的抗肿瘤活性，对于宫颈癌细胞、结直肠癌细胞、非小细胞肺癌细胞、肝癌细胞等多种癌细胞具有明显的抑制作用。
GA相关药物的大量临床应用，证明其毒副作用小，具有一定的生物安全性。利用GA作为骨架进行多种结构修饰生成新型低毒的制剂的研究也引发了广泛关注。然而目前，关于GA的靶标研究尚不系统，其潜在分子机制仍尚待研究。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供靶向调控线粒体能量代谢的化合物及其应用和药物。该化合物可靶向调控线粒体能量代谢，可用于治疗线粒体能量代谢依赖的疾病，该化合物原料来源于天然植物，具有资源丰富、安全性高等优点，在线粒体能量代谢异常的相关疾病的治疗中具有潜在的应用前景，为此类疾病的治疗提供了新的策略。
本发明是这样实现的：
一方面，本发明提供一种靶向调控线粒体能量代谢的化合物，所述化合物包括：具有式(I)结构的化合物，或具有式(I)结构的化合物医学上可接受的盐，或具有式(I)结构的化合物医学上可接受的前药，或具有式(I)结构的化合物的旋光异构体，或具有式(I)结构的化合物的旋光异构体医学上可接受的盐，或具有式(I)结构的化合物的旋光异构体医学上可接受的前药：
Figure BDA0002623855470000011
在式(I)中，R1与R2各自独立的选自氢原子、羟基、巯基、氨基、卤素原子、烃氧基、烃胺基、烃巯基、氨基取代的烃氧基、羧基取代的烃氧基、卤素取代的烃氧基、氨基取代的烃胺基、羧基取代的烃胺基、卤素取代的烃胺基、氨基取代的烃巯基、羧基取代的烃巯基、卤素取代的烃巯基、氨基酸、多肽和葡萄糖醛酸聚合物。
本发明提供具有式(I)结构所示的化合物，其能够靶向调控线粒体能量代谢，该化合物通过对线粒体蛋白结合实现对线粒体能量代谢的靶向调控，并可用于治疗与线粒体能量代谢异常相关的疾病。
在可选的实施方案中，所述烃氧基选自饱和烃氧基与不饱和烃氧基。
在可选的实施方案中，所述烃胺基选自饱和烃胺基与不饱和烃胺基。
在可选的实施方案中，所述烃巯基选自饱和烃巯基与不饱和烃巯基。
在可选的实施方案中，所述烃氧基、烃胺基和烃巯基各自选自C1～C8的烃基；
在可选的实施方案中，所述卤素原子选自F、Cl、Br和I。
在可选的实施方案中，所述氨基酸包括但不限于甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、组氨酸和精氨酸。
在可选的实施方案中，所述多肽的氨基酸残基数量为2-5。
在可选的实施方案中，所述葡萄糖醛酸聚合物的单体数量为1-5。
在可选的实施方式中，所述化合物选自：
Figure BDA0002623855470000021
其中，
Figure BDA0002623855470000022
为18α-甘草次酸，分子式C30H46O4，分子量470.68，白色粉末状固体。溶于醇，不溶于水，CAS号1449-05-4。
Figure BDA0002623855470000031
18β-甘草次酸(GA)，分子式C30H46O4，分子量470.68，白色粉末状固体。溶于醇，不溶于水，CAS号471-53-4。
Figure BDA0002623855470000032
甘草酸(GZ)，分子式C42H62O16，分子量822.93，淡黄色粉末状固体。易溶于热水，不溶于醚，难溶于乙醇、丙二醇。CAS号1405-86-3。
Figure BDA0002623855470000033
甘珀酸钠(CBX)，分子式C34H48Na2O7，分子量614.72，白色粉末状固体。易溶于水。CAS号7421-40-1。
Figure BDA0002623855470000034
甘草次酸乙二胺衍生物(GEN)，分子式C32H52N2O3，分子量512.77，白色粉末状固体。易溶于水。CAS号912541-99-2。
Figure BDA0002623855470000035
甘草次酸丙二胺衍生物(GPN)，分子式C33H54N2O3，分子量526.79，白色粉末状固体。易溶于水。CAS号1237522-71-2。
Figure BDA0002623855470000041
甘草次酸丁二胺衍生物(GBN)，分子式C34H56N2O3，分子量540.82，白色粉末状固体。易溶于水。CAS号1237522-72-3。
另一方面，本发明提供如上任一项所述的化合物在制备用于靶向调控线粒体能量代谢的制剂中的应用。
本发明的研究发现具有式(I)结构所示的化合物的新作用机制，其能够靶向调控线粒体能量代谢，该化合物通过对线粒体蛋白结合实现对线粒体能量代谢的靶向调控，其可用于备用于靶向调控线粒体能量代谢的制剂。
在可选的实施方案中，调控线粒体能量代谢是指如下调控作用中的一种或多种：调控线粒体呼吸链蛋白表达、调控线粒体呼吸水平、调控NAD+和/或NADH含量或比值、调控NADP+和/或NADPH含量或比值、调控ROS含量、改变线粒体膜电位、调控细胞氧化磷酸化水平、以及调控脂肪酸氧化。
在可选的实施方案中，所述线粒体呼吸链蛋白包括但不限于NDUFB7、NDUFS6、NDUFV2、NDUFA13、NDUFS4、NDUFB9、NDUFA12、NDUFS1、NDUFA7、NDUFA8、NDUFA10、NDUFB1、NDUFB6、NDUFS3、NDUFS7、NDUFS2、NDUFS8、NDUFS5、NDUFV1、NDUFA5、NDUFB4、NDUFAF1、NDUFC2、NDUFC2-KCTD14、NDUFB5、NDUFB11、NDUFA2、NDUFAF7、NDUFA6、SDHB、SDHA、SDHC、CYB5B、MT-CYB、CYBA、CYC1、UQCRB、UQCRQ、UQCRFS1、UQCRFS1P1、UQCRC2、UQCRC1、UQCR10、UQCC2、NDUFA4、COX6C、COX7C、COX7A2L、COX6B1、COX4I1、COX7B、MT-CO2、MT-ATP6、ATP5S、ATP5I、ATP5J2、ATP5A1、ATP5L、ATP5F1和ATPAF2。
在可选的实施方案中，所述调控脂肪酸氧化是指如下调控作用中的至少一种：调控脂肪酸氧化相关蛋白表达、调控脂酰肉碱的转运、调控脂肪酸β氧化水平、以及调控脂酰肉碱的含量。
在可选的实施方案中，所述脂肪酸氧化相关蛋白选自ACAD11、ACAD9、ACAD10、HADHA、ACSF2、CPT1A和CPT2。
在可选的实施方案中，所述脂酰肉碱选自Lauroylcarnitine、Vaccenylcarnitine、Trans-Hexadec-2-enoyl carnitine、2,6-Dimethylheptanoylcarnitine、Decanoylcarnitine、Myristoylcarnitine、L-Palmitoylcarnitine中的一种或多种。
在可选的实施方案中，所述化合物通过靶向结合线粒体蛋白以实现调控线粒体能量代谢的作用。
在可选的实施方案中，所述线粒体蛋白选自ACAD9、ACSL3、AIFM2、ATP5F1、ATP5H、BCS1L、C19orf52、C21orf33、CCDC51、CPOX、ECSIT、FLAD1、NDUFAF1、NIPSNAP1、NIT1、PTCD1、RDH13、SHMT2、SLC25A46、SQRDL和TBRG4。
本发明的研究结果首次显示，式(I)结构所示的化合物能够与上述的线粒体蛋白结合实现对线粒体能量代谢的调控。
在可选的实施方案中，所述线粒体蛋白包括但不限于CPOX、SHMT2、C21orf33、PTCD1、FLAD1和SLC25A46。
在可选的实施方案中，所述线粒体蛋白为SHMT2。
另一方面，本发明提供如上任一项所述的化合物在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的应用。
在可选的实施方案中，所述肿瘤包括但不限于肺腺癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺浸润癌、皮肤黑色素瘤、间皮瘤、肉瘤、肾上腺皮质癌、结直肠癌、淋巴瘤、胰腺癌、非小细胞肺癌和髓性白血病。
或者，所述肿瘤包括但不限于RB1缺失型乳腺癌、BCL-2高表达的急性骨髓性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤的OXPHOS亚型、KRas消融的胰腺导管腺癌、LKB1缺失的非小细胞肺癌、PGC1α表达的黑色素瘤和缺氧实体肿瘤。
另一方面，本发明提供如上任一项所述的化合物在制备用于预防或治疗由脂肪酸氧化异常升高引起的相关疾病的药物中的应用。
本发明的研究结果首次显示，式(I)结构所示的化合物能够调控脂肪酸氧化作用主要是下调脂肪酸氧化过程。基于此，该化合物可用于制备预防或治疗由脂肪酸氧化异常升高引起的相关疾病的药物。
在可选的实施方案中，由脂肪酸氧化异常升高引起的相关疾病包括但不限于肺癌、乳腺癌、髓性白血病、肝细胞癌、胶质瘤、星形细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤、结直肠癌、皮肤黑色素瘤和淋巴瘤。
或者，由脂肪酸氧化异常升高引起的相关疾病包括但不限于肥胖、糖尿病、缺血性心脏病、心脏衰竭、糖尿病性心肌病、非酒精性脂肪性肝病和肥胖引起的胰岛素抵抗。
或者，由脂肪酸氧化异常升高引起的相关疾病包括但不限于KRAS突变型肺癌、c-Myc过表达的三阴性乳腺癌、急性骨髓性白血病、肝炎B诱导的肝细胞癌、神经胶质瘤和低度星形细胞瘤。
但需要说明的是，将式(I)结构所示的化合物用于制备成其他由脂肪酸氧化异常升高引起的疾病也是属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明提供如上任一项所述的化合物在制备用于预防或治疗由氧化磷酸化升高引起的相关疾病的药物中的应用。
本发明的研究结果首次显示，式(I)结构所示的化合物能够调控细胞的氧化磷酸化水平主要是下调氧化磷酸化水平。基于此，该化合物可用于制备预防或治疗由氧化磷酸化升高引起的相关疾病。
在可选的实施方案中，由氧化磷酸化升高引起的相关疾病包括但不限于亨廷顿病、家族性帕金森病、阿尔兹海默症、胰岛素耐受、高血压、脂肪肝和衰老。
在可选的实施方案中，由氧化磷酸化升高引起的相关疾病包括但不限于神经退行性疾病、视网膜功能性障碍(如：Leber遗传性视神经病LHON、Leber先天性黑蒙)、肥胖、胰岛素耐受、高血压、脂肪肝、衰老和心力衰竭。
在可选的实施方案中，神经退行性疾病包括但不限于亨廷顿病、家族性帕金森病、阿尔兹海默症和肌萎缩性脊髓侧索硬化症。
基于本发明公开的内容，本领域技术人员容易想到将式(I)结构所示的化合物用于治疗其他的由氧化磷酸化升高引起的疾病，其也是属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明提供如上一种治疗疾病的药物，其含有如上任一项所述的化合物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1：GA处理后HeLa、HCT116、A375细胞线粒体膜电位变化图。
图2：GA处理后HeLa细胞氧消耗速率(左)和基础呼吸(右)。
图3：GA梯度浓度处理HeLa细胞后相关蛋白表达。
图4：GA梯度浓度处理HeLa细胞后NAD+/NADH变化。
图5：GA梯度浓度处理HeLa细胞后ROS变化。
图6：Pull-down实验中GA的相互作用蛋白。
图7：Retro-pull-down实验显示潜在的GA相互作用蛋白。
图8：GA与SHMT2的SPR分析结果。
图9：SHMT2在GA作用下的荧光淬灭谱图。
图10：SHMT2蛋白在不同实验组的热稳定性差异。
图11：GA抑制SHMT2酶活力。
图12：GA处理后显著变化蛋白的GO分析。
图13：GA处理与SHMT2敲除蛋白组相关性分析。
图14：GA处理后蛋白组数据GSEA分析。
图15：代谢组学显示脂酰肉碱积累。
图16：CPT2蛋白在GA处理及SHMT2敲除后表达下调。
图17：GA对多种人源肿瘤细胞系的细胞活力抑制测定。
图18：GA靶向抑制SHMT2的活性抑制肿瘤细胞增殖。
图19：HeLa(左)和A375(右)细胞裸鼠皮下瘤模型。
图20：HeLa(左)和A375(右)裸鼠剥离肿瘤。
图21：HeLa(左)和A375(右)细胞裸鼠肿瘤体积变化。
图22：HeLa(左)和A375(右)细胞裸鼠肿瘤重量。
图23：GA衍生物对细胞活力影响。
图24：GA衍生物对线粒体呼吸链复合物蛋白的影响。
图25：GA与其衍生物对于ATP产生的比较。
图26：SPR验证GA衍生物与SHMT2相互作用。
图27：甘草次酸乙二胺衍生物GEN的核磁图谱(氢谱)。
图28：甘草次酸乙二胺衍生物GEN的核磁图谱(碳谱)。
图29：甘草次酸乙二胺衍生物GEN的高分辨质谱。
图30：甘草次酸丙二胺衍生物GPN的核磁图谱(氢谱)。
图31：甘草次酸丙二胺衍生物GPN的核磁图谱(碳谱)。
图32：甘草次酸丙二胺衍生物GPN的高分辨质谱。
图33：甘草次酸丁二胺衍生物GBN的核磁图谱(氢谱)。
图34：甘草次酸丁二胺衍生物GBN的核磁图谱(碳谱)。
图35：甘草次酸丁二胺衍生物GBN的高分辨质谱。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
甘草次酸的线粒体靶向性细胞表型
为了探索甘草次酸对细胞线粒体的影响，本实施例进行了甘草次酸对细胞线粒体表型变化的研究，即检测18β-甘草次酸(GA；Biopurify；纯度：95％-99％；货号：BP0681)处理后的HeLa细胞、HCT116细胞及A375细胞系各项线粒体表型变化指标，包括：线粒体膜电位变化、线粒体呼吸链相关蛋白表达、线粒体呼吸链复合物I的功能、细胞活性氧自由基(ROS)水平等。
通过免疫印迹(Western blot，WB)检测线粒体呼吸链相关蛋白表达；
通过JC-1染色法(Byotime，#C2006)检测线粒体膜电位变化；
使用Seahouse XF e24 analyser(Agilent Techologies)测定OCR检测活性氧消耗；
使用NAD+/NADH检测试剂盒(Beyotime，#S0175)测定NAD+/NADH比值；
使用活性氧检测试剂盒(Beyotime，#S0033)测定GA对细胞内ROS水平的影响。
结果显示，与阴性对照(NC)相比，100μM GA处理的HeLa细胞、HCT116细胞及A375细胞线粒体膜电位下降(绿色荧光变强)，表明GA通过降低线粒体膜电位引起肿瘤细胞的凋亡(图1)。同时，GA使HeLa细胞的线粒体耗氧速率下降，该现象主要与GA处理后细胞的基础呼吸水平、ATP的产生、最大呼吸速率及剩余呼吸能力下调相关(图2)。WB结果说明，GA对HeLa细胞系的抑制作用可能与线粒体呼吸链复合物蛋白下调，尤其是与线粒体呼吸链复合物I的蛋白下调相关(图3)。同时，GA处理可使NAD+/NADH比值逐渐下调(图4)，细胞内活性氧自由基(ROS)聚集，且该趋势呈浓度依赖性(图5)。
以上结果表明，GA具有一定的线粒体靶向性，可以导致多种线粒体功能紊乱。
实施例2
甘草次酸的线粒体靶向性研究
1.Pull-down实验研究甘草次酸靶点蛋白
借助光反应探针的技术将GA进行固相化，选取人宫颈癌细胞系HeLa的提取蛋白用于下拉实验(Pull-downexperiment)，分别设置相关的药物空白实验、药物竞争性实验为对照实验，每组实验均进行三组生物学重复。将洗脱下来的蛋白借助Label-free的方法进行定量蛋白质组学分析。
实验结果显示，pull-down实验中共鉴定到61个GA的相互作用蛋白，即能被GA充分竞争(图6)，ratio(GAaverageintensity/GA-comp average intensity)>1.5。而这61个相互作用蛋白主要分布在线粒体中，包括线粒体蛋白：ACAD9、ACSL3、AIFM2、ATP5F1、ATP5H、BCS1L、C19orf52、C21orf33、CCDC51、CPOX、ECSIT、FLAD1、NDUFAF1、NIPSNAP1、NIT1、PTCD1、RDH13、SHMT2、SLC25A46、SQRDL、TBRG4。其中线粒体蛋白CPOX、SHMT2、C21orf33、PTCD1、FLAD1、SLC25A46能够被游离的GA完全竞争，属于GA的核心靶点蛋白。该结果进一步表明，GA可以与线粒体蛋白特异性结合，具有线粒体靶向性。
2.与靶点蛋白相互作用的体外验证
本实施例以线粒体丝氨酸羟甲基转移酶SHMT2为例，验证其与GA直接特异性结合。通过反拉实验(Retro-pull-down)、表面等离子体共振技术(surface plasmon resonance，SPR)实验、细胞热转变法(Cellular Thermal Shift Assay，CETSA)实验和荧光淬灭实验(fluorescence-quenching)和对靶点蛋白SHMT2与GA的体外结合进行了验证。
由于SHMT2是由固相化GA后进行的pull-down实验富集得到的，为了进一步验证SHMT2可以与GA相互作用，本发明的发明人设计了反向pull-down实验，即将SHMT2接到琼脂糖珠子上，然后与20μM GA进行孵育，并通过LC-MS分别检测孵育后的小分子溶液(即pull-down实验的上清)和洗脱液中GA的含量来验证SHMT2对GA的富集作用。为了排除琼脂糖珠子的非特异性吸附，在实验中加入了没有连接SHMT2蛋白的空白琼脂糖珠子作对照。GA的浓度根据GA标准品绘制的标准曲线确定。反拉实验结果如图所示(图7)，与空白对照实验相比，固相化SHMT2后能够显著富集游离的GA。
SPR实验结果显示(图8)，GA产生的响应值随浓度增加而升高，通过浓度与响应值变化关系模拟得出GA与SHMT2的相互作用力常数Kd值为2.90μM。说明GA与SHMT2有直接相互作用。
荧光淬灭实验表明(图9)，随着GA的加入，SHMT2以274nm为激发光，在335nm处产生荧光淬灭现象，且这种现象随着浓度的增加趋势逐渐降低，说明GA可以与SHMT2在体外结合，并使SHMT2的蛋白构象发生改变。说明GA能够与SHMT2相结合。
CETSA实验结果如图(图10)，300μM的GA使SHMT2的T1/2增加了3℃，说明GA会影响SHMT2在细胞内的热稳定性，GA能够与SHMT2相结合。
由于SHMT2是催化丝氨酸和四氢叶酸转变为甘氨酸和5,10-亚甲基四氢叶酸的催化酶。本发明的发明人探寻了GA处理是否会影响SHMT2的活性。结果显示(图11)，随着GA浓度的增加，SHMT2的酶活被显著地逐步抑制。
综上，说明GA可以与SHMT2直接相互作用，并能够抑制SHMT2的活性。
实施例3
蛋白质组学与代谢组学技术揭示GA可通过抑制线粒体蛋白SHMT2的活性调控线粒体能量代谢和脂肪酸氧化
1.蛋白质组学技术揭示GA可通过抑制线粒体蛋白SHMT2的活性调控线粒体能量代谢和脂肪酸氧化。
为了揭示GA引发线粒体功能紊乱的潜在机制，及SHMT2在GA生物学活性中的重要作用。本发明的发明人借助等重量串联标签TMT技术对100μM GA处理后的HeLa细胞、SHMT2敲除的HeLa细胞，及空白处理组的野生型HeLa细胞的全蛋白裂解液进行定量蛋白质组学研究，每组实验进行三组生物学重复。药物(或空白)处理细胞48h后，对细胞进行全蛋白提取，通过对每组蛋白进行还原烃基化处理后进行酶解，并将酶解后的多肽进行TMT9同位素标记，标记试剂淬灭后将标记后的样品合并，并进行HPLC分级处理，随后经C18除盐后进行质谱分析。最终得到GA处理及SHMT2敲除后蛋白表达丰度数据。
对于GA处理后差异性表达蛋白，本发明的发明人利用DAVID数据平台综合分析。基因本体富集分析(Gene Ontology enrichment analysis)结果显示，GA处理的细胞中多种线粒体能量代谢相关生物学过程发生显著下调(图12)，如线粒体呼吸链复合物I组装过程、线粒体电子转运过程等。该结论与实施例1中的WB结果所示(GA会引起线粒体呼吸链复合物相关蛋白表达下调)相符合。进一步分析GA处理与SHMT2敲除组的蛋白质组学数据相关性发现(图13)，两种模型的蛋白组变化呈正相关，相关系数在0.61-0.66之间，进一步表明GA通过靶向结合SHMT2发挥相应的生物学活性，如诱导线粒体能量代谢相关生物学过程下调。
此外，GSEA分析发现，GA会导致细胞氧化磷酸化水平显著下调(图14)。该趋势与线粒体蛋白SHMT2敲除后的细胞变化水平一致。此外，进一步研究GA处理及SHMT2敲除后相关蛋白表达变化发现，脂肪酸β-氧化通路相关蛋白(如：ACAD11、ACAD9、ACAD10、HADHA、ACSF2、CPT1A、CPT2等)也显示出相同的下降趋势。
以上结果证明GA可以通过靶向抑制SHMT2的活性，下调细胞线粒体能量代谢及脂肪酸β-氧化过程。
2.代谢组学揭示GA可通过抑制线粒体蛋白SHMT2的活性调控脂肪酸氧化过程
为了进一步了解GA通过结合SHMT2对细胞脂肪酸β-氧化通路的调控作用，本发明的发明人进行了非靶向代谢组学研究。结果显示，在GA处理或SHMT2敲除的HeLa细胞中存在大量的酰基肉碱积聚现象，提示可能是由于线粒体内酰基肉碱的转入减少(图15)引起的。肉毒碱棕榈酰转移酶2(CPT2)是一种负责将酰基肉毒碱运输到线粒体作为能量来源的蛋白质。同时，蛋白质组学数据也表明，CPT2在GA处理或SHMT2敲除后下调，这一结果通过western blot证实(图16)。
该结论进一步说明GA可通过靶向抑制SHMT2的活性，调控细胞的脂肪酸β-氧化过程。
实施例4
GA的抗肿瘤活性研究
采用MTT法测定不同浓度的GA对肿瘤细胞系即黑色素瘤细胞A375(上海ATCC细胞库)、宫颈癌细胞HeLa(国家实验细胞资源共享平台)、结直肠癌细胞Hct116(国家实验细胞资源共享平台)、肝癌细胞HepG2(国家实验细胞资源共享平台)、非小细胞肺癌细胞A549、骨肉瘤细胞U2OS(国家实验细胞资源共享平台)中的抗肿瘤活性对比。
所有细胞系经过相关鉴定。所有细胞系无特殊说明均采用含链霉素(100μg/mL)、青霉素(100U/mL)及胎牛血清(10％)的DMEM培养基(A549采用1640培养基)，在5％CO2相对湿度95％，37℃条件下培养。实验结果如图17所示，GA对以上肿瘤细胞均有一定的抑制作用。
实施例5
GA通过靶向抑制线粒体蛋白SHMT2的活性抑制肿瘤
1.肿瘤细胞增殖实验
为了证明GA可以通过抑制SHMT2的活性达到抑制肿瘤的目的，本实施例分别对野生型HeLa细胞、SHMT2敲除的HeLa细胞、100μM GA处理的野生型和SHMT2敲除的HeLa细胞进行了细胞计数追踪。
分别取等量生长状态较好的野生型及SHMT2敲除的HeLa细胞接种于12孔板中，待细胞贴壁后，分别取3个孔，加入1mL生理盐水润洗，随后加入1mL胰酶，37℃消化3min，待细胞完全消化下来后混匀，取20μL用countstar计数，其余孔中分别加入不含药物的空白对照及100μM的GA，每隔24小时按同样的方法将细胞消化下来计数。总共计5天。
结果如图18所示，SHMT2敲除的HeLa细胞的生长和增殖速度明显比野生型细胞慢，在第四天表现出差异，且随着时间的延长差异越明显。说明SHMT2蛋白可以影响肿瘤细胞的生长和增殖。GA处理后的野生型及SHMT2敲除的HeLa细胞生长明显慢于未加入药物组，说明GA对HeLa系胞有明显的抑制作用，但是单独对比GA处理后的野生型和SHMT2敲除的HeLa细胞的增殖速度可以发现，SHMT2敲除后的HeLa在生长到第四天的时候细胞个数开始反超GA处理后的野生型HeLa细胞，且长至第五天以后，二者显现出明显差异。说明敲除SHMT2后的HeLa细胞对GA的耐受性增加，GA可以通过抑制SHMT2的活性达到抑制肿瘤的目的。
2.宫颈癌和黑色素瘤的荷瘤小鼠模型验证实验
动物：Babc裸鼠(雄)(北京华福康，6周大，SPF级)。
为了探究GA通过抑制SHMT2的活性对实体瘤的影响，本实施例还进行了基于人宫颈癌细胞和黑色素瘤细胞的荷瘤小鼠实验验证。
28只六周龄雄性小鼠分为2组。宫颈癌组12只，裸鼠左侧接种SHMT2敲除的HeLa细胞，右侧接种野生型HeLa细胞，接种浓度为3×106个/100μL，接种100uL。黑色素瘤组16只，裸鼠左侧接种SHMT2敲降的A375细胞，右侧接种敲降对照的A375细胞，接种浓度为3×106个/100μL，接种100uL(图19)。肿瘤体积长至可觉察时，将小鼠随机平均分为两组开始分别腹腔注射给药DMSO对照和GA。每隔两天给药一次，共给药八次，给药剂量为30mg/kg。
瘤体积每6天测量一次。用游标卡尺分别测量肿瘤的长径和短径。
瘤体积计算：体积＝长径×短径2。
接种五周后，荷瘤小鼠腹腔注射水合氯醛进行麻醉，并按实验分组进行拍照。随后将小鼠处死，剥离肿瘤，称量瘤重，随后拍照(图20)。
结果如图所示，相较于药物阴性对照组，接种SHMT2敲除细胞的肿瘤体积，明显小于野生组。而给药后的肿瘤体积明显小于未给药组。进一步分析肿瘤体积(图21)和瘤重数据(图22)可知，对于野生型细胞，连续腹腔注射GA后肿瘤明显变小，说明GA可以抑制HeLa肿瘤的生长。对比野生型与SHMT2敲除的HeLa肿瘤数据可知，SHMT2敲除的HeLa肿瘤明显小于野生型肿瘤，说明SHMT2与HeLa肿瘤的生长相关。但是，对于SHMT2敲除的HeLa肿瘤，腹腔注射GA与NC组之间并没有明显差异，说明敲除SHMT2后，GA对肿瘤的抑制作用降低。以上实验结果表明，GA可以通过靶向抑制SHMT2的活性来抑制HeLa肿瘤的生长。在A375荷瘤小鼠中也得到类似结果(图19-22)。进一步说明GA可通过抑制SHMT2的活性抑制肿瘤。
实施例6
甘草次酸衍生物合成及验证
本实施例以甘草次酸的乙二胺(GEN)、丙二胺(GPN)、丁二胺(GBN)衍生物为例。
1.甘草次酸乙二胺衍生物(GEN)
在无水二氯甲烃(50mL)中加入GA(470mg，1mmol)，乙醇二胺(300mg，5mmol)和1-羟基苯并三唑(HOBT，J&K Scientific，#517257)(162mg，1.2mmol)，在0℃下搅拌30min。随后，加入N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基二亚胺盐酸盐(EDCI,MACKLIN，#N835594)(229.2mg，1.2mmol)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，MACKLIN，#N807281)(387mg，3mmol)，在0℃下继续搅拌30min。之后反应体系在室温下搅拌过夜，并用TLC监控反应过程。反应完成后，用0.5MHCl水溶液洗三次，随后用无水Na2SO4干燥。浓缩有机溶剂，得到的粗产品经硅胶柱层析分离纯化(二氯甲烃：甲醇＝10：1)，得到白色粉末状固体，产率为62.5％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ7.61(s,1H,NH),5.38(s,1H,H-12),3.09-2.96(m,2H,H-A),2.91(m,1H,H-3),2.50(m,2H,H-B),2.21(s,1H,H-9),2.01-1.90(m,2H,H-1,H-15),1.82(m,1H,H-18),1.76-1.59(m,2H,H-2,H-21),1.57-1.46(m,2H,H-16,H-19),1.45-1.37(m,2H,H-6,H-7),1.31(m,1H,H-21’),1.26(s,1H,H-22),1.25(m,1H,H-2’),1.24(s,3H,H-27),1.21(m,1H,H-7’),1.20-1.16(m,2H,H-1’,H-6’),1.15-1.08(2H,H-22’,H-5’),1.03(m,1H,H-16’),0.92(s,9H,H-29,H-25,H-26),0.83(m,1H,H-15’),0.80(s,3H,H-28),0.62(s,3H,H-24),0.58(s,3H,H-23).13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ199.51(C11),175.84(C30),127.93(C12),77.03(C3),61.63(C9),48.16(C18),45.29(C5),43.35(C8),41.32(C20),41.11(C14),41.06(C19),39.23(CA),39.01(CB),37.79(C10),37.11(C4),32.63(C1),31.85(C7),30.92(C17),29.08(C21),28.91(C28),28.61(C23),27.42(C29),26.54(C16),26.41(C15),23.46(C2),23.46(C27),18.81(C24),17.63(C26),16.63(C16),16.46(C25).HRMS(ESI-TOF)calcd for C32H53N2O3+:[M+H]+calcd for 513.4051,found 513.4055。
2.甘草次酸丙二胺衍生物GPN
GPN的制备方法与GEN相似，区别在于用丙二胺(370mg，5mmol)代替乙醇二胺。产物为白色粉末状固体，产率为62.74％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.63(s,1H,NH),5.49(s,1H,H-12),3.19-3.07(m,2H,H-A),3.02(m,1H,H-3),2.64-2.51(m,3H,H-B,H-1),2.32(s,1H,H-9),2.08(m,2H,H-15,H-18),1.90(m,1H,H-2),1.85-1.70(m,2H,H-21,H-16),1.62(m,2H,H-C),1.56(m,1H,H-19),1.53-1.50(m,2H,H-7,H-6),1.48(m,1H,H-21’),1.42(m,2H,H-22,H-2’),1.37(s,1H,H-7’),1.36-1.34(m,3H,H-27),1.30(m,2H,H-6’,H-1’),1.23(m,2H,H-22’,H-5),1.17-1.11(m,1H,H-16’),1.04(m,6H,H-29,H-25),1.01(s,3H,H-26),0.95(m,1H,H-15’),0.91(s,3H,H-28),0.73(s,3H,H-24),0.69(s,3H,H-23).13CNMR(100MHz,DMSO-d6):δ199.50(C11),175.50(C30),179.09(C13),127.95(C12),77.06(C3),61.64(C9),48.22(C18),45.29(C5),43.36(C8),43.32(C20),41.29(C14),39.24(C19),39.20(CA),39.20(CC),39.02(CB),37.80(C22),37.12(C10),36.63(C4),32.95(C1),32.64(C7),31.84(C17),30.92(C21),29.21(C28),28.93(C23),28.60(C29),27.42(C16),26.54(C15),26.41(C2),23.46(C27),18.81(C24),17.63(C26),16.63(C16),16.45(C25).HRMS(ESI-TOF)calcd for C33H55N2O3+:[M+H]+calcd for 527.4207,found 527.4219。
3.甘草次酸丁二胺衍生物GBN
GBN的制备方法与GEN相似，区别在于用丁二胺(440mg，5mmol)代替乙醇二胺。产物为白色粉末状固体，产率为58.33％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.56(s,1H,NH),5.49(s,1H,H-12),3.00-2.98(m,2H,H-A),2.95(s,1H,H-3),2.63-2.54(m,2H,H-D),2.32(s,1H,H-9),2.18(m,2H,H-15,H-1),2.06(m,2H,H-18,H-2),1.90(m,1H,H-21),1.86-1.72(m,2H,H-16,H-19),1.67-1.56(m,2H,H-7,H-6),1.56-1.45(m,4H,H-B,H-C),1.42(m,1H,H-21’),1.39-1.36(m,2H,H-2’,H-22),1.35(s,3H,H-27),1.29(m,3H,H-1’,H-6’,H-7’),1.26(s,1H,H-22’),1.24(s,1H,H-5),1.15(m,1H,H-16’),1.04(m,6H,H-25,H-29),1.01(s,3H,H-26),0.97(s,1H15’),0.92(s,3H,H-28),0.73(s,3H,H-24),0.70(s,3H,H-23).13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ199.53(C11),175.31(C30),170.17(C13),127.91(C12),77.06(C3),61.64(C9),48.20(C18),45.66(C5),43.37(C8),43.28(C20),41.38(C14),41.31(CA),39.24(CD),38.89(C19),38.11(C22),37.78(C10),37.12(C4),34.51(C1),32.63(C7),31.84(C17),30.20(C21),29.16(CC),28.91(C28),28.60(C23),28.51(CB),27.43(C29),27.23(C16),26.54(C15),26.41(C2),23.45(C27),18.81(C24),16.63(C26),16.45(C16),16.18(C25).
HRMS(ESI-TOF)calcd for C34H57N2O3+:[M+H]+calcd for 541.4364,found541.4371。
实施例7
甘草次酸衍生物线粒体靶向性研究
本实施例以甘草次酸的乙二胺(GEN)、丙二胺(GPN)和丁二胺(GBN)衍生物为例。
1.甘草次酸衍生物的抗癌活性研究
通过MTT实验测量甘草次酸乙二胺、丙二胺、丁二胺衍生物在人宫颈癌细胞HeLa和黑色素瘤细胞A375的IC50值。
结果显示(图23)，乙二胺、丙二胺、丁二胺在HeLa细胞系的IC50值差别不大，均在40μM左右。在A375细胞系中，乙二胺、丙二胺的IC50值在40μM左右，而丁二胺在50μM左右。综合两个细胞系结果，甘草次酸衍生物对细胞的杀伤能力均好于甘草次酸，其中丙二胺具有更好的细胞杀伤能力。
2.甘草次酸衍生物的线粒体靶向性表型
使用WB对甘草次酸衍生物处理后的细胞线粒体复合物的变化进行检测；
通过检测细胞内ATP的产生反映对照组、甘草次酸和甘草次酸衍生物分别处理后细胞线粒体能量代谢的变化。
结果显示(图24)，用较GA更低的浓度的乙二胺、丙二胺、丁二胺(40μM)分别处理细胞后，线粒体呼吸链复合物蛋白的表达有所下降。同时，相较于对照组或相对高浓度的甘草次酸处理组，甘草次酸衍生物能在更低的处理浓度抑制ATP产生(图25)。这表明改造甘草次酸生成的衍生物也具有线粒体靶向性，并能抑制能量代谢。
3.甘草次酸衍生物与靶点蛋白SHMT2的相互作用
通过表面等离子体共振技术(surface plasmon resonance，SPR)实验验证GA系列衍生物甘草酸(GZ)、甘铂酸钠(CBX)和丙二胺衍生物(GPN)与SHMT2的直接相互作用。如结果所示(图26)，其中，GZ与SHMT2的亲和力为43μM、CBX与SHMT2的亲和力为15.1μM、GPN与SHMT2的亲和力为2.14μM，因此甘草次酸的3位葡萄糖醛酸衍生物GZ、3位琥珀酸半酯衍生物的钠盐CBX、30位丙二胺衍生物GPN均能够与SHMT2特异性结合。
综上，上述结果表明甘草次酸是潜在的药物设计前体，其衍生物也具有靶向调控(主要是指抑制)线粒体能量代谢、氧化磷酸化水平及脂肪酸氧化的作用，在抑制肿瘤、氧化磷酸化相关疾病及脂肪酸氧化异常相关疾病中具有应用潜力。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种靶向调控线粒体能量代谢的化合物，其特征在于，所述化合物包括：具有式(I)结构的化合物，或具有式(I)结构的化合物医学上可接受的盐，或具有式(I)结构的化合物医学上可接受的前药，或具有式(I)结构的化合物的旋光异构体，或具有式(I)结构的化合物的旋光异构体医学上可接受的盐，或具有式(I)结构的化合物的旋光异构体医学上可接受的前药：
Figure FDA0002623855460000011
在式(I)中，R1与R2各自独立的选自氢原子、羟基、巯基、氨基、卤素原子、烃氧基、烃胺基、烃巯基、氨基取代的烃氧基、羧基取代的烃氧基、卤素取代的烃氧基、氨基取代的烃胺基、羧基取代的烃胺基、卤素取代的烃胺基、氨基取代的烃巯基、羧基取代的烃巯基、卤素取代的烃巯基、氨基酸、多肽和葡萄糖醛酸聚合物。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述烃氧基选自饱和烃氧基与不饱和烃氧基；
优选的，所述烃胺基选自饱和烃胺基与不饱和烃胺基；
优选的，所述烃巯基选自饱和烃巯基与不饱和烃巯基；
优选的，所述烃氧基、烃胺基和烃巯基各自选自C1～C8的烃基；
优选的，所述卤素原子选自F、Cl、Br和I；
优选的，所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、组氨酸和精氨酸；
优选的，所述多肽的氨基酸残基数量为2-5；
优选的，所述葡萄糖醛酸聚合物的单体数量为1-5。
3.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述化合物选自：
Figure FDA0002623855460000012
Figure FDA0002623855460000021
4.权利要求1-3任一项所述的化合物在制备用于靶向调控线粒体能量代谢的制剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，调控线粒体能量代谢是指如下调控作用中的一种或多种：调控线粒体呼吸链蛋白表达、调控线粒体呼吸水平、调控NAD+和/或NADH含量或比值、调控NADP+和/或NADPH含量或比值、调控ROS含量、改变线粒体膜电位、调控细胞氧化磷酸化水平、以及调控脂肪酸氧化；
优选的，所述线粒体呼吸链蛋白选自NDUFB7、NDUFS6、NDUFV2、NDUFA13、NDUFS4、NDUFB9、NDUFA12、NDUFS1、NDUFA7、NDUFA8、NDUFA10、NDUFB1、NDUFB6、NDUFS3、NDUFS7、NDUFS2、NDUFS8、NDUFS5、NDUFV1、NDUFA5、NDUFB4、NDUFAF1、NDUFC2、NDUFC2-KCTD14、NDUFB5、NDUFB11、NDUFA2、NDUFAF7、NDUFA6、SDHB、SDHA、SDHC、CYB5B、MT-CYB、CYBA、CYC1、UQCRB、UQCRQ、UQCRFS1、UQCRFS1P1、UQCRC2、UQCRC1、UQCR10、UQCC2、NDUFA4、COX6C、COX7C、COX7A2L、COX6B1、COX4I1、COX7B、MT-CO2、MT-ATP6、ATP5S、ATP5I、ATP5J2、ATP5A1、ATP5L、ATP5F1和ATPAF2；
优选的，所述调控脂肪酸氧化是指如下调控作用中的至少一种：调控脂肪酸氧化相关蛋白表达、调控脂酰肉碱的转运、调控脂肪酸β氧化水平、以及调控脂酰肉碱的含量；
优选的，所述脂肪酸氧化相关蛋白选自ACAD11、ACAD9、ACAD10、HADHA、ACSF2、CPT1A和CPT2；
优选的，所述脂酰肉碱选自Lauroylcarnitine、Vaccenylcarnitine、Trans-Hexadec-2-enoyl carnitine、2,6-Dimethylheptanoyl carnitine、Decanoylcarnitine、Myristoylcarnitine、L-Palmitoylcarnitine中的一种或多种。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述化合物通过靶向结合线粒体蛋白以实现调控线粒体能量代谢的作用；
优选的，所述线粒体蛋白选自ACAD9、ACSL3、AIFM2、ATP5F1、ATP5H、BCS1L、C19orf52、C21orf33、CCDC51、CPOX、ECSIT、FLAD1、NDUFAF1、NIPSNAP1、NIT1、PTCD1、RDH13、SHMT2、SLC25A46、SQRDL和TBRG4；
优选的，所述线粒体蛋白选自CPOX、SHMT2、C21orf33、PTCD1、FLAD1和SLC25A46；
优选的，所述线粒体蛋白为SHMT2。
7.权利要求1-3任一项所述的化合物在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的应用；
优选的，所述肿瘤选自肺腺癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺浸润癌、皮肤黑色素瘤、间皮瘤、肉瘤、肾上腺皮质癌、结直肠癌、淋巴瘤、胰腺癌、非小细胞肺癌和髓性白血病；
或者，所述肿瘤选自RB1缺失型乳腺癌、BCL-2高表达的急性骨髓性白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤的OXPHOS亚型、KRas消融的胰腺导管腺癌、LKB1缺失的非小细胞肺癌、PGC1α表达的黑色素瘤和缺氧实体肿瘤。
8.权利要求1-3任一项所述的化合物在制备用于预防或治疗由脂肪酸氧化异常升高引起的相关疾病的药物中的应用；
优选的，由脂肪酸氧化异常升高引起的相关疾病选自肺癌、乳腺癌、髓性白血病、肝细胞癌、胶质瘤、星形细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤、结直肠癌、皮肤黑色素瘤和淋巴瘤；
或者，由脂肪酸氧化异常升高引起的相关疾病选自肥胖、糖尿病、缺血性心脏病、心脏衰竭、糖尿病性心肌病、非酒精性脂肪性肝病和肥胖引起的胰岛素抵抗；
或者，由脂肪酸氧化异常升高引起的相关疾病选自KRAS突变型肺癌、c-Myc过表达的三阴性乳腺癌、急性骨髓性白血病、肝炎B诱导的肝细胞癌、神经胶质瘤和低度星形细胞瘤。
9.权利要求1-3任一项所述的化合物在制备用于预防或治疗由氧化磷酸化升高引起的相关疾病的药物中的应用；
优选的，由氧化磷酸化升高引起的相关疾病选自亨廷顿病、家族性帕金森病、阿尔兹海默症、胰岛素耐受、高血压、脂肪肝和衰老；
优选的，由氧化磷酸化升高引起的相关疾病选自神经退行性疾病、视网膜功能性障碍、肥胖、胰岛素耐受、高血压、脂肪肝、衰老和心力衰竭；
优选的，神经退行性疾病选自亨廷顿病、家族性帕金森病、阿尔兹海默症和肌萎缩性脊髓侧索硬化症。
10.一种治疗疾病的药物，其特征在于，其含有权利要求1-3任一项所述的化合物。
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