CN111840564A - 一种二氧化锰基纳米药物载体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种二氧化锰基纳米药物载体，并创新性的结合饥饿疗法和气体疗法进行癌症治疗。具体来说，利用酰胺化反应率先在人血清蛋白上引入叶酸靶向分子，再利用生物矿化法在蛋白质中培养纳米二氧化锰载体。通过物理吸附同时负载葡萄糖氧化酶以及L‑精氨酸。其优点在于：1.极大的提高了纳米二氧化锰的靶向递药效率以及分散性。2.利用癌细胞内特定的化学反应消耗内源葡萄糖并释放一氧化氮气体通过饥饿和气体疗法杀死癌细胞。3.合成载体物质可降解，负载的酶和氨基酸为人体内源性物质，对人体无毒副作用。4.抗癌效果显著，可在极小的生物酶浓度下杀死癌细胞。
Description
技术领域
本发明属于材料和生物医药技术领域，具体涉及一种二氧化锰基纳米药物载体及其制备方法和应用。
背景技术
近年来以葡萄糖氧化酶（GOX）为核心的“饥饿疗法”逐渐兴起。葡萄糖氧化酶能够持续消耗癌细胞的内源葡萄糖，由于无法获得稳定的营养供给癌细胞将被“饿死”。该疗法清洁、无毒、治疗效果可观，因此受到了极大的关注（参见：M. Wang, D.M. Wang, Q. Chen,et al., Small 2019 1903895.）。然而，饥饿疗法也面临着一些问题和挑战：（1）由于葡萄糖氧化酶不具备特殊选择性，因此需要特定的纳米递药系统协助其进入癌细胞；（2）葡萄糖的氧化过程需要充足的氧气，而癌细胞内多缺氧，并且细胞内高含量的谷胱甘肽可与葡萄糖氧化酶发生反应，不利于治疗进行；（3）在实际应用中，瘤体可以通过毛细血管不断补充营养物质，因此单一饥饿疗法无法彻底扼杀癌细胞，通常需要结合其他疗法实施多元化治疗（参见：Y.H. Zhang, W.X. Qiu, M.K. Zhang, et al., ACS Appl. Mater. Inter. 102018 15030−15039; X. Yang, Y. Yang, F. Gao, et al., Nano Lett. 19 2019 4334-4342.）。
纳米二氧化锰作为一种可降解纳米载体被广泛应用于药物递送，并且相较于其他纳米材料具有一些独特的优点：（1）纳米二氧化锰通常具有较大的比表面积，通过特殊的结构设计能够通过范德华力对多种药物实现强物理吸附。（2）纳米二氧化锰能够与癌细胞内丰富的过氧化氢或谷胱甘肽发生反应实现响应性降解，并且降解产物锰离子可被人体循环利用。（3）纳米二氧化锰在体内的降解过程可以通过磁共振成像得到实时监控，实现诊疗-监控一体化（参见Q.Q. Sun, F. He, C.Q. Sun, et al., ACS Appl. Mater. Inter. 102018 33901−33912; L.L. Tian, Q. Chen, X. Yi, et al., Small 13 2017 1700640.）。然而目前纳米二氧化锰结合饥饿疗法的案例却少有报道。特别的是，纳米二氧化锰能够预先消耗癌细胞中的谷胱甘肽，同时改善癌细胞中的缺氧条件，为葡萄糖氧化酶提供更佳的工作环境。然而，二氧化锰本身的一些性质限制了它在药物递送中的大规模应用：（1）二氧化锰的水溶性较差，纳米级别的尺寸调控能一定程度上改善其水溶性却无法避免长时间的粒子团聚；（2）目前对于二氧化锰的靶向修饰工作大多步骤繁琐且效率低，因此需要一种简便而高效的靶向修饰工艺（参见L.T. Meng, S.J. Gan, Y. Zhou, et al., Bio. Sci. 72019 168-177; Q.Q. Sun, F. He, H.T. Bi, et al., Chem. Eng. J. 362 2019 679-691.）；（3）此外，葡萄糖的氧化过程会生成过氧化氢副产物，L-精氨酸（L-Arg）能够和过氧化氢反应生成一氧化氮，可进一步扼杀癌细胞（参见W.P. Fan, N. Lu, P. Huang, etal., Angew. Chem. Int. Edit. 55 2016 1-6.）。因此L-精氨酸能够与葡萄糖氧化酶搭配抗癌，然而目前尚无纳米二氧化锰同时结合饥饿疗法以及一氧化氮（NO）气体疗法的技术和方法。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种二氧化锰基纳米药物载体，以人血清蛋白（HSA）为桥梁预先连接叶酸（FA）靶向分子，方法简便且保证了充足的叶酸修饰。通过生物矿化进一步获得纳米级二氧化锰（MnO2-HSA-FA），被蛋白质包裹的纳米二氧化锰展现出优异的水溶性和稳定性。MnO2-HSA-FA共负载GOX和L-Arg的饥饿-气体协同治疗展现出显著的抗癌效果。
本发明还提供该纳米药物载体的制备方法。
本发明还提供了相应的抗癌药物在该纳米药物上的装载过程。
本发明也提供了该纳米药物载体在制备抗癌药物中的应用。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
一种二氧化锰基纳米药物载体，将人血清蛋白活化处理，连接肿瘤靶向分子，在碱性条件下利用生物矿化作用，制成蛋白质包裹的纳米药物载体，并通过物理吸附作用负载药物。
上述纳米药物载体的制备方法，包括以下步骤：
（1）人血清蛋白与叶酸的有效连接HSA-FA的制备：将叶酸预溶于二甲亚砜中，超声条件下充分溶解；37 ℃条件下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺以及三乙胺，避光搅拌反应20分钟以获得FA-NHS中间体；将100 mg人血清蛋白溶于20 mL去离子水，使用0.2 M氢氧化钠溶液将pH值调至10；搅拌下将人血清蛋白溶液逐渐滴入FA-NHS溶液中，避光反应;获得的溶液被装入12000 M透析袋，在0.1 M氢氧化钠溶液中预先透析，之后转入去离子水中透析，透析结束后样品经冷冻干燥后得到；
（2）生物矿化法制备纳米二氧化锰MnO2-HSA-FA：20~80 mg HSA-FA溶于10 mL去离子水，超声溶解后加入MnCl2溶液；将混合液搅拌20分钟以实现人血清蛋白对于锰离子的充分包裹，继而向溶液中逐滴加入1 M氢氧化钠溶液将混合液pH值调至10~11，室温下敞口反应1~3小时；获得的产物在12000 M透析袋中经去离子水透析24小时，经冷冻干燥后获得；
（3）葡萄糖氧化酶以及L-精氨酸的共负载：取上述步骤中获得的MnO2-HSA-FA 固体溶于10 mL去离子水并超声溶解；向MnO2-HSA-FA中加入L-Arg完全溶解后黑暗下搅拌24小时以实现充分的吸附；之后继续向溶液中加入GOX，完全溶解后暗黑条件下搅拌24小时；所得的混合液经过高速离心，洗涤，冷冻，真空干燥获得MnO2-HSA-FA+GOX+L-Arg固体。
优选地，上述制备方法中，步骤（1）中人血清蛋白与叶酸，NHS，EDC-HCl的质量比为1∶0.1~0.8∶0.2~1.6∶0.2~1.6。
优选地，上述制备方法中，步骤（1）中FA-NHS与HSA的反应时长为12~48小时。
优选地，上述制备方法中，所述步骤（2）中氯化锰与HSA-FA的质量比为1∶0.3~1.3。
优选地，上述制备方法中，所述步骤（3）中MnO2-HSA-FA，GOX，L-Arg的质量比为1∶0.1~0.5∶0.1~0.4。
上述方法制备的纳米药物载体在制备抗癌药物中的应用。
有益效果
（1）以商业化的人血清蛋白、叶酸以及氯化锰为原料，仅通过两步反应便可完成载体的合成工作，且反应条件温和、易操作、无副产物、无需提纯，可实现大规模生产。
（2）首次采用叶酸预修饰人血清蛋白的方式引入靶向分子，避免了先合成载体后靶向修饰的繁琐操作。靶向分子结合率高，比例易控制，且化学键结合的方式使得靶向性更加稳定。细胞实验证实靶向效果显著。
（3）利用生物矿化法合成的MnO2-HSA-FA解决了MnO2水溶性差的难题，同时经蛋白质改性的二氧化锰载体具有更低的毒性，有很好的生物学安全性。
（4）通过物理吸附的方式结合葡萄糖氧化酶以及L-精氨酸，能够最大程度的保留酶活性。MnO2-HSA-FA的降解行为能够改善肿瘤的缺氧问题并降低谷胱甘肽含量。为葡萄糖氧化酶提供更佳的工作条件，L-精氨酸能充分利用饥饿疗法中的副产物过氧化氢达成二次治疗。
附图说明
图1为（一）纳米二氧化锰（MnO2-HSA-FA）的透射电镜（TEM）图片和（二）在不同溶剂中的分散情况。其中1-5号样品对应的溶剂分别为水，磷酸盐缓冲溶液（PBS），乙醇（CH3CH2OH），二甲亚砜（DMSO）以及高糖型细胞培养基（DMEM）；
图2为MnO2，MnO2-HSA-FA的（一）红外光谱图以及（二）Zeta电位数据；
图3为（一）L-Arg以及MnO2-HSA-FA负载L-Arg后的红外光谱图。（二）葡萄糖氧化酶（GOX）在不同浓度MnO2-HSA-FA溶液中的荧光强度变化情况；
图4（一）不同浓度的HSA-FA+GOX+L-Arg与MnO2-HSA-FA+GOX+L-Arg培养24小时后的HeLa细胞存活率。（二）不同浓度的MnO2-HSA+GOX+L-Arg与MnO2-HSA-FA+GOX+L-Arg培养24小时后的HeLa细胞存活率。
图5为双光子共聚焦显微镜拍摄的MnO2-HSA-FA负载罗丹明B后被细胞摄取1小时和4小时的图片；
图6为流式细胞仪测得的细胞内的罗丹明B荧光强度的相对强度，其中A549以及HeLa细胞的对照组所加物质为等体积的磷酸盐缓冲液（PBS）；
图7为（一）被不同浓度的MnO2-HSA-FA培养24小时后的HeLa细胞存活率以及（二）被GOX，MnO2-HSA-FA+GOX或MnO2-HSA-FA+GOX+L-Arg培养24小时后的HeLa细胞存活率，其中图中的浓度特指GOX的浓度。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
将20 mg叶酸溶于20 mL二甲亚砜中，超声溶解。37 ℃条件下加入40 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC-HCl），40 mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以及100 μL三乙胺（TEA），避光搅拌反应20分钟。将100 mg人血清蛋白溶于20 mL去离子水，使用0.2 M氢氧化钠溶液将pH值调至10。搅拌下将人血清蛋白溶液逐渐滴入FA-NHS溶液中，避光反应24小时。获得的溶液被装入12000 M透析袋，在0.1 M PBS溶液中预先透析，之后转入去离子水中透析，透析结束后冷冻干燥后得到HSA-FA。
（2）30 mg HSA-FA溶于10 mL去离子水，超声溶解后加入5 mL 浓度为0.1 M 的MnCl2溶液。匀速搅拌20分钟，继而向溶液中逐滴加入1 M氢氧化钠溶液将混合液pH值调至10，室温下敞口反应1小时；获得的产物在12000 M透析袋中经去离子水透析24小时，冷冻干燥后获得样品。获得的样品如附图1所示，外貌为包裹着黑色MnO2颗粒的蛋白质纳米团簇，且在多种溶剂中显示着良好的分散性。MnO2-HSA-FA的有效合成可通过附图2中的红外光谱以及Zeta电位测试得到验证。
（3）取10 mg上述步骤中获得的MnO2-HSA-FA固体溶于10 mL去离子水并超声溶解。向MnO2-HSA-FA溶液中加入2 mg L-Arg，完全溶解后黑暗下搅拌24小时。之后继续向溶液中加入2 mg GOX，完全溶解后暗黑条件下搅拌24小时。所得的混合液经过12000转高速离心5分钟，移除上清液，加入去离子水洗涤，重复三次。冷冻后通过真空干燥获得MnO2-HSA-FA+GOX+L-Arg固体。有效的药物负载过程可以通过附图三中的红外光谱以及荧光光谱得到证实。
实施例2
（1）将40 mg叶酸溶于20 mL二甲亚砜中，超声溶解。37 ℃条件下加入80 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC-HCl)，80 mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以及200 μL 三乙胺（TEA），避光搅拌反应20分钟。将100 mg人血清蛋白溶于20 mL去离子水，使用0.2M氢氧化钠溶液将PH值调至10。搅拌下将人血清蛋白溶液逐渐滴入FA-NHS溶液中，避光反应24小时。获得的溶液被装入12000 M透析袋，在0.1 M PBS溶液中预先透析，之后转入去离子水中透析，透析结束后冷冻干燥后得到HSA-FA。
（2）50 mg HSA-FA溶于10 mL去离子水，超声溶解后加入5 mL 浓度为1 M 的MnCl2溶液。匀速搅拌20分钟，继而向溶液中逐滴加入1 M氢氧化钠溶液将混合液PH值调至10，室温下敞口反应2小时；获得的产物在12000 M透析袋中经去离子水透析24小时，冷冻干燥后获得样品。
（3）取10 mg上述步骤中获得的MnO2-HSA-FA固体溶于10 mL去离子水并超声溶解。向MnO2-HSA-FA溶液中加入3 mg L-Arg，完全溶解后黑暗下搅拌24小时。之后继续向溶液中加入3 mg GOX，完全溶解后暗黑条件下搅拌24小时。所得的混合液经过12000转高速离心5分钟，移除上清液，加入去离子水洗涤，重复三次。冷冻后通过真空干燥获得MnO2-HSA-FA+GOX+L-Arg固体。
实施例3
（1）将40 mg叶酸溶于20 mL二甲亚砜中，超声溶解。37 ℃条件下加入80 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC-HCl)，80 mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以及200 μL 三乙胺（TEA），避光搅拌反应20分钟。将100 mg人血清蛋白溶于20 mL去离子水，使用0.2M氢氧化钠溶液将pH值调至10。搅拌下将人血清蛋白溶液逐渐滴入FA-NHS溶液中，避光反应36小时。获得的溶液被装入12000 M透析袋，在0.1 M PBS溶液中预先透析，之后转入去离子水中透析，透析结束后冷冻干燥后得到HSA-FA。
（2）50 mg HSA-FA溶于10 mL去离子水，超声溶解后加入5 mL 浓度为1 M 的MnCl2溶液。匀速搅拌20分钟，继而向溶液中逐滴加入2 M氢氧化钠溶液将混合液pH值调至11，室温下敞口反应2小时；获得的产物在12000 M透析袋中经去离子水透析24小时，冷冻干燥后获得样品。
（3）取10 mg上述步骤中获得的MnO2-HSA-FA固体溶于10 mL去离子水并超声溶解。向MnO2-HSA-FA溶液中加入4 mg L-Arg，完全溶解后黑暗下搅拌24小时。之后继续向溶液中加入4 mg GOX，完全溶解后暗黑条件下搅拌24小时。所得的混合液经过12000转高速离心5分钟，移除上清液，加入去离子水洗涤，重复三次。冷冻后通过真空干燥获得MnO2-HSA-FA+GOX+L-Arg固体。
实施例4
（1）将60 mg叶酸溶于20 mL二甲亚砜中，超声溶解。37 ℃条件下加入120 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 (EDC-HCl)，120 mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以及300 μL三乙胺（TEA），避光搅拌反应20分钟。将100 mg人血清蛋白溶于20 mL去离子水，使用0.2 M氢氧化钠溶液将pH值调至10。搅拌下将人血清蛋白溶液逐渐滴入FA-NHS溶液中，避光反应48小时。获得的溶液被装入12000 M透析袋，在0.1 M PBS溶液中预先透析，之后转入去离子水中透析，透析结束后冷冻干燥后得到HSA-FA
（2）50 mg HSA-FA溶于10 mL去离子水，超声溶解后加入5 mL浓度为1 M 的MnCl2溶液。匀速搅拌20分钟，继而向溶液中逐滴加入1 M氢氧化钠溶液将混合液pH值调至11，室温下敞口反应3小时；获得的产物在12000 M透析袋中经去离子水透析24小时，冷冻干燥后获得样品。
（3）取10 mg上述步骤中获得的MnO2-HSA-FA固体溶于10 mL去离子水并超声溶解。向MnO2-HSA-FA溶液中加入5 mg L-Arg，完全溶解后黑暗下搅拌24小时。之后继续向溶液中加入5 mg GOX，完全溶解后暗黑条件下搅拌24小时。所得的混合液经过12000转高速离心5分钟，移除上清液，加入去离子水洗涤，重复三次。冷冻后通过真空干燥获得MnO2-HSA-FA+GOX+L-Arg固体。
对比例1
（1）将100 mg人血清蛋白溶于20 mL去离子水，使用0.2 M氢氧化钠溶液将pH值调至10。搅拌下将人血清蛋白溶液逐渐滴入FA-NHS溶液中，避光反应24小时。获得的溶液被装入12000 M透析袋，在0.1 M PBS溶液中预先透析，之后转入去离子水中透析，透析结束后冷冻干燥后得到HSA-FA。
（2）取10 mg上述步骤中获得的HSA-FA固体溶于10 mL去离子水并超声溶解。向HSA-FA溶液中加入2 mg L-Arg，完全溶解后黑暗下搅拌24小时。之后继续向溶液中加入2mg GOX，完全溶解后暗黑条件下搅拌24小时。所得的混合液经过12000转高速离心5分钟，移除上清液，加入去离子水洗涤，重复三次。冷冻后通过真空干燥获得HSA-FA+GOX+L-Arg固体。
配制相同药物浓度梯度的MnO2-HSA-FA+GOX+L-Arg溶液以及HSA-FA+GOX+L-Arg溶液进行细胞毒性检测，如附图4（一）所示，前者的细胞存活率远低于后者。这可能是由于后者的药物负载能力远低于前者，导致进入细胞的GOX及L-Arg浓度过低。
对比例2
（1）30 mg HSA溶于10 mL去离子水，超声溶解后加入5 mL 浓度为0.1 M 的MnCl2溶液。匀速搅拌20分钟，继而向溶液中逐滴加入1 M氢氧化钠溶液将混合液pH值调至10，室温下敞口反应1小时；获得的产物在12000 M透析袋中经去离子水透析24小时，冷冻干燥后获得样品。
（3）取10 mg上述步骤中获得的MnO2-HSA固体溶于10 mL去离子水并超声溶解。向MnO2-HSA溶液中加入2 mg L-Arg，完全溶解后黑暗下搅拌24小时。之后继续向溶液中加入2mg GOX，完全溶解后暗黑条件下搅拌24小时。所得的混合液经过12000转高速离心5分钟，移除上清液，加入去离子水洗涤，重复三次。冷冻后通过真空干燥获得MnO2-HSA+GOX+L-Arg固体。
配制相同药物浓度梯度的MnO2-HSA-FA+GOX+L-Arg溶液以及MnO2-HSA+GOX+L-Arg溶液进行细胞毒性检测，如附图4（二）所示，前者的细胞存活率低于后者。这可能是由于后者不能被癌细胞特异性识别，导致进入细胞的GOX及L-Arg浓度低于前者。
试验验证
1.纳米二氧化锰载体的细胞摄取实验
将实例1中获得的MnO2-HSA-FA负载罗丹明B后加入HeLa细胞进行培养，在培养1小时以及4小时后使用激光共聚焦显微镜进行观察。其目的在于通过罗丹明B的荧光强度值标准化进入癌细胞的MnO2-HSA-FA数量。图5结果表明，随着时间的增长癌细胞内的荧光强度增加，表明随时累计癌细胞能摄取更多的MnO2-HSA-FA载体。
2.细胞靶向性检测试验
图6为HeLa与A549细胞摄取MnO2-HSA-FA+罗丹明B 24小时后，通过流式细胞仪对于细胞内的罗丹明B荧光强度进行的测量结果。实验结果表明。相对于A549细胞，MnO2-HSA-FA对于HeLa具有更强的选择性和靶向性，这表明了FA受体的有效装载。因此MnO2-HSA-FA有望对FA高表达的癌细胞进行更精确的药物递送。
3.细胞毒性及抗癌活性实验
将实施例1中得到的载体配置成不同浓度进行细胞毒性检测。附图7图（一）表明MnO2-HSA-FA具有可忽略的细胞毒性。在50 μg/mL的浓度下仍然保证了细胞90%的存活率。
使用MnO2-HSA-FA单负载GOX或共负载GOX与L-Arg，保证GOX浓度一致。将Hela细胞分别接种于96孔板中，24小时后将GOX，MnO2-HSA-FA+GOX以MnO2-HSA-FA+GOX+L-Arg及分别加入并形成浓度梯度，加入培养基后进行培养。
相同条件下，分别以纯GOX和负载相同浓度的GOX的MnO2-HSA-FA+GOX，以及MnO2-HSA-FA+GOX+L-Arg做平行对照，24小时后进行细胞存活率检测。结果如附图7（二）所示，相对于纯药物治疗，MnO2-HSA-FA的引入能够明显降低癌细胞的存活率，这与其高效的药物递送效率息息相关，并且双负载的治疗效果高于单一饥饿疗法。这证明了MnO2-HSA-FA+GOX+L-Arg能够实现良好的配合，将靶向药物递送、响应释放药物、饥饿治疗以及气体治疗集于一身，给癌症的治疗带来了新思路。
Claims (7)
1.一种二氧化锰基纳米药物载体，其特征在于，将人血清蛋白活化处理，连接肿瘤靶向分子，在碱性条件下利用生物矿化作用，制成蛋白质包裹的纳米药物载体，并通过物理吸附作用负载药物。
2.一种权利要求1所述的一种二氧化锰基纳米药物载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）人血清蛋白与叶酸的有效连接HSA-FA的制备：将叶酸预溶于二甲亚砜中，超声条件下充分溶解；37 ℃条件下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺以及三乙胺，避光搅拌反应20分钟以获得FA-NHS中间体；将100 mg人血清蛋白溶于20 mL去离子水，使用0.2 M氢氧化钠溶液将pH值调至10；搅拌下将人血清蛋白溶液逐渐滴入FA-NHS溶液中，避光反应；获得的溶液被装入12000 M透析袋，在0.1 M氢氧化钠溶液中预先透析，之后转入去离子水中透析，透析结束后样品经冷冻干燥后得到；
（2）生物矿化法制备纳米二氧化锰MnO2-HSA-FA：20~80 mg HSA-FA溶于10 mL去离子水，超声溶解后加入MnCl2溶液；将混合液搅拌20分钟以实现人血清蛋白对于锰离子的充分包裹，继而向溶液中逐滴加入1 M氢氧化钠溶液将混合液pH值调至10~11，室温下敞口反应1~3小时；获得的产物在12000 M透析袋中经去离子水透析24小时，经冷冻干燥后获得；
（3）葡萄糖氧化酶以及L-精氨酸的共负载：取上述步骤中获得的MnO2-HSA-FA 固体溶于10 mL去离子水并超声溶解；向MnO2-HSA-FA中加入L-Arg完全溶解后黑暗下搅拌24小时以实现充分的吸附；之后继续向溶液中加入GOX，完全溶解后暗黑条件下搅拌24小时；所得的混合液经过高速离心，洗涤，冷冻，真空干燥获得MnO2-HSA-FA+GOX+L-Arg固体。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的人血清蛋白与叶酸、NHS、EDC-HCl的质量比为1∶0.1~0.8∶0.2~1.6∶0.2~1.6，每20 mL二甲亚砜中加入叶酸的质量为10～80 mg，加入三乙胺100-400μL。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的FA-NHS与HSA的反应时长为12~48小时。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中氯化锰与HSA-FA的质量比为1∶0.3~1.3，MnCl2溶液的浓度为0.1 M。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中MnO2-HSA-FA、GOX，L-Arg的质量比为1∶0.1~0.5∶0.1~0.4。
7.一种权利要求1所述的纳米药物载体在制备抗癌药物中的应用。
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