CN111826375A - 一种检测znf384相关融合基因的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测ZNF384相关融合基因的试剂盒及其应用。本发明提供了一种基于TaqMan探针的多重RQ‑PCR检测ZNF384常见相关融合基因的方法，包含5种常见的伙伴基因，用于B‑ALL患者中ZNF384相关融合基因的快速准确的筛查。同时，本发明对B‑ALL的预后分层、指导治疗方式的选择以及MRD的特异性分子监测具有重要的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测ZNF384相关融合基因的试剂盒及其应用。
背景技术
急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)是一种起源于B淋巴细胞的恶性造血系统疾病，是成人尤其是儿童常见的急性白血病类型。尽管儿童B-ALL取得较好疗效，但是成人的疗效不能令人满意，只有30-40％患者获得长期生存。分子学异常是白血病发生和发展的基础，对白血病分子学异常的深入了解无论在其靶向治疗还是危险度指导下的分层治疗策略中均起到关键作用。
以染色体异位形成的融合基因为代表的分子学异常是B-ALL发病的常见机制。在上世纪末，BCR-ABL1、TCF3-PBX1、TEL-AML1以及MLL相关的融合基因等重现性融合基因类型在B-ALL中被确认，这些类型见于约40％的B-ALL患者中。近一个世纪以来，随着新一代测序(NGS)技术的发明和广泛应用，绝大部分B-ALL患者中已找到分子学异常，多种新的融合基因被发现，ZNF384(zinc fingerprotein 384)相关的融合基因是其中一种常见类型。
ZNF384基因位于染色体12p13，编码一种C2H2型锌指蛋白，发挥转录因子功能。2002年Martini等人首次报道在急性白血病中发现EWSR1-ZNF384和TAF15-ZNF384融合基因，之后偶有ZNF384相关融合基因个案报道，由于涉及染色体12p13的异位并不常见，因而一直未被重视，直到NGS的广泛应用于大量病例后才显示ZNF384融合基因在B-ALL中并不少见，已报道的ZNF384常见的伙伴基因包括EP300(E1A binding protein p300)、CREBBP(CREB binding protein)、TCF3(Transcription factor 3)、EWSR1(EWS RNAbindingprotein 1)和TAF15(TATA-box binding protein associated factor 15)等。当前已发表的有关ZNF384融合基因的文章以基于大样本二代测序进行的实验室研究为主，临床疗效往往仅是简单提及，因而缺乏细致的临床研究数据。此外，预后意义的结论不一致，有的结果显示预后好而有的显示无预后意义。因此，ZNF384相关融合基因在B-ALL中的预后意义有待进一步的研究。
当前，转录组测序等NGS技术应用于临床常规尚存在数据量大、分析繁琐复杂、费时等问题，因而实时定量PCR(RQ-PCR)技术检测特定融合基因是一种实用的临床常规检测技术。将基于TaqMan探针的RQ-PCR与多重PCR相结合，可以兼具多重PCR和RQ-PCR的优点，即可同时检测多种融合基因，又能够满足特异性、高敏感性及操作简便等要求，因此是ZNF384相关多种融合基因临床检测的适用方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测ZNF384相关融合基因的试剂盒及其应用。
本发明提供了一种引物探针组合Ⅰ，由引物1至引物15和探针组成；
所述引物1为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将(a1)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物2为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将(a3)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物3为如下(a5)或(a6)：
(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a6)将(a5)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物4为如下(a7)或(a8)：
(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(a8)将(a7)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物5为如下(a9)或(a10)：
(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(a10)将(a9)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物6为如下(a11)或(a12)：
(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(a12)将(a11)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物7为如下(a13)或(a14)：
(a13)序列表的序列7所示的单链DNA分子；
(a14)将(a13)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物8为如下(a15)或(a16)：
(a15)序列表的序列8所示的单链DNA分子；
(a16)将(a15)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物9为如下(a17)或(a18)：
(a17)序列表的序列9所示的单链DNA分子；
(a18)将(a17)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物10为如下(a19)或(a20)：
(a19)序列表的序列10所示的单链DNA分子；
(a20)将(a19)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物11为如下(a21)或(a22)：
(a21)序列表的序列11所示的单链DNA分子；
(a22)将(a21)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物12为如下(a23)或(a24)：
(a23)序列表的序列12所示的单链DNA分子；
(a24)将(a23)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物13为如下(a25)或(a26)：
(a25)序列表的序列13所示的单链DNA分子；
(a26)将(a25)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物14为如下(a27)或(a28)：
(a27)序列表的序列14所示的单链DNA分子；
(a28)将(a27)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物15为如下(a29)或(a30)：
(a29)序列表的序列15所示的单链DNA分子；
(a30)将(a29)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述探针为如下(a31)或(a32)：
(a31)序列表的序列16所示的单链DNA分子；
(a32)将(a31)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子。
本发明还保护引物探针组合Ⅱ，由所述引物探针组合Ⅰ和如下中的至少一种引物探针组合组成；
(1)引物探针组合2：由所述引物1、引物2、引物15和探针组成；
(2)引物探针组合3：由所述引物3至引物7、引物15和探针组成；
(3)引物探针组合4：由所述引物8至引物10、引物15和探针组成；
(4)引物探针组合5：由所述引物11、引物15和探针组成；
(6)引物探针组合6：由所述引物12、引物13、引物15和探针组成。
以上任一所述探针一端采用荧光基团标记，一端采用淬灭基团标记。
所述荧光基团具体可为FAM，所述淬灭基团具体可为TAMRA。
所述探针具体可为5’端标记FAM，3’端标记TAMRA。
本发明还保护所述引物探针组合Ⅰ或所述引物探针组合Ⅱ的应用，为如下(a1)-(a6)中的至少一种：
(a1)检测待测样本中是否含有ZNF384相关融合基因；
(a2)制备用于检测待测样本中是否含有ZNF384相关融合基因的试剂盒；
(a3)检测待测样本中ZNF384相关融合基因的类型；
(a4)制备用于检测待测样本中ZNF384相关融合基因的类型的试剂盒；
(a5)检测待测样本中是否含有ZNF384相关融合基因并且检测融合基因类型；
(a6)制备用于检测待测样本中是否含有ZNF384相关融合基因并且检测融合基因类型的试剂盒。
本发明还保护含有所述引物探针组合Ⅰ或所述引物探针组合Ⅱ的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(b1)或(b2)或(b3)：
(b1)检测待测样本中是否含有ZNF384相关融合基因；
(b2)检测待测样本中ZNF384相关融合基因的类型；
(b3)检测待测样本中是否含有ZNF384相关融合基因并且检测融合基因类型。
所述试剂盒中还包括Gene Expression Master Mix。
所述试剂盒中还包括如下阳性对照：EP300-ZNF384融合基因阳性对照(具体可为经过测序验证含EP300-ZNF384融合基因的cDNA样本)、CREBBP-ZNF384阳性对照(具体可为经过测序验证含CREBBP-ZNF384融合基因的cDNA样本)、TCF3-ZNF384阳性对照(具体可为经过测序验证含TCF3-ZNF384融合基因的cDNA样本)、EWSR1-ZNF384阳性对照(具体可为经过测序验证含EWSR1-ZNF384融合基因的cDNA样本)和TAF-ZNF384阳性对照(具体可为经过测序验证含TAF-ZNF384融合基因的cDNA样本)。
所述试剂盒具体可包括如下6个反应体系中的至少一种：(1)引物探针组合Ⅰ(每种引物和探针各0.4μL)，Gene Expression Master Mix10μL，去离子水1.6μL。每条引物在体系中的浓度为0.3μM，探针在体系中的浓度为0.2μM；(2)引物探针组合2(每种引物和探针各0.4μL)，Gene Expression MasterMix10μL，去离子水6.4μL。每条引物在体系中的浓度为0.3μM，探针在体系中的浓度为0.2μM；(3)引物探针组合3(每种引物和探针各0.4μL)，GeneExpression Master Mix10μL，去离子水5.2μL。每条引物在体系中的浓度为0.3μM，探针在体系中的浓度为0.2μM；(4)引物探针组合4(每种引物和探针各0.4μL)，Gene ExpressionMaster Mix10μL，去离子水6.0μL。每条引物在体系中的浓度为0.3μM，探针在体系中的浓度为0.2μM；(5)引物探针组合5(每种引物和探针各0.4μL)，Gene Expression Master Mix10μL，去离子水6.8μL。每条引物在体系中的浓度为0.3μM，探针在体系中的浓度为0.2μM；(6)引物探针组合6(每种引物和探针各0.4μL)，Gene Expression Master Mix10μL，去离子水6.8μL。每条引物在体系中的浓度为0.3μM，探针在体系中的浓度为0.2μM。
本发明还保护一种检测待测样本中是否含有ZNF384相关融合基因的方法(方法甲)，包括如下步骤：(1)提取待测样本的总RNA，并反转录为cDNA；(2)以步骤(1)制备的cDNA为模板，采用所述探针组合Ⅰ进行多重RQ-PCR扩增；如果可以实现阳性扩增，则待测样本中含有ZNF384相关融合基因；如果不能实现阳性扩增，则测样本中不含有ZNF384相关融合基因。
本发明还保护一种检测待测样本中ZNF384相关融合基因的类型的方法(方法乙)，包括如下步骤：(1)提取待测样本的总RNA，并反转录为cDNA；(2)以步骤(1)制备的cDNA为模板，采用所述探针组合2至引物探针组合6分别进行多重RQ-PCR扩增；如果探针组合2可以实现阳性扩增，则待测样本中含有EP300-ZNF384融合基因；如果探针组合3可以实现阳性扩增，则待测样本中含有CREBBP-ZNF384融合基因；如果探针组合4可以实现阳性扩增，则待测样本中含有TCF3-ZNF384融合基因；如果探针组合5可以实现阳性扩增，则待测样本中含有EWSR1-ZNF384融合基因；如果探针组合组合6可以实现阳性扩增，则待测样本中含有TAF15-ZNF384融合基因。
本发明还保护一种检测待测样本中是否含有ZNF384相关融合基因并且检测融合基因类型的方法，包括如下步骤：采用方法甲判断待测样本中是否含有ZNF384相关融合基因，然后方法乙检测待测样本中ZNF384相关融合基因的类型。
以上任一所述多重RQ-PCR扩增的反应程序具体可为：50℃2min，1个循环；95℃10min，1个循环；95℃15s，62℃1min，40个循环。
本发明还保护用于检测ZNF384相关融合基因的产品在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(c1)和/或(c2)和/或(c3)：
(c1)B系急性淋巴细胞白血病的辅助诊断；
(c2)B系急性淋巴细胞白血病患者化疗或移植后微小残留病水平评估；
(c3)B系急性淋巴细胞白血病患者预后复发评估。
本发明还保护一种试剂盒，包括用于检测ZNF384相关融合基因的产品；所述试剂盒的用途为如下(c1)和/或(c2)和/或(c3)：
(c1)B系急性淋巴细胞白血病患者的辅助诊断；
(c2)B系急性淋巴细胞白血病患者化疗或移植后微小残留病水平评估；
(c3)B系急性淋巴细胞白血病患者预后复发评估。
本发明还保护ZNF384相关融合基因作为靶标在如下(d1)和/或(d2)和/或(d3)中的应用：
(d1)B系急性淋巴细胞白血病患者的辅助诊断；
(d2)B系急性淋巴细胞白血病患者化疗或移植后微小残留病水平评估；
(d3)B系急性淋巴细胞白血病患者预后复发评估。
以上任一所述检测ZNF384相关融合基因的产品具体可为以上任一所述的引物探针组合Ⅰ或引物探针组合Ⅱ或试剂盒。
以上任一所述待测样本具体可为离体骨髓样本或从离体骨髓样本中分离的有核细胞样本。
以上任一所述ZNF384相关融合基因包括EP300-ZNF384融合基因、CREBBP-ZNF384融合基因、TCF3-ZNF384融合基因、EWSR1-ZNF384融合基因和TAF15-ZNF384融合基因。
本发明提供了一种基于TaqMan探针的多重RQ-PCR检测ZNF384常见相关融合基因的方法，包含5种常见的伙伴基因，用于B-ALL患者中ZNF384相关融合基因的快速准确的筛查。本发明具有如下优点：(1)覆盖面广：本试剂盒包含5种ZNF相关融合基因，覆盖了目前已报道的常见融合类型；(2)准确可靠：本试剂盒采用的是基于TaqMan探针的RQ-PCR，保证了扩增的特异性。在多重RQ-PCR体系检测到阳性结果后，再进行分管RQ-PCR分别检测各个ZNF384融合基因，以确定具体类型，并起到验证多重PCR结果的作用；(3)操作简便、快速、成本低廉：采用一管多重RQ-PCR体系同时筛查5种融合基因，若为阴性直接报告结果，阳性再分管检测。无需电泳过程。
本发明检测了222例连续治疗的成人Ph(-)B-ALL患者初诊时骨髓样本，18.9％可检出ZNF384相关融合基因，5种类型均可见，以EP300-ZNF384为主(83.3％)；具有ZNF384相关融合基因与化疗后的高微小残留病(MRD，采用流式细胞术检测)水平有关；生存分析显示，在全部及接受异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)的成人Ph(-)B-ALL患者中，具有ZNF384相关融合基因与低复发相关，然而在仅接受化疗患者群中，ZNF384相关融合基因与复发无关。因此，本发明对B-ALL的预后分层、指导治疗方式的选择以及MRD的特异性分子监测具有重要的临床应用价值。
附图说明
图1为B-ALL患者样本多重ZNF384相关融合基因公共体系的检测结果。
图2为B-ALL患者样本EP300-ZNF384公共体系的检测结果。
图3为B-ALL患者样本多重ZNF384相关融合基因公共体系的检测结果。
图4为6名B-ALL患者样本测序结果。
图5为无复发生存(RFS)分析结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
Gene Expression Master Mix：美国AB公司产品，商品号：4369016。
实施例1、检测ZNF384相关融合基因的方法建立
一、用于检测ZNF384相关融合基因的引物探针的制备
用于检测ZNF384相关融合基因的引物信息如表1所示。
用于检测ZNF384相关融合基因的TaqMan探针信息如表2所示。
表1引物信息
表2 TaqMan探针信息
二、检测体系的建立
建立如下检测体系：
(1)多重ZNF384相关融合基因公共体系(体系Ⅰ)
表1中编号1至编号14的14条上游引物各0.4μL，表1中编号15的下游引物0.4μL，表2中的TaqMan探针0.4μL，Gene Expression Master Mix 10μL，去离子水1.6μL。其中，每条上游引物在体系中的浓度为0.3μM，每条下游引物在体系中的浓度为0.3μM，TaqMan探针在体系中的浓度为0.2μM。
(2)EP300-ZNF384公共体系(体系Ⅱ)
表1中编号1和编号2的的2条上游引物各0.4μL，表1中编号15的下游引物0.4μL，表2中的TaqMan探针0.4μL，Gene Expression Master Mix 10μL，去离子水6.4μL。其中，每条上游引物在体系中的浓度为0.3μM，每条下游引物在体系中的浓度为0.3μM，TaqMan探针在体系中的浓度为0.2μM。
(3)CREBBP-ZNF384公共体系(体系Ⅲ)
表1中编号3至编号7的5条上游引物各0.4μL，表1中编号15的下游引物0.4μL，表2中的TaqMan探针0.4μL，Gene Expression Master Mix 10μL，去离子水5.2μL。其中，每条上游引物在体系中的浓度为0.3μM，每条下游引物在体系中的浓度为0.3μM，TaqMan探针在体系中的浓度为0.2μM。
(4)TCF3-ZNF384公共体系(体系Ⅳ)
表1中编号8至编号10的3条上游引物各0.4μL，表1中编号15的下游引物0.4μL，表2中的TaqMan探针0.4μL，Gene Expression Master Mix 10μL，去离子水6.0μL。其中，每条上游引物在体系中的浓度为0.3μM，每条下游引物在体系中的浓度为0.3μM，TaqMan探针在体系中的浓度为0.2μM。
(5)EWSR1-ZNF384公共体系(体系Ⅴ)
表1中编号11的上游引物0.4μL，表1中编号15的下游引物0.4μL，表2中的TaqMan探针0.4μL，Gene Expression Master Mix 10μL，去离子水6.8μL。其中，每条上游引物在体系中的浓度为0.3μM，每条下游引物在体系中的浓度为0.3μM，TaqMan探针在体系中的浓度为0.2μM。
(6)TAF15-ZNF384公共体系(体系Ⅵ)
表1中编号12至14的3条上游引物各0.4μL，表1中编号15的下游引物0.4μL，表2中的TaqMan探针0.4μL，Gene Expression Master Mix 10μL，去离子水6.0μL。其中，每条上游引物在体系中的浓度为0.3μM，每条下游引物在体系中的浓度为0.3μM，TaqMan探针在体系中的浓度为0.2μM。
(7)阳性对照体系
包括EP300-ZNF384阳性对照cDNA样本(Sanger测序结果见图4的2)、CREBBP-ZNF384阳性对照cDNA样本(Sanger测序结果见图4的5)、TCF3-ZNF384阳性对照cDNA样本(Sanger测序结果见图4的6)、EWSR1-ZNF384阳性对照cDNA样本(Sanger测序结果见图4的4)、TAF15-ZNF384阳性对照cDNA样本(Sanger测序结果见图4的3)。
上述反应体系配置完成后可在4℃避光储存1个月，-20℃避光储存1年。
三、检测方法的建立
1、将待测骨髓样本采用裂解红细胞法获取有核细胞，提取总RNA，调整RNA浓度至1μg/μL，将2μL(2μg)的总RNA加入18μL反转录体系中逆转录为cDNA。
2、将步骤1得到的cDNA取2μl(相当于200ng的RNA)加至18μl步骤二建立的多重ZNF384相关融合基因公共体系(体系Ⅰ)中，进行多重RQ-PCR反应。同时设置采用5个阳性对照样本作为待测cDNA的阳性对照。
多重RQ-PCR反应条件：50℃2min，1个循环；95℃10min，1个循环；95℃15s，62℃1min，40个循环。
3、如果步骤2的反应结果无扩增，则说明阴性，报告结果为阴性；如果有扩增，再将步骤1得到的cDNA取2μl分别加至18μl步骤二建立的EP300-ZNF384公共体系(体系Ⅱ)、CREBBP-ZNF384公共体系(体系Ⅲ)、TCF3-ZNF384公共体系(体系Ⅳ)、EWSR1-ZNF384公共体系(体系Ⅴ)和TAF15-ZNF384公共体系(体系Ⅵ)中，进行多重RQ-PCR反应。同时设置采用5个阳性对照样本作为待测cDNA的阳性对照。
多重RQ-PCR反应条件：50℃2min，1个循环；95℃10min，1个循环；95℃15s，62℃1min，40个循环。
如果EP300-ZNF384公共体系(体系Ⅱ)结果有扩增，则待测患者含有EP300-ZNF384融合基因；
如果CREBBP-ZNF384公共体系(体系Ⅲ)结果有扩增，则待测患者含有CREBBP-ZNF384融合基因；
如果TCF3-ZNF384公共体系(体系Ⅳ)结果有扩增，则待测患者含有TCF3-ZNF384融合基因；
如果EWSR1-ZNF384公共体系(体系Ⅴ)结果有扩增，则待测患者含有EWSR1-ZNF384融合基因；
如果TAF15-ZNF384公共体系(体系Ⅵ)结果有扩增，则待测患者含有TAF15-ZNF384融合基因。
实施例2、方法验证及特异性实验
一、方法验证
在获得知情同意后，收集1名北京大学人民医院(北京大学第二临床医学院)B-ALL的患者(即表3患者1)初诊时的骨髓样本，裂解红细胞获取有核细胞，提取总RNA并反转录为cDNA，将cDNA样本采用实施例1的步骤三中的方法进行检测。其中，多重ZNF384相关融合基因公共体系(体系Ⅰ)的检测结果见图1，CT值＝26.66，说明该患者具有本试剂盒所包含的ZNF384相关融合基因中的一种，为确定ZNF384的伙伴基因，进一步采用体系Ⅱ-体系Ⅴ进行分析具体类型，其中EP300-ZNF384(体系Ⅱ)扩增曲线如图2所示，CT值＝26.56，其余各管均无扩增，因此该患者具有EP300-ZNF384融合基因。该结果与Sanger测序结果相同(图4的1)。
在获得知情同意后，收集1名北京大学人民医院(北京大学第二临床医学院)B-ALL的患者初诊时的骨髓样本，裂解红细胞获取有核细胞，提取总RNA并反转录为cDNA，将cDNA样本采用实施例1的步骤三中的方法进行检测。多重ZNF384相关融合基因公共体系(体系Ⅰ)的检测结果见图3，无扩增，因而该患者不具有EP300-ZNF384、CREBBP-ZNF384、TCF3-ZNF384、EWSR1-ZNF384和TAF15-ZNF384融合基因。该结果与Sanger测序结果相同。
二、特异性
在获得知情同意后，收集6名北京大学人民医院(北京大学第二临床医学院)B-ALL的患者初诊时的骨髓样本，裂解红细胞获取有核细胞，提取总RNA并反转录为cDNA，将cDNA样本采用实施例1的步骤三中的方法进行检测。同时进行定性PCR(引物与实施例1中定量PCR使用的引物相同，不包含探针)并Sanger测序，将二者的结果进行比较。测序结果如图4所示。图4中，1-6依次对应编号为1-6的患者。结果比较如表3所示。
表3 6例阳性患者本发明检测结果与Sanger测序结果的比较
上述结果表明，测序结果证明检测的特异性。6例阳性患者的测序结果与本试剂盒检测结果均一致，本发明特异性好。
实施例3、临床意义
在获得患者知情同意后，收集222名北京大学人民医院(北京大学第二临床医学院)接受治疗的B-ALL的患者初诊时的骨髓样本，裂解红细胞获取有核细胞，提取总RNA并反转录为cDNA，将cDNA样本采用实施例1的步骤三中的方法进行检测。同时结合临床病例记载分析如下：
1、发生率分析：如表4所示，共42例患者检测到ZNF384相关融合基因，5种融合基因均有检出。ZNF384相关融合基因在Ph(-)B-ALL中的发生率为18.9％(42/222)。EP300-ZNF384最常见，占全部ZNF384相关融合基因的(83.3％)、在Ph(-)B-ALL的发生率为15.8％(35/222)。
表4. 222例Ph(-)B-ALL患者ZNF384相关融合基因检出情况
2、ZNF384相关融合基因与其他初诊指标的关系
如表5所示，ZNF384相关融合基因(+)与初诊时更高的血小板数以及更多比例的标危/中危核型相关，但与性别、年龄、白细胞数和血红蛋白水平无关。
表5 ZNF384相关融合基因与其他初诊指标的关系
3、ZNF384相关融合基因与治疗反应的关系
如表6所示，ZNF384相关融合基因不影响诱导1疗程的完全缓解(CR)率，但是更多的ZNF384相关融合基因(+)的B-ALL患者具有诱导CR、巩固1及巩固2后高微小残留病(MRD，采用流式细胞术检测)水平，即ZNF384融合基因(+)与化疗后的高MRD水平相关。
表6 ZNF384相关融合基因与治疗反应的关系
4、生存分析
222例Ph(-)B-ALL患者中201例诱导后获得CR的患者进行了无复发生存(RFS)分析，如图5所示，全部患者中ZNF384融合基因(+)患者比(-)患者具有明显更高的3年RFS率(79.5％vs 50.4％,P＝0.009，图5A)。亚组分析显示，对于接受allo-HSCT的113例患者，ZNF384融合基因(+)比(-)患者具有明显更高的3年RFS率(100.0％vs 70.3％,P＝0.020，图5B)；对于仅接受化疗的88例患者，ZNF384融合基因(+)患者与(-)患者的3年RFS率无明显差异(30.7％vs 25.0％,P＝0.55，图5C)；若接受allo-HSCT的患者截尾至移植，则全部患者中ZNF384融合基因(+)与(-)患者的3年RFS率同样无明显差异(47.1％vs 34.0％,P＝0.16，图5D)。因此，在成人Ph(-)B-ALL患者中，全部以及接受allo-HSCT的患者具有ZNF384融合基因与低复发相关，然而对于仅接受化疗的患者具有ZNF384融合基因不影响复发。
序列表
<110> 北京大学人民医院（北京大学第二临床医学院）
<120> 一种检测ZNF384相关融合基因的试剂盒及其应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcctatgcag ctcttggact 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aggcatggtt ccagtttcc 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccaatgaacc actctgtcca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcgcatgcaa gtttctcaag 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aggcacaacc tgtgagacct 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttgtcgaacc atgaaaaacg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tacatgaacc agccccagac 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttctcgtcca gcccttctac 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aggacgagga gaacacgtca 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
catctgcatc ctccttctcc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaagaggggg atttgatcgt 20
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccagcagtcc tatcattcac aa 22
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ataaccaggg acagcagcaa 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tggtggtcac agggattatg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggcaacagct gatccttcat 20
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tccccacagt ctcaggtcag atc 23
Claims (10)
1.引物探针组合Ⅰ，由引物1至引物15和探针组成；
所述引物1为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将(a1)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物2为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将(a3)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物3为如下(a5)或(a6)：
(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a6)将(a5)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物4为如下(a7)或(a8)：
(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(a8)将(a7)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物5为如下(a9)或(a10)：
(a9)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(a10)将(a9)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物6为如下(a11)或(a12)：
(a11)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(a12)将(a11)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物7为如下(a13)或(a14)：
(a13)序列表的序列7所示的单链DNA分子；
(a14)将(a13)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物8为如下(a15)或(a16)：
(a15)序列表的序列8所示的单链DNA分子；
(a16)将(a15)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物9为如下(a17)或(a18)：
(a17)序列表的序列9所示的单链DNA分子；
(a18)将(a17)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物10为如下(a19)或(a20)：
(a19)序列表的序列10所示的单链DNA分子；
(a20)将(a19)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物11为如下(a21)或(a22)：
(a21)序列表的序列11所示的单链DNA分子；
(a22)将(a21)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物12为如下(a23)或(a24)：
(a23)序列表的序列12所示的单链DNA分子；
(a24)将(a23)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物13为如下(a25)或(a26)：
(a25)序列表的序列13所示的单链DNA分子；
(a26)将(a25)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物14为如下(a27)或(a28)：
(a27)序列表的序列14所示的单链DNA分子；
(a28)将(a27)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述引物15为如下(a29)或(a30)：
(a29)序列表的序列15所示的单链DNA分子；
(a30)将(a29)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子；
所述探针为如下(a31)或(a32)：
(a31)序列表的序列16所示的单链DNA分子；
(a32)将(a31)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的DNA分子。
2.引物探针组合Ⅱ，由权利要求1所述的引物探针组合Ⅰ和如下中的至少一种引物探针组合组成；
(1)引物探针组合2：由权利要求1中所述的引物1、引物2、引物15和探针组成；
(2)引物探针组合3：由权利要求1中所述的引物3至引物7、引物15和探针组成；
(3)引物探针组合4：由权利要求1中所述的引物8至引物10、引物15和探针组成；
(4)引物探针组合5：由权利要求1中所述的引物11、引物15和探针组成；
(6)引物探针组合6：由权利要求1中所述的引物12、引物13、引物15和探针组成。
3.权利要求1所述的引物探针组合Ⅰ或权利要求2所述的引物探针组合Ⅱ的应用，为如下(a1)-(a6)中的至少一种：
(a1)检测待测样本中是否含有ZNF384相关融合基因；
(a2)制备用于检测待测样本中是否含有ZNF384相关融合基因的试剂盒；
(a3)检测待测样本中ZNF384相关融合基因的类型；
(a4)制备用于检测待测样本中ZNF384相关融合基因的类型的试剂盒；
(a5)检测待测样本中是否含有ZNF384相关融合基因并且检测融合基因类型；
(a6)制备用于检测待测样本中是否含有ZNF384相关融合基因并且检测融合基因类型的试剂盒。
4.含有权利要求1所述的引物探针组合Ⅰ或权利要求2所述的引物探针组合Ⅱ的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(b1)或(b2)或(b3)：
(b1)检测待测样本中是否含有ZNF384相关融合基因；
(b2)检测待测样本中ZNF384相关融合基因的类型；
(b3)检测待测样本中是否含有ZNF384相关融合基因并且检测融合基因类型。
5.一种检测待测样本中是否含有ZNF384相关融合基因的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总RNA，并反转录为cDNA；
(2)以步骤(1)制备的cDNA为模板，采用权利要求1或2中所述的探针组合Ⅰ进行多重RQ-PCR扩增；如果可以实现阳性扩增，则待测样本中含有ZNF384相关融合基因；如果不能实现阳性扩增，则测样本中不含有ZNF384相关融合基因。
6.一种检测待测样本中ZNF384相关融合基因的类型的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测样本的总RNA，并反转录为cDNA；
(2)以步骤(1)制备的cDNA为模板，采用权利要求2中所述的探针组合2至引物探针组合6分别进行多重RQ-PCR扩增；如果探针组合2可以实现阳性扩增，则待测样本中含有EP300-ZNF384融合基因；如果探针组合3可以实现阳性扩增，则待测样本中含有CREBBP-ZNF384融合基因；如果探针组合4可以实现阳性扩增，则待测样本中含有TCF3-ZNF384融合基因；如果探针组合5可以实现阳性扩增，则待测样本中含有EWSR1-ZNF384融合基因；如果探针组合组合6可以实现阳性扩增，则待测样本中含有TAF15-ZNF384融合基因。
7.一种检测待测样本中是否含有ZNF384相关融合基因并且检测融合基因类型的方法，包括如下步骤：采用权利要求5所述的方法判断待测样本中是否含有ZNF384相关融合基因，然后采用权利要求6所述的方法检测待测样本中ZNF384相关融合基因的类型。
8.用于检测ZNF384相关融合基因的产品在制备试剂盒中的应用；所述试剂盒的用途为如下(c1)和/或(c2)和/或(c3)：
(c1)B系急性淋巴细胞白血病患者的辅助诊断；
(c2)B系急性淋巴细胞白血病患者化疗或移植后微小残留病水平评估；
(c3)B系急性淋巴细胞白血病患者预后复发评估。
9.一种试剂盒，包括用于检测ZNF384相关融合基因的产品；所述试剂盒的用途为如下(c1)和/或(c2)和/或(c3)：
(c1)B系急性淋巴细胞白血病患者的辅助诊断；
(c2)B系急性淋巴细胞白血病患者化疗或移植后微小残留病水平评估；
(c3)B系急性淋巴细胞白血病患者预后复发评估。
10.ZNF384相关融合基因作为靶标在如下(d1)和/或(d2)和/或(d3)中的应用：
(d1)B系急性淋巴细胞白血病患者的辅助诊断；
(d2)B系急性淋巴细胞白血病患者化疗或移植后微小残留病水平评估；
(d3)B系急性淋巴细胞白血病患者预后复发评估。
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