CN111818929A

CN111818929A - 用于治疗和/或预防牙周疾病的化合物、组合物和方法

Info

Publication number: CN111818929A
Application number: CN201880076753.7A
Authority: CN
Inventors: 德米特里奥斯·布拉多克; 布莱恩·福斯特; 玛莎·萨默曼; 埃米莉·初; 恩里克·德·拉·克鲁斯
Original assignee: United States, Represented By Minister Of Health And Human Services; Yale University
Current assignee: United States, Represented By Minister Of Health And Human Services; Yale University; US Department of Health and Human Services
Priority date: 2017-11-27
Filing date: 2018-11-27
Publication date: 2020-10-23
Also published as: EP3716985A1; WO2019104316A1; IL274529A; US20200323895A1

Abstract

在受试者中治疗或预防牙周疾病的方法包括向受试者施用外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶‑1(ENPP1)的抑制剂。还公开了用于治疗或预防牙周疾病或用于增加牙骨质形成的外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶‑1(ENPP1)抑制剂和药物组合物。

Description

用于治疗和/或预防牙周疾病的化合物、组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年11月27日提交的美国临时申请号62/590,824的权益，其全部内容通过引用并入本文。

关于联邦政府赞助的研究或开发的声明

本公开是在美国国立卫生研究院授予的AR041196和AR041197的政府支持下进行的。政府对所公开的主题具有一定权利。

背景

牙周疾病，也称为牙龈疾病或牙周炎，包括一系列影响牙周的炎性疾病，牙周是围绕并支撑牙齿的组织：牙龈组织(或牙龈)、牙骨质(牙根外层)、牙槽骨和牙周膜(在牙骨质和牙槽骨之间延伸的结缔组织纤维)。牙周炎是由附着在牙齿表面并在牙齿表面生长的微生物，以及针对这些微生物的过度攻击性免疫反应所引起的。牙周疾病包括一系列疾病，这些疾病可能会依序(sequential)或相继(in tandem)发展，包括：牙龈炎、慢性牙周炎、侵袭性牙周炎、作为全身性疾病的表现的牙周炎、坏死性溃疡性牙龈炎/牙周炎、牙周脓肿和牙周-牙髓联合病变。牙周炎会引起牙槽骨、牙齿周围的牙周韧带的渐进性丧失以及牙根牙骨质的破坏，如果不及时治疗，可能会导致牙齿松动和随后的牙齿脱落。

牙骨质是将牙齿锚固到牙周韧带的无血管矿化组织。当牙骨质流失时，牙齿就会从牙周韧带上脱落，由此形成的袋会形成一个以牙周病为特征的慢性感染的病灶。当前的牙周疾病治疗根本不能解决牙骨质流失。相反，牙周治疗的重点是口腔卫生、口服药物(例如抗生素，包括低剂量多西环素(doxycycline))以及在牙周“袋”中局部应用抗生素以对抗病灶中的慢性感染(这会导致牙骨质的进一步降解)，以及旨在缩少袋深度、恢复牙根覆盖和/或牙槽骨再生的手术疗法。再生疗法的结果通常不是循证的，不够可靠的，因此也是不可预测的。

因此，需要鉴定可用于以可靠的、循证的和可预测的方式治疗或预防牙周疾病或促进牙骨质形成的化合物、组合物和方法。

发明内容

本文公开了用于治疗或预防牙周疾病的方法和组合物。

该方法包括向受试者施用外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶-1(ecto-nucleotidepyrophosphate/phosphodiesterase-I)(ENPP1)的抑制剂。

药物组合物包含用于治疗或预防牙周疾病或用于增加牙骨质形成的外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶-1(ENPP1)抑制剂。

还公开了一种用于治疗或预防牙周疾病或用于增加牙骨质形成的外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶-1(ENPP1)抑制剂。

通过以下附图和详细说明来例示上述内容和其他特征。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解所公开主题的说明性实施方式的以下详细描述。尽管在附图中示出了特定的实施方式，但是应当理解，所公开的主题不限于附图中示出的实施方式的精确配置和手段。

图1示出了牙齿和支撑结构的某些方面，例示了牙周疾病中牙骨质流失的某些部位。

图2示出了通过磷酸盐/焦磷酸盐(Pi/PPi)比调节牙骨质形成的非限制性示例性机制。

图3A示出了小鼠ENPP1-Fc对ENPP1^asj/asj小鼠牙骨质的某些非限制性体内作用。小鼠ENPP1功能丧失(LOF)模型的牙骨质增加，施用ENPP1-Fc会减少牙骨质形成，提供了ENPP1的全身递送在局部牙根部位有效的体内证据。在这种情况下，将ENPP1功能引入ENPP1^asj/asj小鼠减少了牙骨质形成。在某些实施方案中，如图2中所示，抑制ENPP1活性会促进牙骨质产生(牙骨质生成)。

图3B示出了三组小鼠中每组的无细胞牙骨质的微计算机断层扫描(CT)定量(每组n＝3-5)。在此图中，4个星号表示p<0.0001，1个星号表示p<0.05。

图4A-4B呈现了GACI患者(图4B)和正常人受试者(图4A)的牙齿的代表性CT图像。箭头指示了每个图像中的牙骨质层。使用微型计算机断层扫描(CT)来分析人和小鼠的牙齿。在μCT 50(Scanco Medical)中以70kVp、76μA、0.5Al滤波器对样品进行扫描，对于人类样品，积分时间为900ms，体素尺寸为10μm，对于小鼠样品，积分时间为1200ms，体素尺寸为2μm。使用AnalyzePro1.0(AnalyzeDirect)分析了重建的图像。

根据在ENPP1功能丧失模型的小鼠模型中获得的数据(图3A和3B)，将GACI患者牙齿的二维横截面(左)和三维重建(右)microCT图像(图4B)与正常人的对照(图4A)进行比较。GACI是一种超罕见的新生儿疾病，其特征是婴儿在大中型血管中发生广泛的动脉钙化，其特征还在于其ENPP1活性显著受损和血清血浆焦磷酸盐。GACI患者的牙骨质层更大，表明对人类ENPP1的抑制会导致牙骨质产生增加。

图5示出了牙周修复/再生的非限制性动物模型(技术示意图(上)和所得组织学图像(下))，其中使用Rodrigues,等人,2011,J.Periodontol.82(12):1757-66的方法测试了ENPP1抑制剂在牙周疾病中的功效。

具体实施方式

发明人发现抑制外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1(也称为ENPP1)会促进哺乳动物中牙骨质的形成。因此，ENPP1的抑制作用可用于治疗受试者的牙周疾病。在某些实施方案中，ENPP1的抑制可以预防具有遗传缺陷导致牙骨质形成缺乏或极少的个体的牙周疾病，目的是增加牙骨质形成并随后增加新的牙周韧带(PDL)附着和牙槽骨形成。受试者可以是哺乳动物。在某些实施方案中，受试者是人类。

牙骨质是一种无血管矿化的牙根结构，在体内表现出非常有限的周转，能够将牙齿附着在已插入支撑骨中的牙周韧带上。在人类和啮齿动物中，牙骨质沿着牙根表面，即在牙骨质-牙釉质交界处下方(在健康个体的牙龈下方，图1)。牙周疾病患者由于微生物毒素和宿主免疫炎性反应引起的病态牙骨质而导致牙骨质局部丧失，并导致牙周韧带从牙根脱落。当前还没有已知的方法可以促进牙骨质的产生，从而可以更新牙周疾病中牙骨质丧失。如本文所证明的，使用例如小分子ENPP1抑制剂抑制ENPP1活性可用于促进牙骨质的产生，从而治疗和/或改善牙周疾病，甚至预防与牙骨质缺乏有关的遗传相关的牙周疾病。

人ENPP蛋白家族由七个水解磷酸二酯键的胞外糖基化蛋白(即ENPP1、ENPP2、ENPP3、ENPP4、ENPP5、ENPP6和ENPP7)组成。除ENPP2外，这些ENPP是细胞表面酶，ENPP2被排出到质膜，但被弗林蛋白酶裂解并释放到细胞外液中。这些酶具有高度的序列和结构同源性，但是表现出多样的底物特异性，涵盖了从脂质到核苷酸。

ENPP1是II型细胞外膜结合糖蛋白，位于成骨细胞和软骨细胞的矿物质沉积基质囊泡上，以及脑毛细血管和其他矿化组织相关细胞的血管表面上。ENPP1将细胞外三磷酸腺苷(ATP)的降解异化为单磷酸腺苷(AMP)和焦磷酸盐(PPi)，并且是体内细胞外PPi的主要来源。PPi可能通过占据新生或正在生长的羟基磷灰石(HA)晶体表面上的一些磷酸盐(Pi)位点来抑制异位组织矿化，从而产生不规则结构，这种不规则结构会减慢或终止晶体生长的传播，并直接影响破骨细胞活性。构建体ENPP1-Fc能够降低因ENPP1突变而纯合的小鼠(ENPPl^asi/asi)中的泛发性动脉钙化(generalized arterial calcification)(Albright,等人,2015,Nature Comm.10006)。ENPPl^asi/asi小鼠作为婴儿泛发性动脉钙化(GACI)的动物模型，GACI是一种超罕见的新生儿疾病，其特征是婴儿在大中型血管中发生广泛的动脉钙化，导致心血管衰竭和新生儿期死亡。

如本文所证明，牙骨质对Pi/PPi比的调节高度敏感(参见，例如，图3A-3B)。ENPP1是PPi胞外来源的主要来源，在ENPP1抑制的生理状态下牙骨质的产生显著增加。实际上，ENPP1功能丧失(LOF)的动物模型表明，在牙齿和牙周韧带之间的牙根处牙骨质的产生增加(超过10倍)(图3)。所使用的ENPP1 LOF的动物模型是公认的GACI动物模型enpp1^asj/asj小鼠。用ENPP1-Fc处理enpp1^asj/asj小鼠导致牙骨质产生的抑制(图3A和3B)。与这些鼠结果一致，获得了来自正常人和患有GACI的人类患者的牙齿图像，证实了ENPP1功能丧失的GACI患者的牙骨质明显增加(图4A-4B)。综上所述，这些结果构成了体内证据，表明抑制ENPP1会增加人牙骨质的产生。ENPP1活性的抑制剂，例如但不限于ENPP1的小分子抑制剂，可用于促进受试者中牙骨质的形成，从而治疗受试者的牙周疾病，并可能预防由于某些罕见的遗传病症而缺乏形成牙骨质的能力的受试者的牙周疾病。

定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管类似于或等同于本文描述的那些方法和材料的任何方法和材料都可以用于本公开的实践或测试中，但是描述了示例性方法和材料。

如本文所用，以下每个术语在本节中具有与其相关的含义。

为了清楚起见，以下符号约定被应用于本公开。无论如何，本文中不遵循该约定的任何教导仍然是本公开的一部分，并且鉴于公开该教导的上下文可以被充分理解。蛋白质符号以非斜体大写字母公开。作为非限制性实例，“ENPP1”是指相应的蛋白质。在某些实施方案中，如果蛋白质是人类蛋白质，则在蛋白质符号前使用“h”。在其他实施方式中，如果蛋白质是小鼠蛋白质，则在符号前使用“m”。因此，人类ENPP1被称为“hENPP1”，小鼠ENPP1被称为“mENPP1”。人类基因符号以斜体大写字母公开。作为非限制性实例，与蛋白质hENPP1相对应的人类基因是ENPP1。小鼠基因符号以如下方式公开：首字母大写，其余字母小写；此外，小鼠基因符号用斜体表示。作为非限制性实例，制造蛋白质mEnpp1的小鼠基因是Enpp1。有关基因突变的符号显示为大写文本。例如，在基因Enpp1中具有与关节僵化相关的突变的转基因小鼠被称为“asj”突变，其注释为ENPP1^asj/asj，以表示与该突变相关的基因和表型。

冠词“一”在本文中用于指代一个或多个(即，至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“一个元件”是指一个元件或多于一个元件。

当涉及可测量值，例如量、持续时间等时，本文所使用的“约”意指涵盖指定值±20％或±10％，在某些实施方案中±5％，在某些实施方案中±1％，在某些实施方案中±0.1％的变化，因为这样的变化适用于执行所公开的方法。

当在生物体、组织、细胞或其组分的上下文中使用时，术语“异常”是指在至少一种可观察的或可检测的特征(例如年龄、治疗、天数时间等)方面与显示“正常的”(预期的)相应特征的生物、组织、细胞或其组分不同的那些生物、组织、细胞或其组分。对于一种细胞或组织类型正常或预期的特征对于另一种细胞或组织类型可能异常。

如果疾病或病症的症状的严重程度、患者经历这种症状的频率或两者都降低，则该疾病或病症“减轻”。

如本文所用，术语“改变”、“缺陷”、“变异”或“突变”是指细胞中基因中影响其编码的多肽的功能、活性、表达(转录或翻译)或构象的突变。本公开所涵盖的突变可以是导致增强或破坏所编码的多肽的功能、活性、表达或构象(包括完全不表达所编码的蛋白质)的细胞中基因的任何突变，并且可以包括例如错义和无意义的突变、插入、删除、移码和过早终止。不受限于此，本公开所涵盖的突变可改变剪接mRNA(剪接位点突变)或引起阅读框的移位(移框)。

“疾病”是动物的一种健康状态，其中动物无法维持体内稳态，并且如果疾病没有得到改善，则动物的健康状况将继续恶化。

动物的“病症(disorder)”是一种健康状态，在这种状态下，动物能够维持体内稳态，但与没有该病症的情况相比，动物的健康状态不利。如果不治疗，病症不一定会导致动物健康状态进一步下降。

如本文所用，术语“有效量”、“药物有效量”和“治疗有效量”是指无毒但足以提供所需生物学结果的试剂量。该结果可以是疾病的迹象、症状或病因的减少和/或减轻，或任何其他期望的生物系统的改变。本领域普通技术人员可以使用常规实验确定在任何个体情况下的适当治疗量。

如本文所用，术语“Fc”是指人或小鼠IgG Fc结构域。

如本文所用的术语“指导材料”包括出版物、记录、图表或者可用于传达试剂盒中本公开的化合物用于鉴定或减轻或治疗本文所述的各种疾病或病症的可用性的任何其他表达介质。可选地或可替代地，指导材料可以描述一种或多种用于鉴定或减轻受试者的细胞或组织中的疾病或病症的方法。试剂盒的指导材料可以例如固定在含有本发明化合物的容器上，或者与含有该化合物的容器一起运输。可替代地，可以以使接收者协同使用指导材料和化合物为目的，将指导材料与容器分开运输。

“分离的”是指从自然状态改变或移出。例如，天然存在于活体动物中的核酸或多肽不是“分离的”，而与天然状态的共存材料部分或完全分离的相同核酸或多肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境，例如宿主细胞中。

如本文所用，术语“NPP”或“ENPP”是指外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶。

如本文所用，术语“患者”、“个体”或“受试者”是指人类或非人类哺乳动物。非人类哺乳动物包括例如牲畜和宠物，例如绵羊、牛、猪、犬、猫和鼠类哺乳动物。在某些实施方案中，患者、个体或受试者是人类。

如本文所用，关于牙周疾病的术语“预防”，如果没有发生病症或疾病，则是指没有疾病或病症，或者如果已经发展了病症或疾病，则是指没有进一步的病症或疾病发展。还考虑一个人预防与病症或疾病相关的某些或全部症状的能力。

如本文所用，术语“药物组合物”是指一种组合物，其包含在所公开的方法中有用的至少一种化合物和至少一种其他物质，例如载体，优选药学上可接受的载体。药物组合物任选地包含一种或多种另外的活性剂。该药物组合物有利于向患者施用该化合物。本领域中存在多种施用化合物的技术，包括但不限于静脉内、口服、气雾剂、吸入、直肠、阴道、透皮、鼻内、颊、舌下、肠胃外、鞘内、胃内、眼科、肺部和局部施用。

如本文所用，术语“药学上可接受的”是指一种材料，例如载体或稀释剂，其不消除化合物的生物学活性或特性并且相对无毒，即，可以将该材料施用于个体，而不会引起不良的生物学影响或以有害的方式与包含它的组合物的任何组分相互作用。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填充剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、稀释剂、赋形剂、增稠剂、溶剂或包囊材料，它们参与在患者体内或向患者携带或运输在所公开的主题内有用的化合物，从而使其可以执行其预期的功能。通常，将此类构建体从一个器官或身体的一部分携带或运输到另一器官或身体的另一部分。从与制剂的其他成分(包括在所公开的主题内有用的化合物)相容的意义上讲，每种载体必须是“可接受的”，并且对患者无害。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；表面活性剂；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及药物制剂中使用的其他无毒相容性物质。如本文所用，“药学上可接受的载体”还包括与在所公开的主题内有用的化合物的活性相容并且病人在生理上可接受的任何和所有包衣、抗细菌和抗真菌剂，以及吸收延迟剂等。也可以向组合物中掺入补充活性化合物。“药学上可接受的载体”可以进一步包括在所公开的主题内有用的化合物的药学上可接受的盐。在所公开的主题的实践中使用的药物组合物中可以包括的其他另外的成分是本领域已知的，并且在例如《雷明顿药物科学》(Genaro,Ed.,Mack Publishing Co.,1985,Easton,PA)(其通过引用并入本文)中进行了描述。

如本文所用，语言“药学上可接受的盐”是指由药学上可接受的无毒酸和碱制备的所施用的化合物的盐，所述药学上可接受的无毒酸和碱包括无机酸、无机碱、有机酸、无机碱、溶剂化物、水合物及其包合物。合适的药学上可接受的酸加成盐可以由无机酸或有机酸制备。无机酸的实例包括硫酸、硫酸氢盐、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、硫酸和磷酸(包括磷酸氢盐和磷酸二氢盐)。合适的有机酸可以选自有机酸的脂族类、脂环族类、芳族类、芳脂族类、杂环类、羧酸类和磺酸类，其实例包括甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、葡萄糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖醛酸、马来酸、富马酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、邻氨基苯甲酸、4-羟基苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸、扑酸(帕莫酸)、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、泛酸、三氟甲磺酸、2-羟基乙磺酸、对甲苯磺酸、磺胺酸、环己基氨基磺酸、硬脂酸、海藻酸、β-羟基丁酸、水杨酸、半乳糖和半乳糖醛酸。所公开主题的化合物的合适的药学上可接受的碱加成盐包括例如金属盐，包括碱金属盐、碱土金属盐和过渡金属盐，例如钙、镁、钾、钠和锌盐。药学上可接受的碱加成盐还包括由碱性胺例如N,N’-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡萄糖胺)和普鲁卡因(procaine)制成的有机盐。所有这些盐均可以通过例如使合适的酸或碱与化合物反应而由相应的化合物制备。

如本文所用，“样品”或“生物样品”是指从受试者分离的生物材料。生物样品可以包含适合于检测受试者的生理或病理过程的mRNA、多肽或其他标志物的任何生物材料，并且可以包含从个体获得的液体、组织、细胞和/或非细胞材料。

如本文所用，术语“小分子”是指分子量低于约2,000Da的分子。在某些实施方案中，小分子不是多肽和/或肽，而是可以包含多肽或蛋白质亚结构。在其他实施方案中，小分子是多肽和/或肽。

如本文所用，“基本上纯的”是指基本上不含其他组分。例如，基本上纯的多肽是已经从天然存在状态下通常与其有关的其他组分中分离出来的多肽。

如本文所用，术语“治疗”被定义为向患者应用或施用治疗剂，即在所公开的主题内有用的化合物(单独或与另一种药剂组合)，或向从患有疾病或病症、疾病或病症的症状或可能发展疾病或病症的患者分离的组织或细胞系应用或施用治疗剂(例如，用于诊断或离体应用)，目的是治愈(cure)、治愈(heal)、减轻(alleviate)、缓解(relieve)、改变、补救(remedy)、改善(ameliorate)、改善(improve)或影响疾病或病症、疾病或病症的症状或发展疾病或病症的潜力。基于从药物基因组学领域获得的知识，可以具体地定制或修改这种治疗。

范围：在整个本公开中，可以以范围形式呈现所公开的主题的各个方面。应当理解，范围形式的描述仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所公开主题的范围的僵化限制。因此，应该将范围的描述视为已明确公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，对范围例如从1到6的描述应视为已明确公开了子范围，例如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。这与范围的广度无关。

化合物

在某些实施方案中，本发明涵盖了ENPP1活性的任何抑制剂，例如但不限于任何已知的或尚未鉴定的小分子ENPP1抑制剂，或其溶剂化物或盐(例如，药学上可接受的盐)。抑制剂包括ENPP1底物ATP(三磷酸腺苷)和2’,3’-cGAMP(环状[G(2′,5′)pA(3′,5′)p])的不可水解类似物：

不可水解的ATP类似物包括α,β-亚甲基-腺苷5'-三磷酸(“α,β-亚甲基-ATP”)

(也称为APCP.P，其中句点表示两个磷原子之间的标准O接头)、AP.PNP、AP.PCP、AP.PCCl₂P、APCP.P、ACP.PP、ATPγF、ATPαS、ATPβS、ATPγS及其类似物、前药、盐或溶剂化物。这些不可水解的ATP类似物的结构示于表1中。不可水解的ATP类似物的其他实例示于表2中。

表1.ATP类似物中O取代的表示

(三磷酸基团类似物；R＝5'-腺苷基团)

表2.ATP类似物

不可水解的2’,3’-cGAMP抑制剂包括但不限于：2’,3’-cGAM(PS)₂(Rp/Sp)；3'-腺苷酸P-硫代鸟苷酰-(2’→5’)-环状核苷酸(3'-Adenylic acid,P-thioguanylyl-(2’→5’)-,cyclic nucleotide)；2'-鸟苷酸P-硫代腺苷酰-(3’→5’)-环状(2’→5’)-核苷酸(2'-Guanylic acid,P-thioadenylyl-(3’→5’)-,cyclic(2’→5’)-nucleotide)；2'-鸟苷酸腺苷酰-(3’→5’)-3'-脱氧-环状2’→5’-核苷酸(2'-Guanylic acid,adenylyl-(3’→5’)-3'-deoxy-,cyclic 2’→5’-nucleotide)；2'-鸟苷酸腺苷酰-(3’→5')-环状核苷酸(2'-Guanylic acid,adenylyl-(3’→5')-,cyclic nucleotide)；3'-鸟苷酸腺苷酰-(3’→5’)-环状核苷酸(3'-Guanylic acid,adenylyl-(3’→5’)-,cyclic nucleotide)；或其类似物、前药、盐或溶剂化物：

该化合物可用于治疗或预防牙周疾病或增加牙骨质形成(牙骨质生成)。

可以如本文其他地方所述，通过体外和/或体内测试或使用现有技术中已知或认可的任何方法来鉴定可用于所公开方法的化合物。在非限制性实例中，在所公开的方法中有用的化合物可增加文献中建立的成牙骨质细胞(cementoblast)培养物中牙骨质的产生(Rodrigues,等人,2011,J.Periodontol.82(12):1757-66；Foster,等人,2012,PLoS ONE 7(6):e 383-393；Foster,等人,2011,Cells Tissues Organs 194(5):382-405)。在另一个非限制性实例中，在所公开的方法中有用的化合物可以增加和/或恢复文献中建立的牙周疾病动物模型中牙骨质的产生。这些模型包括牙周疾病的鼠类模型，其中在进行性强直性蛋白质敲除(Ank KO)和野生型(WT)小鼠的下颌磨牙的颊面产生了牙周开窗缺口(2mm/1mm/0.5mm)，如在Rodrigues,等人,2011,J.Periodontol.82(12):1757-66中所描述的(见图5)。这些模型还包括任何SIBLING(小整合素结合配体N-连接的糖皮质激素)蛋白质家族的功能丧失小鼠模型。例如，在啮齿动物模型(BSP敲除(KO)模型)中，骨唾液蛋白(BSP)的功能丧失会导致牙周表型，这是牙根牙骨质形成极少的结果(Foster,等人,2013,J.Dent.Res.92(2):166-172)。可以将用ENNP1抑制剂治疗BSP KO小鼠用作确定抑制剂纠正牙骨质缺损的能力的模型。

可以将所公开的方法中有用的化合物配制成还包含至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。在某些实施方案中，将药物组合物配制成用于局部施用，即，通过牙龈组织注射到患病部位，或在制作手术皮瓣后递送，或用于颊部施用。在其他实施方案中，在所公开的方法中有用的化合物被吸附或结合到药物组合物中的纳米颗粒上。在其他实施方案中，在所公开的方法中有用的化合物被吸附或结合到药物组合物中的纳米纤维上。如果使用外科手术，则可以使用可吸收的缝合线和/或伤口愈合敷料。

方法

本公开提供了治疗或预防受试者的牙周疾病和/或由于罕见遗传缺陷导致的牙骨质形成缺陷的方法。在某些实施方案中，向受试者施用治疗有效量的至少一种本公开所考虑的化合物。可以将该至少一种化合物配制成包含至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。在其他实施方案中，将该至少一种化合物施用于和/或注射至受试者的牙龈组织。在其他实施方案中，将该至少一种化合物急性或慢性地施用给受试者。在其他实施方案中，准备手术皮瓣以递送该化合物和载体。在其他实施方案中，受试者是哺乳动物。在其他实施方案中，哺乳动物是人。

本领域的技术人员将认识到，当掌握了包括本文详述的方法的本公开时，所公开的主题一旦建立就不限于疾病或病症的治疗。特别地，疾病或病症的症状不必表现为对受试者有害；实际上，在施用治疗之前，不需要在受试者中检测到疾病或病症。即，在本公开可能提供益处之前，不必发生来自疾病或病症的重大病理学。因此，如本文更全面地描述的，所公开的主题包括一种用于预防受试者的疾病和病症的方法，因为可以在疾病或病症的发作之前，将本文所考虑的任何化合物施用给受试者，从而预防疾病或病症的发展。当掌握了本文的公开内容时，本领域的技术人员将理解，预防受试者的疾病或病症包括向受试者施用本文所考虑的化合物作为针对疾病或病症的预防措施。

所公开的主题包括施用本文所考虑的化合物以实践所公开的方法；基于本文提供的公开内容，本领域技术人员将理解如何配制和向受试者施用本文所考虑的任何化合物。但是，所公开的主题不限于任何特定的施用方法或治疗方案。以下情况尤其如此，掌握了本文提供的公开内容的本领域技术人员将认识到的是，可以由药理学领域的技术人员确定施用本文所公开的化合物的方法。

药物组合物和制剂

本公开提供了药物组合物，其包含至少一种在所公开的方法中有用的化合物。在某些实施方案中，该至少一种化合物是组合物中存在的唯一治疗有效剂。在其他实施方案中，该至少一种化合物是组合物中存在的唯一治疗有效剂，其量足以治疗或预防所公开的主题内考虑的疾病或病症。

这样的药物组合物是适合于向受试者施用的形式，或者该药物组合物可以进一步包含一种或多种药学上可接受的载体、一种或多种另外的成分或这些的一些组合。如本领域中众所周知，药物组合物的各种组分可以以生理上可接受的盐的形式存在，例如与生理上可接受的阳离子或阴离子组合。

在某些实施方案中，可以施用可用于实施所公开的方法的药物组合物以递送1ng/kg/天至100mg/kg/天的剂量。在其他实施方案中，可以施用可用于实施所公开的方法的药物组合物以递送1ng/kg/天至500mg/kg/天的剂量。

所公开的主题的药物组合物中活性成分、药学上可接受的载体和任何另外的成分的相对量将根据所治疗受试者的身份、大小和状况而变化，并且还取决于该组合物将被施用的途径。举例来说，组合物可以包含约0.1％至约100％(w/w)的活性成分。

可以适当开发在所公开的方法中有用的药物组合物，用于口服、肠胃外、局部、透皮、颊、眼或其他施用途径。其他考虑的制剂包括计划的纳米颗粒、脂质体制剂、含有活性成分的重新密封的红细胞和基于免疫学的制剂。施用途径对技术人员而言是显而易见的，并且取决于许多因素，包括所治疗疾病的类型和严重性、所治疗的兽类或人类患者的类型和年龄等等。

在某些实施方案中，通过化学和/或离子附着或粘附至目前用于局部递送抗生素疗法的合适基底上，将化合物和/或组合物局部递送至牙周疾病的部位，以治疗牙周疾病。用于向牙周疾病部位递送局部抗生素疗法的底物的实例包括但不限于生物膜、纳米颗粒、缝合材料、微球、聚合物、纤维、基质和凝胶。通过本领域已知的方法和上述方法直接应用于牙周疾病袋的基底的商业实例包括FDA批准的产品，例如ARESTIN、ATRIDOX、ACTISITE、

ELYZOL和DENTOMYSIN。

在某些实施方案中，将化合物和/或组合物施用于受试者，以最小化或避免受试者对该化合物和/或组合物的全身暴露。

可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法来制备本文描述的药物组合物的制剂。通常，这种制备方法包括以下步骤：使活性成分与载体或一种或多种其他辅助成分结合，然后，如果必要或期望，将产品塑型或包装成所需的单剂量或多剂量单位。

如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的离散量的药物组合物。活性成分的量通常等于将被施用于受试者的活性成分的剂量或该剂量的方便部分，例如该剂量的一半或三分之一。单位剂型可以是单个日剂量或多个日剂量之一(例如，每天约1至4次或多次)。当使用多个日剂量时，单位剂型可以相同或不同。

尽管本文提供的药物组合物的描述主要针对适合于对人类进行伦理施用的药物组合物，但是技术人员应理解，此类组合物通常适合于施用于所有种类的动物。为了使组合物适合于向各种动物施用，对适合于向人类施用的药物组合物进行修改是众所周知的，并且普通技术兽医药理师可以仅通过普通的(如果有的话)实验来设计和进行这种修改。预期施用所公开的药物组合物的受试者包括但不限于人类和其他灵长类动物、哺乳动物，包括与商业相关的哺乳动物，例如牛、猪、马、绵羊、猫和狗。

在某些实施方案中，使用一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体配制组合物。在某些实施方案中，药物组合物包含治疗有效量的活性剂和药学上可接受的载体。有用的药学上可接受的载体包括但不限于甘油、水、盐水、乙醇和其他药学上可接受的盐溶液，例如磷酸盐和有机酸的盐。这些和其他药学上可接受的载体的实例在Remington’sPharmaceutical Sciences,1991,Mack Publication Co.,New Jersey中描述。

制剂可能与常规赋形剂，即本领域已知的适合于口服、肠胃外、经鼻、静脉内、皮下、肠内或任何其他合适的施用方式的药学上可接受的有机或无机载体物质混合使用。可以对药物制剂进行灭菌，并且如果需要，可以与辅助剂，例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压缓冲剂的盐、着色剂、调味剂和/或芳香族物质等混合。在需要时，它们也可以与其他活性剂，例如其他镇痛剂组合。

如本文所用，“另外的成分”包括但不限于以下中的一种或多种：赋形剂；表面活性剂；分散剂；惰性稀释剂；制粒和崩解剂；粘合剂；润滑剂；甜味剂；调味剂；着色剂；防腐剂；生理可降解的组合物，例如明胶；水性溶媒和溶剂；油性溶媒和溶剂；悬浮剂；分散剂或湿润剂；乳化剂，缓和剂；缓冲剂；盐；增稠剂；填充剂；乳化剂；抗氧化剂；抗生素；抗真菌剂；稳定剂；和药学上可接受的聚合材料或疏水材料。可以包括在所公开的药物组合物中的其他“另外的成分”是本领域已知的，并且例如在Genaro,ed.,1985,Remington’s PharmaceuticalSciences,Mack Publishing Co.,Easton,PA(其通过引用并入本文)中描述。

可以使用常规方法制备液体悬浮液，以使活性成分悬浮在水性或油性溶媒中。水性溶媒包括例如水和等渗盐水。油性溶媒包括例如杏仁油、油性酯、乙醇、植物油例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油、分馏的植物油以及矿物油例如液体石蜡。液体悬浮液可以进一步包含一种或多种另外的成分，包括但不限于悬浮剂、分散剂或湿润剂、乳化剂、缓和剂、防腐剂、缓冲剂、盐、调味剂、着色剂和甜味剂。油性悬浮液可以进一步包含增稠剂。已知的悬浮剂包括但不限于山梨糖醇糖浆、氢化食用脂肪、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪胶、阿拉伯胶和纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素)。已知的分散剂或湿润剂包括但不限于天然存在的磷脂，例如卵磷脂，氧化烯与脂肪酸、与长链脂族醇、与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯或与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，分别为聚氧乙烯硬脂酸酯、十七烷基乙烯氧基鲸蜡醇、聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯和聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。已知的乳化剂包括但不限于卵磷脂和阿拉伯胶。已知的防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯、抗坏血酸和山梨酸。已知的甜味剂包括例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、蔗糖和糖精。用于油性悬浮液的已知增稠剂包括例如蜂蜡、硬石蜡和鲸蜡醇。

可以以与液体悬浮液基本相同的方式制备活性成分在水性或油性溶剂中的液体溶液，主要区别在于活性成分是溶解的，而不是悬浮在溶剂中。如本文所用，“油性”液体是包括含碳液体分子并且表现出比水小的极性的液体。药物组合物的液体溶液可以包含关于液体悬浮液描述的每种组分，应理解的是，悬浮剂不一定有助于活性成分在溶剂中的溶解。水性溶剂包括例如水和等渗盐水。油性溶剂包括，例如，杏仁油、油性酯、乙醇、植物油例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油、分馏的植物油以及矿物油例如液体石蜡。

可以使用已知方法来制备药物制剂的粉状和粒状制剂。此类制剂可直接施用于受试者，例如用于形成片剂、填充胶囊或通过向其中添加水性或油性溶媒来制备水性或油性悬浮液或溶液。这些制剂中的每一种可以进一步包含分散剂或湿润剂、悬浮剂和防腐剂中的一种或多种。这些制剂中还可以包括其他赋形剂，例如填充剂和甜味剂、调味剂或着色剂。

药物组合物也可以以水包油乳剂或油包水乳剂的形式制备、包装或出售。油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油，矿物油，例如液体石蜡，或这些的组合。这样的组合物可以进一步包含一种或多种乳化剂，例如天然存在的胶，例如阿拉伯胶或黄芪胶，天然存在的磷脂，例如大豆或卵磷脂，衍生自脂肪酸和己糖醇酐的组合的酯或偏酯，例如脱水山梨糖醇单油酸酯，以及这种偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。这些乳液还可以包含另外的成分，包括例如甜味剂或调味剂。

用化学成分浸渍或涂覆材料的方法在本领域中是已知的，包括但不限于将化学成分沉积或结合到表面上的方法，在材料合成过程中将化学成分掺入到材料的结构中的方法(即，例如使用生理上可降解的材料)，以及将水性或油性溶液或悬浮液吸收到吸收性材料中(随后进行或不进行干燥)的方法。

施用/剂量

施用方案可能会影响有效量的构成。例如，可以每天施用或相继施用几个分开的剂量以及错开的剂量，或者可以连续输注该剂量，或者可以是大剂量注射。此外，治疗制剂的剂量可以根据治疗或预防情况的紧急程度成比例地增加或减少。

可以使用已知的方法，以有效治疗患者的疾病或病症的剂量和时间段将本发明的组合物施用于患者，例如哺乳动物，例如人。实现治疗效果所必需的治疗化合物的有效量可以根据诸如以下的因素而变化：所使用的特定化合物的活性；施用时间；化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与该化合物组合使用的其他药物、化合物或材料；所治疗的患者的疾病或病症的状态、年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史，以及医学领域众所周知的类似因素。可以调整剂量方案以提供最佳的治疗反应。例如，如治疗情况的紧急情况所指示，可以每天施用数个分开的剂量或者可以成比例地减少该剂量。治疗化合物的有效剂量范围的非限制性实例是约0.01至50mg/kg体重/每天。本领域普通技术人员将能够就治疗化合物的有效量研究相关因素并做出决定而无需过度实验。

该化合物可以以每天几次频繁地施用于动物，也可以不那么频繁地施用，例如每天一次，每周一次，每两周一次，每月一次或甚至更不频繁地施用，例如每几个月一次，或者甚至每年一次或更不频繁。应当理解，在非限制性实例中，每天给药的化合物的量可以每天、每隔一天、每2天、每3天、每4天或每5天施用。例如，对于每隔一天施用一次，可以在星期一开始施用5mg/天的剂量，在星期三施用第一次后续5mg/天的剂量，在星期五施用第二次5mg/天的剂量，依此类推。剂量的频率对技术人员而言是显而易见的，并且取决于许多因素，例如但不限于所治疗的疾病的类型和严重性，以及动物的类型和年龄。

可以改变药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以获得对于特定患者、组合物和施用方式而言有效实现所需治疗反应，而对患者没有毒性的活性成分的量。

具有本领域普通技术的医生，例如医师或兽医，可以容易地确定所需药物组合物的有效量和给所需药物组合物的有效量开处方。例如，医师或兽医可以以低于为了获得所需治疗效果所需的剂量水平开始药物组合物中使用的化合物的剂量，并逐渐增加剂量直至达到所需效果。

在特定的实施方案中，以易于施用和剂量均匀性的剂量单位形式配制化合物是特别有利的。如本文所用，剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于待治疗患者的物理上离散的单位；每个单位都包含预定量的治疗化合物，经计算该预定量的治疗化合物可以与所需的药物溶媒结合以产生所需的治疗效果。剂量单位形式由以下因素决定，并直接取决于以下因素：(a)治疗化合物的独特特征和要实现的特定治疗效果，以及(b)配合/配制这种用于治疗患者的疾病或病症的治疗化合物的领域固有的局限性。

在某些实施方案中，将所公开的组合物以每天1至5次或更多次的剂量施用于患者。在其他实施方案中，将组合物以包括但不限于每天一次、每两天一次、每三天一次、每周一次和每两周一次的剂量范围施用于患者。对于本领域技术人员而言显而易见的是，各种组合组合物的施用频率因受试者而异，取决于许多因素，包括但不限于年龄、待治疗的疾病或病症、性别、总体健康和其他因素。因此，所公开的主题不应被解释为限于任何特定的剂量方案，并且将由主治医生考虑与患者有关的所有其他因素来确定将要施用于任何患者的精确剂量和组合物。

用于施用的公开化合物可以在以下范围内：约1μg至约7,500mg、约20μg至约7,000mg、约40μg至约6,500mg、约80μg至约6,000mg、约100μg至约5,500mg、约200μg至约5,000mg、约400μg至约4,000mg、约800μg至约3,000mg、约1mg至约2,500mg、约2mg至约2,000mg、约5mg至约1,000mg、约10mg至约750mg、约20mg至约600mg、约30mg至约500mg、约40mg至约400mg、约50mg至约300mg、约60mg至约250mg、约70mg至约200mg、约80mg至约150mg，以及其间的任何和所有全部或部分增量。

在一些实施方案中，化合物的剂量为约0.5μg至约5,000mg。在一些实施方案中，用于本文所述的组合物中的化合物的剂量小于约5,000mg，或小于约4,000mg，或小于约3,000mg，或小于约2,000mg，或小于约1,000mg，或小于约800mg，或小于约600mg，或小于约500mg，或小于约200mg，或小于约50mg。类似地，在一些实施方案中，本文所述的第二化合物的剂量小于约1,000mg，或小于约800mg，或小于约600mg，或小于约500mg，或小于约400mg，或小于约300mg，或小于约200mg，或小于约100mg，或小于约50mg，或小于约40mg，或小于约30mg，或小于约25mg，或小于约20mg，或小于约15mg，或小于约10mg，或小于约5mg，或小于约2mg，或小于约1mg，或小于约0.5mg，及其任何和所有全部或部分增量。

在某些实施方案中，本公开涉及一种包装的药物组合物，其包含容器，所述容器容纳了单独的或与第二药剂组合的治疗有效量的本文所公开的化合物；和使用该化合物治疗、预防或减轻患者疾病或病症的一种或多种症状的说明。

术语“容器”包括用于容纳药物组合物的任何容器。例如，在某些实施方案中，容器是包含药物组合物的包装。在其他实施方案中，容器不是包含药物组合物的包装，即，容器是容器，例如包含包装的药物组合物或未包装的药物组合物以及药物组合物的使用说明的盒子或小瓶。而且，包装技术是本领域众所周知的。应当理解，药物组合物的使用说明书可以包含在含有药物组合物的包装上，因此，说明书与包装的产品形成增加的功能关系。但是，应该理解，说明书可能包含有关该化合物执行其预期功能的能力的信息，例如治疗、预防或减少患者的疾病或病症。

施用途径

本文公开的任何组合物的施用途径包括局部递送至牙周疾病部位、吸入、口服、鼻、直肠、肠胃外、舌下、经皮、经粘膜(例如舌下、舌、(经)颊、(经)尿道、阴道(例如经阴道和阴道周围(perivaginally))、鼻(内)和(经)直肠)、膀胱内、肺内、十二指肠内、胃内、鞘内、皮下、肌肉内、皮内、动脉内、静脉内、支气管内、吸入和局部施用。

合适的组合物和剂型包括，例如，片剂、胶囊剂、囊片(caplet)、丸剂、凝胶胶囊(gel cap)、锭剂(troche)、分散剂、悬浮剂、溶液、糖浆、颗粒剂、珠剂(bead)、透皮贴剂、凝胶剂、散剂、丸剂、乳浆剂(magma)、锭剂(lozenge)、乳膏、糊剂、膏药、洗剂、圆盘、栓剂、用于鼻腔或口服施用的液体喷雾剂、用于吸入的干粉或气雾制剂、用于膀胱内施用的组合物和制剂等。应当理解，可用于所公开的方法的制剂和组合物不限于本文描述的特定制剂和组合物。

口服施用

对于口服应用，特别合适的是片剂、糖衣丸、液体、滴剂、栓剂或胶囊、囊片和凝胶胶囊(gelcap)。其他适合口服施用的制剂包括但不限于粉末或颗粒制剂、水性或油性悬浮液、水性或油性溶液、糊剂、凝胶剂、牙膏、漱口剂、包衣剂、口服冲洗剂或乳液。预期用于口服使用的组合物可以根据本领域已知的任何方法来制备，并且这样的组合物可以包含一种或多种选自由以下组成的组的剂：适于制备片剂的惰性、无毒的药物赋形剂。这样的赋形剂包括例如惰性稀释剂，例如乳糖；制粒和崩解剂，例如玉米淀粉；粘合剂，例如淀粉；以及润滑剂，例如硬脂酸镁。

片剂可以是非包衣的，或者可以使用已知方法进行包衣，以在受试者的胃肠道中实现延迟崩解，从而提供活性成分的持续释放和吸收。举例来说，可以使用诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的材料来对片剂进行包衣。进一步举例来说，可以使用美国专利号4,256,108；4,160,452；和4,265,874中所述的方法对片剂进行包衣，以形成渗透控释片剂。片剂可以进一步包含甜味剂、调味剂、着色剂、防腐剂或这些的一些组合，以提供药学上优雅且可口的制剂。

包含活性成分的硬胶囊可以使用生理上可降解的组合物例如明胶来制备。这样的硬胶囊包含活性成分，并且可以进一步包含另外的成分，包括例如惰性固体稀释剂，例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土。

包含活性成分的软明胶胶囊可以使用生理上可降解的组合物例如明胶来制备。这样的软胶囊包含活性成分，其可以与水或油介质，例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。

对于口服施用，本公开的化合物可以是通过常规方式与药学上可接受的赋形剂例如粘合剂；填充剂；润滑剂；崩解剂或润湿剂一起制备的片剂或胶囊剂的形式。如果需要，可以使用合适的方法和包衣材料对片剂进行包衣，所述包衣材料例如可从Colorcon，WestPoint，Pa获得的OPADRY^TM薄膜包衣系统(例如OPADRY^TM OY型、OYC型、有机肠溶OY-P型、水性肠溶OY-A型、OY-PM型和OPADRY^TM White，32K18400)。

用于口服施用的液体制剂可以是溶液、糖浆或悬浮液的形式。液体制剂可以通过常规方法与药学上可接受的添加剂例如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆、甲基纤维素或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性溶媒(例如，杏仁油、油性酯或乙醇)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)一起制备。适用于口服施用的药物组合物的液体制剂可以以液体形式或以干燥产品的形式制备、包装和销售，所述干燥产品旨在在使用前用水或另一种合适的溶媒重构。

包含活性成分的片剂可以例如通过将活性成分(任选地与一种或多种另外的成分一起)压缩或模制来制备。压缩片剂可以通过如下方法制备：在合适的装置中，将自由流动形式的活性成分例如粉末或颗粒制剂压缩，所述自由流动形式的活性成分任选地与一种或多种粘合剂、润滑剂、赋形剂、表面活性剂和分散剂混合。模制片剂可以通过如下方法制备：在合适的装置中，将一种混合物模制，所述混合物是活性成分、药学上可接受的载体和至少足以润湿该混合物的液体。用于制造片剂的药学上可接受的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂、制粒和崩解剂、粘合剂和润滑剂。已知的分散剂包括但不限于马铃薯淀粉和淀粉羟乙酸钠。已知的表面活性剂包括但不限于月桂基硫酸钠。已知的稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、乳糖、微晶纤维素、磷酸钙、磷酸氢钙和磷酸钠。已知的制粒和崩解剂包括但不限于玉米淀粉和藻酸。已知的粘合剂包括但不限于明胶、阿拉伯胶、预糊化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和羟丙基甲基纤维素。已知的润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、二氧化硅和滑石粉。

本公开还包括多层片剂，其包括提供用于本文公开的方法中的一种或多种化合物的延迟释放的层，以及提供用于该方法中的一种或多种化合物的立即释放的另一层。使用蜡/pH敏感性聚合物混合物，可以获得其中包埋了活性成分的胃不溶性组合物，从而确保了其延迟释放。

肠胃外施用

如本文所用，药物组合物的“肠胃外施用”包括任何给药途径，其特征在于受试者的组织的物理破坏，并通过组织中的该破坏来施用药物组合物。因此，肠胃外施用包括但不限于通过注射组合物、通过手术切口应用组合物、通过穿透组织的非手术伤口应用组合物等来施用药物组合物。特别地，肠胃外施用预期包括但不限于皮下、静脉内、腹膜内、肌内、胸骨内注射和肾脏透析输注技术。

其他施用形式

另外的剂型包括如美国专利号6,340,475、6,488,962、6,451,808、5,972,389、5,582,837和5,007,790中所述的剂型。另外的剂型还包括如美国专利申请号20030147952、20030104062、20030104053、20030044466、20030039688和20020051820中所述的剂型。另外的剂型还包括如PCT申请号WO 03/35041、WO 03/35040、WO 03/35029、WO 03/35177、WO 03/35039、WO 02/96404、WO02/32416、WO 01/97783、WO 01/56544、WO 01/32217、WO 98/55107、WO98/11879、WO 97/47285、WO 93/18755和WO 90/11757中所述的剂型。

控释制剂和药物递送系统

可以使用常规技术来制备药物组合物的控释或缓释制剂。在某些情况下，可以使用不同比例的提供所需释放特征的例如羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、凝胶、渗透膜、渗透系统、多层包衣、微粒、脂质体或微球或其组合，将待使用的剂型提供为其中一种或多种活性成分的缓释或控释形式。可以很容易地选择本领域普通技术人员已知的合适的控释制剂，包括本文所述的那些，以与药物组合物一起使用。因此，本公开内容涵盖适合于口服施用的适合于控释的单一单位剂型，例如片剂、胶囊剂、软胶囊剂和囊片剂。

大多数控释药物产品的共同目标是改善药物治疗，使其优于其非控释对应物。理想地，在医学治疗中使用最佳设计的控释制剂的特征在于，在最短的时间内使用最少的药物来治愈或控制病况。控释制剂的优势包括药物活性延长、给药频率降低和患者依从性提高。另外，控释制剂可用于影响作用时间或其他特征，例如药物的血液水平，因此可影响副作用的发生。

大多数控释制剂被设计成最初释放一定量的药物，立即产生所需治疗效果，并逐步连续释放其他量的药物，以在长时间段内维持该水平的治疗效果。为了维持药物在体内的这种恒定水平，必须以一定的速率从剂型中释放药物，该速率将替代被代谢和从体内排出的药物的量。

活性成分的控释可以通过各种诱导剂来刺激，例如pH、温度、酶、水或其他生理条件或化合物。在本公开的上下文中，术语“控释组分”在本文中定义为一种或多种化合物，包括但不限于有助于活性成分的控释的聚合物、聚合物基质、凝胶、可渗透膜、脂质体或微球或其组合。

在某些实施方案中，所公开的主题的制剂可以是但不限于短期、快速失效(rapid-offset)以及控释例如缓释、延迟释放和脉冲释放制剂。

术语“缓释”以其常规含义使用，用来指一种药物制剂，其可在长时间段内逐渐释放药物，并且可以(尽管不一定)导致药物的血液水平在长时间段内基本恒定。该时间段可以长达一个月或更长时间，并且应当是比等量的以推注(bolus)形式施用的药剂更长的释放。为了持续释放，可以将化合物与合适的聚合物或疏水材料一起配制，所述聚合物或疏水材料为化合物提供缓释特性。这样，用于所公开的方法中的化合物可以以微粒的形式例如通过注射施用，或者以圆片或圆盘的形式通过植入施用。在某些实施方案中，使用缓释制剂将化合物单独或与另一种药物组合施用给患者。

术语延迟释放在本文中以其常规含义使用，用来指一种药物制剂，其在药物施用后一定延迟后提供药物的初始释放，并且可以(尽管不一定)包括约10分钟长达约12小时的延迟。术语脉冲释放在本文中以其常规含义使用，用来指一种药物制剂，其以一定方式提供药物的释放从而在药物施用后产生药物的脉冲血浆分布(profile)。术语立即释放以其常规含义使用，用于指药物制剂，其在药物施用后立即提供药物的释放。

如本文所用，短期是指药物施用后长达并且包括约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约40分钟、约20分钟或约10分钟及其任何和所有全部或部分增量的任何时间段。

如本文所用，快速失效是指药物施用后长达并且包括约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约40分钟、约20分钟或约10分钟及其任何和所有全部或部分增量的任何时间段。

本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的具体过程、实施方案、权利要求和实施例的许多等同方案。这样的等同方案被认为在本公开的范围内，并由所附的权利要求书涵盖。例如，应该理解的是，具有本领域公认的替代方案并且仅使用常规实验进行的反应条件或施用方案的改变在本申请的范围内。

应当理解，无论在何处提供数值和范围，这些数值和范围所涵盖的所有数值和范围都意在涵盖在本公开的范围内。此外，本申请还考虑落入这些范围内的所有值以及值的范围的上限或下限。

以下实施例进一步说明了所公开主题的各方面。但是，它们绝不是对本文所公开内容的限制。

实施例

方法和材料：

如先前所描述的(Rodrigues,等人,2011,J.Periodontol.82:1757-1766,2011)，并且在图5中示出，使用小鼠模型，在一侧(左或右下颌骨象限)，在下颌骨的下边界做一个0.5cm的浅表皮切口(口外)，分离浅筋膜和肌肉以使下面的牙槽骨可视化。在第一下颌磨牙的远端根部的颊侧产生牙周开窗缺口(宽度约2mm，长度约1mm，深度约0.5mm)。用四分之一圆钻和高速机头在盐水冲洗下去除浅表骨。在慢速牙科机头中使用牙科凿子和钻针将第一下颌磨牙的远端根部的牙周膜、牙骨质和浅表牙本质剥除。将ENPP1抑制剂和合适的载体递送到该部位，并缝合外部切口。为了监测随时间的牙骨质生成，使用荧光探针并在指定时间注射，如Rodrigues,等人,2011,J.Periodontol.82:1757-1766,2011所述，并在指定时间处理组织。

人ENPP1氨基酸序列(NCBI登录号NP_006199)为SEQ ID NO：1。

实施例1：

体外筛选：

在公认的成骨细胞细胞系(OCCM细胞)中评估ENPP1抑制剂。先前已经描述了OCCM.30鼠成牙骨质细胞的分离和鉴定(D’Errico,等人,2000,J.Periodontol.71(1):63-72；Berry,等人,2003,Connect Tissue Res.44:Suppl.1:97-102)。细胞在含有10％v/v胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中生长(所有试剂来自Invitrogen，Carlsbad，CA)。对于基因表达和矿化实验，如上所述，将OCCM.30细胞铺板于标准培养基中，24小时后将培养基更换为含1％FBS和50μg/ml抗坏血酸(AA)的DMEM。在实验的剩余时间中，每48小时更换一次培养基。包含有机P_i源β-甘油磷酸盐(βGP；5mM或10mM)或3.3mM Pi)用于创造矿化条件。加入ENPP1抑制剂以测定对细胞功能的影响。βGP购自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)，Pi溶液由磷酸二氢钠一水合物(NaH2PO4-H2O)和磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H20)制成，它们也购自Sigma-Aldrich。一式三份进行至少三次细胞培养实验。

按照制造商的指示(CellTiter

AQ_ueous增殖测定，Promega，Madison，WI)，使用非放射性的基于MTS的测定来测量细胞增殖。在570nm处测量吸光度，在750nm处读取参考值。吸光度与培养中活细胞的数量成正比。

使用由以前的报告(Tullberg-Reinert&Jundt,1999,Histochem.Cell Biol.112(4):271-276；Addison&McKee,2010,Bone 46(4):1100-1107)修改的方法，通过picrosirius红染色定量体外细胞胶原蛋白产生。简言之，将细胞用PBS冲洗，并在室温下在Bouin溶液中固定1小时。去除固定剂，将平板在水中冲洗几次，以去除多余的Bouin溶液。通过在温和振荡下与picrosirius红色染料((Direct Red80，Polysciences，Inc.，Warrington，PA)一起孵育，将板中的胶原蛋白基质染色。通过用0.01N HCl冲洗几次除去未结合的染料。通过与0.1N NaOH孵育并振荡至少1hr，除去结合的染料。通过读取550nm处的吸光度来定量picrosirius红。相对于标准曲线来校准胶原蛋白的数量，标准曲线通过铺板并洗脱已知浓度的大鼠尾部胶原蛋白而产生。

使用标准程序进行Von Kossa染色以形成矿结节(Lillie,1965,HistopathologicTechnique and Practical Histochemistry,McGraw-Hill(Blakiston Division)pp.172-177)。银染色显示为黑色，染色强度指示细胞基质中磷酸钙沉淀的量(银离子与磷酸盐反应)。使用由以前的报告(Addison&McKee,2010,Bone 46(4):1100-1107)修改的方法，通过测量钙沉积物来定量测定体外细胞矿化作用。向细胞培养孔中加入500μl 0.5N HCl，并将板振荡60min以溶解磷酸钙沉淀。使用钙测定法(Genzyme Diagnostics，Farmingham，MA)测量洗脱的钙。将1μl样品添加到99μl Arsenazo试剂中，并在650nm处读取吸光度。使用钙储备溶液制备标准曲线。

使用了用于测量体外碱性磷酸酶活性(ALP)的修改的测定法(Osanthanon,等人,2009,Biomaterials 30(27):4513-21)。简言之，将细胞培养物用PBS冲洗，并在黑暗中在室温下与200μl对硝基苯基磷酸酯(PNPP，Sigma)孵育30min。孵育后，将每种条件下的10μL上清液转移至96孔板中，每孔含90μL的3N NaOH(终止溶液)。在405nm的波长处记录吸光度。

根据以前描述的程序(Rosenthal,等人,1991,Arthr&Rheumatol.34(7):904-911)，使用酶促测定法来测定产生焦磷酸盐的外酶的活性(核苷三磷酸焦磷酸水解酶，NTPPPHase活性)。将细胞用PBS冲洗，并在37℃且无CO₂的条件下，与2.0ml的1mM胸苷5'-单磷酸对硝基苯酯钠(TMPNP)溶液一起孵育2小时。孵育后，将每种条件的20μL上清液转移至96孔板，每孔含80μL的0.1N NaOH(终止溶液)。在410nm的波长处记录吸光度。

RNA分离和实时定量RT-PCR

如先前所述进行RNA的分离、cDNA的合成以及实时定量PCR的性能(Foster,等人,2011,Cells Tissues Organs 194(5):382-405)。使用RNeasy Micro试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从细胞中分离总RNA，由1.0μg RNA合成cDNA(Transcriptor试剂盒，RocheApplied Science)。使用跨内含子引物(www dot gene-expression-analysis dot com)，在Roche Lightcycler 480系统(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)上用DNAMaster SYBR Green I试剂盒(Roche Applied Science)进行PCR反应。使用3-磷酸甘油醛脱氢酶(Gapdh)作为管家/参考基因，用于靶基因标准化和扩增效率校正情况下的相对定量。表3中列出了所用的引物序列。通过扩增后的解链曲线分析进行PCR产物的鉴定。为了检测组内和组间基因表达差异，我们采用了单因素ANOVA和事后Tukey测试，使用PASW(SPSS)Statistics 19软件。

表3.实时定量PCR引物序列

实施例2.mENPP1-Fc对ENPP1^asj/asj小鼠牙骨质的体内作用

ENPP1^asj/asj小鼠，是一种小鼠ENPP1功能丧失(LOF)模型，对于Enpp1基因的错义突变是纯合的，在ENPP1蛋白中产生V246D突变，导致缺乏ENPP1酶促活性，因此与具有野生型(WT)ENPP1的相同遗传背景的小鼠相比焦磷酸盐水平降低。

小鼠ENPP1-Fc(mENPP1-Fc)是小鼠ENPP1的胞外结构域与小鼠IgG1的Fc区的融合蛋白。将小鼠ENPP1-Fc配制在溶媒中，使得递送的溶媒的体积为每克体重16ml溶媒。用不含内毒素的水将由10X PBS浓缩物组成的溶媒(AmericanBio有限公司，库存号AB11072)稀释至1X并补充14mM CaCl₂和14mM ZnCl₂。

给野生型(WT)ENPP1或ENPP1^asj/asj小鼠施用溶媒或配制在溶媒中的mENPP1-Fc。在生命的第14天开始对小鼠进行每日皮下注射，剂量水平为500a.u.kg^-1mENPP1-Fc。

根据所递送的酶的总活性而不是酶的浓度给动物给药，以解释所使用的酶批次之间活性的变化。一个活性单位(1a.u.)定义为pNP-TMP底物水解的min^-1mg^-1酶的pM。活性测定在由50mM Tris pH9、150mM NaCl、0.1mM ZnCl₂、0.1mM CaCl₂、0.1mM MgCl₂组成的缓冲液中进行。可接受的蛋白质制剂的活性在40至43a.u.mg^-1之间变化，丢弃<40a.u.mg^-1的制剂。500a.u.kg^-1的剂量对应于6至10mg kg^-1，取决于蛋白质制剂的比活性。

图3A示出了一般而言根据Albright,等人,2015,Nature Comm.10006中描述的程序，对将小鼠ENPP1-Fc施用给Enpp1^asj小鼠的响应的代表性图像。在出生后35-37天处死动物。将下颌骨解剖、固定并处理，以进行组织学或microCT分析。使用标准的苏木精和曙红染色来观察牙周复合体。以2微米体素分辨率扫描下颌第一磨牙，以区分无细胞牙骨质和牙本质。量化无细胞牙骨质的体积(每组n＝3-5)，并使用单因素ANOVA(GraphPad Prism)测试统计学显著性。图3A的第一列显示在施用溶媒之前(上图)和之后(下图)来自具有野生型(WT)ENPP1的小鼠的组织学图像。图3的第二列和第三列是在施用溶媒(第二列)或mENPP1-Fc(第三列)之前(上图)和之后(下图)来自ENPP1^asj/asj小鼠(“ENPP1”)的图像。与具有野生型ENPP1(WT”)的小鼠相比，用mENPP1-Fc治疗之前ENPP1^asj/asj小鼠的牙骨质(AC)增加。图3B显示了无细胞牙骨质的microCT定量，验证了ENPP1-Fc的施用减少了ENPP1^asj/asj小鼠中牙骨质的形成。向Enpp1^asj小鼠施用mENPP1-Fc会引入ENPP1酶促活性并减少牙骨质形成，从而提供体内证据表明，ENPP1的全身递送和由此产生的PPi水平的增加能够有效地减少局部牙根部位的牙骨质形成。

通过以下非限制性的方面进一步说明本公开。

方面1A：一种治疗或预防受试者的牙周疾病的方法，所述方法包括向受试者施用外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶-1(ENPP1)的抑制剂。

方面1B：一种药物组合物，其包含外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶-I(ENPP1)抑制剂，其被配制用于治疗或预防牙周疾病或用于增加牙骨质形成。

方面1C：一种用于治疗或预防牙周疾病或用于增加牙骨质形成的外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶-I(ENPP1)抑制剂。

方面2：方面1A-1C中任一项的方法、组合物或ENPP1抑制剂，其中所述ENPP1抑制剂包括小分子抑制剂或其类似物、衍生物、前药、溶剂化物或盐。

方面3：前述方面中任一项的方法、组合物或ENPP1抑制剂，其中所述ENPP1抑制剂包含ATP或2’,3’-cGAMP的不可水解的类似物或衍生物，或其前药、溶剂化物或盐。

方面4：方面3的方法、组合物或ENPP1抑制剂，其中ATP的不可水解的类似物或衍生物是选自表1或表2的至少一种化合物。

方面5：方面3的方法、组合物或ENPP1抑制剂，其中2’,3’-cGAMP的不可水解的类似物或衍生物是2’,3’-cGAM(PS)₂(Rp/Sp)；3'-腺苷酸P-硫代鸟苷酰-(2’→5’)-环状核苷酸；2'-鸟苷酸P-硫代腺苷酰-(3’→5’)-环状(2’→5’)-核苷酸；2'-鸟苷酸腺苷酰-(3’→5’)-3'-脱氧-环状2’→5’-核苷酸；2'-鸟苷酸腺苷酰-(3’→5')-环状核苷酸；3'-鸟苷酸腺苷酰-(3’→5’)-环状核苷酸；或其组合。

方面6：前述方面中任一项的方法、组合物或ENPP1抑制剂，其中所述ENPP1抑制剂被吸附或结合至纳米颗粒、纳米纤维、缝合材料、微球体、聚合物、纤维、基质、凝胶或其组合。

方面7：前述方面中任一项的方法、组合物或ENPP1抑制剂，其中所述ENPP1抑制剂被配制成药物组合物。

方面8：前述方面中任一项的方法、组合物或ENPP1抑制剂，其中所述药物组合物还包含至少一种药学上可接受的载体。

方面9：前述方面中任一项的方法、组合物或ENPP1抑制剂，其中所述ENPP1抑制剂被配制用于在牙龈组织中注射、在外科皮瓣处局部递送、颊部递送、通过可吸收的缝合线递送、通过伤口愈合敷料递送或上述的组合。

方面10：前述方面中任一项的方法、组合物或ENPP1抑制剂，其中所述ENPP1抑制剂被急性或慢性地施用于所述受试者。

方面11：前述方面中任一项的方法、组合物或ENPP1抑制剂，其中所述受试者是哺乳动物。

方面12：方面11的方法、组合物或ENPP1抑制剂，其中所述哺乳动物是人。

方面13：前述方面中任一项的方法、组合物或ENPP1抑制剂，其中治疗或预防牙周疾病包括增加受试者的牙骨质形成。

方面14：前述方面中任一项的方法、组合物或ENPP1抑制剂，其包括预防具有导致牙骨质形成缺乏或极少的遗传状况的受试者的牙周疾病。

方面15：前述方面中任一项的方法、组合物或ENPP1抑制剂，其包括治疗受试者的牙周疾病。

方面16：前述方面中任一项的方法、组合物或ENPP1抑制剂，其中所述ENPP1抑制剂以治疗有效量存在或施用。

通常，本文所述的组合物和方法可以可替代地包含本文公开的任何组分或步骤、由其组成或基本上由其组成。组成和方法可以另外地或替代地被制造或执行，以使得没有或基本上没有对于实现本权利要求的功能或目的而言不必要的任何成分、步骤或组分。

除非另有定义，否则本文所使用的技术和科学术语具有与本公开所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。

本文引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容通过引用整体并入本文。但是，如果本申请中的术语与并入的参考文献中的术语矛盾或冲突，则本申请中的术语优先于并入的参考文献中的冲突术语。

尽管已经参考特定实施方式描述了所公开的主题，但是显然，本领域的其他技术人员可以设计其他实施方式和变型而不脱离所公开主题的真实精神和范围。同样可以结合本领域已知的其他特征。此外，尽管可以在本文而不是在其他实施方式中讨论所公开的主题的一些实施方式的各个特征，但是应当清楚的是，一些实施方式的各个特征可以与另一实施方式的一个或多个特征或者多个实施方式的特征组合。所附权利要求旨在被解释为包括所有这样的实施方式和等同变形。

序列表

<110> 耶鲁大学

由卫生与公众服务部部长代表的美利坚合众国

Braddock, Demetrios

Somerman, Martha

<120> 用于治疗和/或预防牙周疾病的化合物、组合物和方法

<130> NIH0137PCT

<150> US62590824

<151> 2017-11-27

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 925

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Met Glu Arg Asp Gly Cys Ala Gly Gly Gly Ser Arg Gly Gly Glu Gly

1 5 10 15

Gly Arg Ala Pro Arg Glu Gly Pro Ala Gly Asn Gly Arg Asp Arg Gly

20 25 30

Arg Ser His Ala Ala Glu Ala Pro Gly Asp Pro Gln Ala Ala Ala Ser

35 40 45

Leu Leu Ala Pro Met Asp Val Gly Glu Glu Pro Leu Glu Lys Ala Ala

50 55 60

Arg Ala Arg Thr Ala Lys Asp Pro Asn Thr Tyr Lys Val Leu Ser Leu

65 70 75 80

Val Leu Ser Val Cys Val Leu Thr Thr Ile Leu Gly Cys Ile Phe Gly

85 90 95

Leu Lys Pro Ser Cys Ala Lys Glu Val Lys Ser Cys Lys Gly Arg Cys

100 105 110

Phe Glu Arg Thr Phe Gly Asn Cys Arg Cys Asp Ala Ala Cys Val Glu

115 120 125

Leu Gly Asn Cys Cys Leu Asp Tyr Gln Glu Thr Cys Ile Glu Pro Glu

130 135 140

His Ile Trp Thr Cys Asn Lys Phe Arg Cys Gly Glu Lys Arg Leu Thr

145 150 155 160

Arg Ser Leu Cys Ala Cys Ser Asp Asp Cys Lys Asp Lys Gly Asp Cys

165 170 175

Cys Ile Asn Tyr Ser Ser Val Cys Gln Gly Glu Lys Ser Trp Val Glu

180 185 190

Glu Pro Cys Glu Ser Ile Asn Glu Pro Gln Cys Pro Ala Gly Phe Glu

195 200 205

Thr Pro Pro Thr Leu Leu Phe Ser Leu Asp Gly Phe Arg Ala Glu Tyr

210 215 220

Leu His Thr Trp Gly Gly Leu Leu Pro Val Ile Ser Lys Leu Lys Lys

225 230 235 240

Cys Gly Thr Tyr Thr Lys Asn Met Arg Pro Val Tyr Pro Thr Lys Thr

245 250 255

Phe Pro Asn His Tyr Ser Ile Val Thr Gly Leu Tyr Pro Glu Ser His

260 265 270

Gly Ile Ile Asp Asn Lys Met Tyr Asp Pro Lys Met Asn Ala Ser Phe

275 280 285

Ser Leu Lys Ser Lys Glu Lys Phe Asn Pro Glu Trp Tyr Lys Gly Glu

290 295 300

Pro Ile Trp Val Thr Ala Lys Tyr Gln Gly Leu Lys Ser Gly Thr Phe

305 310 315 320

Phe Trp Pro Gly Ser Asp Val Glu Ile Asn Gly Ile Phe Pro Asp Ile

325 330 335

Tyr Lys Met Tyr Asn Gly Ser Val Pro Phe Glu Glu Arg Ile Leu Ala

340 345 350

Val Leu Gln Trp Leu Gln Leu Pro Lys Asp Glu Arg Pro His Phe Tyr

355 360 365

Thr Leu Tyr Leu Glu Glu Pro Asp Ser Ser Gly His Ser Tyr Gly Pro

370 375 380

Val Ser Ser Glu Val Ile Lys Ala Leu Gln Arg Val Asp Gly Met Val

385 390 395 400

Gly Met Leu Met Asp Gly Leu Lys Glu Leu Asn Leu His Arg Cys Leu

405 410 415

Asn Leu Ile Leu Ile Ser Asp His Gly Met Glu Gln Gly Ser Cys Lys

420 425 430

Lys Tyr Ile Tyr Leu Asn Lys Tyr Leu Gly Asp Val Lys Asn Ile Lys

435 440 445

Val Ile Tyr Gly Pro Ala Ala Arg Leu Arg Pro Ser Asp Val Pro Asp

450 455 460

Lys Tyr Tyr Ser Phe Asn Tyr Glu Gly Ile Ala Arg Asn Leu Ser Cys

465 470 475 480

Arg Glu Pro Asn Gln His Phe Lys Pro Tyr Leu Lys His Phe Leu Pro

485 490 495

Lys Arg Leu His Phe Ala Lys Ser Asp Arg Ile Glu Pro Leu Thr Phe

500 505 510

Tyr Leu Asp Pro Gln Trp Gln Leu Ala Leu Asn Pro Ser Glu Arg Lys

515 520 525

Tyr Cys Gly Ser Gly Phe His Gly Ser Asp Asn Val Phe Ser Asn Met

530 535 540

Gln Ala Leu Phe Val Gly Tyr Gly Pro Gly Phe Lys His Gly Ile Glu

545 550 555 560

Ala Asp Thr Phe Glu Asn Ile Glu Val Tyr Asn Leu Met Cys Asp Leu

565 570 575

Leu Asn Leu Thr Pro Ala Pro Asn Asn Gly Thr His Gly Ser Leu Asn

580 585 590

His Leu Leu Lys Asn Pro Val Tyr Thr Pro Lys His Pro Lys Glu Val

595 600 605

His Pro Leu Val Gln Cys Pro Phe Thr Arg Asn Pro Arg Asp Asn Leu

610 615 620

Gly Cys Ser Cys Asn Pro Ser Ile Leu Pro Ile Glu Asp Phe Gln Thr

625 630 635 640

Gln Phe Asn Leu Thr Val Ala Glu Glu Lys Ile Ile Lys His Glu Thr

645 650 655

Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Arg Val Leu Gln Lys Glu Asn Thr Ile Cys

660 665 670

Leu Leu Ser Gln His Gln Phe Met Ser Gly Tyr Ser Gln Asp Ile Leu

675 680 685

Met Pro Leu Trp Thr Ser Tyr Thr Val Asp Arg Asn Asp Ser Phe Ser

690 695 700

Thr Glu Asp Phe Ser Asn Cys Leu Tyr Gln Asp Phe Arg Ile Pro Leu

705 710 715 720

Ser Pro Val His Lys Cys Ser Phe Tyr Lys Asn Asn Thr Lys Val Ser

725 730 735

Tyr Gly Phe Leu Ser Pro Pro Gln Leu Asn Lys Asn Ser Ser Gly Ile

740 745 750

Tyr Ser Glu Ala Leu Leu Thr Thr Asn Ile Val Pro Met Tyr Gln Ser

755 760 765

Phe Gln Val Ile Trp Arg Tyr Phe His Asp Thr Leu Leu Arg Lys Tyr

770 775 780

Ala Glu Glu Arg Asn Gly Val Asn Val Val Ser Gly Pro Val Phe Asp

785 790 795 800

Phe Asp Tyr Asp Gly Arg Cys Asp Ser Leu Glu Asn Leu Arg Gln Lys

805 810 815

Arg Arg Val Ile Arg Asn Gln Glu Ile Leu Ile Pro Thr His Phe Phe

820 825 830

Ile Val Leu Thr Ser Cys Lys Asp Thr Ser Gln Thr Pro Leu His Cys

835 840 845

Glu Asn Leu Asp Thr Leu Ala Phe Ile Leu Pro His Arg Thr Asp Asn

850 855 860

Ser Glu Ser Cys Val His Gly Lys His Asp Ser Ser Trp Val Glu Glu

865 870 875 880

Leu Leu Met Leu His Arg Ala Arg Ile Thr Asp Val Glu His Ile Thr

885 890 895

Gly Leu Ser Phe Tyr Gln Gln Arg Lys Glu Pro Val Ser Asp Ile Leu

900 905 910

Lys Leu Lys Thr His Leu Pro Thr Phe Ser Gln Glu Asp

915 920 925

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 2

ggggacatgc agtatgagtt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物

<400> 3

ggcctggtag ttgttgtgag 20

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 4

gaatcagtcg gcccat 16

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

gttcgccagt ttattgct 18

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

gagacggcga tagttcc 17

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

agtgccgcta actcaa 16

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

caccccagcc gcaaagagt 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

cgggcagaaa gcacagcact 20

<210> 10

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

gcgcggataa ggatga 16

<210> 11

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

gtccccgtgg ctactc 16

<210> 12

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

cgccaccgag actaaa 16

<210> 13

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

tcatagcgtc cgtcat 16

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

accacagtcc atgccatcac 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

tccaccaccc tgttgctgta 20

<210> 16

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

tttacagcct gcaccc 16

<210> 17

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

ctagcagtga cggtct 16

Claims

1.一种治疗或预防受试者的牙周疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶-1(ENPP1)的抑制剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述ENPP1抑制剂包括小分子抑制剂或其类似物、衍生物、前药、溶剂化物或盐。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述ENPP1抑制剂包括ATP或2’,3’-cGAMP的不可水解的类似物或衍生物，或其前药、溶剂化物或盐。

4.根据权利要求3所述的方法，其中ATP的不可水解的类似物或衍生物是选自表1或表2的至少一种化合物。

5.根据权利要求3所述的方法，其中2’,3’-cGAMP的不可水解的类似物或衍生物是2’,3’-cGAM(PS)₂(Rp/Sp)；3'-腺苷酸P-硫代鸟苷酰-(2’→5’)-环状核苷酸；2'-鸟苷酸P-硫代腺苷酰-(3’→5’)-环状(2’→5’)-核苷酸；2'-鸟苷酸腺苷酰-(3’→5’)-3'-脱氧-环状2’→5’-核苷酸；2'-鸟苷酸腺苷酰-(3’→5')-环状核苷酸；3'-鸟苷酸腺苷酰-(3’→5’)-环状核苷酸；或其组合。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述ENPP1抑制剂被吸附或结合至纳米颗粒、纳米纤维、缝合材料、微球体、聚合物、纤维、基质、凝胶或其组合。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述ENPP1抑制剂被配制成药物组合物。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述药物组合物还包含至少一种药学上可接受的载体。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述ENPP1抑制剂被配制用于在牙龈组织中注射、在外科皮瓣处局部递送、颊部递送、通过可吸收的缝合线递送、通过伤口愈合敷料递送或前述的组合。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述ENPP1抑制剂被急性或慢性地施用给所述受试者。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中治疗或预防牙周疾病包括增加受试者的牙骨质形成。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其包括预防具有导致牙骨质形成缺乏或极少的遗传状况的受试者的牙周疾病。

15.一种药物组合物，其包含用于治疗或预防牙周疾病或用于增加牙骨质形成的外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶-I(ENPP1)抑制剂。

16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述组合物被配制用于在牙龈组织中注射、在外科皮瓣处局部递送、颊部递送、通过可吸收的缝合线递送、通过伤口愈合敷料递送或前述的组合。

17.根据权利要求15或16所述的药物组合物，其中所述ENPP1抑制剂以治疗有效量存在。

18.一种用于治疗或预防牙周疾病或用于增加牙骨质形成的外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶-1(ENPP1)抑制剂。

19.根据权利要求18所述的ENPP1抑制剂，其被配制成药物组合物。

20.根据权利要求18或19所述的ENPP1抑制剂，其包含小分子抑制剂或其类似物、衍生物、前药、溶剂化物或盐。

21.根据权利要求18至20中任一项的ENPP1抑制剂，其包含ATP或2’,3’-cGAMP的不可水解的类似物或衍生物，或其前药、溶剂化物或盐，优选地，ATP的不可水解的类似物或衍生物是选自表1或表2的至少一种化合物，或者2’,3’-cGAMP的不可水解的类似物或衍生物是2’,3’-cGAM(PS)2(Rp/Sp)；3'-腺苷酸P-硫代鸟苷酰-(2’→5’)-环状核苷酸；2'-鸟苷酸P-硫代腺苷酰-(3’→5’)-环状(2’→5’)-核苷酸；2'-鸟苷酸腺苷酰-(3’→5’)-3'-脱氧-环状2’→5’-核苷酸；2'-鸟苷酸腺苷酰-(3’→5')-环状核苷酸；3'-鸟苷酸腺苷酰-(3’→5’)-环状核苷酸；或其组合。