CN111808907A - 调整觉醒的物质及方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种用于选择用于调整觉醒的药剂的方法，所述方法包括测定所述候选药剂对nAChRα3的活性和/或表达的影响。所述药剂可用于治疗、预防觉醒功能异常或延迟觉醒功能异常的进展。此外，本申请提供用于确定受试者患有觉醒功能异常，和/或处于患有觉醒功能异常的风险下的可能性的方法。本申请也提供一种非人生物体或其活体部分。

Description

调整觉醒的物质及方法
发明背景
睡眠与觉醒两者在从昆虫、鱼类到哺乳动物的范围内的动物中均是重要的。控制睡眠和觉醒的分子机理和神经回路正受到活跃研究。从睡眠向醒来的转换可为内源性的(昼夜节律促进醒来)或外源性的(由刺激诱导)，先前研究已表明这两种形式的觉醒以差异性方式受调控。
尽管胆碱能神经元长久以来已被认为是哺乳动物与蝇两者中的关键睡眠调控调节物，但胆碱能神经元在睡眠和觉醒中的特定功能仍有争议，并且关于AChR在睡眠调控中的作用所知甚少。在哺乳动物与蝇两者中，ACh在能够促进睡眠与觉醒两者方面是矛盾的。尽管长久以来已知ACh在睡眠和觉醒调控中起重要作用，但胆碱能信号传导的分子基础仍然难以捉摸，并且关于AChR在睡眠和觉醒调控中的作用所知甚少。
发明概述
本申请提供一种用于选择用于调整觉醒的药剂的方法，所述方法包括：提供候选药剂；测定所述候选药剂对nAChRα3的活性和/或表达的影响；并且如果所述nAChRα3的所述活性和/或表达由所述候选药剂改变，那么将所述候选药剂选为用于调整觉醒的药剂。药剂可用于治疗、预防觉醒功能异常或延迟觉醒功能异常的进展。此外，本申请提供用于确定受试者患有觉醒功能异常，和/或处于患有觉醒功能异常的风险下的可能性的方法，所述方法包括：评估所述受试者中nAChRα3的活性和/或表达。本申请也提供一种非人生物体或其活体部分。
在一个方面，本申请提供一种用于选择用于调整觉醒的药剂的方法，所述方法包括：提供候选药剂；测定所述候选药剂对nAChRα3的活性和/或表达的影响；并且如果所述nAChRα3的所述活性和/或表达由所述候选药剂改变，那么将所述候选药剂选为用于调整觉醒的药剂。
在一些实施方案中，如果所述nAChRα3的活性和/或表达由所述候选药剂增加，那么将所述候选药剂选为用于促进觉醒的药剂。
在一些实施方案中，如果所述nAChRα3的活性和/或表达由所述候选药剂降低，那么将所述候选药剂选为用于减少觉醒的药剂。
在一些实施方案中，所述nAChRα3是黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)nAChRα3或其直系同源物。
在一些实施方案中，所述测定包括：测定所述候选药剂对多巴胺能细胞中所述nAChRα3的活性和/或表达的影响。
在一些实施方案中，所述多巴胺能细胞包括多巴胺能神经元细胞。
在一些实施方案中，所述nAChRα3的所述活性包括以下中的一者或多者：使多巴胺的活性、释放和/或数量增加的能力；以及使多巴胺信号传导活化的能力。
在一些实施方案中，方法是体外方法或离体方法。
在一些实施方案中，所述觉醒包括外源性觉醒。
在一些实施方案中，所述药剂不实质上影响移动、昼夜节律或睡眠。
在一些实施方案中，所述睡眠包括夜间睡眠。
在一些实施方案中，所述药剂包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。
在一些实施方案中，所述药剂直接作用于nAChRα3编码蛋白和/或编码nAChRα3编码蛋白的核酸分子。
在另一方面，本申请提供一种用于选择用于调整觉醒的药剂的系统，其中所述系统包含能够测定所述药剂对nAChRα3的活性和/或表达的影响的物质。
在一些实施方案中，所述物质能够测定所述药剂对编码所述nAChRα3的核酸分子的活性和/或表达的影响。
在一些实施方案中，能够测定所述药剂对编码所述nAChRα3的核酸分子的活性和/或表达的影响的所述物质包括：能够特异性扩增nAChRα3的引物，和/或能够特异性识别nAChRα3的探针。
在一些实施方案中，所述物质能够测定所述药剂对nAChRα3编码蛋白的活性和/或表达的影响。
在一些实施方案中，能够测定所述药剂对nAChRα3编码蛋白的活性和/或表达的影响的所述物质包括：能够特异性识别nAChRα3编码蛋白的试剂和/或能够测定nAChRα3编码蛋白的活性的试剂。
在另一方面，本申请提供一种用于治疗、预防觉醒功能异常和/或延迟觉醒功能异常的进展的方法，所述方法包括：向有需要的受试者施用治疗有效量的能够改变所述受试者中nAChRα3的活性和/或表达的药剂。
在一些实施方案中，所述觉醒功能异常与觉醒障碍和夜惊相关，并且所述药剂能够使所述受试者中nAChRα3的活性和/或表达降低。
在一些实施方案中，所述药剂包括编码nAChRα3的核酸分子或其表达产物。
在一些实施方案中，所述药剂包括如以SEQ ID No.1-10中的任一者阐述的编码nAChRα3的核酸分子。
在一些实施方案中，所述觉醒功能异常与维持睡眠的障碍相关，并且所述药剂能够使所述受试者中nAChRα3的活性和/或表达增加。
在一些实施方案中，所述药剂是用于促进觉醒的药剂，因为所述nAChRα3的活性和/或表达由所述药剂增加。
在一些实施方案中，所述药剂是用于减少觉醒的药剂，因为所述nAChRα3的活性和/或表达由所述药剂降低。
在一些实施方案中，所述nAChRα3是黑腹果蝇nAChRα3或其直系同源物。
在一些实施方案中，对所述nAChRα3的活性和/或表达的所述改变是在多巴胺能细胞中。
在一些实施方案中，所述多巴胺能细胞包括多巴胺能神经元细胞。
在一些实施方案中，所述nAChRα3的所述活性包括以下中的一者或多者：使多巴胺的活性、释放和/或数量增加的能力；使多巴胺能信号传导活化的能力。
在一些实施方案中，方法是体外方法、体内方法或离体方法。
在一些实施方案中，所述药剂包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。
在一些实施方案中，所述药剂直接作用于nAChRα3编码蛋白，和/或编码所述nAChRα3的核酸分子。
在另一方面，本申请提供能够改变nAChRα3的活性和/或表达的药剂在制造用于治疗、预防觉醒功能异常或延迟觉醒功能异常的进展的药物中的用途。
在一些实施方案中，所述试剂能够测定所述药剂对编码所述nAChRα3的核酸分子的活性和/或表达的影响。
在一些实施方案中，能够测定所述药剂对编码所述nAChRα3的核酸分子的活性和/或表达的影响的所述试剂包括：能够特异性扩增nAChRα3的引物，和/或能够特异性识别nAChRα3的探针。
在一些实施方案中，所述试剂能够测定所述药剂对所述nAChRα3编码蛋白的活性和/或表达的影响。
在一些实施方案中，测定所述药剂对nAChRα3编码蛋白的活性和/或表达的影响的所述物质试剂包括：能够特异性识别nAChRα3编码蛋白的试剂和/或能够测定nAChRα3编码蛋白的活性的试剂。
在另一方面，本申请提供一种能够改变nAChRα3编码蛋白的活性和/或表达的药剂，所述药剂用于治疗、预防觉醒功能异常或延迟觉醒功能异常的进展。
在另一方面，本申请提供一种用于确定受试者患有觉醒功能异常，和/或处于患有觉醒功能异常的风险下的可能性的方法，所述方法包括：评估所述受试者中nAChRα3的活性和/或表达。
在一些实施方案中，nAChRα3的所述活性和/或表达包括编码所述nAChRα3的核酸分子的活性和/或表达，和/或所述nAChRα3编码蛋白的活性和/或表达。
在一些实施方案中，能够测定所述药剂对编码所述nAChRα3的核酸分子的活性和/或表达的影响的物质包括：能够特异性扩增nAChRα3的引物，和/或能够特异性识别nAChRα3的探针。
在一些实施方案中，能够测定所述药剂对所述nAChRα3编码蛋白的活性和/或表达的影响的物质包括：能够特异性识别nAChRα3编码蛋白的试剂和/或能够测定nAChRα3编码蛋白的活性的试剂。
在一些实施方案中，所述觉醒功能异常包括觉醒障碍、夜惊和/或维持睡眠的障碍。
在另一方面，本申请提供一种用于确定受试者患有觉醒功能异常，和/或处于患有觉醒功能异常的风险下的可能性的系统，所述系统包含：能够指示所述受试者中nAChRα3的活性和/或表达水平的试剂。
在一些实施方案中，nAChRα3的所述活性和/或表达包括编码所述nAChRα3的核酸分子的活性和/或表达，和/或所述nAChRα3编码蛋白的活性和/或表达。
在一些实施方案中，能够测定所述药剂对编码所述nAChRα3的核酸分子的活性和/或表达的影响的物质包括：能够特异性扩增nAChRα3的引物，和/或能够特异性识别nAChRα3的探针。
在一些实施方案中，能够测定所述药剂对所述nAChRα3编码蛋白的活性和/或表达的影响的物质包括：能够特异性识别nAChRα3编码蛋白的试剂和/或能够测定nAChRα3编码蛋白的活性的试剂。
在一些实施方案中，所述觉醒功能异常包括觉醒障碍、夜惊和/或维持睡眠的障碍。
在另一方面，本申请提供能够指示受试者的nAChRα3的活性和/或表达水平的试剂制造关于所述受试者患有觉醒功能异常，和/或处于患有觉醒功能异常的风险下的可能性的指示剂的用途。
在一些实施方案中，nAChRα3的所述活性和/或表达包括编码所述nAChRα3的核酸分子的活性和/或表达，和/或所述nAChRα3编码蛋白的活性和/或表达。
在一些实施方案中，能够测定所述药剂对编码所述nAChRα3的核酸分子的活性和/或表达的影响的试剂包括：能够特异性扩增nAChRα3的引物，和/或能够特异性识别nAChRα3的探针。
在一些实施方案中，能够测定所述药剂对所述nAChRα3编码蛋白的活性和/或表达的影响的试剂包括：能够特异性识别nAChRα3编码蛋白的试剂和/或能够测定nAChRα3编码蛋白的活性的试剂。
在一些实施方案中，所述觉醒功能异常包括觉醒障碍(disorder of arousal)、夜惊(night terror)和/或维持睡眠的障碍(disorder of maintaining sleep)。
在另一方面，本申请提供一种包含功能受损的nAChRα3的非人生物体或其活体部分。
在另一方面，本申请提供非人生物体或其活体部分，其中所述非人生物体是黑腹果蝇。
在一些实施方案中，非人生物体或其活体部分不包含任何功能性nAChRα3。
在一些实施方案中，非人生物体或其活体部分就功能受损的nAChRα3来说是纯合的。
在一些实施方案中，相较于相应野生型非人生物体，所述非人生物体具有降低的觉醒率。
在一些实施方案中，所述生物体中的nAChRα3基因被敲低或剔除。
在一些实施方案中，所述生物体中的nAChRα3基因通过RNAi来敲低。
在一些实施方案中，所述生物体中的nAChRα3基因通过α3KIGal4来敲低。
在一些实施方案中，所述生物体中nAChRα3蛋白的94号氨基酸到335号氨基酸被删除，并且所述nAChRα3蛋白包含如以SEQ ID NO:11阐述的氨基酸序列。
在另一方面，本申请提供一种源于非人生物体或其活体部分的细胞、细胞系或原代细胞培养物。
在另一方面，本申请提供一种源于非人生物体或其活体部分的组织。
在一些实施方案中，组织源于神经组织。
在一些实施方案中，组织源于包含多巴胺能细胞的神经组织。
在另一方面，本申请提供一种筛选适用于治疗、预防觉醒功能异常或延迟觉醒功能异常的进展的物质、装置和/或组合物的方法，所述方法包括将候选物质、装置和/或组合物施加于非人生物体或其活体部分、细胞、细胞系或原代细胞培养物、或组织，以及测定所述候选物质、装置和/或组合物对以下中的一者或多者的影响：所述非人生物体的觉醒率；多巴胺的活性、数量和/或释放；以及多巴胺能信号传导的活化。
在一些实施方案中，所述觉醒功能异常包括觉醒障碍、夜惊和/或维持睡眠的障碍。
在一些实施方案中，所述测定包括：测定所述候选物质、装置和/或组合物对多巴胺能细胞中所述nAChRα3的活性和/或表达的影响。
在一些实施方案中，所述多巴胺能细胞包括多巴胺能神经元细胞。
在一些实施方案中，所述nAChRα3是黑腹果蝇nAChRα3或其直系同源物。
在一些实施方案中，方法是体外方法或离体方法。
在一些实施方案中，所述候选物质和/或组合物包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。
在一些实施方案中，所述候选物质、装置和/或组合物直接作用于nAChRα3编码蛋白和/或编码nAChRα3编码蛋白的核酸分子。
在另一方面，本申请提供一种筛选适用于诊断和/或监测觉醒功能异常的生物标志物的方法，所述方法包括：测定物质的疾病值，其中所述疾病值是所述物质在从非人生物体或其活体部分、细胞、细胞系或原代细胞培养物、或组织获得的样品中的存在性和/或水平；测定所述物质的野生型值，其中所述野生型值是所述物质在从相应野生型非人生物体或其相应活体部分、细胞或组织获得的样品中的存在性和/或水平；以及当所述疾病值不同于所述野生型值时，将所述物质鉴定为所述生物标志物。
在一些实施方案中，所述觉醒功能异常包括觉醒障碍、夜惊和/或维持睡眠的障碍。
在一些实施方案中，所述疾病值大于所述野生型值，并且所述生物标志物是指示促进觉醒的生物标志物。
在一些实施方案中，所述疾病值小于所述野生型值，并且所述生物标志物是指示减少觉醒的生物标志物。
在另一方面，本申请提供非人生物体或其活体部分、细胞、细胞系或原代细胞培养物、或组织制备筛选适用于觉醒功能异常的治疗、诊断、预防、监测和/或预后的物质、装置、组合物和/或生物标志物的系统的用途。
在一些实施方案中，所述觉醒功能异常包括觉醒障碍、夜惊和/或维持睡眠的障碍。
在一些实施方案中，所述物质、组合物和/或生物标志物包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。
在一些实施方案中，所述物质、装置、组合物和/或生物标志物直接作用于nAChRα3编码蛋白和/或编码nAChRα3编码蛋白的核酸分子。
在另一方面，本申请提供非人生物体或其活体部分、细胞、细胞系或原代细胞培养物、或组织，其用于筛选适用于觉醒功能异常的治疗、诊断、预防、监测和/或预后的物质、装置、组合物和/或生物标志物。
在一些实施方案中，所述觉醒功能异常包括觉醒障碍、夜惊和/或维持睡眠的障碍。
通过下面的详细描述，本申请的其他方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见，其中，仅示出和描述了本申请的示例性实施方式。将会认识到的是，本申请能够具有其他的和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些都不脱离本申请。因此，附图和描述本质上应被认为是说明性的，而不是限制性的。
以引用的方式并入
本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请都以引用的方式并入本文中，其程度如同特别且个别地指示每一个别出版物、专利或专利申请以引用的方式并入一般。
附图简述
在所附权利要求中具体阐述了本发明的新颖特征。通过参考下面的详细说明，可以更好地理解本发明的特征和优点，以下详细说明阐述了说明性实施方案，在这些说明性实施方案中利用了本发明的原理及其附图(本文中也表示为“图”)：
图1A-图1C说明构建AChR突变体和敲入株系的策略；
图2说明nAChRα3KO的图示；
图3说明13个乙酰胆碱受体突变体在机械刺激下的觉醒率；
图4A-图4B说明nAChRα3KO蝇的觉醒率；其中，A：α3-/Y和α3+/Y雄蝇，B：α3-/-、α3+/-蝇和α3+/+雌蝇；
图5A-图5B说明蝇在移动期间的速度；其中，A：α3-/-、α3+/-蝇和α3+/+雌蝇在移动期间的速度，B：α3-/Y和α3+/Y雄蝇在移动期间的速度；
图6A-图6D说明蝇的睡眠持续时间，其中，A和B：α3-/-、α3+/-和α3+/+雌蝇的睡眠持续时间，以30分钟分区加以绘制，C和D：α3-/Y和α3+/Y雄蝇的睡眠持续时间，以30分钟分区加以绘制；
图7A-图7B说明α3KO的睡眠体内平衡和昼夜节律时期，其中，A：α3-/-和α3+/+蝇在12小时睡眠剥夺之后的累积睡眠反弹率，B：α3+/+和α3-/-蝇在连续7天中的活动度图和时期长度；
图8说明在nAChRα3表达性细胞中再引入nAChRα3会挽救α3-/-的觉醒率；
图9说明nAChRα3KOGal4和nAChRα3KIGal4的示意性基因型；
图10A-图10B说明脑(A)和VNC(B)中由mCD8::GFP标记的α3KIGal4表达模式；
图11A-图11C说明脑中由stinger::GFP(A)、Syt::GFP(B)、DenMark(C)标记的α3KIGal4表达模式；
图12A-图12B说明α3KIGal4；TH-p65AD,LexAop-myr::GFP,UAS-LexADBD的表达模式。脑(A)和VNC(B)中共同表达nAChRα3和TH的神经元用GFP标记；
图13A-图13B说明nAChRα3在多巴胺能神经元中起促进觉醒的作用，其中，A：在nAChRα3+TH+细胞中再引入nAChRα3挽救了nAChRα3突变体的觉醒率，B：敲低多巴胺能细胞中的nAChRα3导致觉醒率降低；
图14说明敲低nAChRα3表达性细胞中的TH导致觉醒率降低；
图15说明口服施用L-多巴会挽救α3-/-的觉醒率。
详细描述
尽管本文已经示出和描述了本发明的各种实施方案，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到许多变化，改变和替代。应当理解，可以采用本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案。nAChRα3
存在两种类型的神经递质乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)受体：烟碱型(nicotinic)AChR(nAChR)和蕈毒碱型(muscarinic)AChR。nAChR是由五个亚单位组成的配体门控离子通道。在哺乳动物中，nAChR亚单位包括16个nAChR亚单位(nAChRα1～α7、nAChRα9、nAChRα10、nAChRβ1～β4、nAChRδ、nAChRγ、nAChRε)和5个mAChR(CHRM1～M5)。在昆虫中，nAChR亚单位包括10个nAChR亚单位(nAChRα1～α7、nAChRβ1～β3)和3个mAChR(mAChRA、mAChRB、mAChRC)。
如本文所用，术语“nAChRα3”通常是指编码烟碱型乙酰胆碱受体α3亚单位(nAChRα3)的基因。nAChRα3包括具有nAChRα3的活性的nAChRα3的同源物、片段、衍生物、变体或直系同源物。nAChRα3基因在人、黑猩猩、恒河猴、狗、母牛、小鼠、大鼠、鸡、蚊子和蛙中是保守的。在一些情况下，nAChRα3可为黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)nAChRα3，具有NCBI数据库中的基因标识符31767。在一些实施方案中，黑腹果蝇nAChRα3编码蛋白可包含如以NCBI登录号：NP_525079.3阐述的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)。
作为另一序列的“同源物(homolog)”或“直系同源物(ortholog)”的多核苷酸序列或多肽序列是指在另一受试物种中执行大致上相同功能，并且共有实质性序列同一性的蛋白质，从而它们在本领域中被认定为是同一蛋白质的不同形式，不同之处主要在于它们所见于其中的物种。因此，举例来说，人nAChRα3、小鼠nAChRα3、大鼠nAChRα3和蝇nAChRα3全都被视为彼此的同源物或直系同源物。如果在最优比对(容许有空位)时，两个多核苷酸序列或多肽序列共有至少约50％序列同一性，或如果序列共有确定功能性基序(motifs)，那么它们被视为具有实质性同一性。在替代性实施方案中，如果最优比对序列在一特定区域共有至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性，那么它们可被视为大致上同一(即具有实质性同一性)。
术语“同一性(identity)”和“同一(identical)”是指两个肽或两个多核苷酸分子之间的序列类似性。同一性可以通过比较被比对序列中的每个位点来确定。氨基酸序列间或核苷酸序列的同一性程度是这些序列——例如特定区域中——共有的位点处相同或匹配的氨基酸或核苷酸数量的函数。出于测定核苷酸序列同一性百分比的目的的比对可以用属于本领域中的技能的各种方式实现，例如使用可公开获得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ClustalW2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定适于比对序列的参数，包括在所比较序列的全长实现最大比对所需的任何算法。
在一些实施方案中，本申请的nAChRα3可为黑腹果蝇nAChRα3或其直系同源物。举例来说，nAChRα3可源于铃木氏果蝇(Drosophila suzukii)、拟果蝇(Drosophilasimulans)、塞席尔果蝇(Drosophila sechellia)、智人(Homo sapiens)、小鼠(Musmusculus)、褐鼠(Rattus norvegicus)、热带爪蟾(Xenopus tropicalis)、斑马鱼(Daniorerio)，只要它们在那些物种中具有相同活性即可。nAChRα3编码蛋白可在许多生物体的中枢和外周神经系统、肌肉以及许多其他组织中表达。
nAChRα3的活性
如本文所用，术语“功能性(functional)”通常是指具有调控觉醒的功能，与调控觉醒的功能相关联，或是调控觉醒的功能。
如本文所用，术语“多巴胺(dopamine，DA)”通常是指一种由神经元释放的有机化学物质。在脑中，多巴胺可充当神经递质。它是一种从它的前体化学物质L-多巴(L-DOPA)分子合成的胺。多巴胺也在植物和大多数动物中合成。在黑腹果蝇中，多巴胺通过酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)来合成。
如本文所用，术语“多巴胺能细胞”通常是指中枢神经系统中合成多巴胺和/或多巴胺的合成酶(诸如酪氨酸羟化酶，TH)的细胞。
如本文所用，术语“神经元细胞(neuronal cell)”通常是指神经系统细胞。在哺乳动物中，神经元细胞可包括处于多个区域中的胆碱能(cholinergic)神经元、γ-氨基丁酸能(GABAergic)神经元、谷氨酸能(glutamatergic)神经元、多巴胺能(dopaminergic)神经元、去甲肾上腺素能(norepinephrinergic)神经元和血清素能(serotonergic)神经元，所述区域包括脑干(brain stem)、视叶前下丘脑(preoptic hypothalamus)、侧下丘脑(lateral hypothalamus)和基底前脑(basal forebrain)。在昆虫中，神经元细胞可包括处于多个区域中的胆碱能神经元、γ-氨基丁酸能神经元、谷氨酸能神经元、多巴胺能神经元、章鱼胺能神经元和血清素能神经元，所述区域包括背侧扇形体(dorsal fan-shapedbody)、椭圆体(ellipsoid body)、蕈形体(mushroom body)和脑间部(parsintercerebralis)。在一些实施方案中，nAChRα3可能够使多巴胺的活性、释放和/或数量增加，例如使多巴胺的合成酶的活性、释放和/或数量增加。
在一些实施方案中，nAChRα3可能够使多巴胺能信号传导活化。如本文所用，术语“多巴胺能信号传导(dopaminergic signaling)”是指涉及多巴胺或多巴胺受体的信号传导。在一些实施方案中，nAChRα3可使涉及多巴胺的信号传导路径活化。
nAChRα3的活性和/或表达可与觉醒相关。觉醒可包括觉醒障碍、夜惊和/或维持睡眠的障碍。关系可使用通过本领域中的任何基因工程改造方法(例如CRISPR、RNAi、同源重新组织)来获得的剔除和/或敲入突变体来评估，所述突变体例如nAChRα3剔除突变蝇。在一些实施方案中，nAChRα3的活性和/或表达的增加可促进觉醒。在一些实施方案中，nAChRα3的活性和/或表达的降低可减少觉醒。
检测方法
nAChRα3的活性和/或表达可用本领域中已知的方法以可定量方式测定，所述方法包括但不限于免疫组织化学分析、PCR、RT-PCR、原位杂交、southern印迹、western印迹、northern印迹、分光光度测定法、基因芯片、流式细胞计量术(FACS)、蛋白质芯片、DNA测序和ELISA。在一些情况下，方法可包括能够特异性扩增nAChRα3的引物。引物可为一对引物。此外，方法可包括能够特异性识别nAChRα3的探针。探针可能够结合nAChRα3核苷酸序列或其片段，而非另一核苷酸序列。探针可具有可检测信号。在其他情况下，方法可包括能够特异性识别nAChRα3蛋白的试剂和/或能够测定nAChRα3编码蛋白的活性的试剂，诸如nAChRα3编码蛋白的抗体和/或配体和/或其片段。
在一些情况下，在一些情况下，nAChRα3的表达可通过本领域中已知的方法来检测，所述方法诸如免疫荧光、免疫组织化学分析和共焦成像。检测可通过使靶标偶联于可检测物质来促进。可检测物质的实例包括各种酶、辅基(prosthetic groups)、荧光物质(fluorescent materials)、发光物质(luminescent materials)、生物发光物质(bioluminescent materials)和放射性物质。适合酶的实例包括辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)或乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase)；适合辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素(streptavidin/biotin)和亲和素/生物素(avidin/biotin)；适合荧光物质的实例包括伞形酮(umbelliferone)、荧光素(fluorescein)、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate)、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺荧光素(dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹磺酰氯(dansyl chloride)或藻红素(phycoerythrin)；发光物质的一实例包括鲁米诺(luminol)；生物发光物质的实例包括荧光素酶(luciferase)、虫荧光素(luciferin)和水母素(aequorin)。用于免疫组织化学分析的抗体的实例可为GFP、GRP、nc82、AlexaFluor488鸡抗体、AlexaFluor 633小鼠抗体。
调整觉醒
如本文所用，术语“觉醒(arousal)”通常是指醒来的状态或感觉器官受刺激以达到某一感知点的状态。觉醒由若干不同神经系统介导。觉醒由释放神经递质乙酰胆碱、去甲肾上腺素、多巴胺、组胺和血清素的神经元调控。觉醒在调控意识、注意力、警惕性和信息处理方面是重要的。觉醒分析方法可包括在特定授时因子时间在睡眠期间施加短暂和特定强度的光照或短暂和特定强度的机械刺激，以及视频记录在刺激之后的响应。
如本文所用，术语“调整觉醒(adjust arousal)”通常是指将觉醒水平调控至满意或适当状态。举例来说，调整觉醒包括在有需要的情况下促进觉醒和/或减少觉醒。
如本文所用，术语“昼夜节律(circadian rhythm)”通常是指包括植物、动物、真菌和蓝细菌的生物的生理过程中的大致24小时周期。在一些情况下，昼夜节律可为内源性产生的。在其他情况下，昼夜节律可通过外部提示诸如阳光和温度来调节。昼夜节律可通过在恒定黑暗中的移行活动来分析。
如本文所用，术语“不实质上影响(does not substantially affect)”通常是指在药剂治疗之后，在表型上不显著不同于野生型。
在一个方面，本申请提供一种用于选择用于调整觉醒的药剂的方法。方法包括：提供候选药剂；测定所述候选药剂对nAChRα3的活性和/或表达的影响；并且如果所述nAChRα3的所述活性和/或表达由所述候选药剂改变，那么将所述候选药剂选为用于调整觉醒的药剂。
在一些实施方案中，方法可为体外方法(in vitro)或离体(ex vivo)方法。方法可包括使用表达nAChRα3的细胞、细胞系或原代细胞培养物。细胞可来自人，诸如干细胞或人神经细胞。在一些情况下，方法可使用包含或对应于nAChRα3表达的组织和/或细胞诸如神经元细胞、脑区域或其他组织来进行。在一些情况下，细胞可为来自任何适合物种的神经细胞，例如蝇神经细胞、小鼠神经细胞和/或斑马鱼神经细胞。方法可包括使药剂与组织和/或细胞接触。可使细胞与药剂一起孵育，用包含药剂的载体转染。举例来说，可体外或离体培养组织和/或细胞，接着，可将候选物质施加于培养组织和/或细胞，在孵育适当时期(例如数小时、数天、数周或数月)之后，可用如本申请中所述的方法考查nAChRα3的表达量。
接着测定nAChRα3的表达量或活性。测定技术可如本申请中所述来进行。相较于对照，如果nAChRα3的活性增加，那么候选药剂可为用于促进觉醒的药剂；如果nAChRα3的活性降低，那么候选药剂可为用于减少觉醒的药剂。
在一些实施方案中，药剂可影响多巴胺能细胞中nAChRα3的活性和/或表达。在某一实施方案中，多巴胺能细胞包括多巴胺能神经元细胞。
在一些实施方案中，本申请的药剂不实质上影响移动。在一些实施方案中，本申请的使nAChRα3的活性和/或表达降低的药剂不实质上影响在移动期间的速度。在一些实施方案中，nAChRα3KO的低响应性不可归因于移动缺陷。举例来说，在nAChRα3剔除蝇的情况下，在移动期间的速度是野生型的累积速度的约80％至约120％，例如约90％至约110％、约95％至约105％或约100％，如在行为分析中所测量。
在一些实施方案中，本申请的药剂不实质上影响昼夜节律。举例来说，剔除蝇在恒定黑暗中的周期长度是野生型的那个时期长度的约80％至约120％，例如约90％至约110％、约95％至约105％或约100％，如在昼夜节律分析中所测量。
在一些实施方案中，本申请的药剂不实质上影响睡眠。在一些实施方案中，所述睡眠包括夜间睡眠。举例来说，剔除蝇的夜间睡眠持续时间是野生型的那个夜间睡眠持续时间的约80％至约120％，例如约90％至约110％、约95％至约105％或约100％，如在觉醒测定中所测量。
在一些实施方案中，药剂可包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。在一些实施方案中，药剂直接作用于编码nAChRα3编码蛋白的核酸分子。编码nAChRα3编码蛋白的核酸分子可为天然或合成核酸，包括DNA和RNA，例如cDNA、反义物(antisense)和mRNA。
觉醒功能异常
在另一方面，本申请提供一种用于治疗、预防觉醒功能异常或延迟觉醒功能异常的进展的方法。
如本文所用，术语“觉醒功能异常(arousal dysfunction)”一般是指归因于异常觉醒机理的功能异常。如本文所用，术语“觉醒功能异常”可包括将受益于用本发明的药剂进行的治疗的任何病状，包括可通过有效量的本文所述的药剂来治疗的任何觉醒疾病或障碍。在一些实施方案中，觉醒功能异常可包括觉醒障碍(disorders of arousal)、夜惊(night terror)和维持睡眠的障碍(disorders of maintaining sleep)。
如本文所用，术语“觉醒障碍(disorders of arousal)”一般是指其中人们具有觉醒困扰的觉醒功能异常。在一些实施方案中，觉醒障碍可包括频繁从睡眠觉醒，易于从睡眠觉醒，和/或具有睡眠困扰。
如本文所用，术语“夜惊(night terror)”一般是指通常在睡眠期间发生的导致惊恐或恐惧感觉的觉醒功能异常，它通常发生在非快速眼动(NREM)睡眠中。在一些实施方案中，在夜惊期间，人可突然直立坐在床上，苦痛地大叫或尖叫，具有较快呼吸和较快心跳，出汗，翻来覆去和/或表现出恐惧不安。
如本文所用，术语“维持睡眠的障碍(disorders of maintaining sleep)”一般是指具有维持睡眠的困扰的觉醒功能异常。在一些实施方案中，维持睡眠的障碍可包括睡眠过度、长久睡眠、难以醒来。
如本文所用，术语“REM”一般是指可通过随机/快速眼动来辨别的睡眠阶段。
如本文所用的术语“治疗(treatment)”是指治愈性疗法、防治性疗法和预防性疗法。连续治疗或施用是指以至少每日为基础进行治疗，在治疗中不以一天或多天加以间断。间歇治疗或施用或以间歇方式治疗或施用是指治疗不是连续的，而是在性质上具有周期性。根据本发明方法的治疗可导致完全缓解或治愈疾病或病状，或部分改善疾病或病状的一种或多种症状，并且可具有暂时或大致上永久作用。
如本文所用，术语“预防(prevention)”意指缓和所提及病症的症状。特定来说，所述术语涵盖向受试者施用本申请的药剂的完全范围的治疗正性作用，包括减轻、缓和以及缓解觉醒功能异常，例如觉醒障碍、夜惊和/或维持睡眠的障碍。术语“预防”包括预防或延缓疾病的发展，预防或延缓症状的发展，和/或减轻将会发展或预期会发展的所述症状的严重性。这些进一步包括改善现有症状，预防额外症状，以及改善或预防症状的潜伏原因。
用于觉醒功能异常的方法
如本文所用的术语“有效量(effective amount)”通常是指足以提供足够高以赋予对其接受者的有益作用的浓度的剂量。用于任何特定受试者的特定治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的疾病或病症、疾病或病症的严重性、特定组分的活性、施用途径、清除速率、治疗持续时间，受试者的年龄、体重、性别、膳食和总体健康状况，以及其他相关因素。
在一些实施方案中，方法可包括向有需要的受试者施用治疗有效量的能够改变所述受试者中nAChRα3的活性和/或表达的药剂。用于本发明方法中的药剂(以及任何额外治疗剂)可通过任何适合手段来施用，所述手段包括胃肠外、肺内和鼻内，并且如果为局部治疗所需，那么包括病灶内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。
在一些实施方案中，药剂可向非人生物体或其活体部分施用。在一些实施方案中，药剂可向源于非人生物体或其活体部分的组织施用。在一些实施方案中，方法可为基因治疗方法。在一些情况下，从受试者获取原代细胞，向细胞施用载体以产生经转导、经感染或经转染重组细胞，并且将重组细胞再施用至同一或不同受试者中。
在一些实施方案中，施用可包括将用于重组蛋白表达的载体递送至所培养的一个或多个细胞中和/或受试者的细胞或器官中。用于重组蛋白或多肽表达的载体可通过以下方式来引入细胞中：转染(transfection)，此通常意指通过物理手段(例如磷酸钙转染、电穿孔、显微注射或脂质体转染)来将异源性DNA插入细胞中；感染(infection)，此通常是指通过感染物即病毒来进行引入；或转导(transduction)，此通常意指用病毒稳定感染细胞或通过病毒剂(例如噬菌体)来将遗传物质从一种微生物转移至另一微生物中。在临床环境中，药剂递送系统可通过许多方法中的任一者来引入受试者中，所述方法中的各者在本领域中是通晓的。举例来说，药剂递送系统的药物制剂可例如通过静脉内注射来以全身性方式引入，并且对靶标细胞的特异性转导主要由于由药剂递送载体提供的转染特异性、归因于控制核酸分子的表达的转录调控序列的细胞类型或组织类型表达、或其组合而发生。
此外，药剂可于可接受稀释剂中加以递送，或递送系统可包含递送载体被包埋在其中的缓慢释放基质。或者，当完全药剂递送系统可由重组细胞例如逆转录病毒包装物完整产生时，药物制剂可包含一种或多种产生药剂递送系统的细胞。在后述情况下，引入病毒包装细胞(viral packaging cells)的方法可由例如可再装填装置或生物可降解装置提供。近年来已开发了各种缓慢释放聚合物装置并在体内加以测试以用于对包括蛋白质生物药物的药物的控制递送，并且通过对聚合物组成和形式进行操作，所述装置可适合于释放病毒粒子。多种生物可相容聚合物(包括水凝胶)，包括生物可降解聚合物与非可降解聚合物两者，可用于形成用于由植入在特定靶标部位处的细胞持续释放病毒粒子的植入物。本发明的所述实施方案可用于递送已并入聚合装置中的外源纯化病毒，或用于递送由囊封在聚合装置中的细胞产生的病毒粒子。
在一些实施方案中，药剂可包括编码nAChRα3的核酸分子或其表达产物。在一些实施方案中，药剂可包括如以SEQ ID No.1-10中的任一者阐述的核酸序列。在一些实施方案中，向有需要的受试者施用药剂可使nAChRα3的活性和/或表达增加。
在另一方面，本申请提供一种用于选择用于调整觉醒的药剂的系统，其中所述系统包含能够测定所述药剂对nAChRα3的活性和/或表达的影响的物质。物质可能够测定nAChRα3的核酸分子的活性和/或表达。在一些实施方案中，物质可包括能够特异性扩增nAChRα3的引物，和/或能够特异性识别nAChRα3的探针。物质可能够测定nAChRα3编码蛋白的活性和/或表达。在一些实施方案中，物质可包括能够特异性识别nAChRα3编码蛋白的试剂和/或能够测定nAChRα3编码蛋白的活性的试剂。
在另一方面，本申请提供能够改变nAChRα3的活性和/或表达的药剂在制造用于治疗、预防觉醒功能异常或延迟觉醒功能异常的进展的药物中的用途。
觉醒功能异常的可能性
在另一方面，本申请提供一种确定受试者患有觉醒功能异常，和/或处于患有觉醒功能异常的风险下的可能性的方法。方法可包括测定nAChRα3的活性和/或表达。测定技术可为本申请中所述的方法。相较于对照，如果受试者中nAChRα3的活性和/或表达水平较高，那么所述受试者可患有觉醒功能异常，和/或处于患有觉醒功能异常例如觉醒障碍和夜惊的风险下。相较于对照，如果受试者中nAChRα3的活性和/或表达水平较低，那么所述受试者可患有觉醒功能异常，和/或处于患有觉醒功能异常例如维持睡眠的障碍的风险下。如本文所用，术语“处于患有觉醒功能异常的风险下(at risk of having a sleep disorder)”通常是指患有觉醒功能异常的可能性高于对照。
在另一方面，本申请提供一种用于确定受试者患有觉醒功能异常，和/或处于患有觉醒功能异常的风险下的可能性的系统，所述系统包含：能够指示所述受试者中nAChRα3的活性和/或表达水平的试剂。
非人模型
术语“干扰RNA(RNAi)”在本文中用于指代导致特定mRNA催化降解，因此可用于抑制/降低特定基因的表达的双链RNA。
在另一方面，本申请提供包含功能受损的nAChRα3的非人生物体或其活体部分。非人生物体可为昆虫，诸如海栖蜈蚣(Strigamia maritima)、肩突硬蜱(Ixodesscapularis)、家蚕(Bombyx mori)、帝王斑蝶(Danaus plexippus)、家蝇(Muscadomestica)、刺舌蝇(Glossina morsitans)和/或果蝇属(Drosophila)物种。在一些实施方案中，非人生物体可为果蝇属物种，诸如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、铃木氏果蝇(Drosophila suzukii)、拟果蝇(Drosophila simulans)、榕果蝇(Drosophila erecta)、塞席尔果蝇(Drosophila sechellia)、雅库巴果蝇(Drosophila yakuba)、嗜凤梨果蝇(Drosophila ananassae)、拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura)、黑翅果蝇(Drosophilapersimilis)、威尔斯托尼果蝇(Drosophila willistoni)、黑果蝇(Drosophila virilis)、摩加夫果蝇(Drosophila mojavensis)、格瑞姆沙韦果蝇(Drosophila grimshawi)。在一些实施方案中，非人生物体是黑腹果蝇、拟果蝇、西方蜜蜂(Apis mellifera)。
在一些实施方案中，非人生物体或其活体部分可不包含任何功能性nAChRα3。本申请的非人生物体可通过以下方式来产生：将无nAChRα3的异源性核酸序列引入例如非人生物体的受精卵、未受精卵、精子、原始生殖细胞、卵原细胞、卵母细胞、精原细胞、精母细胞和/或精细胞中，例如在受精卵的胚胎发育中的初始阶段(例如在8细胞阶段之前)。异源性核酸序列可通过基因转移(gene transfer)方法来引入，所述方法诸如磷酸钙共沉淀、电穿孔、脂质体转染、凝集、显微注射、基因枪(粒子枪)和/或DEAE-右旋糖酐方法。异源性核酸序列也可被引入蝇的体细胞、组织和/或器官中(例如通过基因转移方法)，接着可进一步培养和/或维持经工程改造体细胞、组织和/或器官。也可通过细胞融合方法来使经工程改造细胞与胚胎或另一细胞(诸如来自非人生物体的种系的细胞)融合以产生本申请的非人生物体。
在本申请的用于产生模型动物的方法中，核酸酶试剂可用于帮助修饰靶标基因基因座(target gene locus)。这种核酸酶试剂可促进供体核酸分子与靶标基因组基因座之间的同源性重组。在一些实施方案中，核酸酶试剂可包括核酸内切酶试剂。
如本文所用，术语“核酸酶试剂的识别位点(recognition site for a nucleaseagent)”通常是指核酸酶试剂可诱导切口或双链断裂所处的DNA序列。核酸酶试剂的识别位点可为细胞内源性的(或天然的)，或识别位点可为细胞外源性的。在一些实施方案中，识别位点可为细胞外源性的，并且由此不天然存在于细胞的基因组中。在其他实施方案中，外源性或内源性识别位点可在宿主细胞的基因组中仅存在一次。在特定实施方案中，可鉴定在基因组内仅出现一次的内源性或天然位点。这种位点可接着用于设计将在内源性识别位点处产生切口或双链断裂的核酸酶试剂。
识别位点的长度可变化，并且包括例如长度是至少4、6、8、10、12、14、16、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70个或更多个核苷酸的识别位点。在一个实施方案中，核酸酶试剂的各单体可识别具有至少9个核苷酸的识别位点。在其他实施方案中，识别位点的长度可为约9至约12个核苷酸、约12至约15个核苷酸、约15至约18个核苷酸、或约18至约21个核苷酸以及所述子范围的任何组合(例如9-18个核苷酸)。识别位点可为回文的(palindromic)，也就是说一个链上的序列与互补链在相反方向上的读取相同。应认识到给定核酸酶试剂可结合识别位点并裂解那个结合位点，或者，核酸酶试剂可结合不同于识别位点的序列。此外，术语识别位点(recognition site)可包括核酸酶试剂结合位点与切口/裂解位点两者而不考虑切口/裂解位点在核酸酶试剂结合位点内部或外部。在另一变化形式中，由核酸酶试剂达成的裂解可发生在彼此紧密相对的核苷酸位置处以产生钝性末端切割(blunt end cut)，或在其他情况下，切口可交错以产生也称为“粘性末端(sticky ends)”的单链突出部分，其可为5’端突出部分(5’overhangs)或3’端突出部分。
在所需识别位点中诱导切口或双链断裂的任何核酸酶试剂都可用于本申请的方法中。可采用天然存在或天然核酸酶试剂，只要所述核酸酶试剂在所需识别位点中诱导切口或双链断裂即可。或者，可采用经修饰或经工程改造核酸酶试剂。“经工程改造核酸酶试剂(engineered nuclease agent)”包括从它的天然形式进行工程改造(修饰或衍生)以达成特异性识别并在所需识别位点中诱导切口或双链断裂的核酸酶。因此，经工程改造核酸酶试剂可源于天然的天然存在核酸酶试剂，或它可被人工创建或合成。对核酸酶试剂的修饰可少至蛋白质裂解试剂中的一个氨基酸或核酸裂解试剂中的一个核苷酸。在一些实施方案中，经工程改造核酸酶可在识别位点中诱导切口或双链断裂，其中所述识别位点不是将已由天然(非工程改造或非修饰)核酸酶试剂识别的序列。在识别位点或其他DNA中产生切口或双链断裂可在本文中称为“切割(cutting)”或“裂解(cleaving)”所述识别位点或其他DNA。
在一些实施方案中，核酸酶试剂可为转录活化子样效应物核酸酶(TranscriptionActivator-Like Effector Nuclease，TALEN)。TAL效应物核酸酶是一类可用于在原核或真核生物体的基因组中的特定靶标序列处产生双链断裂的序列特异性核酸酶。TAL效应物核酸酶可通过使天然或经工程改造转录活化子样(transcription activator-like，TAL)效应物或其功能性部分融合于核酸内切酶诸如像FokI的催化结构域来创建。独特模块化TAL效应物DNA结合结构域允许设计具有潜在任何给定DNA识别特异性的蛋白质。因此，TAL效应物核酸酶的DNA结合结构域可被工程改造来识别特定DNA靶标位点，因此用于在所需靶标序列处产生双链断裂。参见WO 2010/079430；Morbitzer等(2010)PNAS 10.1073/pnas.1013133107；Scholze和Boch(2010)Virulence 1:428-432；Christian等Genetics(2010)186:757-761；Li等(2010)Nuc.Acids Res.(2010)doi:10.1093/nar/gkq704；以及Miller等(2011)Nature Biotechnology 29:143-148；其全都以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，核酸酶试剂可为锌指核酸酶(zinc-finger nuclease，ZFN)。举例来说，ZFN的各单体可包含3个或更多个基于锌指的DNA结合结构域，其中各基于锌指的DNA结合结构域可结合3个碱基对(bp)子位点。在其他实施方案中，ZFN可为包含基于锌指的DNA结合结构域可操作地连接于独立核酸酶的嵌合蛋白。在一些实施方案中，独立核酸内切酶可为FokI核酸内切酶。在一些实施方案中，核酸酶试剂可包含第一ZFN和第二ZFN，其中所述第一ZFN和所述第二ZFN各自可操作地连接于FokI核酸酶，其中所述第一ZFN和所述第二ZFN识别靶标DNA序列的各链中由约6个碱基对(bp)至约40个碱基对(bp)裂解位点或约5个碱基对(bp)至约6个碱基对(bp)裂解位点分隔的两个连续靶标DNA序列，并且其中FokI核酸酶二聚化并产生双链断裂。参见例如US20060246567；US20080182332；US20020081614；US20030021776；WO/2002/057308A2；US20130123484；US20100291048；和WO/2011/017293A2，其各自以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，核酸酶试剂可为兆碱基大范围核酸酶(meganuclease)。兆碱基大范围核酸酶已基于保守序列基序被分类成四个家族，所述家族是LAGLIDADG、GIY-YIG、H—N—H和His-Cys框家族。这些基序参与金属离子的配位和磷酸二酯键的水解。HE酶以它们的长识别位点以及以容许在它们的DNA底物中具有一些序列多态性(sequencepolymorphisms)而著称。兆碱基大范围核酸酶结构域、结构和功能是已知的，参见例如Guhan和Muniyappa(2003)Crit.Rev Biochem Mol Biol 38:199-248；Lucas等,(2001)Nucleic Acids Res29:960-9；Jurica和Stoddard,(1999)Cell Mol Life Sci 55:1304-26；Stoddard,(2006)Q Rev Biophys 38:49-95；以及Moure等,(2002)Nat Struct Biol 9:764。
在一些实施方案中，本申请的方法中采用的核酸酶试剂可采用CRISPR/Cas系统。所述系统可采用例如Cas9核酸酶，其在一些情况下可针对它将被表达所处的所需细胞类型加以密码子优化(codon-optimized)。系统可进一步采用与密码子优化Cas9一起起作用的融合crRNA-tracrRNA构建体。这个单一RNA可经常被称为小引导RNA或sgRNA。简要来说，可将含有靶标序列的短DNA片段插入sgRNA表达质粒中。sgRNA表达质粒可包含靶标序列(在一些实施方案中，约20个核苷酸)、某一形式的tracrRNA序列(骨架)以及在细胞中具有活性的适合启动子和为在真核细胞(诸如蝇细胞)中达成适当加工所必需的元件。可接着将sgRNA表达盒和Cas9表达盒引入细胞中。参见例如Mali P等(2013)Science 2013年2月15日；339(6121):823-6；Jinek M等Science 2012年8月17日；337(6096):816-21；Hwang W Y等NatBiotechnol 2013年3月；31(3):227-9；Jiang W等Nat Biotechnol 2013年3月；31(3):233-9；以及Cong L等Science 2013年2月15日；339(6121):819-23，其各自以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，所述生物体中的nAChRα3基因通过RNAi来敲低。可将双链RNA(dsRNA)引入细胞中(例如使用短寡聚小双链干扰RNA(siRNA)或siRNA可从其进行转录的DNA质粒)。在实施方法时，向非人生物体施用有效量的RNAi试剂来以合乎需要的方式调节靶标基因的表达，例如用以实现靶标细胞基因表达的预期减少。本申请中采用的RNAi试剂是以双链体结构存在的小核糖核酸分子，即寡核糖核苷酸(oligoribonucleotides)，例如彼此杂交的两个不同寡核糖核苷酸或采用小发夹构造以产生双链体结构的单一核糖寡核苷酸。在一些实施方案中，其中RNA试剂是彼此杂交的两个不同核糖核酸的双链体结构，例如siRNA。在一些情况下，将siRNA引入细胞质(例如神经元细胞)中。在一些实施方案中，siRNA可来源于细胞内部。在其他实施方案中，siRNA可以外源性方式引入细胞中。
RNAi试剂可使用任何适宜方案来向非人生物体施用，其中采用的方案通常是核酸施用方案，其中许多不同所述方案在本领域中是已知的。
在一些实施方案中，所述生物体中的nAChRα3基因通过α3KIGal4来敲低。通过在α3KIGal4的控制下表达α3RNAi来敲低nAChRα3。在一些实施方案中，所述生物体中nAChRα3蛋白的94号氨基酸到335号氨基酸被删除，并且所述nAChRα3蛋白包含如以SEQ ID NO:11阐述的氨基酸序列。
在另一方面，本申请提供一种源于非人生物体或其活体部分的细胞、细胞系或原代细胞培养物。
在另一方面，本申请提供一种源于非人生物体或其活体部分的组织。在一些实施方案中，组织源于神经组织。在一些实施方案中，组织源于包含多巴胺能细胞的神经组织。
在一些实施方案中，非人生物体或活体部分可用于选择用于调整觉醒的药剂的方法中。在一些实施方案中，方法可包括向非人生物体或活体部分施用药剂，以及检测所述nAChRα3的活性和/或表达。在一些实施方案中，非人生物体或活体部分可用于筛选适用于诊断和/或监测觉醒功能异常的生物标志物。在一些实施方案中，非人生物体或活体部分可用于制备筛选适用于觉醒功能异常的治疗、诊断、预防、监测和/或预后的物质、装置、组合物和/或生物标志物的系统。
筛选方法
在另一方面，本申请提供一种筛选适用于治疗、预防觉醒功能异常和/或延迟觉醒功能异常的进展的物质、装置和/或组合物的方法，所述方法包括将候选物质、装置和/或组合物施加于本申请的非人生物体或其活体部分、细胞、细胞系或原代细胞培养物或组织，以及测定所述候选物质、装置和/或组合物对以下中的一者或多者的影响：所述非人生物体的觉醒率，多巴胺的活性、数量和/或释放，以及多巴胺能信号传导的活化。
在一些实施方案中，方法可为体外方法或离体方法。举例来说，样品(例如细胞、组织或其他含DNA或RNA样品、含蛋白质样品和/或含代谢物样品)可在觉醒功能异常(例如觉醒障碍、夜惊和/或维持睡眠的障碍)之前和之后从本申请的非人生物体或其活体部分获取。接着，可全面测定源于样品的基因转录产物(转录物组)、基因翻译产物(蛋白质组)或代谢物(代谢物组)，并且可鉴定在觉醒功能异常之前和之后变化的物质。
基因转录产物(例如转录物组)可使用核酸微阵列诸如DNA微阵列来分析。基因翻译产物(例如蛋白质组)可使用凝胶电泳(诸如二维凝胶电泳(two-dimensional gelelectrophoresis))或质谱测定法(诸如飞行时间质谱测定法(time-of-flight massspectrometry)、电喷雾离子化质谱测定法(electronspray ionization massspectrometry)、毛细管HPLC/MS和LC/MS/MS)来分析。代谢物(代谢物组)可使用NMR、毛细管电泳(capillary electrophoresis)、LC/MS和/或LC/MS/MS来分析。
当物质的存在性/数量显示在觉醒功能异常之前和之后具有显著差异时，这种物质可被视为觉醒功能异常的生物标志物，其可接着用于对觉醒功能异常的早期诊断(特别是临床前诊断)。所鉴定生物标志物可用特定试剂或检测方法加以进一步检测。举例来说，当生物标志物是蛋白质或肽时，它可用使用特异性抗体进行的免疫测定加以检测。当生物标志物是核酸分子(诸如转录产物)时，它可用使用特异性探针进行的Northern印迹分析，或用使用特异性引物进行的RT-PCR加以检测。
在另一方面，本申请提供一种用于选择用于调整觉醒的药剂的系统。在一些实施方案中，系统可包括提供用于售卖包含本申请的药剂的组合物的销售网络，以及对患者或医师提供关于在受试者中使用所述药剂来调整觉醒的指导材料。
在一些实施方案中，系统可包括确定本申请的药剂的适于在受试者中施用以调整觉醒的制剂和剂量，关于在动物中的功效和毒性对如上所述加以鉴定的制剂进行治疗性分析；以及提供用于售卖如上所述被鉴定为具有可接受治疗特征的制剂的销售网络。
系统可进一步包含试剂盒(kit)。在一些实施方案中，试剂盒可包含采用适合包装的本申请的药剂以及说明书、临床研究分析、副作用等。试剂盒也可包含指示或确认组合物的活性和/或优势的信息，诸如科学参考文献、包装插页材料、临床试验结果和/或所述类似信息的概述，和/或给药方案、施用、副作用、药物相互作用的信息，或对于健康护理提供者有用的其他信息。系统可进一步包含另一药剂。在一些情况下，本申请的药剂在试剂盒内提供在单独容器中。
在一些情况下，可对相关人员提供、售卖和/或销售系统，所述人员包括健康护理提供者、医师、护士、药剂师、开处方者、药物开发者、药物制造者等。在其他情况下，可直接对消费者售卖系统。
另一方面，本申请还可包含以下实施方案：
1.一种用于选择用于调整觉醒的药剂的方法，所述方法包括：
提供候选药剂；
测定所述候选药剂对nAChRα3的活性和/或表达的影响；并且
如果所述nAChRα3的所述活性和/或表达由所述候选药剂改变，那么将所述候选药剂选为用于调整觉醒的药剂。
2.如实施方案1所述的方法，其中如果所述nAChRα3的所述活性和/或表达由所述候选药剂增加，那么将所述候选药剂选为用于促进觉醒的药剂。
3.如实施方案1-2中任一项所述的方法，其中如果所述nAChRα3的所述活性和/或表达由所述候选药剂降低，那么将所述候选药剂选为用于减少觉醒的药剂。
4.如实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述nAChRα3是黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)nAChRα3或其直系同源物。
5.如实施方案1-4中任一项所述的方法，其中所述测定包括：测定所述候选药剂对多巴胺能细胞中所述nAChRα3的活性和/或表达的影响。
6.如实施方案5所述的方法，其中所述多巴胺能细胞包括多巴胺能神经元细胞。
7.如实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述nAChRα3的所述活性包括以下中的一者或多者：
使多巴胺的活性、释放和/或数量增加的能力；以及
使多巴胺信号传导活化的能力。
8.如实施方案1-7中任一项所述的方法，其是体外方法或离体方法。
9.如实施方案1-8中任一项所述的方法，其中所述觉醒包括外源性觉醒。
10.如实施方案1-9中任一项所述的方法，其中所述药剂不实质上影响移动、昼夜节律或睡眠。
11.如实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述睡眠包括夜间睡眠。
12.如实施方案1-11中任一项所述的方法，其中所述药剂包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。
13.如实施方案1-12中任一项所述的方法，其中所述药剂直接作用于nAChRα3编码蛋白和/或编码nAChRα3编码蛋白的核酸分子。
14.一种用于选择用于调整觉醒的药剂的系统，其中所述系统包含能够测定所述药剂对nAChRα3的活性和/或表达的影响的物质。
15.根据实施方案14所述的系统，其中所述物质能够测定所述药剂对编码所述nAChRα3的核酸分子的活性和/或表达的影响。
16.根据实施方案15所述的系统，其中能够测定所述药剂对编码所述nAChRα3的所述核酸分子的活性和/或表达的影响的所述物质包括：能够特异性扩增nAChRα3的引物，和/或能够特异性识别nAChRα3的探针。
17.如实施方案14-16中任一项所述的系统，其中所述物质能够测定所述药剂对nAChRα3编码蛋白的活性和/或表达的影响。
18.根据实施方案17所述的系统，其中能够测定所述药剂对所述nAChRα3编码蛋白的活性和/或表达的影响的所述物质包括：能够特异性识别所述nAChRα3编码蛋白的试剂和/或能够测定所述nAChRα3编码蛋白的所述活性的试剂。
19.一种用于治疗、预防觉醒功能异常或延迟觉醒功能异常的进展的方法，所述方法包括：
向有需要的受试者施用治疗有效量的能够改变所述受试者中nAChRα3的活性和/或表达的药剂。
20.如实施方案19所述的方法，其中所述觉醒功能异常与觉醒障碍和夜惊相关，并且所述药剂能够使所述受试者中nAChRα3的所述活性和/或表达降低。
21.如实施方案19-20中任一项所述的方法，其中所述药剂包括编码nAChRα3的核酸分子或其表达产物。
22.如实施方案19-21中任一项所述的方法，其中所述药剂包括如以SEQ ID No.1-10中的任一者阐述的编码nAChRα3的核酸分子。
23.如实施方案19所述的方法，其中所述觉醒功能异常与维持睡眠的障碍相关，并且所述药剂能够使所述受试者中nAChRα3的所述活性和/或表达增加。
24.如实施方案19-23中任一项所述的方法，其中所述药剂是用于促进觉醒的药剂，因为所述nAChRα3的所述活性和/或表达由所述药剂增加。
25.如实施方案19-24中任一项所述的方法，其中所述药剂是用于减少觉醒的药剂，因为所述nAChRα3的所述活性和/或表达由所述药剂降低。
26.如实施方案19-25中任一项所述的方法，其中所述nAChRα3是黑腹果蝇nAChRα3或其直系同源物。
27.如实施方案19-26中任一项所述的方法，其中对所述nAChRα3的所述活性和/或表达的所述改变是在多巴胺能细胞中。
28.如实施方案27所述的方法，其中所述多巴胺能细胞包括多巴胺能神经元细胞。
29.如实施方案19-28中任一项所述的方法，其中所述nAChRα3的所述活性包括以下中的一者或多者：
使多巴胺的活性、释放和/或数量增加的能力；
使多巴胺能信号传导活化的能力。
30.如实施方案19-29中任一项所述的方法，其是体外方法、体内方法或离体方法。
31.如实施方案19-30中任一项所述的方法，其中所述药剂包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。
32.如实施方案19-31中任一项所述的方法，其中所述药剂直接作用于nAChRα3编码蛋白，和/或编码所述nAChRα3的核酸分子。
33.能够改变nAChRα3的活性和/或表达的药剂在制造用于治疗、预防觉醒功能异常或延迟觉醒功能异常的进展的药物中的用途。
34.如实施方案33所述的用途，其中所述试剂能够测定所述药剂对编码所述nAChRα3的核酸分子的活性和/或表达的影响。
35.如实施方案34所述的用途，其中能够测定所述药剂对编码所述nAChRα3的核酸分子的活性和/或表达的影响的所述试剂包括：能够特异性扩增nAChRα3的引物，和/或能够特异性识别nAChRα3的探针。
36.如实施方案33-35中任一项所述的用途，其中所述试剂能够测定所述药剂对所述nAChRα3编码蛋白的活性和/或表达的影响。
37.根据实施方案36所述的用途，其中测定所述药剂对所述nAChRα3编码蛋白的活性和/或表达的影响的所述物质试剂包括：能够特异性识别所述nAChRα3编码蛋白的试剂和/或能够测定所述nAChRα3编码蛋白的所述活性的试剂。
38.一种能够改变nAChRα3编码蛋白的活性和/或表达的药剂，所述药剂用于治疗、预防觉醒功能异常或延迟觉醒功能异常的进展。
39.一种用于确定受试者患有觉醒功能异常，和/或处于患有觉醒功能异常的风险下的可能性的方法，所述方法包括：
评估所述受试者中nAChRα3的活性和/或表达。
40.根据实施方案39所述的方法，其中nAChRα3的所述活性和/或表达包括编码所述nAChRα3的核酸分子的活性和/或表达，和/或所述nAChRα3编码蛋白的活性和/或表达。
41.根据实施方案40所述的方法，其中能够测定所述药剂对编码所述nAChRα3的核酸分子的活性和/或表达的影响的物质包括：能够特异性扩增nAChRα3的引物，和/或能够特异性识别nAChRα3的探针。
42.如实施方案40-41中任一项所述的方法，其中能够测定所述药剂对所述nAChRα3编码蛋白的活性和/或表达的影响的物质包括：能够特异性识别所述nAChRα3编码蛋白的试剂和/或能够测定所述nAChRα3编码蛋白的所述活性的试剂。
43.如实施方案39-42中任一项所述的方法，其中所述觉醒功能异常包括觉醒障碍、夜惊和/或维持睡眠的障碍。
44.一种用于确定受试者患有觉醒功能异常，和/或处于患有觉醒功能异常的风险下的可能性的系统，所述系统包含：
能够指示所述受试者中nAChRα3的活性和/或表达水平的试剂。
45.根据实施方案44所述的系统，其中nAChRα3的所述活性和/或表达包括编码所述nAChRα3的核酸分子的活性和/或表达，和/或所述nAChRα3编码蛋白的活性和/或表达。
46.根据实施方案45所述的系统，其中能够测定所述药剂对编码所述nAChRα3的核酸分子的活性和/或表达的影响的物质包括：能够特异性扩增nAChRα3的引物，和/或能够特异性识别nAChRα3的探针。
47.如实施方案45-46中任一项所述的系统，其中能够测定所述药剂对所述nAChRα3编码蛋白的活性和/或表达的影响的物质包括：能够特异性识别所述nAChRα3编码蛋白的试剂和/或能够测定所述nAChRα3编码蛋白的所述活性的试剂。
48.如实施方案44-47中任一项所述的系统，其中所述觉醒功能异常包括觉醒障碍、夜惊和/或维持睡眠的障碍。
49.能够指示受试者的nAChRα3的活性和/或表达水平的试剂制造关于所述受试者患有觉醒功能异常，和/或处于患有觉醒功能异常的风险下的可能性的指示剂的用途。
50.根据实施方案49所述的用途，其中nAChRα3的所述活性和/或表达包括编码所述nAChRα3的核酸分子的活性和/或表达，和/或所述nAChRα3编码蛋白的活性和/或表达。
51.根据实施方案50所述的用途，其中能够测定所述药剂对编码所述nAChRα3的核酸分子的活性和/或表达的影响的试剂包括：能够特异性扩增nAChRα3的引物，和/或能够特异性识别nAChRα3的探针。
52.如实施方案50-51中任一项所述的用途，其中能够测定所述药剂对所述nAChRα3编码蛋白的活性和/或表达的影响的试剂包括：能够特异性识别所述nAChRα3编码蛋白的试剂和/或能够测定所述nAChRα3编码蛋白的所述活性的试剂。
53.如实施方案50-52中任一项所述的用途，其中所述觉醒功能异常包括觉醒障碍(disorder of arousal)、夜惊(night terror)和/或维持睡眠的障碍(disorder ofmaintaining sleep)。
54.一种非人生物体或其活体部分，其包含功能受损的nAChRα3。
55.如实施方案54所述的非人生物体或其活体部分，其中所述非人生物体是黑腹果蝇。
56.如实施方案54-55中任一项所述的非人生物体或其活体部分，其不包含任何功能性nAChRα3。
57.如实施方案54-56中任一项所述的非人生物体或其活体部分，其就功能受损的nAChRα3来说是纯合的。
58.如实施方案54-57中任一项所述的非人生物体或其活体部分，其中相较于相应野生型非人生物体，所述非人生物体具有降低的觉醒率。
59.如实施方案54-58中任一项所述的非人生物体或其活体部分，其中所述生物体中的nAChRα3基因被敲低或剔除。
60.如实施方案54-59中任一项所述的非人生物体或其活体部分，其中所述生物体中的nAChRα3基因通过RNAi来敲低。
61.如实施方案54-60中任一项所述的非人生物体或其活体部分，其中所述生物体中的nAChRα3基因通过α3KIGal4来敲低。
62.如实施方案54-61中任一项所述的非人生物体或其活体部分，其中所述生物体中nAChRα3蛋白的94号氨基酸到335号氨基酸被删除，并且所述nAChRα3蛋白包含如以SEQID NO:11阐述的氨基酸序列。
63.一种细胞、细胞系或原代细胞培养物，其源于如实施方案54-62中任一项所述的非人生物体或其活体部分。
64.一种组织，其源于如实施方案54-62中任一项所述的非人生物体或其活体部分。
65.如实施方案64所述的组织，其中所述组织源于神经组织。
66.如实施方案64-65中任一项所述的组织，其中所述组织源于包含多巴胺能细胞的神经组织。
67.一种筛选适用于治疗、预防觉醒功能异常或延迟觉醒功能异常的进展的物质、装置和/或组合物的方法，所述方法包括将候选物质、装置和/或组合物施加于如实施方案54-62中任一项所述的非人生物体或其活体部分、如实施方案63所述的细胞、细胞系或原代细胞培养物、或如实施方案64-66中任一项所述的组织，以及测定所述候选物质、装置和/或组合物对以下中的一者或多者的影响：
所述非人生物体的觉醒率；
多巴胺的活性、数量和/或释放；以及
多巴胺能信号传导的活化。
68.如实施方案67所述的方法，其中所述觉醒功能异常包括觉醒障碍、夜惊和/或维持睡眠的障碍。
69.如实施方案67-68中任一项所述的方法，其中所述测定包括：测定所述候选物质、装置和/或组合物对多巴胺能细胞中所述nAChRα3的活性和/或表达的影响。
70.如实施方案69所述的方法，其中所述多巴胺能细胞包括多巴胺能神经元细胞。
71.如实施方案67-70中任一项所述的方法，其中所述nAChRα3是黑腹果蝇nAChRα3或其直系同源物。
72.如实施方案67-71中任一项所述的方法，其是体外方法或离体方法。
73.如实施方案67-72中任一项所述的方法，其中所述候选物质和/或组合物包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。
74.如实施方案67-73中任一项所述的方法，其中所述候选物质、装置和/或组合物直接作用于nAChRα3编码蛋白和/或编码nAChRα3编码蛋白的核酸分子。
75.一种筛选适用于诊断和/或监测觉醒功能异常的生物标志物的方法，所述方法包括：
测定物质的疾病值，其中所述疾病值是所述物质在从如实施方案54-68中任一项所述的非人生物体或其活体部分、如实施方案63所述的细胞、细胞系或原代细胞培养物、或如实施方案64-66中任一项所述的组织获得的样品中的存在性和/或水平；
测定所述物质的野生型值，其中所述野生型值是所述物质在从相应野生型非人生物体或其相应活体部分、细胞或组织获得的样品中的存在性和/或水平；
以及当所述疾病值不同于所述野生型值时，将所述物质鉴定为所述生物标志物。
76.如实施方案75所述的方法，其中所述觉醒功能异常包括觉醒障碍、夜惊和/或维持睡眠的障碍。
77.如实施方案75-76中任一项所述的方法，其中所述疾病值大于所述野生型值，并且所述生物标志物是指示促进觉醒的生物标志物。
78.如实施方案75-77中任一项所述的方法，其中所述疾病值小于所述野生型值，并且所述生物标志物是指示减少觉醒的生物标志物。
79.如实施方案54-62中任一项所述的非人生物体或其活体部分、如实施方案63所述的细胞、细胞系或原代细胞培养物、或如实施方案64-66中任一项所述的组织制备筛选适用于觉醒功能异常的治疗、诊断、预防、监测和/或预后的物质、装置、组合物和/或生物标志物的系统的用途。
80.如实施方案79中任一项所述的用途，其中所述觉醒功能异常包括觉醒障碍、夜惊和/或维持睡眠的障碍。
81.如实施方案79-80中任一项所述的用途，其中所述物质、组合物和/或生物标志物包括小分子、蛋白质和/或多核苷酸。
82.如实施方案79-81中任一项所述的用途，其中所述物质、装置、组合物和/或生物标志物直接作用于nAChRα3编码蛋白和/或编码nAChRα3编码蛋白的核酸分子。
83.如实施方案54-62中任一项所述的非人生物体或其活体部分、如实施方案63所述的细胞、细胞系或原代细胞培养物、或如实施方案64-66中任一项所述的组织，其用于筛选适用于觉醒功能异常的治疗、诊断、预防、监测和/或预后的物质、装置、组合物和/或生物标志物。
84.如实施方案83所述的用途，其中所述觉醒功能异常包括觉醒障碍、夜惊和/或维持睡眠的障碍。
实施例
提出下列实施例以将如何制造与使用本发明方法和组合物的完整公开内容以及说明提供给本领域技术人员，且并没有试图限制发明人认为是他们的发明的范围。已尽力确保所用数字(例如量、温度等)的准确性，但可能产生某些实验误差与偏差。除非另有说明，否则份数为重量份，分子量为平均分子量，温度为摄氏度，且压力为大气压或接近大气压。可使用标准缩写，例如bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；nt，核苷酸；i.m.，肌肉内；i.p.，腹膜内；s.c.，皮下；等。
用Prism 5(GraphPad)进行统计分析。曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)用于比较两列数据。采用邓恩氏事后检验(Dunn’s posttest)的克鲁斯凯-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test)用于比较来自突变体、挽救和RNAi的多列数据。费雪氏精确检验(Fisher’s exact test)用于比较觉醒率。统计显著性用星号表示：***表示P<0.001，**表示P<0.01，*表示P<0.05，n.s.表示P>0.05。
实施例1转基因、剔除和敲入蝇的产生
将蝇在25℃和60％湿度下在标准培养基中饲养，并且以12hr:12hr光照:黑暗循环加以保持，除非使用恒定黑暗测定。1)UAS-α3RNAi(THU2756)来自清华果蝇中心(TsingHuaFly Center)。2)UAS-Dicer来自维也纳果蝇RNAi中心(Vienna Drosophila RNAi Center)。3)UAS-THRNAi是来自Mark N.Wu(约翰霍普金斯大学(Johns Hopkins University))。4)UAS-mCD8::GFP、5)UAS-stinger::GFP、6)UAS-Syt::GFP、7)UAS-DenMark、8)LexAop-Flp,UAS-FRT-终止序列-FRT-mCD8::GFP、9)LexAop-myr::GFP和10)UAS-LexADBD来自布卢明顿储备中心(Bloomington Stock Center)。这个研究中使用的所有蝇都已回交成Canton-S背景至少五代。
野生型蝇的总RNA使用TRIzol试剂(Invitrogen)来分离，接着通过PrimeScriptTMII第1链cDNA合成试剂盒(Takara，6210A)来制备第1链cDNA。从第1链cDNA扩增nAChRα3的编码序列，并且插入Addgene质粒26224载体中，从而产生UAS-α3和LexAop-α3DNA构建体。构建体被插入在attP2位点中。
CRISPR/Cas9系统用于产生敲除(knockout)和敲入(knockin)蝇。构建AChR突变体和敲入株系的策略显示于图1中。将靶向编码序列的两个gRNA连同Cas9 mRNA一起注射以产生缺失(deletion)和插入缺失(indel)株系(图1A)。nAChRα3KO突变体通过缺失大部分的配体结合结构域(LBD)和跨膜结构域(TMD)来产生，经缺失部分：NP_525079.3，94号氨基酸-335号氨基酸(图2)。
将另一供体质粒与两个gRNA和Cas9 mRNA一起共注射以产生KOGal4、KORFP、KIGal4和KILexA蝇。将5’同源臂(homologous arms)(约2.5kb)和3’同源臂(约2.5kb)插入pBSKII载体中以产生供体质粒，其中靶标序列处于两个同源臂之间。在通过gRNA来切割靶标位点之后，同源性引导的修复将靶标序列(Gal4、RFP或LexA)从供体引入基因组中的特定位点中，从而替换两个同源臂之间的原始基因组序列。5’同源臂的3’末端被设计来恰好位于KOGal4和KORFP中的起始密码子之后(图1B)，以使翻译由靶标序列中的终止密码子终止。5’同源臂的3’末端被设计在恰好位于KIGal4和KILexA中的终止密码子之前(图1C)，以使翻译不被破坏，因此KIGal4和KILexA可代表靶标基因的尽可能天然的表达模式。nAChR-KOGal4、nAChR-KORFP、nAChR-KIGal4和nAChR-KILexA蝇通过以上策略来产生。
nAChRα3KO-gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-2所示，nAChRα3KOGal4 5’同源臂的正反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3-4所示，nAChRα3KOGal4 3’同源臂的正反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5-6所示，nAChRα3KIGal4 5’同源臂的正反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7-8所示，nAChRα3KIGal4 3’同源臂的正反向引物的核苷酸序列如SEQID NO:9-10所示。
实施例2行为测定
在羽化之后的5小时内，将雄蝇和雌蝇隔离，并且龄期是5～8天的蝇用于行为测定中。
2.1睡眠
将持续超过5分钟的不中断行为不动时期定义为睡眠。简要来说，将单只蝇转移至含有蝇食物的监测管(5mm x 65mm)中，将48个监测管固定在记录板上，并且持续3～5天对蝇进行记录。接着追踪蝇的位置，使用Matlab(Mathworks)来分析睡眠持续时间和速度。
2.2睡眠剥夺(Sleep deprivation)
通过在整个夜晚随机振摇来剥夺睡眠。将记录管固定于硅胶夹持器，接着水平放置至容纳盒中。使盒在伺服电机(TowerProTM MG995)的控制下以顺时针方向或逆时针方向旋转以及碰撞塑料塞以对蝇进行振摇。以2～5分钟的随机间隔对蝇进行振摇。各振摇持续18秒，包括对盒的9次连续旋转。将每30分钟的反弹率(rebound rate)计算为(在剥夺之后的睡眠持续时间–等效时间(equivalent time)内在剥夺之前的睡眠持续时间)/(睡眠丧失(sleep loss))。将累积反弹率计算为从停止剥夺以来的反弹率的总和。
2.3昼夜节律分析
对于昼夜节律分析，持续3天以12h:12h光照黑暗循环(LD cycles)来对蝇进行导引，接着持续9天以恒定黑暗进行导引。通过Actogram J插件来测量和分析移行活动(Locomotor activity)，以分析周期长度。
2.4觉醒测定
1.在觉醒测定中，通过偏心振动电机(1.0g)来在夜晚对蝇进行三次刺激(ZT16、ZT18和ZT20)。将偏心振动电机固定在记录板下面以对蝇进行刺激，并且刺激的强度通过调节电压输出来控制。刺激强度通过连接在板的表面中的加速度传感器(CJMCU_ADXL345型，由ArduinoTM板读取)来测量。将刺激强度设置成1.0g(1.0g等于在地球表面处的重力，9.8m/s2)。各刺激含有3次持续200毫秒的振动，其中间隔800毫秒。将觉醒率计算为由刺激唤醒的蝇的数目与在刺激之前睡着的蝇的数目的比率。
实施例3ACh通过nAChRα3促进觉醒
为探究AChR在调控外源性刺激诱导的觉醒方面的作用，通过实施例2中所述的觉醒测定来测量13个AChR突变株系的觉醒率。结果显示在nAChRα3剔除(knockout)(nAChRα3KO，α3-/-)蝇的情况下，觉醒率显著降低(图3)。图4A表示nAChRα3KO雄蝇α3-/Y(n＝100)、α3+/Y(n＝110)的觉醒率。图4B表示α3+/+(左侧)(n＝91)、α3+/-(中间)(n＝121)和α3-/-(右侧)(n＝63)在机械刺激下的觉醒率。在雄性α3-/Y(图4A)突变蝇与雌性α3-/-(图4B)突变蝇两者的情况下，觉醒率均显著降低。α3+/-蝇的觉醒率处于α3-/-的觉醒率与α3+/+的觉醒率之间(图4B)，从而表明nAChRα3是单倍不足的(haploinsufficient)。
在α3-/-雌性(n＝30)的情况下，在移动期间的速度并未与野生型(n＝48)的速度不同(图5A)，并且α3-/Y(n＝47)雄性的速度甚至略微增加(图5B)，从而表明nAChRα3KO的低响应性不可归因于移动缺陷(defective locomotion)。在nAChRα3KO的情况下，夜间睡眠不与野生型的夜间睡眠不同(图6A-图6D)。在α3-/-蝇(n＝34)的情况下，在睡眠剥夺之后的睡眠恢复略微降低，并且在α3-/-(n＝28)与α3+/+(n＝39)之间，昼夜节律并无不同(图7)。在图7中，在DD(constant darkness days，恒定黑暗日)的情况下，α3-/-(n＝28)的周期长度与α3+/+(n＝39)蝇不具有显著差异(右侧)。*表示P<0.05，n.s.表示P>0.05。曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)。误差棒代表平均值标准误差。使用的是雌蝇。
KOGal4株系用于挽救(rescue)，并且敲入株系用于标记。在KIGal4株系中，使基因组序列缺失，并且用2A-Gal4-终止序列替换，其中Gal4以同框方式融合于C末端。矩形指示外显子，灰色框表示非翻译区，白色框是蛋白质编码序列。
通过将nAChRα3再引入nAChRα3表达性细胞中，同时用α3KOGal4驱动UAS-nAChRα3，而使得α3-/-的觉醒率得以充分挽救(图8)，其中nAChRα3的翻译由2A-Gal4-终止序列终止(图9)，从而证明α3-/-的觉醒表型由nAChRα3的缺失所致。在图9中，矩形指示外显子，灰色框表示非翻译区，白色框是蛋白质编码序列。
实施例4nAChRα3在多巴胺能神经元中产生促进觉醒的作用
为检测nAChRα3的表达，将2A-Gal4同框融合于nAChRα3，从而制备α3KIGal4株系(图9)。其随后用于驱动表达mCD8::GFP、stinger::GFP、Syt::GFP和DenMark的UAS株系以分别对nAChRα3表达性神经元的膜、核、轴突和树突进行标记。
结果显示α3KIGal4在食道下神经节(subesophageal ganglion，SOG)、蕈形体(mushroom bodies，MB)、上神经纤维网(superior neuropils，SNP)和腹侧神经纤维网(ventrolateral neuropils，VLNP)中，以及在腹神经索(ventral nerve cord，VNC)的中胸神经原节、后胸神经原节(mesothoracic,、metathoracic neuromere，MN、MtN)和腹部中心(abdominal center，AC)中表达(图10A-图10B和图11A-图11C)。α3KIGal4的表达模式类似于多巴胺能神经元的先前报道表达模式(请参见Mao,Z.和Davis,R.L.Eight differenttypes of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom bodyneuropil:anatomical and physiological heterogeneity.Front.Neural Circuits 3,5(2009).)。
为测试多巴胺能神经元中nAChRα3促进觉醒的可能性，首先检查在由多巴胺的合成酶酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)标记的多巴胺能神经元中nAChRα3是否表达。nAChRα3和TH表达重叠(overlaps)通过先前报道中所述的拆分LexA策略来检测(请参见Ting,C.等Focusing transgene expression in Drosophila by coupling Gal4 with anovel split-LexA expression system.Genetics 188,229–233(2011).)。使Gal4和p65AD以同框方式融合于编码序列的3’末端以产生THKIGal4和TH-p65AD，其中策略和细节由Deng,B.等人(Chemoconnectomics:Mapping Chemical Transmission inDrosophila.Neuron 101,1–18(2019).)描述。
结果显示nAChRα3和TH在CNS中的多个区域中共定位(colocalized)(图12A-图12B)，所述区域包括视叶、MB、PB、中央复合体(central complex，CC)、SOG和VNC。nAChRα3和TH的共定位允许nAChRα3通过多巴胺进行信号传导。
将nAChRα3再引入处于α3-/-背景下的nAChRα3和TH交叉细胞中，于是觉醒率得以部分挽救(图13A，对于α3KO/α3KOGal4；LexAop-α3/+(n＝82)、α3KO/α3KOGal4；TH-p65AD,UAS-LexADBD/+(n＝92)、α3KO/α3KOGal4；TH-p65AD,UAS-LexADBD/LexAop-α3(n＝43)以及野生型(n＝96)蝇绘制觉醒的蝇数目(实心棒条)以及保持睡眠的蝇数目(空心棒条)。觉醒率表示在各棒条下。)。这些结果表明α3表达性多巴胺能神经元中的nAChRα3足以促进觉醒。由THKIGal4驱动的对多巴胺能神经元中nAChRα3的RNAi敲低使觉醒率显著降低(图13B，对于UAS-Dicer/+；THKIGal4/+(n＝114)、UAS-α3RNAi/+(n＝132)、UAS-Dicer/+；THKIGal4/UAS-α3RNAi(n＝99)以及野生型(n＝113)蝇绘制蝇的数目)，从而表明多巴胺能神经元中的nAChRα3为促进觉醒所必需。总之，这些数据表明nAChRα3在多巴胺能神经元中产生促进觉醒的作用。
对nAChRα3表达性神经元中TH的RNAi敲低也使觉醒率显著降低(图14)，从而表明nAChRα3表达性神经元中的多巴胺为觉醒所必需。
用多巴胺前体L-多巴对蝇喂食，以测试nAChRα3是否通过多巴胺信号来产生作用。L-多巴将α3-/-的觉醒率挽救至用模拟物(mock)喂食的α3+/+蝇的水平(图15)。综上，我们的结果表明nAChRα3在多巴胺能神经元中通过正性调控(positively regulating)多巴胺信号传导来产生促进觉醒的作用。
虽然本文中已示出和描述了本发明的某些实施方案，但对本领域技术人员来说将显而易见的是此类实施方案仅仅是通过举例而提供。本发明不旨在受说明书内所提供的特定实施例限制。虽然已参照上述说明书描述了本发明，但本文中对实施方案的描述和说明并不意在以限制意义来解释。本领域技术人员将会想到许多变化、改变以及替换，而不会脱离本发明。此外，应了解，本发明的所有方面不限于本文所阐述的特定描述、配置或相对比例，其取决于多种条件和变量。应了解，在实践本发明时可采用本文中所描述的本发明实施方案的各种替代方案。因此可以预期的是，本发明还应涵盖任何此类替代、修改、变化或等效物。以下权利要求旨在限定本发明的范围并且从而涵盖这些权利要求和其等效物的范围内的方法和结构。
序列表
<110> 北京原基华毅生物科技有限公司
<120> 调整觉醒的物质及方法
<130> 0122-PA-013
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> nAChRα3KO-gRNA1
<400> 1
gggagcccaa ggagtatgg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> nAChRα3KO-gRNA2
<400> 2
ggagccatcg tgtgcgtttg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> nAChRα3KOGal4-5‘臂-正向引物
<400> 3
actcaagtgg cgacttaaag 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> nAChRα3KOGal4-5‘臂-反向引物
<400> 4
cacttgaaac cacttcatct c 21
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> nAChRα3KOGal4-3‘臂-正向引物
<400> 5
cgacatcctc tcgacactc 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> nAChRα3KOGal4-3‘臂-反向引物
<400> 6
ctaaggccag tcagcagac 19
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> nAChRα3KIGal4-5'臂-正向引物
<400> 7
agcctcaatt gcagctg 17
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> nAChRα3KIGal4-5'臂-反向引物
<400> 8
caacacaggc ctggc 15
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> nAChRα3KIGal4-3'臂-正向引物
<400> 9
aaccacaaaa cttgttccag 20
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> nAChRα3KIGal4-3'臂-反向引物
<400> 10
cgaagaaggc aatagcg 17
<210> 11
<211> 795
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> nAChRα3 编码蛋白
<400> 11
Met Lys Trp Phe Gln Val Thr Ile Asp Met Ile Leu Val Leu Ser Phe
1 5 10 15
Ile Ser Ser Ser Thr Ala Asn Pro Asp Ala Lys Arg Leu Tyr Asp Asp
20 25 30
Leu Leu Ser Asn Tyr Asn Lys Leu Val Arg Pro Val Val Asn Val Thr
35 40 45
Asp Ala Leu Thr Val Arg Ile Lys Leu Lys Leu Ser Gln Leu Ile Asp
50 55 60
Val Asn Leu Lys Asn Gln Ile Met Thr Thr Asn Leu Trp Val Glu Gln
65 70 75 80
Ser Trp Tyr Asp Tyr Lys Leu Lys Trp Glu Pro Lys Glu Tyr Gly Gly
85 90 95
Val Glu Met Leu His Val Pro Ser Asp His Ile Trp Arg Pro Asp Ile
100 105 110
Val Leu Tyr Asn Asn Ala Asp Gly Asn Phe Glu Val Thr Leu Ala Thr
115 120 125
Lys Ala Thr Leu Asn Tyr Thr Gly Arg Val Glu Trp Arg Pro Pro Ala
130 135 140
Ile Tyr Lys Ser Ser Cys Glu Ile Asp Val Glu Tyr Phe Pro Phe Asp
145 150 155 160
Glu Gln Thr Cys Val Met Lys Phe Gly Ser Trp Thr Tyr Asp Gly Phe
165 170 175
Gln Val Asp Leu Arg His Ile Asp Glu Leu Asn Gly Thr Asn Val Val
180 185 190
Glu Val Gly Val Asp Leu Ser Glu Phe Tyr Thr Ser Val Glu Trp Asp
195 200 205
Ile Leu Glu Val Pro Ala Val Arg Asn Glu Lys Phe Tyr Thr Cys Cys
210 215 220
Asp Glu Pro Tyr Leu Asp Ile Thr Phe Asn Ile Thr Met Arg Arg Lys
225 230 235 240
Thr Leu Phe Tyr Thr Val Asn Leu Ile Ile Pro Cys Met Gly Ile Ser
245 250 255
Phe Leu Thr Ile Leu Val Phe Tyr Leu Pro Ser Asp Ser Gly Glu Lys
260 265 270
Val Ser Leu Ser Ile Ser Ile Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Phe Leu
275 280 285
Leu Leu Ala Glu Ile Ile Pro Pro Thr Ser Leu Val Val Pro Leu Leu
290 295 300
Gly Lys Phe Val Leu Phe Thr Met Ile Leu Asp Thr Phe Ser Ile Cys
305 310 315 320
Val Thr Val Leu Val Leu Asn Ile His Phe Arg Ser Pro Gln Thr His
325 330 335
Thr Met Ala Pro Trp Val Arg Thr Val Phe Ile Asn Gln Leu Pro Arg
340 345 350
Phe Leu Val Met Arg Arg Pro Leu Tyr Pro Ile Ser Glu Met Ile Lys
355 360 365
Ser Ser Arg Arg Leu Met Val Arg Thr Cys Asn Gly Leu Glu Leu Arg
370 375 380
Asp Gln Ile Pro Pro Leu Pro Pro Pro Val Ala Leu Ser Arg Met His
385 390 395 400
His Ser Pro Lys Thr Thr Ser Arg Ser Thr Ser Pro His Leu Gln His
405 410 415
Arg Val Gln Thr Tyr Asn Leu Met Asp Glu Cys Gly Met Gly Met Gly
420 425 430
Gly Gly Ala Ser Thr Ile Thr Gly His Leu Ser Ser Leu Tyr Pro Pro
435 440 445
Thr Met Ser Thr Ala Asn Gln Gln Thr Ser Thr Thr Ser Ser Leu Ile
450 455 460
Asp Ala Gln Tyr His Asn Gln Tyr Gln Gln Thr Gly Gly Ser Leu Leu
465 470 475 480
Asp His Pro Leu Thr Pro Thr Lys Phe Arg Gln Met Thr Ser Thr Ser
485 490 495
Ser Gln Thr Gly Gln Asn Gly Ser Gly Asn Gly Asn Gly Asn Gly Gly
500 505 510
Tyr Gly Gly His Gly Gln Ser Gly Gly His His Leu Tyr Arg Gln Gln
515 520 525
Ser Ser Cys Ser Ala Asn Phe Ser Pro Leu Pro Gln His Ala His Gln
530 535 540
Ala His Ala Ser Thr Thr Thr Ser Asp Leu Gly Met Ala Asn Pro Asn
545 550 555 560
Val Ile Lys Ser Thr Thr Thr Val Asn Ser Val Ala Thr Ala Ser Thr
565 570 575
Leu Ala Asp Ser Cys Cys Ser Gly Thr Ile Gln Ile His Gln Gly Met
580 585 590
Gly Ala Gly Ala Ala Cys Gln Ser Ser Glu Leu Leu His His Gln Gln
595 600 605
Leu His His Gln Gln Met His His Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
610 615 620
Gln His His His His Gln Arg Pro Thr Thr Ser Ala Ala Ala Ala Ala
625 630 635 640
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Pro Ser Thr Ser Ala Ala Ala Ala Ala
645 650 655
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Thr Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro
660 665 670
Ala Gly Val Cys Asp Ile Leu Pro Ala Cys Gln Arg Glu Gly Gly Pro
675 680 685
His Cys Cys Ser Gly Arg Gly Asn Val Arg Gln Arg Trp His Thr Cys
690 695 700
Pro Glu Leu His Lys Ala Met Asp Gly Val Thr Tyr Ile Ala Asp Gln
705 710 715 720
Thr Arg Lys Glu Glu Glu Ser Thr Arg Val Lys Glu Asp Trp Lys Tyr
725 730 735
Val Ala Met Val Leu Asp Arg Leu Phe Leu Trp Ile Phe Thr Ile Ala
740 745 750
Val Val Val Gly Thr Ala Gly Ile Ile Leu Gln Ala Pro Thr Leu Tyr
755 760 765
Asp Thr Arg Met Pro Ile Asp Ile Lys Leu Ser Glu Ile Ala Ser Thr
770 775 780
Thr Ala Lys Pro Asn Val Ala Arg Pro Val Leu
785 790 795

Claims (10)

1.一种用于选择用于调整觉醒的药剂的方法，所述方法包括：
提供候选药剂；
测定所述候选药剂对nAChRα3的活性和/或表达的影响；并且
如果所述nAChRα3的所述活性和/或表达由所述候选药剂改变，那么将所述候选药剂选为用于调整觉醒的药剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中如果所述nAChRα3的所述活性和/或表达由所述候选药剂增加，那么将所述候选药剂选为用于促进觉醒的药剂。
3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中如果所述nAChRα3的所述活性和/或表达由所述候选药剂降低，那么将所述候选药剂选为用于减少觉醒的药剂。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述nAChRα3是黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)nAChRα3或其直系同源物。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述测定包括：测定所述候选药剂对多巴胺能细胞中所述nAChRα3的活性和/或表达的影响。
6.一种用于选择用于调整觉醒的药剂的系统，其中所述系统包含能够测定所述药剂对nAChRα3的活性和/或表达的影响的物质。
7.能够改变nAChRα3的活性和/或表达的药剂在制造用于治疗、预防觉醒功能异常或延迟觉醒功能异常的进展的药物中的用途。
8.一种能够改变nAChRα3编码蛋白的活性和/或表达的药剂，所述药剂用于治疗、预防觉醒功能异常或延迟觉醒功能异常的进展。
9.能够指示受试者的nAChRα3的活性和/或表达水平的试剂制造关于所述受试者患有觉醒功能异常，和/或处于患有觉醒功能异常的风险下的可能性的指示剂的用途。
10.一种非人生物体或其活体部分，其包含功能受损的nAChRα3。
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