CN111807952B - 一种参与脂质代谢的新型化合物及其制备方法 - Google Patents

一种参与脂质代谢的新型化合物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种新型的化合物，所述化合物为E‑13‑(2‑甲基苯基)‑12‑烯‑十三酸，上述化合物来源于球孢链霉菌C‑1027，其能够影响细胞对于低密度脂蛋白的摄取，参与了胞内的脂质代谢过程。上述化合物为白色无定形粉末，难溶于水，易溶于丙酮、氯仿等低极性有机溶剂。本发明还提供了利用调控蛋白SGL6295和调控蛋白SGL6296制备上述化合物的方法。

Description

一种参与脂质代谢的新型化合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种化合物及其制备方法和应用，尤其涉及一种 新型的参与脂质代谢的化合物及其制备方法。
背景技术
微生物的次级代谢产物是药物发现的重要来源，链霉菌产生的次级代谢产物具有广泛 的生物活性，超过三分之二的临床有用抗生素是从链霉菌中分离出来的。传统的天然产物 发现方法存在化合物重复发现率高和新结构天然产物的发现率低等缺点。随着基因测序成 本的降低和生物信息学技术的发展，科学家们发现微生物中仍存在大量未知的生物合成基 因簇(biosynthetic gene clusters,BGCs)，具有巨大的开发潜力。但由于大多数天然产物BGCs 在实验室培养条件下不表达或表达量很低，只有在特殊的环境下才会被活化并表达出相应 的产物，因此目前发现微生物次级代谢产物方法的瓶颈之一是如何激活沉默BGCs。
球孢链霉菌C-1027(Streptomyces globisporus C-1027)是从湖北省潜江县的土壤中分 离到的一株链霉菌，能产生具有抗肿瘤活性的新型烯二炔类抗生素-力达霉素(又名C-1027)。 申请人经过十几年的研究，已经初步阐明了力达霉素的生物合成途径和调控机制，并获得 了该菌株完整的基因组序列。在此基础上，申请人拟采用基因组发掘技术对该菌株中的其 他次级代谢产物开展研究，采用过表达基因簇内部或附近可能的途径特异性调控因子的方 法激活沉默BGCs，并结合生物信息学分析、化学分离以及代谢网络分析等确定目标基因簇 的产物。
本申请中，申请人结合基因组发掘技术和转录组测序，确定S.globisporus C-1027中的 沉默生物合成基因簇，然后采用过表达基因簇内部或附近可能的途径特异性调控蛋白的策 略诱导激活，并从基因簇激活的菌株中分离鉴定新的天然产物。
发明内容
一方面，本发明提供了一种新型的化合物E-13-(2-甲基苯基)-12-烯-十三酸，所述化合 物的结构式如式I所示：
Figure BDA0002542348010000021
所述化合物参与了细胞的脂质代谢。
上述化合物来源于球孢链霉菌C-1027(Streptomyces globisporus C-1027)，其能够影响 细胞对于低密度脂蛋白的摄取，参与了胞内的脂质代谢过程。
上述化合物为白色无定形粉末，难溶于水，易溶于丙酮、氯仿等低极性有机溶剂。
上述化合物的1H和13C NMR数据如表1-2，其ESI-MS/MS、HRMS、1H-NMR、13C-NMR、 1H-1H COSY、HSQC、HMBC图谱如图5-12所示。
本发明中，上述化合物，E-13-(2-甲基苯基)-12-烯-十三酸，也用化合物1来指代。
另一方面，本发明提供了一种蛋白组合，所述蛋白组合包括调控蛋白SGL6295和调控 蛋白SGL6296，其中，所述SGL6295的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述SGL6296 的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明还提供了一种核酸构建体，所述构建体包括第一核酸序列和第二核酸序列，其 中，所述第一核酸序列编码调控蛋白SGL6295，所述第二核酸序列编码调控蛋白SGL6296。
在优选的实施方式中，所述第一核酸序列如SEQ ID No.2所示，所述第二核酸序列如 SEQ ID No.4所示。
在一个实施方式中，所述核酸构建体还包括启动子和终止子；优选的，所述启动子选 自下组：组成型启动子、诱导型启动子、或者强启动子。
另一方面，本发明还提供了一种重组载体，所述载体包括上述核酸构建体。
在优选的实施方式中，所述载体为表达载体，优选为，pL646载体。
另一方面，本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括上述重组载体。
所述宿主细胞选自原核细胞或真核细胞，在优选的实施方式中，所述宿主细胞为球孢 链霉菌(Streptomyces globisporus)，优选为，球孢链霉菌C-1027。
另一方面，本发明还提供了一种制备上述化合物的方法，所述方法包括利用上述蛋白 组合、核酸构建体、重组载体或宿主细胞制备上述化合物的步骤。
另一方面，本发明还提供了上述蛋白组合、核酸构建体、重组载体或宿主细胞在制备 上述化合物中的应用。
在优选的实施方式中，所述制备上述化合物的方法包括利用所述宿主细胞进行发酵的 步骤；进一步的，还包括对发酵液进行处理的步骤。
附图说明
图1.菌株C-1027/pL-C26-SGL6295-6296乙酸乙酯提取物的TLC分析。
图2.菌株C-1027/pL-C26-SGL6295-6296乙酸乙酯提取物的HPLC分析。
图3.化合物1和2的TLC分析。
图4.化合物1的半制备HPLC(280nm)色谱图(A)和紫外图谱(B)。
图5.化合物1的1H-NMR谱图(500MHz,(CD3)2CO)。
图6.化合物1的13C-NMR谱图(125MHz,(CD3)2CO)。
图7.化合物1的1H-1H COSY谱图(500MHz,(CD3)2CO)。
图8.化合物1的HSQC谱图((CD3)2CO)。
图9.化合物1的HMBC谱图((CD3)2CO)。
图10.化合物1的DEPT谱图(125MHz,(CD3)2CO)。
图11.化合物1的(-)HRMS图谱。
图12.化合物1的(-)-ESI-MS/MS质谱图,分子离子峰为m/z 301.22。
图13.化合物1对细胞内脂质代谢的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而 已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技 术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技 术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
以球孢链霉菌C-1027(Streptomyces globisporus C-1027)为菌种，申请人分析其基因 组序列预测得到5个非核糖体肽杂合聚酮类(NRPS-PKS)生物合成基因簇(Cluster19、 26、28、32、33)；之后，收集发酵48h的菌体，提取了RNA，结果提示，除了编码力达 霉素的生物合成基因簇Cluster 33在转录上是高表达的，其它4个生物合成基因簇(Cluster19、26、28、32)在转录水平上表达量较低或不表达，是沉默的基因簇。
其中基因簇Cluster 26中包括两个调控蛋白SGL6295和SGL6296，SGL6295和SGL6296 的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示，其核酸序列分别如SEQ IDNo.2和 SEQ ID No.4所示。
实施例1、过表达沉默生物合成基因簇Cluster 26中关键调控蛋白SGL6295和SGL6296
以野生型菌株S.globisporus C-1027的基因组总DNA为模板，通过PCR扩增调控基因SGL6295和SGL6296，克隆至pEasy-Blunt Zero载体中，重组质粒酶切验证得到与PCR 片段长度一致的条带，经测序确定序列正确后，再用NdeI和BamHI双酶切后克隆至基于pSET152的表达质粒pL646【Hong B,Phornphisutthimas S,Tilley E,Baumberg S,McDowall KJ. Streptomycin production by Streptomyces griseus can be modulatedby a mechanism not associated with change in the adpA component of the A-factor cascade.Biotechnol Lett 2007, 29:57-64】的NdeI和BamHI位点，得到重组质粒pL-C26-SGL6295-6296。
将重组质粒pL-C26-SGL6295-6296通过接合转移导入到野生型菌株S.globisporus C-1027中，利用阿普霉素抗性筛选及PCR验证获得阳性接合子 C-1027/pL-C26-SGL6295-6296，同时也将pSET152通过接合转移导入到野生型菌株中，获 得对照菌株C-1027/pSET152。
实施例2、过表达调控蛋白SGL6295和SGL6296的菌株的发酵产物分析
对过表达调控蛋白SGL6295和SGL6296的菌株液体发酵培养7天，对脂溶性次级代谢 产物(乙酸乙酯提取物)进行TLC和HPLC分析。TLC结果显示过表达菌株 C-1027/pL-C26-SGL6295-6296与对照菌株C-1027/pSET152相比出现新的次级代谢产物 (图1)，且较对照菌株多出至少七条色带；HPLC结果(图2)显示过表达菌株在7-19min 出现较多的显著差异峰，30.6min的化合物产量有所提高。说明调控蛋白SGL6295和6296 过表达之后，引起代谢产物种类和数量的增加。对TLC板上差异条带刮板后进行HPLC分 析，显示该条带即为30.6min的产物。
实施例3、菌株C-1027/pL-C26-SGL6295-6296产物鉴定
采用如下的方法对菌株C-1027/pL-C26-SGL6295-6296的产物进行前处理和分离，经制 备薄层层析和制备高压液相色谱纯化后，在菌株C-1027/pL-C26-SGL6295-6296中分离得到 化合物1-5。
化合物1-5的提取分离：
发酵上清液20L，经等体积乙酸乙酯萃取后，得到萃取物1.1g。萃取物使用等量的硅 胶混合后，进行硅胶柱层析分离，依次使用氯仿：甲醇[100:0(0.2g,Fr.1)，50:1(0.1g,Fr.2)， 10:1(0.12g,Fr.3)，5:1(0.15g,Fr.4)和1:1(0.12g,Fr.5)]的流动相洗脱，获得五个组分。 使用TLC对上述五个组分依次进行分析，展开剂使用氯仿：甲醇：醋酸100:20:1进行展开， 发现目标化合物分布于Fr.2和Fr.3组分。合并Fr.2和Fr.3并进行制备薄层层析(展开剂 氯仿:甲醇:醋酸100:20:1)，将薄层板上的5条颜色较深的条带刮下，硅胶粉末经过三氯甲 烷洗脱，获得五条色带对应的洗脱产物。洗脱产物蒸干后，再使用半制备高压液相对化合 物进行纯化。条带1经过95％乙腈水等度洗脱获得化合物1(tR＝20min,35mg)；80％乙 腈水溶液洗脱获得化合物2(tR＝20min,20mg)；75％乙腈水溶液洗脱获得化合物3(tR＝20 min,1.5mg)；60％乙腈水溶液洗脱获得化合物4(tR＝20min,5.0mg)，条带五化合物粗品 量少于1.0mg没有得到足够的量进行NMR解析。Fr.4组分(0.15g)为淡黄色油状物，经过制备薄层层析分离得到一条色带(展开剂为氯仿：甲醇：乙酸50:10:1，Rf为0.5)，经 过半制备高压液相纯化后，得到化合物5(20.5mg)。其中，化合物1-5分别为E-13-(2-甲 基苯基)-12-烯-十三酸(化合物1)，确定为新结构的天然产物；E-5-(2-甲基苯基)-4-戊烯酸(化合物2)；E-5-(2-甲基苯基)-3-氧代-4-戊烯酸(化合物3)；5-(2-甲基苯基)-5-氧代戊酸(化 合物4)和E-3-(2-甲基苯基)丙烯酸(化合物5)。
实施例4、化合物1结构鉴定和功能
将菌株C-1027/pL-C26-SGL6295-6296的代谢产物混合物样品经过制备薄层层析，得到 含有化合物1(条带1)和化合物2(条带2)的两条色带(图3)。将两条条带刮下得到含有化合物的硅胶粉末，硅胶粉末使用三氯甲烷洗脱，并对洗脱产物进行TLC分析。化合物1粗品35mg，经半制备高压液相色谱纯化后获得纯品约20mg。化合物1的HPLC分析(图 4A)显示其中保留时间为tR＝19.5min，在线紫外图谱显示其最大吸收波长为λmax:205nm和 249nm(图4B)。
化合物1为白色无定形粉末，难溶于水，易溶于丙酮、氯仿等低极性有机溶剂。薄层层析显示在展开剂为氯仿:甲醇:醋酸100:20:1体系下，Rf值约0.7，紫外灯λ254nm下有暗斑。ESI源负离子模式给出化合物1的准分子离子峰为m/z 301.2[M-H]-，高分辨质谱给出准确分子量为m/z 301.2185[M-H]-，与分子式C20H30O2计算质量数的误差为3.97ppm，其 结构式如式I所示。
Figure BDA0002542348010000051
化合物1的1H NMR[溶剂为(CD3)2CO]给出了一组不对称邻二取代的苯环信号，δH7.41 (1H,d,J＝7.5Hz)，7.02(3H,m)；一组双取代反式双键信号，δH 6.62(1H,dt,J＝13.5,1.5Hz)， 6.12(1H,dt,J＝13.5,5.5Hz)；一组烯丙位亚甲基信号，δH 2.27(1H,t,J＝12.0Hz)，2.23(1H, ddd,J＝12.0,12.0,1.5Hz)；一组与不饱和季碳相连的甲基信号，δH2.29(3H,s)，和其它饱和 质子信号(2.20-1.25ppm,18H)。化合物1的碳谱与DEPT谱给出了所有20个碳信号，包 括一个羧基、一个甲基、一个邻二取代苯环、一个双键和10个饱和亚甲基。
借助于HSQC将化合物1的质子与碳信号一一归属。在化合物1的1H-1HCOSY图谱 中，H2-2/H2-3/～/H2-11/H-12/H-13相关，以及H-16/H-17/H-18/H-19相关。化合物1最终 结构通过HMBC实验得以确定。在HMBC中，单峰甲基质子与C-14和C-16相关，说明 甲基连接在苯环上；H-13与C-15和C-19相关，以及H-12与C-14相关，说明双键一端 与苯环直接相连。同时H-12(H-10)与C-10(C-12)互相相关，H-13(H-11)与C-11(C-13) 互相相关，说明双键的另一端与脂肪酸长链相连，与1H-1HCOSY给出的自旋体系一致。另 外，H2-3与脂肪酸末端羧基碳相连，也说明脂肪酸的存在。因此，化合物1被确定为：E-13- (2-甲基苯基)-12-烯-十三酸，为新化合物，结构如式I所示。化合物1的1H和13C NMR 数据见表1-2，其ESI-MS/MS、HRMS、1H-NMR、13C-NMR、1H-1H COSY、HSQC、HMBC 图谱如图5-12所示。
表1化合物1的1H NMR数据
Figure BDA0002542348010000061
表2化合物1的13C NMR数据
Figure BDA0002542348010000062
Figure BDA0002542348010000071
选用终浓度为4μg/ml的化合物1在50μg/ml LDL-C存在的条件下，作用HepG2细 胞24h，通过油红O染色结果来确定化合物1对HepG2细胞LDL-C(低密度脂蛋白)摄 取的影响(图13)；具体操作如下：取对数生长的细胞，制备单细胞悬液后以5×105个/ml的 密度接种于6孔细胞培养板，每孔2ml。16h细胞贴壁后，实验分成4组分别进行处理， 第一组：DMSO对照，第二组加化合物1(4μg/ml)，第三组LDL-C(50μg/ml)对照，第 四组同时加化合物1(4μg/ml)和LDL-C。作用24h后，弃去培养液上清，PBS洗2遍， 每次1min。4％多聚甲醛固定细胞10min，再用PBS洗2遍。60％异丙醇平衡10min，油 红O染色液孵育30min后，60％异丙醇脱色1min，PBS洗2遍，每次1min。加入甘油 封片，通过显微镜成像系统观察细胞内油红O着色情况。
如图13所示，结果显示在LDL-C存在的情况下，经化合物1作用后HepG2细胞内的脂滴与对照相比明显增多，呈散在分布，提示化合物1促进了HepG2细胞对LDL-C的摄 取，进而影响了脂质代谢过程。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医学科学院
<120> 一种参与脂质代谢的新型化合物及其制备方法
<130> 111
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
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<213> Streptomyces globisporus
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35 40 45
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Glu Ser Val Leu Arg Val Leu Gly Glu Lys Pro Gly Arg Ala Val Val
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Arg Val Leu Cys Thr Ala Glu Ile Ala Ser Asp Val Ala Glu Arg Leu
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Ala Gly Leu Pro Ala Glu Arg Thr Glu Val Arg Val Ser Asp Ser Ala
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Arg Arg Leu Glu Asp His Leu Arg Leu Ser Pro Arg Leu Arg Leu Glu
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Gln Ala Leu Ile Glu Ser Ser Val Ala Met His Arg Ala His Thr Ala
20 25 30
Gln Glu Gln Leu Ile Ala Ser Val Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Val Leu
35 40 45
Glu Thr Ala Gln Asn Leu Ile Asn Gly Ala Thr Arg Ser Ile Asp Ile
50 55 60
Val His Ala Arg Arg Pro Ser Ala Ala Asp Gln Ala Ala Arg Arg Ser
65 70 75 80
Asp Arg Val Glu Arg Glu Leu Leu Arg Thr Ala Ala Asp Gly Ile Ala
85 90 95
Ile Arg Leu Leu Thr Thr Pro Ala Leu Leu Asp Val Asp Phe Val Arg
100 105 110
Glu Gln Val Gly Arg Glu Arg Pro Val Ala Val Arg Val Ala Arg Met
115 120 125
Pro Pro Leu Gln Ala Leu Ile Val Asp Gly Ala Ala Ala Phe Val Val
130 135 140
Thr Glu Ser Ala Val Gly Arg Arg Cys Ser Val Val Arg Glu Pro Glu
145 150 155 160
Val Leu Arg Thr Leu Gln Ala Phe Phe Gln Ser Val Trp Ser Asp Ala
165 170 175
Thr Pro Ala Gly Asp Ser Thr Ala Phe Asp Gly Arg Gly Trp Pro Ala
180 185 190
Leu Val His Arg Val Leu Ala Ala Leu Glu Ser Gly Val Thr Asp Glu
195 200 205
Ile Ala Ala Arg Glu Asn Ala Val Ser Val Arg Thr Tyr Arg Arg His
210 215 220
Val Ala Glu Val Met Ala Phe Leu Gly Ala Thr Ser Arg Phe Gln Ala
225 230 235 240
Gly Val Arg Ala Ala Glu Leu Gly Leu Leu Pro Ala Pro Gln Ser Tyr
245 250 255
Ala Asn Arg Pro Ser Arg Ser Arg Pro Asp Ser
260 265
<210> 4
<211> 804
<212> DNA
<213> Streptomyces globisporus
<400> 4
gtgctggacc gacgcgagga caaactcgaa ctggcgttgc tcgaggtgca ggcgctcatc 60
gagtcgtccg tcgccatgca ccgtgcgcac acggcccagg agcaactgat cgcatcggtg 120
gccggtgagt acggtgcggt gctggaaacc gcccagaacc tgatcaacgg ggccacgcgc 180
agcatcgaca tcgttcacgc acgccgaccg agcgcggcgg accaggccgc gcgccggtcg 240
gaccgggtcg agcgagaact gctccgcacg gcggccgacg gcatcgcgat ccgtctgctc 300
accacaccgg ccctcctcga cgtcgacttc gtacgcgaac aggtcggcag ggaaaggccg 360
gtggcggtcc gcgtcgcgcg gatgcctccg ctgcaggcgc tgatcgtcga cggcgccgcc 420
gccttcgtgg tcaccgagtc cgccgtgggc cgcaggtgct cggtggtccg ggaaccggag 480
gtgctgcgca cgctccaggc cttcttccag agcgtgtgga gcgacgcgac acccgccggg 540
gacagcaccg ccttcgacgg acggggctgg ccggccctcg tccaccgtgt tctggccgcg 600
ctggagagcg gagtcaccga cgagatagcg gcccgtgaga acgccgtgtc cgtgcggacc 660
taccggcgcc atgtcgccga ggtgatggcg tttctcgggg cgacctcccg tttccaggcc 720
ggagtgaggg ccgccgaact cggcctgctc ccggccccgc agtcctacgc caaccgccct 780
tcgcgcagcc gcccggacag ctga 804

Claims (9)

1.一种新型的化合物，所述化合物为E-13-(2-甲基苯基)-12-烯-十三酸，其结构式如式I所示：
Figure FDA0002542348000000011
所述化合物参与了细胞的脂质代谢。
2.一种蛋白组合，所述蛋白组合包括调控蛋白SGL6295和调控蛋白SGL6296，其中，所述SGL6295的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述SGL6296的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
3.一种核酸构建体，所述构建体包括第一核酸序列和第二核酸序列，其中，所述第一核酸序列编码权利要求2中的调控蛋白SGL6295，所述第二核酸序列编码权利要求2中的调控蛋白SGL6296。
4.一种重组载体，所述载体包括权利要求3所述的核酸构建体。
5.一种宿主细胞，所述宿主细胞包括权利要求4所述的重组载体。
6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为球孢链霉菌(Streptomyces globisporus)。
7.权利要求2所述的蛋白组合、权利要求3所述的核酸构建体、权利要求4所述的重组载体、或权利要求5-6任一所述的宿主细胞在制备权利要求1所述的化合物中的应用。
8.一种制备权利要求1所述的化合物的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求5-6任一所述的宿主细胞进行发酵的步骤。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括对发酵液进行处理的步骤。
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