CN111801102A

CN111801102A - 用于形成含铜络合物的方法和组合物及其用途

Info

Publication number: CN111801102A
Application number: CN201880085415.XA
Authority: CN
Inventors: 尼古拉斯·汤克斯; 纳瓦索纳·克里希南; 安德烈亚斯·格里尔; 霍华德·萨尔德
Original assignee: Depmede; Leng Quangangshiyanshi
Current assignee: Depmede; Leng Quangangshiyanshi
Priority date: 2017-11-06
Filing date: 2018-11-06
Publication date: 2020-10-20
Anticipated expiration: 2038-11-06
Also published as: WO2019090331A1; CN111801102B; AU2018360845A1; CA3081815A1; US20200376006A1; US20220370479A1; US11406647B2; EP3706757A1; EP3706757A4; AU2018360845B2

Abstract

提供了形成含铜络合物的方法，包括使含铜样品与式I化合物接触：其中R是‑OH或‑O‑CH₃。还提供了抑制样品中激酶的酶活性的方法，包括使样品与式I化合物接触。还提供了向受试者施用包括任选地与铜络合的式I化合物的药物组合物的方法。还提供了包括与式I化合物络合的铜的药物组合物。

Description

用于形成含铜络合物的方法和组合物及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年11月6日提交的美国临时专利申请号62/582,045的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

政府权利声明

本发明是在由美国国立卫生研究院授予的资助号为CA053840和GM055989的政府支持下做出的。政府拥有本发明的某些权利。

技术领域

本文公开的主题涉及用于与铜离子络合的化合物，以及与铜离子络合的化合物及其用途。更具体地，公开了与铜形成络合物的3-(取代的氨基)-7-羟基-胆烷酸衍生物，及其作为铜螯合剂/酶活性抑制剂和疾病治疗的用途。

背景技术

信号转导通路的异常调节，以及随之而来的蛋白质磷酸化正常模式的破坏，已经与包括糖尿病、肥胖症和癌症在内的多种主要人类疾病的病因有关。靶向此类信号转导通路的能力选择性地拥有巨大的治疗潜力。在过去的十年中，蛋白激酶已成为主要的可用药的靶点。特别是，几种针对蛋白激酶的药物对各种癌症的治疗已产生了重大影响。然而，对用于药物开发的激酶的关注已经遇到了若干挑战，包括对这样的疗法的内在和获得性抗性。因此，需要其他靶点和方法。在这种情况下，重要的是要记住，蛋白质磷酸化是一个可逆的过程，其中激酶和磷酸酶的协同和竞争活性对于确定信号转导的结果很重要。蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)代表着一大类蛋白质，它们与激酶协同作用以控制细胞信号转导，也与几种人类疾病的病因有关。然而，PTP仍未充分利用作为治疗靶点。尤其重要的是通过靶向磷酸酶和激酶的活性来开发糖尿病、肥胖症和癌症的治疗。

此外，通过控制激酶(诸如MEK)的活性，已经表明铜与信号转导的调控有关，将铜与细胞生长的控制，以及其在肿瘤发生和转移方面的破坏联系起来。铜的生理水平处于复杂的体内平衡控制下，包括控制流入和流出的转运蛋白，以及将金属递送到其作用部位的专门分子伴侣。这些体内平衡机制的破坏与多种疾病状态相关。在铜排泄中起作用的ATP7B突变导致金属积累，从而导致威尔逊氏病(Wilson’s disease，一种严重的常染色体隐性遗传疾患)。特别地，在肝脏中感觉到该疾病的生理负担，因为该组织表达高水平的ATP7B。它始于症状前期，在此期间铜在肝脏中积累。各种肝脏问题都会遇到，从肝脏肿大到肝炎和肝硬化，甚至急性肝衰竭。随着疾病的进展，它会导致神经精神症状的发展，包括言语和认知障碍，特别是震颤和肌张力障碍，以及共济失调和帕金森病。另外，在病程中的某些时候，威尔逊患者会出现精神问题，包括人格改变、反社会行为、焦虑和抑郁。当前的治疗策略取决于充当“脱铜”剂的螯合剂，其目的是降低金属的水平并试图恢复正常的体内平衡。不幸的是，最常使用的药物青霉胺和曲恩汀与严重的不良反应有关。因此，需要新的强效和特异性的铜螯合剂来治疗威尔逊氏病。

本公开旨在克服本领域中的这些和其他缺陷。

发明内容

一方面，公开了形成含铜络合物的方法，包括使含铜样品与式I化合物接触：

其中R是-OH或-O-CH₃。在一些实施方式中，含铜样品是非生物溶液或悬浮液。在其他实施方式中，含铜样品是生物溶液、悬浮液、组织或生物体。例如，接触样品可以包括向受试者施用所述化合物。在另一个实例中，施用所述化合物降低了铜的细胞毒性作用。在又一个实例中，受试者是被诊断患有与铜的生理水平升高相关的疾患的人。在一个实例中，该疾患是威尔逊氏病。另一实施方式包括通过形成含铜络合物来抑制酶的催化活性，并且该酶选自丙酮酸激酶M(PKM)、线粒体腺苷酸激酶2(AK2)、肌酸激酶B(CKB)、p21活化的激酶(PAK)、TP53调节激酶(TP53RK)、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)、吡哆醛激酶(PDXK)、U型线粒体肌酸激酶(CKMT1B)、丝裂原活化蛋白激酶(MEK)、酪氨酸激酶CSK、蛋白质酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)以及上述两种或多种的任意组合。

在另一方面，公开了抑制样品中激酶的酶活性的方法，包括使样品与式I化合物接触：

其中R是-OH或-O-CH₃，以及其中该激酶选自丙酮酸激酶M(PKM)、线粒体腺苷酸激酶2(AK2)、肌酸激酶B(CKB)、p21活化的激酶(PAK)、TP53调节激酶(TP53RK)、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)、吡哆醛激酶(PDXK)、U型线粒体肌酸激酶(CKMT1B)、丝裂原活化蛋白激酶(MEK)、酪氨酸激酶CSK以及上述两种或多种的任意组合。在一种实施方式中，样品包括需要药物治疗的受试者，并且接触样品包括将所述化合物施用于受试者。在一个实例中，受试者患有胃癌。在另一个实例中，受试者患有HER2阴性乳腺癌。例如，HER2阴性癌症可以是雌激素受体阴性癌症、孕激素受体阴性癌症或三阴性乳腺癌。在另外实例中，受试者患有三阴性乳腺癌。其他实例包括向受试者施用AZD6244。在一个实例中，向受试者施用所述化合物和AZD6244具有治疗效果，并且该治疗效果大于向受试者施用所述化合物但不施用AZD6244的治疗效果以及向受试者施用AZD6244但不施用所述化合物的治疗效果。例如，治疗效果可以包括抑制肿瘤生长、抑制癌细胞转移、刺激癌细胞死亡或前述中的两种或更多种的任意组合。在再另外实例中，向先前施用了AZD6244的需要药物治疗的受试者施用该化合物。例如，使样品与化合物接触可以包括抑制肿瘤生长、抑制癌细胞转移、刺激癌细胞死亡或前述中的两种或更多种的任意组合。

在又另一方面，公开了向受试者施用药物组合物的方法，该药物组合物包括与式I化合物络合的铜：

其中R是-OH或-O-CH₃。在一种实施方式中，施用药物组合物包括降低受试者的体重指数。在另一实施方式中，施用药物组合物包括增强对一种或多种激素的生理反应，并且一种或多种激素是胰岛素、瘦素或两者。在又另一实施方式中，受试者患有癌症，并且癌症是胃癌或HER2阴性乳腺癌，并且施用药物组合物包括抑制肿瘤生长、抑制癌细胞转移、刺激癌细胞死亡或前述中的两种或更多种的任意组合。在一些实例中，癌症可以是HER2阴性乳腺癌，其中HER2阴性乳腺癌是雌激素受体阴性、孕激素受体阴性或三阴性乳腺癌。一些实施方式还包括向所述受试者施用AZD6244。在一些实例中，其中向受试者施用所述化合物和AZD6244具有治疗效果，并且该治疗效果大于向受试者施用所述化合物但不施用AZD6244的治疗效果以及向受试者施用AZD6244但不施用所述化合物的治疗效果。例如，治疗效果可以包括抑制肿瘤生长、抑制癌细胞转移、刺激癌细胞死亡或前述中的两种或更多种的任意组合。在再另外实例中，向先前施用了AZD6244的需要药物治疗的受试者施用该药物组合物。在还其他实例中，施用药物组合物包括抑制肿瘤生长、抑制癌细胞转移、刺激癌细胞死亡或前述中的两种或更多种的任意组合。在另一实施方式中，施用化合物包括抑制受试者中蛋白质酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的活性。

在另一方面，公开了包括与式I化合物络合的铜的药物组合物：

其中R是-OH或-O-CH₃。在一种实施方式中，组合物包括药学上可接受的赋形剂。

附图说明

当参考附图阅读以下详细描述时，将更好地理解本公开的这些和其他特征、方面和优点，其中：

图1示出了使用DiFMUP作为底物，递增浓度的DPM-1001(正方形)和MSI-1436(圆圈)对长形式的磷酸酶PTP1B_1-405抑制的作用。

图2示出了针对PTP1B双突变体S372P/L192A PTP1B测试的递增浓度的DPM-1001(正方形)和MSI-1436(三角形)的作用。

图3示出了与DPM-1001(1μM)一起温育15min的PTP1B_1-405(圆圈)或PTP1B_1-321(正方形)(100nM)的PTP活性。将络合物稀释100倍，并监测活性240分钟。将结果与用针对PTP1B_1-405(圆圈)或PTP1B_1-321(正方形)用MSI-1436进行的测定进行比较，以灰色表示。

图4示出了DPM-1001对长(黑条)和短(灰条)形式的PTP1B的抑制的时间依赖性。

图5示出了在不存在(圆圈)和存在(三角形)DPM-1001的情况下PTP1B_1-394的洗脱曲线。

图6示出了在不存在(空心条)或存在H₂O₂降解酶过氧化氢酶(灰色条)和过氧化物还原酶(黑色条)的情况下DPM-1001对PTP1B_1-405的抑制的时间依赖性。

图7示出了DPM-1001(1mM)与CuSO4(8mM)反应并且通过ESI-MS分析了反应混合物。插图示出了在727.5m/z处的峰的同位素模式分析。

图8A和8B示出了络合物[Cu(式I)SO₄]的建议结构。

图9示出了针对DPM-1001滴定的浓度增加的放射性标记的铜(⁶⁴Cu)。

图10示出了递增浓度的Cu-DPM-1001络合物对WT PTP1B(圆圈)、H320A/H331APTP1B_1-405(正方形)和H320A/H331A/S372P PTP1B_1-405(三角形)的影响。

图11示出了针对PTP1B_1-405、PTP1B_1-321和H320A/H331A突变体PTP1B滴定的浓度增加的⁶⁴Cu-DPM-1001络合物。

图12示出了针对一组PTP(PTP1B_1-405(圆圈)、PTP1B_1-321(正方形)、TCPTP(菱形)、SHP2(空心圆)、LAR(空心正方形)、PTPα(向上三角形)、PTPσ(向下三角形)和PTEN(空心菱形))滴定的浓度增加的⁶⁴Cu-DPM-1001络合物。

图13示出了DPM-1001对体重的影响。从10周龄开始，直到研究终止(18周龄)，每天以DPM-1001(5mg/kg，或口服或腹膜内)处理高脂饮食(HFD)喂养的肥胖雄性小鼠(C57bl6/J)，以及与盐水处理的肥胖小鼠比较体重(每组n＝10)。

图14示出了用盐水或DPM-1001处理对施用D-葡萄糖(2mg/g体重)的HFD喂养的14周龄雄性小鼠的影响并监测血糖(每组，n＝10)。使用双因素方差分析(2-way ANOVA)进行统计分析(*p<0.05、**p<0.01)。

图15示出了用盐水或DPM-1001处理对施用胰岛素(0.75mU/g体重)的HFD喂养的14周龄雄性小鼠的血糖影响(每组，n＝10)。使用双因素方差分析(2-way ANOVA)进行统计分析(*p<0.05)。

图16示出了口服或腹膜内(IP)用盐水或DPM-1001处理的14周龄小鼠的胰岛素诱导的IR-β的酪氨酸磷酸化。为了胰岛素刺激，用胰岛素(0.75mU/g，IP)处理动物15分钟。平均值±s.e.m.使用双因素方差分析(2-way ANOVA)进行统计分析(**p<0.01)。

图17示出了用盐水或DPM-1001口服或腹膜内(IP)处理的14周龄小鼠的下丘脑组织裂解物中瘦素诱导的JAK2的酪氨酸磷酸化。对于瘦素刺激，将动物用瘦素(1mg/kg，sc)处理15分钟。平均值±s.e.m.使用双因素方差分析(2-way ANOVA)进行统计分析(**p<0.01)。

图18示出了在DPM-1001(1mM)和所示金属(8mM)之间形成络合物的ESI-MS光谱。

图19示出了在从0-1.5mM递增的铜浓度下测量的有(向上三角形)或没有(圆形)DPM-1001情况下的对照细胞的存活率，以及有(灰色，向下三角形)和没有DPM-1001(正方形)情况下的ATP7B敲低细胞(ATP7B-KD1)的存活率。

图20示出了在从0-1.5mM递增的铜浓度下测量的有(向上三角形)和没有(向下三角形)DPM-1001情况下的对照成纤维细胞的存活率，与有(灰色，圆形)和没有(正方形)DPM-1001情况下的源自威尔逊病患者的成纤维细胞(GM00032(上小图))的存活率进行比较。

图21示出了在从0-1.5mM递增的铜浓度下测量的有(向上三角形)和没有(向下三角形)DPM-1001情况下的对照成纤维细胞的存活率，与有(灰色，圆形)和没有(正方形)DPM-1001情况下的源自威尔逊病患者的成纤维细胞(GM00033(中小图))的存活率进行比较。

图22示出了在从0-1.5mM递增的铜浓度下测量的有(向上三角形)和没有(向下三角形)DPM-1001情况下的对照成纤维细胞的存活率，与有(灰色，圆形)和没有(正方形)DPM-1001情况下的源自威尔逊病患者的成纤维细胞(GM05257(下小图))的存活率进行比较。

图23示出了来自未经处理的或经DPM-1001处理的动物的染色TX小鼠模型的肝脏组织的罗丹宁(rhodanine)染色水平。

图24示出了在用盐水、DPM-1001(5mg/kg，每三天口服一次)或四硫代钼酸盐(TTM)(5mg/kg，每天腹膜内)处理，持续两周后，使用ICP-MS测量的野生型(黑条)或TX(灰条)小鼠的(A)肝脏、(B)脑和(C)肾脏中的铜水平。小图(D)代表这些动物的粪便中的铜水平。

图25示出了用盐水、DPM-1001或四硫代钼酸盐(TTM)处理的野生型(黑条)和TX(灰条)小鼠的肝脏(左)或脑(右)中金属硫蛋白的水平。

图26示出了在从0-1.5mM递增的铜浓度下测量的有(向上三角形)和没有(向下三角形)DPM-1001情况下的对照成纤维细胞的存活率，与有(灰色，圆形)和没有(正方形)DPM-1001情况下的源自威尔逊病患者的成纤维细胞GM12158存活率进行比较。

图27示出了在从0-1.5mM递增的铜浓度下测量的有(向上三角形)和没有(向下三角形)DPM-1001情况下的对照成纤维细胞的存活率，与有(灰色，圆形)和没有(正方形)DPM-1001情况下的源自威尔逊病患者的成纤维细胞GM05798(B)的存活率进行比较。

图28示出了在从0-1.5mM递增的铜浓度下测量的有(向上三角形)和没有(向下三角形)DPM-1001情况下的对照成纤维细胞的存活率，与有(灰色，圆形)和没有(正方形)DPM-1001情况下的源自威尔逊病患者的成纤维细胞GM11778(C)的存活率进行比较。

图29示出了用盐水或DPM-1001(2mg/kg)处理的野生型(WT)和TX威尔逊氏病(WD)小鼠12个月内的存活期。

图30示出了使用ICP-MS每三天一次用盐水、DPM-1001(2mg/kg)或DPM-1003(2mg/kg)处理的WT(黑条)和TX(灰条)小鼠肝脏中的铜水平。

图31示出了DPM-1001和DPM-1003对SUM159细胞存活率的影响。

图32示出了DPM-1001和DPM-1003对CAL120细胞存活率的影响。

图33示出了DPM-1001和DPM-1003对HCC38细胞存活率的影响。

图34示出了DPM-1001和DPM-1003对HS578T细胞存活率的影响。

图35示出了DPM-1001和DPM-1003对MCF7细胞存活率的影响。

图36示出了DPM-1001和DPM-1003对MDA-MB-231细胞存活率的影响。

图37示出了DPM-1001和DPM-1003对MDA-MB-361细胞存活率的影响。

图38示出了DPM-1001和DPM-1003对MDA-MB-468细胞存活率的影响。

图39示出了DPM-1001和DPM-1003对4T-1细胞存活率的影响。

图40示出了DPM-1001和DPM-1003对BT-474细胞存活率的影响。

图41示出了DPM-1001和DPM-1003对SKBR3细胞存活率的影响。

图42示出了DPM-1001和DPM-1003对MCF10A细胞存活率的影响。

图43示出了TNBC细胞中的DPM-1001对铜的去除。

图44示出了DPM-1001而不是DPM-1003对肿瘤尺寸的抑制。

图45示出了DPM-1001而不是DPM-1003对肿瘤尺寸的抑制。

图46示出了DPM-1001对MDA-MB-231细胞存活率的抑制。

图47示出了通过用DPM-1001与AZD6244组合处理抑制HCC70细胞的存活率。

图48示出了通过用DPM-1001与AZD6244组合处理抑制MDA-MB-468细胞的存活率。

图49示出了通过用DPM-1001与AZD6244组合处理抑制SUM149细胞的存活率。

图50示出了DPM-1001对SNU116细胞存活率的抑制作用。

图51示出了DPM-1001对KATOIII细胞存活率的抑制作用。

图52示出了DPM-1001对SNU5细胞存活率的抑制作用。

图53示出了DPM-1001对AGS细胞存活率的抑制作用。

图54示出了DPM-1001对MDA-MB-468细胞存活率的抑制作用。

图55示出了DPM-1001对N87存活率的抑制作用。

图56A和56B示出了分别与CuSO4(80mM)和CuCl₂(8mM)反应的DPM-1003(1mM)，以及用ESI-MS分析反应混合物。

具体实施方式

本文公开了可以与铜形成络合物的化合物，或与铜络合的这样的化合物及其用途。这样的化合物可以是药物组合物的形式，并且可以施用于需要药物治疗的患者。在一些实例中，向样品诸如人或动物受试者、生物组织或细胞的样品或非生物样品施用该化合物，以在溶液中形成该化合物与铜的络合物。例如，该化合物可用于螯合铜，以防止或减少铜与样品中其他分子的结合。在其他实例中，可以在或不在首先被配制成与铜的络合物的情况下施用该化合物，使得所施用的或一旦向含铜样品施用化合物时所形成的化合物与铜的络合物可以诸如通过结合和抑制酶而具有治疗作用。在一些实例中，化合物对酶活性的抑制作用可以比当不与铜络合时化合物可能对酶活性的作用更持久。

如本文所公开的是式I化合物：

其中R是-OH或-O-CH₃。这样的化合物能够与铜形成络合物。作为可抑制酶蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的化合物的实例，其中R为-O-CH₃的式I化合物在美国专利号9,546,194中公开。然而，如本文所公开的且之前未实践或未知的令人惊讶的发现是，式I化合物与铜形成络合物，其亲和力远高于任何结合其他金属离子的亲和力，而式I化合物不与该其他金属离子形成络合物。此外，当与铜络合时，式I化合物-铜络合物可以结合并由此抑制PTP1B的磷酸酶活性。本文公开的化合物-铜络合物，诸如式I化合物-铜络合物对PTP1B的酶活性的抑制作用的持续时间可能远长于当该化合物不与铜络合时通过该化合物与PTP1B结合所实现的或不与铜形成络合物的结构上类似的PTP1B抑制剂与PTP1B结合所实现的抑制作用的持续时间。

当施用于动物或人类受试者时，式I化合物的化学结构可通过代谢过程改变以形成代谢物。例如，可以通过体内的代谢过程将R位置处的-O-CH₃改变为R位置处的-OH。如本文还公开的，式I化合物可以与铜形成络合物，并且可以用作铜-化合物络合物或用于其形成，无论R是-O-CH₃还是-OH。技术人员会理解，在生理条件下，R位的羟基氢原子可与该化合物解离，或氢原子可与化合物中其他地方的，诸如与嘧啶环连接的氮杂烷基链中的氮缔合，以形成内部酸，并且所有这样的化合物将包括在本公开的式I中。

在某些实例中，式I可能具有以下结构：

其中R是-OH或-O-CH₃。当R为-O-CH₃时，该化合物在本文中称为DPM-1001。当R为-OH时，该化合物在本文中称为DPM-1011。

在其他实例中，式I可能具有以下结构：

其中R是-OH或-O-CH₃。当R为-O-CH₃时，该化合物在本文中称为DPM-1013。当R为-OH时，该化合物在本文中称为DPM-1015。

在其他实例中，式I可能具有以下结构：

其中R是-OH或-O-CH₃。当R为-O-CH₃时，该化合物在本文中称为DPM-1014。当R为-OH时，该化合物在本文中称为DPM-1016。

在其他实例中，式I可能具有以下结构：

其中R是-OH或-O-CH₃。在其他实例中，两种或更多种前述式I和/或式I的其他立体异构体的组合可以彼此以不同的相对比例组合存在，一些或全部具有的R为-OH以及一些或全部具有的R为-O-CH₃。

如本文也公开的，与式I化合物紧密相关的其他化学结构不与铜形成络合物。例如，trodusquemine，也称为MSI-1436，或3-N-1(精胺)-7,24-二羟基-5-胆甾烷24-硫酸酯，在结构上与DPM-1001相关。尽管DPM-1001与MSI-1436的结构密切相似，但MSI-1436不会与铜形成络合物。此外，类似于本文所公开的DPM-1001，MSI-1436能够抑制PTP1B的酶活性。然而，如本文还公开的，与铜络合的式I化合物诸如DPM-1001对PTP1B酶活性的抑制持续时间具有比MSI-1436对PTP1B酶活性的抑制作用明显更长的持续时间。MSI-1436已经被证明是PTP1B的可逆抑制剂。例如，当将含有PTP1B和MSI-1436的样品稀释100倍时，PTP1B活性会在60分钟或更短时间内恢复，而在对包含PTP1B和DPM-1001与铜的络合物的样品进行类似处理至少240min后，PTP1B活性仍然受到抑制。此外，式I化合物在抑制PTP1B的酶活性方面具有令人惊讶地更高的效力，其通过将化合物与PTP1B预温育而增强。当将式I化合物(诸如DPM-1001)与PTP1B预温育时，其效力(100nm IC₅₀)要比与PTP1B预温育的MSI-1436的效力(600nm IC₅₀)高得多。因此，令人惊讶地，与具有类似化学结构的其他化合物相比，与铜络合的式I化合物(诸如DPM-1001)实质上是更有效的PTP1B抑制剂，其有显著更长的有效持续时间。

如本文还公开的，令人惊奇地发现式I化合物诸如DPM-1001与铜的络合物具有抗肿瘤活性。先前已证明MSI-1436对某些类型的乳腺肿瘤细胞有毒性。MSI-1436的这样的作用可能与MSI-1436对某些类型的乳腺癌细胞中PTP1B活性的抑制作用有关。例如，一些类型的乳腺癌细胞表达蛋白质HER2(也称为受体酪氨酸-蛋白激酶erbB-2，CD340，原癌基因Neu，ERBB2)，而HER2的表达刺激癌症表型和肿瘤生长。PTP1B在某些HER2阳性乳腺癌细胞中过表达，并且已显示PTP1B表达缺乏防止由HER2过表达引起的乳腺肿瘤发展。因此，正在研究将MSI-1436用作HER2⁺乳腺癌患者的癌症治疗用途。

然而，与HER2+乳腺癌相反，PTP1B在癌症本身中的普遍作用尚不清楚。对于某些类型的细胞，与HER2+乳腺癌细胞不同，PTP1B抑制促进而不是抑制癌性表型。因此，仅基于其是否抑制PTP1B活性，无法预测化合物抑制肿瘤生长或肿瘤细胞存活的能力。并且，考虑到HER2表达与PTP1B活性在促进肿瘤生长中之间的关系，对于不表达HER2的乳腺癌细胞，不会预测PTP1B抑制剂会抑制肿瘤生长或肿瘤细胞存活。例如，本文中称为DPM-1003的化合物与DPM-1001相同，除了DPM-1003的嘧啶环的氮原子在嘧啶环的3位而不是嘧啶环的2位。DPM-1003可以抑制PTP1B(K_i 2μM)。然而，如本文所公开的，DPM-1003不抑制三阴性乳腺癌细胞的存活，所述三阴性乳腺癌细胞是不表达HER2并且也不表达雌激素受体或孕激素受体的乳腺癌细胞。DPM-1003对三阴性乳腺癌细胞的存活缺乏抑制作用，支持了传统的理解，即为了抑制PTP1B以降低乳腺癌细胞的存活或预防乳腺癌的生长或减小肿瘤的尺寸，乳腺癌细胞必须表达HER2。

然而，DPM-1003和式I化合物诸如DPM-1001彼此不同之处在于DPM-1003不与铜高亲和力结合或形成络合物。如本文还公开的，三阴性乳腺癌细胞具有升高水平的细胞内铜，和升高水平的负责将铜输入细胞的铜转运蛋白。如本文还公开的，使三阴性乳腺癌细胞与式I化合物(诸如DPM-1001)接触降低细胞的铜水平，这可能是由于该化合物具有与铜高亲和力结合并与之形成络合物或螯合铜的能力，而使这样的细胞与DPM-1003接触并不会降低铜水平，这很可能是由于DPM-1003无法以高亲和力结合铜或不能与其形成络合物。令人惊讶地，如本文所公开的，通过使三阴性乳腺癌细胞与式I化合物诸如DPM-1001接触而形成化合物-铜络合物有效地抑制了三阴性乳腺癌细胞的存活。此外，通过向异种移植三阴性乳腺癌肿瘤小鼠施用DPM-1001来形成式I化合物与铜的络合物，缩小了这样的肿瘤的尺寸，而对这样的动物施用DPM-1003却没有减小肿瘤尺寸或抑制肿瘤生长。然而DPM-1003对HER2阴性乳腺癌细胞(诸如三阴性乳腺癌细胞)的存活以及对这样的细胞肿瘤的生长均没有抑制作用是不足为奇的，鉴于传统的理解，抑制乳腺癌中PTP1B活性的抗癌症作用将需要在癌细胞中表达HER2，本文公开了通过使三阴性乳腺癌细胞与式I化合物诸如DPM-1001接触形成化合物-铜络合物的抑制作用是出乎意料的，并且先前未显示或执行。如本文还公开的，通过向胃癌细胞施用这样的化合物来形成式I化合物诸如DPM-1001与铜的络合物还抑制了这样的细胞的存活。这些效果表明，可以施用DPM-1001来治疗癌症。

螯合是指化合物与金属离子的结合，使得金属离子以高亲和力与化合物结合，并趋于与化合物形成络合物并保持与其结合，而不是作为游离金属离子与化合物存在于溶液中。式I化合物通过以高亲和力与铜结合并与之形成络合物而螯合铜，使得铜趋于不从络合物中释放出来。如本文所公开的，这样的络合物在生理条件下形成，诸如当施用于培养中的细胞或哺乳动物诸如啮齿动物时，并且当施用于人类受试者时将形成。如本文还公开的，式I化合物与铜的这样的络合物也在非生物溶液中形成。非生物溶液或样品为不是从活体或先前活体中获取的样品，并且没有有目的地向其添加活细胞或组织或体液。非生物样品可以是需要从中去除铜或需要测量铜水平的溶液，但不是从活生物体或先前的活生物体中提取的，并且没有有目的地向其添加活组织或细胞或体液。尽管样品可能包括痕污染量的生物组织，诸如意外痕量的细胞或体液，但技术人员会认识到，如果未从活受试者提取或获得，或未向其添加取自活受试者的组织或细胞或体液，或未向其或在其中添加或生长培养的细胞，则这样的样品将是非生物样品或非生物溶液。

如本文还公开的，式I化合物诸如DPM-1001与铜的络合物的形成可以抑制各种激酶的酶活性。因为DPM-1001可以与铜形成络合物，并且因为它可以降低细胞中的铜含量，大概是通过与细胞铜形成络合物，因此对细胞施用式I化合物可螯合这样的细胞中的铜并防止或减少铜与其他细胞分子结合。如果铜结合对于这样的分子的功能很重要，那么使这样的细胞与这样的铜结合化合物接触并与铜形成其与铜的络合物将被认为抑制这样的分子的活性。如本文还公开的，许多激酶结合铜。例如，如本文所公开的，丙酮酸激酶M(PKM)、线粒体腺苷酸激酶2(AK2)、肌酸激酶B(CKB)、p21活化的激酶(PAK)、TP53调节激酶(TP53RK)、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)、吡哆醛激酶(PDXK)、U型线粒体肌酸激酶(CKMT1B)、丝裂原活化蛋白激酶(MEK)和酪氨酸激酶CSK都结合铜。

如本文还公开的，铜的结合促进PAK的激酶活性。例如，将三阴性乳腺癌细胞暴露于高水平的铜中导致磷酸化PAK、以及PAK活化信号转导级联中PAK下游的磷酸化靶点和信号分子的水平升高，诸如磷酸化c-Raf升高和磷酸化Bad增加，表明通过PAK与铜的结合增加导致PAK激酶活性升高。Bad的磷酸化通过防止Bad影响促凋亡功能来促进细胞存活。因此，铜与引起PAK活性升高的PAK结合的增加通过降低Bad的磷酸化和减少Bad的失活而促进细胞存活。考虑到三阴性乳腺癌细胞中铜水平的升高，铜可通过刺激PAK信号转导级联的活性并且从而抑制这样的癌细胞的凋亡和细胞死亡来促进三阴性乳腺癌细胞的存活。如本文还公开的，通过例如向三阴性乳腺癌细胞施用DPM-1001，形成式I化合物与铜的络合物，从而螯合铜并防止铜与PAK结合且防止PAK活性升高，降低了PAK的活性，并因此抑制三阴性乳腺癌细胞的存活。

如本文还公开的，铜结合MEK。MEK的异常活性以及活性被MEK刺激的Ras丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导级联的异常活性与多种癌症有关。MEK和Ras-MAPK活性的升高可以刺激癌细胞存活并促进与转移有关的细胞增殖和细胞迁移功能。因此，抑制MEK和Ras-MAPK级联可预防某些形式的癌症。例如，在某些但不是全部的三阴性乳腺癌形式中，使用MEK抑制剂AZD6244(也称为司美替尼(selumetinib)或6-(4-溴-2-氯苯胺基)-7-氟-N-(2-羟基乙氧基)-3-甲基苯并咪唑-5-羧酰胺)治疗抑制细胞存活。如本文所公开的，在用AZD6244以这样的治疗不抑制癌细胞存活的浓度治疗的三阴性阴性乳腺癌细胞中，通过以它自己不抑制癌细胞存活的浓度施用DPM-1001以在这样的细胞中形成式I化合物和铜的络合物，显著抑制了癌细胞存活。换句话说，如本文所公开的，向三阴性乳腺癌细胞一起施用当它自己施用时不抑制细胞存活的剂量的AZD6244以及它自己不抑制细胞存活的剂量的DPM-1001，抑制了三阴性乳腺癌细胞的存活。向这样的细胞施用式I化合物将形成化合物-铜络合物，诸如通过螯合细胞铜，从而减少可用于结合MEK的铜量。因此，如本文所公开的，通过施用诸如DPM-1001的这样的化合物而形成式I化合物与铜的络合物可以通过抑制MEK的活性和Ras-MAPK信号转导通路而具有抗癌症的保护性，并且因此可以作为这样的癌症的治疗。此外，式I化合物可以是用AZD6244治疗的辅助剂。例如，对AZD6244无反应的，或由于先前施用AZD6244而可能对AZD6244的治疗产生抗性的，或由于预先施用AZD6244无效而被鉴定为对AZD6244无反应的三阴性乳腺癌细胞，例如通过向具有这样的细胞的患者施用DPM-1001来形成式I化合物与铜的络合物可以作为针对这样的癌症的治疗。

如本文还公开的，用式I化合物螯合铜可以针对由激酶B-Raf或BRAF的突变引起的Ras-MAPK通路的失调导致的癌症具有保护作用。BRAF激活Ras-MAPK级联，并且在许多形式的癌症(诸如BRAF V600E)中普遍存在的BRAF突变导致肿瘤细胞中MEK磷酸化增强和Ras-MAPK通路活性增加。这样的BRAF介导的活性增加和肿瘤发生取决于铜，因为在缺乏负责使铜进入细胞的铜转运蛋白的细胞中，以及在表达不能结合铜的MEK的突变形式的细胞中，突变的BRAF(诸如V600E BRAF)的这样的致肿瘤发生作用减弱。此外，通过用铜螯合剂处理细胞抑制V600E BRAF的致肿瘤发生作用。此外，用BRAF抑制剂(诸如例如维罗非尼(vemurafenib，N-[3-[5-(4-氯苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基]-2,4-二氟苯基]丙烷-1-磺酰胺))处理某些癌细胞可以抑制肿瘤生长，但是一些这样的细胞对维罗非尼产生抗性，以至于用维罗非尼预先治疗会导致使细胞对维罗非尼的抗肿瘤作用不敏感的突变。然而，尽管产生允许逃避BRAF抑制的抗肿瘤作用的突变，但用铜螯合剂处理这样的细胞降低了肿瘤的生长。因此，如本文所公开的，通过用式I化合物处理来螯合铜并形成例如DPM-1001与细胞铜的络合物可以是针对以BRAF信号转导中断为代表的癌症类型(诸如表达BRAFV600E或BRAF中缬氨酸600的类似突变的肿瘤)的治疗。类似地，用式I化合物进行的这样的治疗可有效地作为与BRAF抑制剂(诸如维罗非尼或包括例如达拉菲尼(dabrafenib)又名N-[3-[5-(2-氨基嘧啶-4-基)-2-叔丁基-1,3-噻唑-4-基]-2-氟苯基]-2,6-二氟苯磺酰胺的其他药物)一起的辅助疗法，或在用能够导致产生赋予BRAF抗性的突变的BRAF抑制剂治疗之前通过加速肿瘤细胞的死亡来防止对BRAF抑制剂的抗性的发展。

如本文还公开的，通过施用例如DPM-1001形成式I化合物与铜的络合物可以抑制血管生成。血管生成对于许多类型的肿瘤的存活很重要，并且抑制血管生成可以剥夺肿瘤细胞血液、氧气和肿瘤细胞存活、肿瘤细胞生长或转移所需的营养供应。已知铜对于血管生成也很重要。因此，已知铜螯合剂的施用通过抑制血管生成而具有抗一些形式的癌症的保护作用。如本文所公开，可通过向受试者施用式I化合物并形成例如DPM-1001与铜的络合物来螯合铜，从而防止这样的受试者中的血管生成并防止肿瘤生长、促进肿瘤缩小或预防转移。

如本文还公开的，例如，通过向样品或受试者施用DPM-1001以形成式I化合物与铜的络合物，可以具有抗典型或涉及病理上高水平的铜的病症或疾患的保护性。例如，威尔逊氏病涉及身体中铜的积累和身体组织中铜的慢性细胞毒性积累，以及相对于没有威尔逊氏病的受试者中的其水平，铜生理水平的升高。如技术人员将认识到的，细胞毒性作用是导致细胞死亡或者如果持续很长时间则被预测会引起细胞死亡的作用。威尔逊氏病的症状包括肝硬化、溶血性贫血、神经系统异常和角膜混浊。另外，铜毒性可能会因暴露于过量的环境铜中而发生，诸如饮用水中的高含量或未涂覆的铜炊具中烹饪酸含量高的食品。症状可能包括胃肠道不适，诸如呕吐、呕血或黑便、低血压、黄疸或昏迷。慢性病理性高的铜保留可能导致神经、肾脏或肝脏组织损伤。铜螯合可用于治疗因体内铜水平升高而引起的这种病症或症状。如本文所公开的，诸如通过将例如DPM-1001施用于具有或表现出升高的水平的铜的个体或细胞或组织类型而形成式I化合物的络合物并从而螯合这样的受试者或样品中的铜，可以预防、治疗或减少这种升高的铜的细胞毒性或其他有害作用。

与从未患威尔逊氏病的人中取的细胞相比，从威尔逊氏病患者中取的细胞对铜暴露量升高的细胞毒性作用表现出更高的敏感性，而施用DPM-1001预防这种细胞毒作用。此外，在威尔逊氏病的动物模型(毒性奶小鼠模型(TX))中，由于负责铜排泄的铜转运蛋白的突变，TX小鼠保留并积累了过多的身体和组织铜水平，TX小鼠活不了非TX小鼠那么长时间，并且TX小鼠在包括肝脏和大脑在内的各种身体组织中积累高水平的铜。TX小鼠的肝组织还表现出形态异常，诸如肝细胞增大、形状和排列不规则，以及胞质脂质滴大，并且金属硫蛋白(一种金属结合蛋白)的表达升高。但是，如本文所述，用DPM-1001(5mg/kg，每3天一次)处理TX小鼠可延长其寿命，抑制肝脏和大脑中的铜积累，防止肝脏中金属硫蛋白表达升高，并防止在肝脏中的肝细胞增大，伴有不规则形状和排列，细胞质脂质滴大。

相比之下，用不以高亲和力结合铜的DPM-1003处理TX小鼠没有影响肝组织中铜的水平。另一种铜螯合剂四硫代钼酸盐(TTM)也可以防止TX小鼠肝脏和大脑中铜的积累(每天腹膜内5mg/kg处理)，但导致肾脏中铜的积累，可能与其促进铜排泄有关。相比之下，用DPM-1001(口服，5mg/kg，每3天一次)处理TX小鼠不会促进肾脏中铜的积累，显然经由通过消化道的排泄导致铜的消除，如与用TTM处理的TX小鼠或未用DMP-1001处理的TX小鼠相比，用DPM-1001处理的TX小鼠粪便中铜水平升高所证明的。因此，式I化合物可以施用用于治疗患有威尔逊氏病或其他铜毒性的患者，以螯合身体铜并治疗由于过度暴露于铜而引起的症状、疾病或综合症，并且因为所需的相对低的剂量以及粪便排泄而不是肾脏积聚，其可能比用于这种目的的其他铜螯合剂更优选。

在其他实例中，通过向样品或受试者施用式I化合物而形成式I化合物与铜的络合物可用于影响参与葡萄糖和能量代谢的各种激素(诸如胰岛素和瘦素)的作用，并用作与这样的生理过程的病理或失衡的活性相关的病症或疾患(诸如糖尿病、高血糖症或肥胖症)的治疗。类似地，向样品或受试者施用包括式I化合物与铜的络合物的药物组合物也可用于影响参与葡萄糖和能量代谢的各种激素(例如胰岛素和瘦素)的作用，并用作与这样的激素的病理或失衡的活性相关的病症或疾患(诸如糖尿病、高血糖症或肥胖症)的治疗。

例如，已经确定抑制PTP1B活性是治疗糖尿病、提高胰岛素和瘦素敏感性、使血糖水平正常化以及治疗肥胖的方法。如本文所述，包括上文，与铜络合的式I化合物是具有持久抑制作用的有效的PTP1B活性抑制剂。如本文所公开的，在肥胖和胰岛素和瘦素抵抗的动物模型中，向高脂饮食喂养的小鼠施用DPM-1001(5mg/kg，口服或腹膜内)，其体重减轻大约5％(未高脂饮食喂养的小鼠中无体重减轻)，显示了较低的响应于葡萄糖注射的血糖水平升高，并增强了胰岛素降低血糖水平的作用，表明DPM-1001治疗引起的胰岛素信号转导增强。施用DPM-1001(无论是口服还是腹膜内)也增加小鼠中胰岛素刺激的胰岛素受体的磷酸化以及AKT的磷酸化，两者均表明DPM-1001治疗导致的对胰岛素的反应性增加以及升高的小鼠下丘脑中的瘦素诱导的JAK2磷酸化，表明瘦素受体信号转导对瘦素的反应性增加，这是由DPM-1001处理引起的。因此，已诊断出患有糖尿病、高血糖症或肥胖症的患者可以用与铜络合的式I化合物进行治疗，诸如通过向其施用DMP-1001以与受试者体内存在的铜形成络合物或通过施用包括与铜络合的式I化合物(诸如DPM-1001)的药物组合物，以促进适当的胰岛素和瘦素功能和信号转导，维持健康的血糖水平并减少或预防肥胖症。

例如，这样的治疗可以降低受试者的体重指数，该体重指数被计算为体重除以身高的平方，并且可以以kg/m²为单位表示。可以向体重指数在25至30之间(通常作为超重的特征)或超过30(通常作为肥胖的特征)的人施用包括任选地与铜络合或施用后在体内与铜形成络合物的式I化合物的化合物或药物组合物，以降低其体重指数。还可以向体重指数低于25的人施用这样的化合物或药物组合物以促进生理学上合适的胰岛素信号转导、瘦素信号转导，或降低体重指数或防止体重指数增加。

此外，一些糖尿病患者显示出铜水平升高。与威尔逊氏病患者相似，糖尿病患者升高的铜水平可能具有细胞毒性作用，并引起组织或器官损伤或功能障碍。通过施用式I化合物并从而形成这样的化合物与铜的络合物来治疗铜水平升高的患者的上述方法也适用于糖尿病患者的治疗。通过向这样的患者施用式I化合物，诸如DPM-1001，可以在这样的化合物与铜之间形成络合物，诸如通过螯合体内的铜，从而降低铜水平并防止细胞毒性或这样的患者中存在的病理性高铜水平的其他不良作用。

本文还公开了药物组合物，其包括铜络合物形式的式I化合物。在一些实例中，这样的药物组合物可以包括符合这样的药物组合物的制剂的药学上可接受的赋形剂，并且可以被配制为最有效地施用所述药物组合物以促进这样的制剂。

如本文所公开的，DPM-1001以75nM的Kd和1mol/mol的化学计量结合铜。与铜的络合物是指以低于100nM的Kd结合铜，并且包括以75nM的Kd结合铜，Kd如本文实施例中所述进行测量。作为非限制性实例，包括与铜络合的式I化合物的药物组合物包括，冻干或干燥形式的这样的化合物与铜离子，使得这样的干燥物溶解于溶剂中，包括当口服施用至受试者时，这样的化合物在溶液中将以100nM或更小的Kd与铜结合。

向受试者施用的制剂包括适合于口服、肠胃外(包括皮下、皮内、肌内、静脉内和关节内)、直肠和局部(包括皮肤、颊、舌下和眼内)施用的那些。最合适的途径可以取决于接受者的病症和疾患或施用的预期目的。制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域公知的任何方法制备。方法可以包括使式I化合物或其药学上可接受的盐(“活性成分”)与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。通常，可以通过以下来制备制剂：将活性成分与液体载体或细分的固体载体或两者均匀且紧密地结合在一起，并然后如果需要，将产品成形为所需制剂。

适用于口服施用的本公开的制剂可以作为以下存在：离散单位，诸如胶囊、扁囊剂或片剂，每个均包含预定量的活性成分；粉末或颗粒；在水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液；或水包油型液体乳状液或油包水型液体乳状液。式I化合物也可以大丸剂、冲服剂或糊剂的形式存在。对于口服或其他施用，可将式I化合物悬浮在溶液中或溶解在溶剂中，诸如醇、DMSO、水、盐水或其他溶剂，还可将其稀释或溶解在另一种溶液或溶剂中，并且可以或在一些实例中可以包含载体或其他赋形剂。

在某些实施方式中，式I化合物可与赋形剂结合并以可摄取片剂、颊片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、薄片等形式使用。片剂、锭剂、丸剂，胶囊剂等还可以包含以下物质：粘合剂，诸如例如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶或其组合；赋形剂，诸如例如磷酸二钙、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或其组合；崩解剂，诸如例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸或其组合；润滑剂，诸如例如硬脂酸镁；甜味剂，诸如例如蔗糖、乳糖、糖精或其组合；调味剂，诸如例如胡椒薄荷、冬青油、樱桃味调味剂、橙味调味剂等。当剂量单位形式是胶囊剂时，除上述类型的材料外，它还可以包含液体载体。各种其他材料可以作为包衣存在或以其他方式改变剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊剂可以用虫胶、糖或两者包衣。当剂型是胶囊剂时，除上述类型的材料外，它还可包含载体，诸如液体载体。明胶胶囊、片剂或丸剂可以肠溶包衣。肠溶包衣可防止组合物在pH值为酸性的胃或上肠中变性。一旦到达小肠，其中的碱性pH溶解了包衣，并使组合物释放并被专门的细胞(例如上皮肠细胞和派尔集合淋巴结M细胞(Peyer’s patch M cell))吸收。酏剂糖浆可包含活性化合物蔗糖作为甜味剂，对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯作为防腐剂，染料和调味剂，诸如樱桃味或橙味调味剂。当然，用于制备任何剂量单位形式的任何材料应该是药学上纯的，并且在使用量上基本是无毒的。另外，可以将活性化合物掺入缓释制剂和剂型中。

片剂可以通过压制或模制，任选地与一种或多种辅助成分一起制成。可以通过在合适的机器中压制任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑、表面活性剂或分散剂混合的，自由流动形式的活性成分诸如粉末或颗粒，来制备压制片剂。可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物来制备模制片剂。片剂可以任选地被包衣或刻痕，并且可以被配制以提供其中的活性成分的持续、延迟或控制释放。

式I化合物可应用于需要与铜结合或螯合，或需要抑制本文所述的酶活性，或需要检测铜利用性的潜在作用或意义的任何样品。如上所述，样品可以包括非生物样品。或者它可以是从活生物体或先前活的生物体中获取或收获的细胞、组织或体液的样品。样品还可以包括意味着生物体的受试者，包括人类或非人类动物。例如，受试者可以包括需要药物治疗的人类或非人类动物。样品还可以包括生物溶液、生物材料或组织的悬浮液，诸如从活细胞或先前的活细胞，或从培养有活细胞或组织的培养物或组织培养基中取得的组分的溶液或悬浮液，或可包括体液，诸如血液、唾液、脑脊髓液、腹水、淋巴液、血浆、血清、粘液或其他体液或分泌物。生物样品可以是活细胞产生的有机分子或其他化合物的溶液或悬浮液。包含除通过活细胞、组织或生物体以外的其他方式(例如通过人工方法)合成的有机分子的样品(包括其他天然存在的化合物的合成副本)不会构成生物溶液或悬浮液。

用于肠胃外或其他施用的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，这些成分使制剂与预期接受者的血液等张。用于肠胃外或其他施用的制剂还可以包括水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。制剂可以在多剂量容器的单位剂量中存在，例如密封的安瓿瓶和小瓶，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需要在使用前立即添加无菌液体载体，例如盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)等。临时注射溶液和悬浮液可以由前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指无菌的水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳状液，以及用于在即将使用前重构为无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纤维素及其合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射有机酯(诸如油酸乙酯)。可通过以下方式维持适当的流动性：例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣材料，通过在分散剂的情况下维持所需的粒径，以及通过使用表面活性剂。这些组合物还可以包含佐剂，诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，诸如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保防止微生物的作用。也可能需要包括等张剂，诸如糖、氯化钠等。通过包括延迟吸收的试剂，诸如单硬脂酸铝和明胶，可以延长可注射药物形式的吸收。通过在可生物降解的聚合物(诸如聚丙交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐))中形成药物的微胶囊基质来制备可注射的储库形式。根据式I化合物与聚合物的比例和所用特定聚合物的性质，可以控制式I化合物的释放速率。还通过将药物截留在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备储库型可注射制剂。可注射制剂可被灭菌，例如，通过细菌截留过滤器过滤或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂，其可在使用前立即溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中。合适的惰性载体可包括糖，诸如乳糖。

式I化合物制剂可包括不同类型的载体，这取决于它是以固体、液体还是气雾剂形式施用，以及对于诸如注射这样的施用通路是否需要无菌。本发明可以通过以下方式施用：静脉内、皮内、经皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、局部、肌肉内、皮下、粘膜、口服、局部、区域地、吸入(例如气雾剂吸入)、注射、输注、连续输注、直接冲洗目标细胞的区域地灌注、经由导管、经由灌洗、以乳脂、以脂质组合物(例如脂质体)，或通过本领域普通技术人员已知的其他方法或上述方法的任何组合(参见例如，《雷明顿药物科学(Remington’sPharmaceutical Sciences)》第18版，麦克印刷公司(Mack Printing Company)，1990。

术语“药学上可接受的盐”是指由药学上可接受的无毒酸或碱(包括无机酸和碱以及有机酸和碱)制备的盐。除非另有说明，否则本文对式I化合物或特别是任何这样的化合物的提及包括对其药学上可接受的盐的提及。当本公开的化合物是碱性的时，可以由药学上可接受的无毒酸包括无机和有机酸制备盐。用于本发明化合物的合适的药学上可接受的酸加成盐包括乙酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸(苯磺酸盐)、苯甲酸、桦木酸、硼酸、丁酸、樟脑酸、樟脑磺酸、碳酸、柠檬酸、乙二磺酸、乙磺酸、乙二胺四乙酸、甲酸、富马酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、羟萘酸、羟乙磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂基磺酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、萘磺酸、硝酸、油酸、扑酸(pamoic)、泛酸、磷酸、特戊酸、多半乳糖醛酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、单宁酸、酒石酸、teoclatic、对甲苯磺酸、熊果酸等。当化合物包含酸性侧链时，适用于本发明化合物的药学上可接受的碱加成盐包括但不限于由铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌制成的金属盐或由赖氨酸、精氨酸、N,N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)和普鲁卡因制成的有机盐。另外的药学上可接受的盐在适当时包括无毒的铵阳离子和与具有1至20个碳原子的烷基连接的羧酸根、磺酸根和膦酸根阴离子。

式I化合物可以配制成游离碱、中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如与蛋白类组合物的游离氨基形成的盐，或与无机酸(诸如例如盐酸或磷酸)或有机酸(诸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的盐。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，诸如例如钠、钾、铵、钙或铁氢氧化物；或有机碱，诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。配制后，将以与剂型相容的方式和治疗有效量施用溶液。该制剂易于以多种剂型施用，诸如配制成用于肠胃外施用，诸如注射溶液，或用于递送至肺的气雾剂，或配制成用于消化施用，诸如药物释放胶囊等。

如本文所用，术语“生理功能衍生物”是指本发明化合物的任何药学上可接受的衍生物，其在施用于哺乳动物后能够(直接或间接)提供本发明化合物或其活性代谢产物。这样的衍生物，例如酯和酰胺，对于本领域技术人员而言将是显而易见的，而无需进行过多的实验。可以参考《伯格药物化学和药物发现(Burger’s Medicinal Chemistry And DrugDiscovery)》，第5版，卷1：原理和实践(Principles and Practice)的教导。

如本文所用，术语“有效量”是指可以引起例如由研究者或医师寻求的细胞、组织、系统、动物或人的生物学或医学反应的式I化合物药剂的量。术语“治疗有效量”是指与未接受该量的相应受试者相比，导致改善治疗、治愈、预防或减轻疾病、疾患或副作用，或减少疾病或疾患的进展速度的量。该术语在其范围内还包括有效增强正常生理功能的量。为了用于治疗，可以将治疗有效量的式I化合物及其盐、溶剂化物和生理功能性衍生物作为化学原料施用。另外，活性成分可以作为药物组合物存在。

本发明的药物组合物包括有效量的式I化合物和任选地溶解或分散在药学上可接受的载体中的一种或多种其他药剂。短语“药学上或药理学上可接受的”是指当适当地施用于动物例如人时不产生不利、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。根据本公开内容，本领域技术人员将知道包含式I化合物和任选地一种或多种其他活性成分的药物组合物的制剂，如由《雷明顿药物科学》第18版，麦克印刷公司，1990所示例的。此外，对于动物(例如人)施用，应当理解，制剂应符合FDA生物学标准办公室要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。

还根据本发明，适合于施用的本发明的组合物可以与或不与惰性稀释剂一起在药学上可接受的载体中提供。载体应该是可同化(assimilable)的，并且包括液体、半固体(即糊剂)或固体载体。除非任何常规介质、试剂、稀释剂或载体有害于接受者或其中所含组合物的治疗效果，否则其在用于实施本发明方法的可施用组合物中使用是合适的。载体或稀释剂的实例包括脂肪、油、水、盐溶液、脂质、脂质体、树脂、粘合剂、填充剂等或其组合。该组合物还可包括各种抗氧化剂，以阻止一种或多种组分的氧化。另外，可以通过防腐剂诸如各种抗细菌剂和抗真菌剂来预防微生物的作用，所述防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸酯(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。

根据本发明，式I化合物可以以任何方便和实用的方式与载体组合，即通过溶液、悬浮、乳化、掺和、包囊、吸收等。对于本领域技术人员而言，这样的程序是常规的。

在本发明的具体实施方式中，将组合物与半固体或固体载体充分组合或混合。混合可以以任何方便的方式进行，诸如研磨。也可以在混合过程中加入稳定剂，以保护组合物免受治疗活性的损失，即胃中的变性。用于组合物中的稳定剂的实例包括缓冲剂、氨基酸诸如甘氨酸和赖氨酸、碳水化合物诸如右旋糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨糖醇、甘露糖醇等。

在其他实施方式中，本发明可以涉及包括式I化合物和水性溶剂的药物脂质媒介物组合物的用途。如本文所使用的，术语“脂质”将被定义为包括特征性地不溶于水并且可以用有机溶剂提取的宽范围物质中的任何一种。这样的广泛的化合物是本领域技术人员众所周知的，并且由于在本文中使用术语“脂质”，因此其不限于任何特定的结构。实例包括含有长链脂族烃及其衍生物的化合物。脂质可以是天然存在的或合成的(即由人设计或生产)。但是，脂质通常是生物物质。生物脂质在本领域中是众所周知的，并且包括例如中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜烯、溶血脂(lysolipid)、糖鞘脂、糖脂、硫脂、具有醚和酯连接的脂肪酸的脂质和可聚合的脂质及其组合。当然，本领域技术人员理解为脂质的不同于本文具体描述的化合物以外的化合物也包括在本发明的组合物和方法中。

本领域普通技术人员将熟悉可用于将组合物分散在脂质媒介物中的一系列技术。例如，式I化合物可以分散在含有脂质的溶液中、溶解于脂质中、与脂质乳化、与脂质混合、与脂质组合、与脂质共价键合、作为悬浮物包含在脂质中、与胶束或脂质体一起被包含或与胶束或脂质体复合，或通过本领域普通技术人员已知的任何方式与脂质或脂质结构关联。分散可以导致或可以不导致脂质体的形成。

向受试者(例如动物或人类患者)施用的本发明的组合物的实际剂量可以通过物理和生理因素来确定，诸如体重、病症的严重程度、所治疗疾病的类型、先前或同时的治疗干预、患者的特发性疾病和施用途径，以及治疗目的。根据剂量和施用途径，优选剂量和/或有效量的施用次数可以根据受试者的反应或治疗目的而变化。在任何情况下，负责施用的医生将确定针对个体受试者的组合物中一种或多种活性成分的浓度和一个或多个合适剂量。

在某些实施方式中，药物组合物可包含例如至少约0.1％的活性化合物。在其他实施方式中，活性化合物可以占单位的重量的约2％至约75％，或例如约25％至约60％，以及其中可衍生的任何范围。自然地，可以以在任何给定单位剂量的化合物中获得合适剂量的方式来制备每种治疗上有用的组合物中式I化合物的量。制备这样的药物制剂的领域的普通技术人员将考虑诸如溶解度、生物利用度、生物学半衰期、施用途径、产品保存期限以及其他药理学考虑等因素，正因如此，各种剂量和治疗方案可能是理想的。

在其他非限制性实例中，剂量还可包括每次施用约1微克/kg体重、约5微克/kg体重、约10微克/kg体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg体重、约200微克/kg体重、约350微克/kg体重、约500微克/kg体重、约1毫克/kg体重、约5毫克/kg体重、约10毫克/kg体重、约50毫克/kg体重、约100毫克/kg体重、约200毫克/kg体重、约350毫克/kg体重、约500毫克/kg体重、至约1000mg/kg体重，或更多，以及可在其中衍生的任何范围。在可从本文所列数字衍生的范围的非限制性实例中，根据上述数字，可以施用约5mg/kg体重至约100mg/kg体重，约5微克/kg/体重至约500毫克/kg体重等的范围。

可以根据包括治疗目的、症状严重程度或个体受试者体重在内的因素修改或选择剂量。日剂量可以每天施用一次，或分布在每天2、3、4、5、6、7、8或更多次施用中。日剂量可以为每天10mg至20g。日剂量可以小于10mg，例如每天5mg或1mg，或在1-5mg之间或5-10mg之间的范围内。日剂量可以在10mg至50mg之间、或50mg至100mg之间、或100mg至150mg之间、或150mg至200mg之间、或200mg至250mg之间、或250mg至300mg之间、或300mg至350mg之间、或350mg至400mg之间、或400mg至450mg之间、或450mg至500mg之间。日剂量可以在500mg至600mg之间、或600mg至700mg之间、或700mg至800mg之间、或900mg至1g之间、或1g至1500mg之间、或1500mg至2g之间、或2g至2500mg之间、或2500mg至3g之间、或3g至3500mg之间、或3500mg至4g之间、或4g至4500mg之间、或4500mg至5g之间。日剂量可以在5g至6g之间、或6g至7g之间、或7g至8g之间、或8g至9g之间、或9g至10g之间、或10g至11g之间、或11g至12g之间、或12至13g之间、或13g至14g之间、或14g至15g之间、或15g至16g之间、或16g至17g之间、或在17g至18g之间、或在18g至19g之间、或在19g至20g之间。在这些范围中的任何一个之内和之间的所有子范围也包括在本公开内。

在一些实施方式中，式I化合物可以被配制为通过消化途径施用。消化途径包括其中组合物与消化道直接接触的所有可能的施用途径。具体而言，式I化合物可以口服、经颊、经直肠或舌下施用。因此，式I化合物可以与惰性稀释剂或与可同化的可食用载体一起配制，或者可以封装在硬壳或软壳明胶胶囊中，或者可以压制成片剂，或者可以直接与饮食的食物结合。

对于口服施用，式I化合物可替代地与漱口剂、洁齿剂、颊片剂、口服喷雾剂或舌下经口施用制剂形式的一种或多种赋形剂结合。例如，可以制备在适当的溶剂诸如硼酸钠溶液(多贝耳氏溶液(Dobell Solution))中以所需量掺入式I化合物的漱口剂。替代地，可将式I化合物掺入口服溶液中，诸如包含硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的溶液，或分散在洁齿剂中，或以治疗有效量添加至可包含水、粘合剂、磨料、调味剂、发泡剂和保湿剂的组合物中。替代地，可以将式I化合物制成可以置于舌下或以其他方式溶解于口腔中的片剂或溶液形式。

适用于其他消化施用方式的其他制剂包括栓剂。栓剂是各种重量和形状的固体剂型，通常被配药成用于插入直肠。插入后，栓剂会软化、融化或溶解在腔液中。通常，对于栓剂，传统载体可包括例如聚亚烷基二醇、甘油三酯或其组合。在某些实施方式中，栓剂可由包含例如约0.5％至约10％，且优选约1％至约2％范围内的活性成分的混合物形成。

在其他实施方式中，式I化合物可以通过肠胃外途径施用。如本文所用，术语“肠胃外”包括绕过消化道的途径。具体而言，式I化合物可以通过例如但不限于以下的方式施用：静脉内、皮内、肌内、动脉内、鞘内、皮下或腹膜内。

式I化合物作为游离碱或药理学上可接受的盐的溶液可以在水中适当地与表面活性剂诸如羟丙基纤维素混合而制备。分散液也可以在甘油、液态聚乙二醇类及其混合物和油中制备。在常规的储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。适用于注射用途的药物形式包括无菌水性溶液或分散液以及用于即时制备无菌注射液或分散液的无菌粉剂。在所有情况下，该形式都可以是无菌的并且具有易于注射的程度的流体。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(即甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物，和/或植物油。可通过以下方式维持适当的流动性：例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣，通过在分散剂的情况下维持所需的粒径，以及通过使用表面活性剂。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，来实现可注射组合物的延长吸收。

对于在水溶液中的肠胃外施用，例如，如果需要，可以适当地缓冲溶液，以及首先用足够的盐水或葡萄糖等张的液体稀释剂。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。就此而言，根据本公开，本领域技术人员将知道可以采用的无菌水性介质。例如，可以将一剂量溶解在1ml等张NaCl溶液中，或者添加到1000ml皮下灌注液中，或者在建议的输注部位注射(参见例如《雷明顿药物科学》第15版，第1035-1038页和第1570-1580页)。取决于被治疗的受试者的情况，必然会发生剂量的一些变化。在任何情况下，负责施用的人将确定针对个体受试者的合适剂量。此外，对于人类施用，制剂可符合FDA生物学标准办公室要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。

无菌注射溶液可通过将所需量的式I化合物与所需的上述各种其他成分掺入适当的溶剂中，然后过滤灭菌来制备。通常，可以通过将各种灭菌的活性成分掺入到无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物包含基础分散介质和以上列举的那些所需的其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，其从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。粉末状组合物可以在稳定剂存在或不存在的情况下与液体载体诸如例如水或盐水溶液混合。

在其他实施方式中，可以将式I化合物配制成用于通过各种其他途径施用，例如局部(即透皮)施用、粘膜施用(鼻内、阴道等)和/或吸入。

用于局部施用的药物组合物可以包括配制用于药物应用的式I化合物，诸如软膏剂、糊剂、乳膏剂或粉剂。软膏剂包括用于局部施用的所有油性、吸附性、乳状液和水溶性基剂组合物，而乳膏剂和洗剂是仅包含乳状液基剂的那些组合物。局部施用的药物可包含渗透促进剂，以促进活性成分通过皮肤的吸收。合适的渗透促进剂包括甘油、醇、烷基甲基亚砜、吡咯烷酮类和月桂氮卓酮(luarocapram)。用于局部施用的组合物的可能的基剂包括聚乙二醇、羊毛脂、冷膏和凡士林，以及任何其他合适的吸收、乳状液或水溶性软膏基剂。局部制剂还可以根据需要包含乳化剂、胶凝剂和抗微生物防腐剂，以保存活性成分并提供均质的混合物。本发明的透皮施用也可以包括“贴剂”的使用。例如，贴剂可以在固定的时间段内以预定的速率并且以连续的方式供应一种或多种活性物质。

在某些实施方式中，药物组合物可以通过滴眼剂、鼻内喷雾剂、吸入剂和/或其他气雾剂递送媒介物来递送。已经描述了经由鼻气溶胶喷雾剂将组合物直接递送至肺的方法。同样，使用鼻内微粒树脂和溶血磷脂酰甘油化合物的药物递送在制药领域也是众所周知的。同样，根据本公开，可以采用聚四氟乙烯支持基质形式的透粘膜药物递送。

术语气雾剂是指分散在液化或加压气体推进剂中的液体颗粒的细分固体的胶体系统。用于吸入的本发明的气雾剂可以由活性成分在液体推进剂或液体推进剂与合适的溶剂的混合物中的悬浮液组成。合适的推进剂包括烃和烃醚。合适的容器将根据推进剂的压力要求而变化。气雾剂的施用将根据受试者的年龄、体重以及症状的严重程度和反应而变化。

实施例

以下实施例旨在说明本公开的实施方式，但无意限制其范围。

尽管已经在本文中详细阐述和描述了优选实施方式，但是对于相关领域的技术人员来说显而易见的是，在不脱离本公开的精神的情况下，可以进行各种修改、增加、替换等，并且这些因此被认为在所附权利要求书所限定的本公开的范围内。

式I化合物的合成

通常，本文公开的化合物可以使用容易获得的起始原料、试剂和常规合成程序通过例如如下所述的一般反应方案中所示的方法或其修改来制备。在这些反应中，也可以利用本身已知的变体，但此处未提及。起始原料是可商购的、如实施例中所述合成的或可以通过本领域技术人员众所周知的方法获得的。参考在别处公开的和熟练的技术人员众所熟知的合成方法和材料，诸如Dolle et al.,1993,Tetrahedron 49:2485-2498中的。

作为一个实例，可以根据以下合成方案合成式I化合物：

制备1：

将MeOH(50mL)中5β-胆烷酸-3α-7α-二醇(25.0g，63.7mmol)和浓HCl(37％，7mL)的混合物加热回流10min，然后在室温下搅拌过夜。将混合物用EtOAc(1L)稀释，用10％水性NaOH溶液(2 x 200mL)、水(2 x 200mL)和盐水(50mL)洗涤两次。有机层经无水Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发，得到1(25.7g，99％)，为白色泡沫。粗产物无需进一步纯化即可直接用于下一步。TLC:Rf＝0.6(硅胶，EtOAc:己烷，50:50)。1H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.84(m,1H,H-7),3.65(s,3H,OCH₃),3.50-3.40(m,1H),2.42-2.29(m,1H),2.28-2.23(m,2H),2.02-1.58(m,8H),1.54-0.98(m,17H),0.92(d,J＝6.6Hz,3H,H-21),0.89(s,3H,H-19),0.64(s,3H,H-18)。

制备2：

将Ag₂CO₃/硅藻土(25g，50wt％，45.33mmol)在甲苯(300mL)中的悬浮液在与迪安-斯达克(Dean-Stark)装置相连的三颈圆底烧瓶中加热回流30min，然后使其冷却至室温。在40min内滴加1(8.72g，21.4mmol)在甲苯中的溶液，并将所得混合物加热回流4h，同时经由迪安-斯达克装置除去水。使混合物冷却至室温，通过硅藻土垫过滤，并用EtOAc洗涤。将滤液蒸发并真空干燥，得到2(8.51g，98％)，为白色泡沫。TLC:Rf＝0.5(硅胶，EtOAc:己烷，30:70)。1H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ3.95(m,1H,H-7),3.65(s,3H,OCH₃),3.44(m,1H,H-4α),2.45-2.28(m,2H),2.25-1.50(m,11H),1.48-1.10(m,14H),1.00(s,3H,H-19),0.93(d,J＝6.4Hz,3H,H-21),0.69(s,3H,H-18)。

制备3：

经30min经由固体添加漏斗在0℃在氮气下向2(2.0克，4.94mmol)和二甲氧基甲烷(4.51g，59.1mmol)在无水CHCl₃(200mL)中的混合物中分批加入P₂O₅(7.53g)。将所得混合物在室温下搅拌3h。将混合物倾入冰-水(500mL)中，分离有机相，并用CHCl₃(2 x 100mL)萃取水相。合并的有机层用1M HCl(50mL)、水(100mL)、盐水洗涤，并用无水Na₂SO₄干燥，然后蒸发并真空干燥。粗产物通过硅胶快速色谱法纯化，用5-30％EtOAc己烷洗脱，得到3(1.18g，53％)，为浅黄色固体。TLC:Rf＝0.7(硅胶，EtOAc:己烷，30:70)。1H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ4.60(d,J＝6.8Hz,2H,-OCH₂O-),3.71-3.62(m,4H,OCH₃和H-7),3.36(s,3H,OCH₃),3.34-3.28(m,1H,H-4α),2.46-2.30(m,2H),2.28-2.04(m,3H),2.26-1.62(m,8H),1.58-1.04(m,11H),1.0(s,3H,H-19),0.93(d,J＝6.4Hz,3H,H-21),0.67(s,3H,H-18)。

制备4：

向3(2.5g，5.57mmol)在THF:MeOH:H₂O(3:1:1，25mL)混合物中的溶液中添加LiOH.H₂O。将混合物在环境温度下搅拌一个周末。然后将混合物用EtOAc(200mL)稀释，用0.1N HCl、水、盐水洗涤并干燥(Na₂SO₄)，然后过滤并蒸发，得到4(2.39g，98％)，为白色泡沫。TLC:Rf＝0.25(硅胶，EtOAc:己烷，40:60)。1H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ4.60(d,J＝6.8Hz,2H,-OCH₂O-),3.69-3.64(m,1H,H-7),3.36(s,3H,OCH₃),3.34-3.26(m,1H,H-4α),2.46-2.09(m,5H),2.08-1.06(m,23H),1.01(s,3H,H-19),0.95(d,J＝6.4Hz,3H,H-21),0.68(s,3H,H-18)。APCI-＝433。

制备5：

在室温下，向4(2.38g，5.48mmol)在DMSO(200mL)中的溶液中分批加入SIBX(4.8g，7.71mmol)，然后加入TFA(130μL)。将该混合物在40℃下搅拌保持2d。将反应混合物冷却至室温，加入水(1L)，并用EtOAc(4×200mL)萃取。用水、盐水洗涤合并的有机层，用无水Na₂SO₄干燥并在旋转蒸发仪上浓缩以得到固体。向该固体中加入CH₂Cl₂(300mL)，并过滤除去未溶解的白色固体。蒸发滤液，并将残余物通过硅胶快速色谱法纯化，用15-50％EtOAc己烷洗脱，得到5(830mg，35％)，为白色固体。TLC:Rf＝0.3(硅胶，EtOAc:己烷，50:50)。1H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ5.71(s,1H,H-4),4.63(dd,J＝12.6,6.9Hz,2H,-OCH₂O-),3.78-3.72(m,1H,H-7),3.34(s,3H,OCH₃),2.65-2.60(m,1H),2.46-2.22(m,5H),2.08-1.71(m,5H),1.70-1.06(m,15H),0.92(d,J＝6.4Hz,3H,H-21),0.70(s,3H,H-18)。APCI-＝431。

制备6：

在-78℃下向液氨(230mL)中加入碎片状Li金属(85mg，12.3mmol)，并搅拌蓝色溶液10min以确保Li完全溶解。加入5(530mg，1.23mmol)在THF(16mL)中的溶液，并将混合物搅拌10min。然后将反应物用固体NH₄Cl淬灭(直至颜色消失)，使其温热至室温，直至所有NH₃逸出。将水添加至白色固体，将其用1M HCl酸化，并用EtOAc(3×50mL)萃取。用盐水洗涤合并的有机层，经无水Na2SO4干燥，过滤，并在减压下蒸发溶剂。粗产物通过硅胶快速色谱纯化，用0-50％EtOAc-己烷洗脱，得到6(202mg，38％)，为白色固体。TLC:Rf＝0.5(硅胶，EtOAc:己烷，50:50)。1H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ4.62(dd,12.6,6.9Hz,-OCH₂O-),3.64-3.60(m,1H,H-7),3.38-3.34(m,1H,H-4α),3.34(s,3H),2.44-2.14(m,5H),2.08-1.71(m,7H),1.50-1.20(m,12H),1.19-1.02(m,3H),1.00(s,3H,H-19),0.93(d,J＝6.4Hz,3H,H-21),0.67(s,3H,H-18)。APCI-＝433。

制备7：

向6(200mg，0.46mmol)在MeOH(10mL)中的溶液中加入8滴2％H2SO4，并将混合物加热回流3h。将混合物冷却至室温，并用EtOAc(200mL)稀释，用饱和NaHCO3溶液(50mL)、盐水(20mL)洗涤，并用无水Na2SO4干燥，然后过滤并蒸发，得到200mg产物。粗产物的NMR显示酮:缩酮的混合物(1:3)。将该混合物溶解于丙酮(10mL)中，并加入5滴水，然后加入Amberlyst15树脂(200mg)。将混合物搅拌25min，过滤并用丙酮洗涤。将滤液在旋转蒸发仪上浓缩并干燥。粗产物通过硅胶快速色谱纯化，用10-25％EtOAc-己烷洗脱，得到7(160mg，78％)，为白色固体。TLC:Rf＝0.7(硅胶，EtOAc:己烷，20:80)。1H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ4.62(dd,J＝12.6,6.9Hz,Hz,2H,-OCH₂O-),3.68-3.59(m,4H,-CO₂CH₃和H-7),3.38-3.32(m,4H,H-4α,OCH₃),2.41-2.16(m,6H),2.12-1.68(m,8H),1.5-1.06(m,16H),1.00(s,3H,H-19),0.92(d,J＝6.4Hz,3H,H-21),0.66(s,3H,H-18)。

制备8：

在氮气气氛中，向吡啶-2-甲醛(picolinaldehyde)(5.0g，46.7mmol)在CH₂Cl₂(300mL)中的溶液中加入(4-氨基丁基)氨基甲酸叔丁酯(8.8g，46.74mmol)，然后加入NaB(OAc)3H(19.8g，93.42mmol)。将混合物在室温下搅拌5h。将反应混合物倒入饱和NaHCO₃溶液(300mL)中，并搅拌10min。分离有机层，用饱和NaHCO₃溶液、盐水洗涤，并用无水Na2SO4干燥，然后过滤和蒸发。粗产物通过硅胶快速色谱法纯化，用5-10％MeOH-CH2Cl2洗脱，得到8(6.9g，53％)，为黄色油。TLC:Rf＝0.4(硅胶，MeOH:CH₂Cl₂，10:90)。1H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.54(m,1H,H-6),7.64(m,1H,H-4),7.20(m,1H,H-3),7.18-7.13(m,1H),3.89(s,2H,-CH₂N-),3.2-3.05(m,2H,-CH₂NHBoc),2.67(t,2H,-CH₂NH),1.55-1.53(m,4H,-CH₂-CH₂-),1.42(s,9H,-C(CH₃)₃)。APCI+＝280。

制备9：

在0℃下经30min向0℃下8(6.9g，24.69mmol)在CH₂Cl₂(60mL)中的溶液中加入TFA:CH₂Cl₂(1:1，40mL)。使混合物温热至室温，搅拌过夜，并在旋转蒸发仪上与作为助溶剂的甲苯(5×100mL)一起浓缩。将粗产物溶解于水中，并冻干过夜，得到棕色油，将其与EtOAc(500mL)一起搅拌。过滤分离出的固体，用EtOAc洗涤，并在真空下干燥，得到9(8.2g，64％)，为白色固体。¹H NMR(300MHz,CD3OD)δ8.66-8.62(m,1H,H-6),7.91-7.82(m,1H,H-4),7.48-7.39(m,2H,H-3,H-5),4.38(s,2H,-CH₂N-),3.2-3.12(m,2H,-CH₂N),3.03-2.94(m,2H,-CH₂N),1.91-1.70(m,4H,-CH₂-CH₂)。APCI+＝180。

制备10：

向7(370mg，0.71mmol)和9(160mg，0.35mmol)在CH₃OH:THF(1:1，8mL)中的混合物中加入

分子筛(1g)，然后加入DIPEA(0.55g，4.26mmol)，并将混合物搅拌过夜。质谱显示反应不完全，因此加入1g的

分子筛并将混合物再搅拌7h，然后加入Na BH₃CN(71mg，1.13mmol)。将混合物在RT(室温)下搅拌2天。通过硅藻土垫过滤反应混合物，并用二氯甲烷和甲醇洗涤。浓缩滤液，得到粗产物，将其重新溶解在二氯甲烷中，用水、5％NaOH溶液洗涤；将水相用二氯甲烷再萃取，并将合并的有机相用盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，并在减压下除去溶剂以分离粗产物。使用1-10％MeOH/CHCl₃和1-2％NH₃于MeOH中通过FCC纯化该物质，分离出36mg的3α-异构体(10a，16％)和72mg的3β-异构体(10b，33％)。

3α-异构体(10a):¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.56(m,1H-Py),7.63(dt,J＝1.5,5.7Hz,1H-Py),7.30(d,J＝6.6Hz,1H-Py),7.16(m,1H-Py),4.63(dd,J＝12.6,6.9Hz,Hz,2H,-OCH₂O-),3.91(s,2H,CH₂-Py),3.65(s,3H,COOMe),3.57(m,1H,H-7),3.33(s,3H,OCH₃),2.84(m,1H,H-3β),2.63(bt,2H,-N-CH₂-),2.55(bt,2H,-N-CH₂-),2.10-2.40(m,3H),1.70-1.90(m,7H),1.00-1.70(m,25H),0.92(d,J＝6.4Hz,3H,H-21),0.77(s,3H,H-19),0.62(s,3H,H-18)。APCI+＝612。

3β-异构体(10b):¹H NMR(300MHz,CDCl₃)δ8.56(m,1H-Py),7.63(dt,J＝1.5,5.7Hz,1H-Py),7.30(d,J＝6.6Hz,1H-Py),7.16(m,1H-Py),4.62(dd,J＝12.6,6.9Hz,Hz,2H,-OCH₂O-),3.92(s,2H,CH₂-Py),3.64(s,3H,COOMe),3.57(m,1H,H-7),3.35(s,3H,OCH3),2.60-2.75(m,4H,-N-CH₂-CH₂-N-),2.40-2.55(m,1H,H-3β),2.10-2.40(m,3H),1.58-1.90(m,13H),1.00-1.55(m,18H),0.89(d,J＝6.4Hz,3H,H-21),0.69(s,3H,H-19),0.61(s,3H,H-18)。APCI+＝612

制备11：

向密封管中化合物10b(71mg，0.116mmol)在MeOH(3mL)中的溶液中添加MeOH中的HCl(1.25M，0.46mL，0.58mmol)，并将混合物在65℃加热2.5h，由于反应不完全，所以加入0.1mL过量的MeOH中的HCl，并在65℃下继续反应7h。将反应混合物浓缩并干燥以分离出95mg(＞100％)的化合物11。总共8mg的粗产物用于尝试纯化(色谱；洗涤；研磨)，未成功。剩余的材料在真空中干燥过夜。总共82mg被发送到Ohr。

¹H NMR(300MHz,CD3OD)δ8.74(m,1H-Py),8.13(dt,J＝1.5,5.7Hz,1H-Py),7.77(d,J＝6.6Hz,1H-Py),7.65(m,1H-Py),4.50(s,2H,CH2-Py),3.80(m,1H,H-7),3.64(s,3H,COOMe),3.00-3.30(m,5H,-N-CH₂-CH₂-N-,H-3α),2.19-2.41(m,2H),1.11-2.10(m,28H),0.93(d,J＝6.4Hz,3H,H-21),0.87(s,3H,H-19),0.69(s,3H,H-18)。APCI+＝568。HPLC＝94％。

一种替代的合成方案如下：

制备4：

在室温下，向3(2.0g，4.45mmol)在DMSO(100mL)中的溶液中加入SIBX(45％)(5.5g，8.9mmol)，然后加入TFA(100μL)。将该混合物在40℃下搅拌过夜。将反应混合物冷却至室温，加入水(0.5L)，并用EtOAc(2×200mL)萃取。用水、盐水洗涤合并的有机层，用无水Na2SO4干燥，浓缩并通过Isco(120g硅胶柱)纯化，并用EtOAc-己烷(0至100％EA)洗脱，得到4(1.3g，65％)，为白色固体。

制备5：

在-78℃下向液氨(60mL)中加入碎片状Li金属(100mg，114.5mmol)，并搅拌蓝色溶液10min以确保Li完全溶解。加入4(650mg，1.45mmol)在THF(16mL)和叔丁醇(0.17ml)的混合物中的溶液，并将混合物搅拌10min。然后将反应物用固体NH4Cl淬灭(直至颜色消失)，使其温热至室温，直至所有NH3逸出。将水添加至白色固体，将其用1M HCl酸化，并用EtOAc(3×50mL)萃取。用盐水洗涤合并的有机层，经无水Na2SO4干燥，过滤，并在减压下蒸发溶剂。通过Isco(120g硅胶柱)纯化粗产物，并用EtOAc-己烷(0至100％EA)洗脱，得到5(170mg，26％)，为白色固体。

合成式I化合物的替代方法如下：

制备1：

参考：1.Tetrahedron.,1993,49,2485。将5β-胆烷酸-3α-7α-二醇(鹅去氧胆酸，Combiblocks&QA-9583)25.0g，63.7mmol)和浓HCl(37％，7mL)在MeOH(50mL)中的混合物加热回流10min，然后在室温下搅拌过夜。将混合物用EtOAc(1L)稀释，用10％水性NaOH溶液(2x 200mL)、水(2 x 200mL)和盐水(50mL)洗涤两次。有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并蒸发，得到1(25.7g，99％)，为白色泡沫。粗产物无需进一步纯化即可直接用于下一步。TLC:Rf＝0.6(硅胶，EtOAc:己烷，50:50)。1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ3.84(m,1H,H-7),3.65(s,3H,OCH3),3.50-3.40(m,1H),2.42-2.29(m,1H),2.28-2.23(m,2H),2.02-1.58(m,8H),1.54-0.98(m,17H),0.92(d,J＝6.6Hz,3H,H-21),0.89(s,3H,H-19),0.64(s,3H,H-18)。

制备2：

参考：Tetrahedron.,1993,49,2485。将Ag2CO3/硅藻土(25g，50wt％，45.33mmol)在甲苯(300mL)中的悬浮液在与迪安-斯达克装置相连的三颈圆底烧瓶中回流下加热30min，然后使其冷却至室温。在40min内逐滴加入1(8.72g，21.4mmol)在甲苯中的溶液，将所得混合物加热回流4h，同时经由迪安-斯达克装置除去水。使混合物冷却至室温，通过硅藻土垫过滤，并用EtOAc洗涤。将滤液蒸发并真空干燥，得到2(8.51g，98％)，为白色泡沫。TLC:Rf＝0.5(硅胶，EtOAc:己烷，30:70)。1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ3.95(m,1H,H-7),3.65(s,3H,OCH3),3.44(m,1H,H-4α),2.45-2.28(m,2H),2.25-1.50(m,11H),1.48-1.10(m,14H),1.00(s,3H,H-19),0.93(d,J＝6.4Hz,3H,H-21),0.69(s,3H,H-18)。

制备3：

经30分钟经由固体添加漏斗在0℃在氮气下向2(2.0g，4.94mmol)和二甲氧基甲烷(4.51g，59.1mmol)在无水CHCl3(200mL)中的混合物中分批加入P2O5(7.53g)。将所得混合物在室温下搅拌3h。将混合物倾入冰-水(500mL)中，分离有机相，并用CHCl3(2 x 100mL)萃取水相。合并的有机层用1M HCl(50mL)、水(100mL)、盐水洗涤，并用无水Na2SO4干燥，然后蒸发并真空干燥。粗产物通过硅胶快速色谱法纯化，用5-30％EtOAc己烷洗脱，得到3(1.18g，53％)，为浅黄色固体。TLC:Rf＝0.7(硅胶，EtOAc:己烷，30:70)。1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ4.60(d,J＝6.8Hz,2H,-OCH2O-),3.71-3.62(m,4H,OCH3和H-7),3.36(s,3H,OCH3),3.34-3.28(m,1H,H-4α),2.46-2.30(m,2H),2.28-2.04(m,3H),2.26-1.62(m,8H),1.58-1.04(m,11H),1.0(s,3H,H-19),0.93(d,J＝6.4Hz,3H,H-21),0.67(s,3H,H-18)。

制备4：

在氮气气氛中，向吡啶-2-甲醛(5.0g，46.7mmol)在CH2Cl2(300mL)中的溶液中加入(4-氨基丁基)氨基甲酸叔丁酯(8.8g，46.74mmol)，然后加入NaBH(OAc)3(19.8g,93.42mmol)。将混合物在室温搅拌5h。将反应混合物倒入饱和NaHCO3溶液(300mL)中，并搅拌10min。分离有机层，用饱和NaHCO3溶液、盐水洗涤，并经无水Na2SO4干燥，然后过滤和蒸发。粗产物通过硅胶快速色谱法纯化，用5-10％MeOH-CH2Cl2洗脱，得到4(6.9g，53％)，为黄色油。TLC:Rf＝0.4(硅胶，MeOH:CH2Cl2，10:90)。1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.54(m,1H,H-6),7.64(m,1H,H-4),7.20(m,1H,H-3),7.18-7.13(m,1H),3.89(s,2H,-CH2N-),3.2-3.05(m,2H,-CH2NHBoc),2.67(t,2H,-CH2NH),1.55-1.53(m,4H,-CH2-CH2-),1.42(s,9H,-C(CH3)3)。APCI+＝280。

制备5：

经30min在0℃向4(6.9g，24.69mmol)在0℃下CH2Cl2(60mL)中的溶液加入TFA:CH2Cl2(1:1，40mL)。使混合物温热至室温，搅拌过夜，并在旋转蒸发仪上与作为助溶剂的甲苯(5×100mL)一起浓缩。将粗产物溶解于水中，并冻干过夜，得到棕色油，将其与EtOAc(500mL)一起搅拌。过滤分离出的固体，用EtOAc洗涤，并在真空下干燥，得到5(8.2g，64％)，为白色固体。1H NMR(300MHz,CD3OD)δ8.66-8.62(m,1H,H-6),7.91-7.82(m,1H,H-4),7.48-7.39(m,2H,H-3,H-5),4.38(s,2H,-CH2N-),3.2-3.12(m,2H,-CH2N),3.03-2.94(m,2H,-CH2N),1.91-1.70(m,4H,-CH2-CH2)。APCI+＝180。

1H NMR(300MHz,CD3OD)δ8.74(m,1H-Py),8.13(dt,J＝1.5,5.7Hz,1H-Py),7.77(d,J＝6.6Hz,1H-Py),7.65(m,1H-Py),4.50(s,2H,CH2-Py),3.80(m,1H,H-7),3.64(s,3H,COOMe),3.00-3.30(m,5H,-N-CH2-CH2-N-,H-3α),2.19-2.41(m,2H),1.11-2.10(m,28H),0.93(d,J＝6.4Hz,3H,H-21),0.87(s,3H,H-19),0.69(s,3H,H-18)。APCI+＝568。HPLC＝94％。

将化合物3(1.00g，2.2mmol，1当量)溶解在无水AcCN(16mL)和无水MeOH(8mL)的混合物中。用化合物5(2.57g，4.9mmol，2.2当量)、DIPEA(4.3mL，24.8mmol，11当量)和7.8g3A分子筛处理溶液。搅拌过夜后，将混合物冷却至-30℃并用NaCNBH3(182mg，2.9mmol，1.3当量)处理。将其在室温搅拌3h，然后用2.2mL HOAc处理。3h后，将反应混合物通过硅藻土过滤并蒸发至干。通过LC/MS分析表明～0.3-0.5/1比率的3-碳差向异构体的混合物。通过在Aegla AQ-C18柱上的中压RP色谱纯化粗反应，使用在AcCN中0.1％TFA/在H2O中0.1％TFA的梯度，得到450mg(约24％)的推测的化合物6的二-TFA盐，为□/□混合物。1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ8.90(宽s,2H),8.59(d,1H-Py),7.93(dd,1H-Py)7.67(d,1H-Py),7.47(dd,1H-Py),4.66(d,1H,-OCH2O-),4.52(d,1H,-OCH2O-),4.38(s,2H,-CH2Py),3.65(s,3H,COOCH3),3.56(宽s,1H),3.33(s,3H,-OCH3),3.15(宽s,2H),2.99(宽s,2H),2.85&/或2.55(宽m,1H,H-3),1.1-2.5(m,28H),0.99&/或0.91(s,3H),0.89(d,3H),0.62(s,3H)。质量：(APCI)M+＝612。化学位移可根据冻干后剩余的TFA当量而变化。

在密封管中在65-70℃下加热6(245mg，0.29mmol)在5mL MeOH以及0.5mL在MeOH中的1M HCl中的溶液3h。通过旋转蒸发除去溶剂后，将残余物溶解在H2O/AcCN混合物中并冻干，得到三盐酸盐7(150mg，76％)，为灰白色泡沫。

1H-NMR(300MHz,CD3OD):δ8.70(d,1H-Py),8.00(dd,1H-Py),7.63(d,1H-Py),7.54(dd,1H-Py),4.47(s,2H,-CH2-Py),3.81(bs,1H),3.65(s,3H,COOMe),3.42(bs,1H),3.20(m,2H),3.06(m,2H),2.80&/或2.97m,1H,H-3),2.18-2.48(m,3H),1.7-2.06(m,14H),1.1-1.6(m,15H),0.98&/或1.03(s,3H),0.95(d,3H),0.72(s,3H)。质量：(APCI)M+＝568。

将富含一种或另一种异构体的6的样品分别脱保护，得到7的样品。

前述的替代方案被描绘如下：

然后可以通过柱色谱分离异构体(类似于DPM-1001)的混合物，以分离β-顺式和α-顺式类似物(即分别为DPM-1013和DPM-1014)，相对纯度为95％，如下：

式I化合物结合铜并改善瘦素和胰岛素信号转导以及肥胖

方法

试剂

所有常用试剂均获自Thermo Fisher Scientific(Waltham,MA)或Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。二氟-4-甲基伞形酮磷酸酯(DiFMUP)获自Invitrogen(cat#D22065)。用于磷酸酶测定的黑色实心384孔板(cat#3573)来自康宁公司(Corning,NY)。

抗体

研究中使用的抗体购自：Upstate Biotechnology(pTyr，目录05-321，克隆4G10；)；Invitrogen(pY1162/1163-IR-β，目录700393，克隆97H9L7)；Santa CruzBiotechnology Inc.(IR-β，目录sc-711，克隆C711)；Cell Signaling

Technology(JAK2，目录3230，克隆D2E12；p-T308 AKT(目录13038，克隆D25E6)；AKT(目录4691，克隆C67E7)和Sigma-Aldrich(肌动蛋白，目录A2228，克隆AC-74)。

PTP1B的纯化

使用LB在大肠杆菌BL21(DE3)-RIL中表达含有His标签的野生型PTP1B。将细胞重悬于含有cOmplete无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒(cOmplete EDTA-free ProteaseInhibitor Cocktail)(Roche)的裂解缓冲液(50mM Hepes pH 7.2，150mM NaCl，10mM咪唑，2mM TCEP)中，然后在4℃下使用超声仪裂解。通过离心澄清裂解物。最初的蛋白质纯化是通过重力流，镍柱色谱法进行的。立即使用蛋白质，或将蛋白质储存在-80℃的50mM HEPES pH7.4、100mM NaCl、2mM二硫苏糖醇和25％甘油中。

凝胶过滤

将PTP1B(5μM)与10μM MSI-1436在最终体积为200μl的缓冲液(50mM HEPES，pH7.0，100mM NaCl，0.2mM EDTA，2mM DTT)中在4℃下温育。然后将反应混合物在Superdex200柱(HR30/10；Pharmacia Biotech Inc.)上进行凝胶过滤。在上样MSI-1436饱和蛋白质样品之前，将色谱柱用50mM HEPES、pH 7.0、100mM NaCl、0.2mM EDTA和2mM DTT平衡。分别使用蓝色葡聚糖和考马斯蓝染料测量空隙体积(V_o)和总体积(V_t)。收集0.5ml的级分，并且通过Bradford测定法或通过记录280nm处的UV吸收光谱来确定每个样品中的蛋白质浓度。

铜结合测定

使用放射性标记的铜(64Cu²⁺)进行直接结合测定。将不同浓度的放射性标记的铜(0-100nM)与DPM-1001(100nM)温育。通过使样品通过脱盐柱除去过量的铜。通过闪烁计数直接定量与化合物结合的金属量。为了用该蛋白进行测定，将带有His标签的PTP1B(100nM)与不同浓度的Cu-DPM-1001络合物在测定缓冲液(50mM Hepes，100mM NaCl，0.1％BSA pH6.5)中于25℃下温育60min。通过将蛋白质-抑制剂混合物与50μl的50％Ni-NTA珠在25℃下温育10min来分离蛋白结合的化合物和游离化合物。用含有150mM NaCl和25mM咪唑的测定缓冲液洗涤珠3次，并通过闪烁计数来测定与蛋白质结合的抑制剂。通过BCA蛋白质定量估计珠结合的蛋白质的量。

DPM-1001-铜络合物的ESI-MS分析

8当量的M(NO₃)₂·xH₂O或MSO₄·xH₂O(M＝Cu，Zn)与1当量的DPM-1001(在H₂O中，1mM)反应。将反应溶液在RT、40℃和80℃下搅拌2h。在装有电喷雾电离(ESI)源的BrukerEsquire 6000 HCT四极离子阱仪器(Bruker Daltonik GmbH，Leipzig，德国)上记录质谱。DPM-1001/Cu(II)物质的分子式的生成以及理论(模拟)和测得的同位素模式之间的比较是使用DataAnalysis 4.0软件(Bruker)进行的。

动物实验。

所有方案均已获得冷泉港实验室的机构动物使用和护理委员会(InstitutionalAnimal Use and Care Committee)的批准。在实验前，在标准条件下让喂养普通饮食或高脂饮食(D12492)的10周龄的雄性小鼠适应环境10天。向小鼠每天一次腹膜内(i.p.)注射媒介物、5mg/kg DPM-1001，腹膜内或口服，持续50天。禁食6h后对小鼠实施安乐死，收集血清样品以测量代谢参数，并收集组织样品以研究信号转导的变化。

代谢测量。

使用血糖仪(One-Touch Basic；Lifescan，CA)测量尾部血液中的葡萄糖。对于葡萄糖耐量测试(GTT)，将小鼠禁食10小时，然后注射20％的D-葡萄糖(2mg/g体重)，并在即将注射之前以及在注射后15、30、60和120min时监测血糖。对于胰岛素耐量测试(ITT)，在禁食4小时的动物中给予胰岛素(0.75mU/g)，并在即将注射之前以及在注射后30、60和120分钟时监测血糖。使用ANOVA对GTT和ITT进行统计分析。

结果

发现DPM-1001(IC₅₀ 100nM)是比MSI-1436(IC₅₀ 600nM)更有效的磷酸酶抑制剂。图1.为了研究DPM-1001抑制的机制，我们针对PTP1B-L192A/S372P(一种该蛋白的MSI-1436抗性突变体形式)进行了测试。尽管PTP1B-L192A/S372P对MSI-1436不敏感，但该突变酶被DPM-1001抑制(IC₅₀为1μM)，但与野生型磷酸酶相比敏感性降低。图2.这表明与DPM-1001相比，MSI-1436抑制PTP1B的机制有所不同。通过稀释酶-抑制剂络合物并监测磷酸酶活性可恢复的程度来检查抑制的可逆性。与发现是PTP1B_1–405(包含延长的C末端片段的PTP1B的长形式)和PTP1B_1–321二者的可逆抑制剂的MSI-1436形成对比，DPM-1001可逆地抑制了PTP1B的短形式，而PTP1B_1–405在延长的时间段内仍保持无活性。图3.为了检查DPM-1001抑制的时间依赖性，在与DPM-1001温育不同时间后，测量了长和短形式的PTP1B的活性。随着酶和化合物的温育时间延长，DPM-1001对PTP1B_1-405的抑制效力提高。没有预温育的情况下，对PTP1B_1-405的IC50为600nM，与MSI-1436相似；但是，预温育30分钟后，效力提高到100nM。与之不同，对PTP1B_1-321的IC₅₀没有明显的时间依赖性变化，表明两种化合物的行为差异需要PTP1B的C端。图4.

进一步检查时间依赖性的基础中，DPM-1001没有诱导PTP1B聚集，从而消除了这种有害的机制。图5.现已公认，PTP1B中的活性位点半胱氨酸极易氧化，且据报道，小分子可促进磷酸酶测定法中活性氧类的产生；因此，测试了DPM-1001是否促进了酶的长形式的优先氧化和失活。在存在或不存在过氧化物还原酶1(PRX1)或过氧化氢酶(CAT)的情况下，测量了DPM-1001介导的对PTP1B_1-405的抑制作用，因为这两种酶均将H₂O₂降解为H₂O，但机制不同。在存在或不存在PRX1的情况下，DPM-1001介导的对PTP1B_1-405的抑制作用的效力呈现时间依赖性增加(图6)，这表明该作用不是由于该化合物介导的磷酸酶氧化和失活所致。在过氧化氢酶存在下，抑制作用没有明显的时间依赖性(图6)。与PRX1不同，过氧化氢酶是一种金属依赖性酶。因此，过氧化氢酶可以结合测定缓冲液中作为杂质存在的金属离子，并从而防止DPM-1001以金属离子依赖性的方式抑制PTP1B。

DPM-1001与铜(II)形成稳定的络合物

DPM-1001与过量的CuSO₄或Cu(NO₃)₂反应，并进行ESI-MS分析。DPM-1001/CuSO₄反应混合物的ESI-MS谱显示出m/z 568.6和727.5处的两个主要峰，与游离DPM-1001和与DPM-1001和硫酸盐阴离子两者结合的Cu(II)络合物一致。在分析同位素模式之后，后者被鉴定为[Cu(DPM-1001)(SO₄)+H⁺]⁺(图7)。在硝酸铜存在下，在m/z 692.5和755.5处检测到光谱峰，其对应于[Cu(DPM-1001)(NO₃)]⁺和[Cu(DPM-1001)(NO₃)₂+H⁺]⁺的结构。不限于任何特定的结合机制或结构，DPM-1001可以充当三齿配体，形成一个七元和一个五元螯合环，而铜(II)周围的环境最有可能是五配位，显示四方锥体或三角双锥体几何形状(图8A)。方形平面几何形状虽然对于Cu(II)来说是很典型的，但由于DPM-1001配体的性质，在这种情况下是没有优势的，而四面体几何形状则非常少见(结构通常通过溶剂/抗衡离子配位或配体重排提供具有更高配位数的热力学更稳定的化合物)。

为了进一步检查DPM-1001的螯合性能，使用了放射性标记的铜(⁶⁴Cu)来确定DPM-1001对金属的亲和力。通过针对浓度增加的⁶⁴Cu来滴定DPM-1001，测量了75nM的Kd和1mol/mol的化学计量。图9.已经显示出其他已知的Cu²⁺螯合剂也可以螯合Zn²⁺离子；因此，使DPM-1001与ZnSO₄或Zn(NO₃)₂反应，并对溶液进行ESI-MS分析。在所有情况下，仅在m/z 568.6处检测到一个主峰，对应于DPM-1001；DPM-1001与Zn(II)没有络合。

DPM-1001与PTP1B的C末端结合并抑制该酶

为了确定Cu-DPM-1001络合物抑制PTP1B的机制，产生了截短突变，其中磷酸酶C末端片段的长度发生了变化。与MSI-1436类似，DPM-1001对三个截短突变体PTP1B_1-367、PTP1B_1-346和PTP1B_1-321的抑制效力比其对PTP1B_1-405和PTP1B_1-394的抑制效力低。此外，仅在PTP1B_1-405和PTP1B_1-394中观察到抑制的时间依赖性。这突出了延长的C末端对于PTP1B的时间依赖性抑制的重要性。

考虑到蛋白质中铜结合位点中His残基的记录的重要性，测试了将PTP1B C末端片段中His残基突变为的Ala对Cu-DPM-1001络合物介导的时间依赖性抑制的影响。特别地，His残基H320和H331的突变导致Cu-DPM-1001的抑制效力显著降低。图10.此外，将H320A/H331A突变与降低PTP1B对MSI-1436的敏感性的S372P/L192A组合使Cu-DPM-1001介导的PTP1B抑制的效力进一步向右移动，从纳摩尔到微摩尔。图10.

针对一组六个PTP测试了Cu-DPM-1001络合物，并观察到(再次类似于MSI-1436)，与其他测试的PTP相比，存在对含有C末端片段的PTP1B长形式的优先抑制作用。Cu-DPM-1001和PTP1B之间存在直接的相互作用。使用放射性标记的铜(⁶⁴Cu)，生成⁶⁴Cu和DPM-1001的络合物，并使用野生型和突变形式的PTP1B进行结合测定。针对长和短形式的PTP1B滴定游离放射性标记的铜，并且高浓度的铜可以与PTP1B结合，而对长和短形式的酶没有偏好。所有后续测定均在低于0.1mM的铜浓度下进行，以最大程度地减少Cu与PTP1B之间的直接相互作用。针对⁶⁴Cu-DPM-1001络合物测试野生型PTP1B_1-405，其显示K_d为75nM的相互作用。图11.这与在体外磷酸酶活性测定中观察到的IC₅₀一致。与之形成对比，几乎没有检测到⁶⁴Cu-DPM-1001络合物与C端截短的PTP1B(1-321)的结合。类似地，即使在高浓度络合物下，相对于野生型，⁶⁴Cu-DPM-1001络合物与PTP1B的H320A/H331A双突变体形式的结合显著降低。图11.如在活性测定中所见，在这些结合测定中概括了Cu-DPM-1001络合物对PTP1B相对于PTP家族其他成员的特异性。图12.不限于任何特定的抑制PTP1B活性的机制，这些数据揭示了一种抑制PTP1B的新机制，该机制结合了MSI-1436靶向的变构位点的特征，而添加了铜依赖性结合的附加特征。

DPM-1001通过改善胰岛素和瘦素信号转导抑制小鼠中饮食引起的肥胖。

PTP1B是胰岛素和瘦素信号转导的负调节剂；因此，可以预期PTP1B抑制剂(诸如DPM-1001)会促进通过胰岛素和瘦素受体的信号转导。高脂饮食喂养的C57B16/J小鼠用于检查DPM-1001对动物肥胖、代谢和信号转导的影响。用DPM-1001处理高脂饮食和普通饮食喂养的小鼠。将口服或腹膜内递送的化合物的作用与盐水处理的小鼠进行比较。与盐水形成对比，经DPM-1001处理的高脂饮食喂养的小鼠在处理后五天内开始体重减轻。体重减轻持续大约三周，此后未观察到体重进一步下降。总体而言，用DPM-1001处理可导致～5％的体重减轻。图13.重要的是，当化合物口服或腹膜内递送时，观察到相同的效果。此外，普通饮食喂养的小鼠没有发现体重减轻，这表明观察到的体重减轻是肥胖动物能量代谢改善的结果。

与盐水的施用形成对比，口服或腹膜内DPM-1001处理在葡萄糖耐量(图14)和胰岛素耐量(图15)测试中改善了葡萄糖耐量和胰岛素敏感性。这些数据表明该化合物在高脂饮食喂养的小鼠中导致增强的胰岛素信号转导。为了进一步检查，通过肝中AKT的磷酸化，测量了该化合物对胰岛素受体β亚单位的酪氨酸磷酸化和下游信号转导的活化的作用。口服或腹膜内施用化合物后，观察到β-亚基磷酸化的显著增加，而用盐水则未观察到。图16.与此一致的是，在DPM-1001处理后，观察到了增强的AKT磷酸化，表明了响应于该化合物的胰岛素信号转导的改善。

还考虑到瘦素在控制葡萄糖体内平衡和肥胖中的重要作用，测试了该化合物对下丘脑中瘦素信号转导的作用。与胰岛素信号转导的改善相似，用DPM-1001而不是盐水进行处理导致JAK2磷酸化增强，与瘦素信号转导增强一致。图17.

式I化合物结合威尔逊氏病小鼠模型中的铜和改善的缺陷

方法

DPM-1001-铜络合物的ESI-MS分析

8当量的M(NO₃)₂·xH₂O或MSO₄·xH₂O与1当量的DPM-1001、DPM-1003或类似物2(在H₂O中，1mM)反应。将反应溶液在RT、40℃和80℃下搅拌2h。将每个样品在50％甲醇、0.1％甲酸中稀释5倍，然后装入500μL注射器中。配备有HESI喷雾源的Thermo Vantage三重四极杆质谱仪(Thermo Scientific)与Accela HPLC系统(Thermo Scientific)耦合。流动相A由0.1％甲酸组成，且流动相B由甲醇中的0.1％甲酸组成。等度流量设置为200μL/min的50％B。通过注射泵以10μL/min将200μl样品注入LC流管线，并电喷雾至Vantage三重四极杆质谱仪中。使用4.3kV的喷射电压以及350℃的毛细管温度。每次完整MS扫描为0.5s，并在1min内以200m/z至900m/z的扫描范围收集数据。

铜结合测定

使用放射性标记的铜(64 Cu²⁺)进行直接结合测定。将不同浓度的放射性标记的铜与DPM-1001(100nM)温育。通过使样品通过C18柱除去过量的铜。通过闪烁计数直接定量与化合物结合的金属量。为了用该蛋白进行测定，将带有His标签的PTP1B(100nM)与不同浓度的Cu-DPM-1001络合物在测定缓冲液(50mM Hepes，100mM NaCl，0.1％BSA pH 6.5)中于25℃下温育60min。通过将蛋白质-抑制剂混合物与50μl的50％Ni-NTA珠在25℃下温育10min来分离蛋白结合的化合物和游离化合物。用含有150mM NaCl和25mM咪唑的测定缓冲液洗涤珠3次，通过将样品以5000x g离心10分钟。通过闪烁计数确定与蛋白质结合的抑制剂。通过BCA蛋白质定量估计珠结合的蛋白质的量。为了进行蛋白质定量，将珠结合的蛋白质用TCA(最终25％)在冰上沉淀30分钟。将沉淀物溶解在200μl的8M尿素中，并使用BCA蛋白质定量方法估计蛋白质浓度。

细胞培养

在含有10％FBS的RPMI培养基中在5％CO₂在37C培养从ATCC购买的HepG2细胞。从Coriell Biorepository获得对照(AGO9319)和威尔逊氏病患者来源的成纤维细胞(GM00032、GM00033、GM05257、GM12158、GM05798和GM11778)，并在10％FBS的DMEM中在5％CO₂在37℃下培养。

基于细胞的测定

为了进行细胞存活测定，将10,000个细胞接种在96孔板中并培养直至完全汇合(90％)。向这些细胞转染了购自Qiagen和Santa Cruz Biotechnology的ATP7B siRNA或加扰的siRNA(阴性对照)。Lipofectamine RNAiMAX试剂(Thermofischer)和siRNA在Opti-MEM(Gibco)中稀释至最终体积为100μl。将混合物在室温下温育30min，然后将800μl的Opti-MEM添加至混合物。将上述转染溶液以5nM siRNA的终浓度覆盖在细胞上。用加扰的siRNA转染HepG2细胞作为阴性对照。转染后十二小时，将完全培养基添加到每个孔中。之后，检查敲低效率(24小时后)，并将细胞暴露于不同浓度的铜(0-1mM)中12h，并使用MTT测定法测定细胞生存力，如前所述(37)。为了测试DPM-1001预防铜诱导的毒性的能力，在将细胞暴露于铜之前，将细胞与2μM的化合物预温育1小时。

动物实验。

从Jackson实验室获得C3He-Atp7b^tx-j。所有动物实验均根据已获得冷泉港实验室的机构动物使用和护理委员会批准的方案进行。向小鼠腹膜内(i.p.)注射媒介物，或腹膜内或口服施用DPM-1001，每三天一次，5mg/kg，持续一年。在研究结束时，对动物实施安乐死并取出组织样品进行生化研究。

电感耦合等离子体质谱法。

用包含1mM EDTA的PBS洗涤来自用盐水、DPM-1001或四硫代钼酸盐处理的野生型或TX小鼠的组织样品3次(以去除非特异性结合的铜)。然后，向每个样品中添加215μl浓硝酸(BDH Aristar Ultra)，并温育过夜。将样品在95℃下煮沸1h，然后将大约150μl的每个样品在2ml 2％硝酸中(由浓硝酸和Milli-Q水新鲜制得)进一步稀释。将样品在ThermoFisher iCAP Qc ICP质谱仪上以动能歧视(KED)模式针对已知铜和磷浓度的校准曲线进行分析，并以Ga(20μg/l，Inorganic Ventures)作为内标。每个实验进行两次，且每种条件重复至少三次。

金属硫蛋白定量

将组织样品(100mg肝脏或25mg脑)在PBS中冲洗以去除多余的血液，并在冰上使用杜恩斯(dounce)匀浆器匀浆(PBS，1％吐温)。将样品以5000×g离心5分钟，并收集上清液。使用Bradford试剂测量上清液中的总蛋白，并使用等量的每个样品(基于蛋白浓度)测量金属硫蛋白水平。小鼠金属硫蛋白Elisa试剂盒购自Lifespan Biosciences，Inc，并根据用户手册进行测定。

组织学

将来自未处理和DPM-1001处理的野生型和TX小鼠的肝组织切片并用H&E或罗丹宁染色。使用Aperio ScanScope XT自动扫描系统(Vista，CA)捕获H&E染色的组织的全玻片数字化图像。使用Image J软件定量罗丹宁染色。

结果

DPM-1001是一种特异性铜螯合剂

为了检查DPM-1001对铜的螯合，通过将该化合物与一系列金属离子温育，然后对络合物进行ESI-MS分析来测试DPM-1001是否显示为铜特异性。在CuSO₄存在下，该化合物的ESI-MS光谱显示出在568.6、620和727.5m/z处的三个峰。在568.6处的峰对应于游离化合物，而在620处和727.5处的峰分别对应于Cu-和CuSO₄-结合形式。图18.当将DPM-1001与多种其他金属一起温育时，多种其他金属都没有与该化合物形成络合物。图18.其包括银，它是等电子的，且大小与Cu⁺相似，这突出了DPM-1001对铜严格的特异性。

使用放射性标记的铜(⁶⁴Cu)，并在结合测定中针对浓度增加的⁶⁴Cu滴定DPM-1001，测得K_d为75nM。为了研究DPM-1001螯合铜的机制，产生了一系列类似物。从胆固醇组中A环的3位上除去N¹-(吡啶-2-基甲基)丁烷-1,4-二胺尾部足以消除铜结合，将注意力集中在了该尾部的重要性。用哌啶或苯取代吡啶基基团，或生成带有醚的4-氨基取代基，以产生4-(吡啶-2-基甲氧基)丁烷-1-胺，也损害结合。在吡啶基基团内，N原子从DPM-1001中的2-位移动到3-位，以产生化合物DPM-1003。有趣的是，尽管DPM-1003和DPM-1001的化学组成相同，但与DPM-1001不同，DPM-1003对放射性标记的⁶⁴Cu和任何测试的金属均显示出有限的结合。

另外，生成了N¹,N⁴-双(吡啶-2-基甲基)丁烷-1,4-二胺(类似物2)，这是一种对称化合物，其中在DPM-1001中存在的类固醇部分被第二个吡啶环替换。当在CuSO₄存在下温育时，该类似物在ESI-MS分析中在332处产生一个明显的峰，其对应于该化合物的Cu(II)结合形式。当针对⁶⁴Cu滴定时，Kd为57nM。此外，与DPM-1001不同，当我们将类似物2放在金属板上温育时，该类似物与所有测试的金属结合。总体而言，这些数据说明在DPM-1001中，N¹-(吡啶-2-基甲基)丁烷-1,4-二胺尾部负责铜的螯合，而类固醇部分赋予铜结合的选择性。

DPM-1001改善了暴露于高铜的细胞的生存力。

由于DPM-1001是有效的体外铜螯合剂，因此测试了其在细胞环境中结合铜的能力。HepG2细胞被用作模型，包括其中ATP7B(一种在铜排泄中起作用的P型Cu-ATP酶)被抑制的细胞。与野生型细胞不同，观察到ATP7B敲低细胞对暴露于铜敏感。在铜浓度大于0.5mM时，ATP7B-KD1的存活率小于20％(图19)，突显了ATP7B在保护细胞免受过量铜的影响中的重要性。当在DPM-1001(2μM)存在下测试生存力时，该化合物能够从铜诱导的细胞死亡中拯救细胞(图19)。

通过测试一组六种来自威尔逊氏病患者的不同皮肤成纤维细胞，进一步探索了这一观察结果的意义。据报道这些细胞表达不同突变形式的ATP7B，并且相对于正常的成纤维细胞，表现出升高的游离铜水平。测量了这些细胞在存在增加的铜浓度的情况下的存活率，并将其与正常皮肤成纤维细胞中观察到的反应进行了比较。尽管在突变细胞中观察到了对铜的不同反应，但发现它们与野生型细胞相比均对铜诱导的细胞死亡更敏感。有趣的是，DPM-1001还抑制了铜诱导的源自威尔逊氏病患者的成纤维细胞中的细胞死亡。图20-22、26-28.

DPM-1001降低了威尔逊氏病动物模型中的铜含量。

TX小鼠是天然存在的威尔逊氏病的遗传和表型模型。由Gly至Asp的替换(G775D)会使ATP7B蛋白失去功能，并导致铜积累。这已被广泛用作了解人类疾病的模型。TX和野生型小鼠表现出不同的寿命。因此，评估了用DPM-1001或盐水处理的TX和野生型小鼠的存活率。用盐水或DPM-1001处理的野生型小鼠存活到研究结束，一岁时存活率为100％。相比之下，仅60％的经盐水处理的TX小鼠在1岁时存活。有趣的是，经DPM-1001处理的TX小鼠中有90％在一岁时存活。图29.在野生型或TX小鼠中，DPM-1001的长期处理均没有明显的毒副作用。

通过两种单独的方法评估组织铜水平。从已经用盐水或DPM-1001处理过的野生型和TX小鼠中切除肝脏组织，然后固定并用罗丹宁(一种对铜结合蛋白染色的染料)染色。在从盐水或DPM-1001处理的野生型小鼠获得的肝样品中未检测到信号。在盐水处理的TX小鼠中，观察到该染料明亮染色，表明铜水平升高。相反，在从DPM-1001处理的小鼠获得的肝样品中没有观察到罗丹宁的明显染色。图23.ICP-MS用于获得铜水平的定量测量。与对照动物相比，盐水处理的TX小鼠肝脏中的铜水平升高，并且DPM-1001处理降低了两个组织中的铜水平。图24.有趣的是，具有与DPM-1001相同的化学组成但不螯合铜的3-吡啶基类似物DPM-1003没有抑制TX小鼠肝脏中的金属水平，这表明DPM-1001对组织铜水平的作用是直接的。图30.然后将DPM-1001的作用与药物候选螯合剂四硫代钼酸盐(TTM)进行了比较，且DPM-1001与四硫代钼酸盐在从肝脏和大脑中去除铜的效果一样，而剂量较低且施用频率较低。图24

还研究了DPM-1001清除组织铜水平的机制。青霉胺作为“脱铜剂”促进尿液中金属的排泄。因此，测量了从盐水处理或DPM-1001处理的野生型和TX小鼠中获得的肾脏样品中的铜水平，且未观察到显著差异。与之不同，用四硫代钼酸盐治疗会导致肾脏中的铜水平急剧升高。图24.从小鼠收集粪便材料并分析其铜水平。与用盐水处理的TX小鼠形成对比，DPM-1001处理的TX小鼠粪便中的铜水平显著升高。与DPM-1001处理不同，用四硫代钼酸盐处理只会导致粪便中铜的水平少量增加。图24.

DPM-1001改善了与WD相关的肝并发症

鉴于肝损伤和肝并发症是威尔逊氏病的特点，因此，在用盐水或DPM-1001处理后，对从野生型和TX小鼠获得的肝脏进行了形态学分析。在野生型肝中，用生理盐水或DPM-1001处理，然后切片并染色以进行形态分析，未发现明显异常；观察到正常的肝细胞尺寸、形状和排列。与之不同，从用盐水治疗的TX小鼠获得的肝脏切片显示，肝细胞增大、形状和排列不规则以及胞质脂质滴大。有趣的是，从用DPM-1001处理的TX小鼠获得的肝脏切片看起来与具有正常肝细胞尺寸、形状和排列的野生型小鼠获得的肝脏切片相似。此外，与盐水处理的TX小鼠的肝脏切片相比，没有观察到大的脂质滴。

此外，测量了肝脏和大脑中的金属硫蛋白水平。与野生型相比，TX小鼠的两个组织中的金属硫蛋白水平均显著升高。此外，DPM-1001处理降低了肝脏和大脑中的金属硫蛋白水平。图25.数据表明，DPM-1001降低了组织铜水平并改善了与威尔逊氏病相关的症状。

式I化合物的抗癌作用和对激酶活性的抑制

方法

细胞增殖测定

MTT测定法用于评估在不存在和存在不同化合物的情况下的细胞存活率。将噻唑基蓝四唑鎓溴化物(MTT)溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，浓度为5mg/ml，过滤并在4℃下保存。将约10,000个细胞接种到96孔板中，并在含有血清的生长培养基中培养。24小时后，用指示浓度的DPM-1001或DPM-1003(0-100uM)处理细胞2小时。随后将20μl MTT加入每个孔中。ELISA板读数器(Biotek，Winooski，Vermont，美国)用于测量490nm处的光密度。

结晶紫染色

将MDA-MB-231细胞(1x10⁵)接种在生长培养基中在6cm平板中。细胞未经处理或用DPM-1001(0.5、1、2和5μM)、DPM-1003(0.5、1、2和5μM)或TTM(25、50、100μM)处理1h。之后，轻轻吸出培养基，并用PBS洗涤细胞。向每个平板中添加0.5ml的结晶紫(0.5％)，并在室温下在黑暗中温育10分钟。除去染色溶液，并将平板用PBS洗涤(3次)。对用染料染色的细胞成像。

膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)染色

将细胞(1×10⁵)铺在生长培养基中在六孔板中。细胞未经处理或用DPM-1001(2μM)处理。随后，将细胞用冷PBS洗涤两次，并重悬于0.1M Hepes/NaOH(pH 7.4)、1.4M NaCl、25mM CaCl2中。向细胞悬液中加入5μl的异硫氰酸荧光素(FITC)-缀合的膜联蛋白V(0.1mg/ml)和碘化丙啶(1mg/ml)，并将样品在室温下于黑暗中温育30分钟。通过流式细胞仪(Becton Dickinson LSRII细胞分析仪)分析样品。

电感耦合等离子体质谱

将TNBC细胞(1×10⁶)铺在生长培养基中在10-cm培养皿中。接种细胞后约24h，未对其进行处理或用DPM-1001(2uM)或DPM-1003(2uM)处理2h。随后，将细胞用PBS洗涤3次。然后，向每个样品中添加215μl浓硝酸(BDH Aristar Ultra)，并温育过夜。将样品在95℃下煮沸1h，然后将大约150μl的每个样品在2ml 2％硝酸中(由浓硝酸和Milli-Q水新鲜制得)进一步稀释。将样品在Thermo Fisher iCAP Qc ICP质谱仪上以动能歧视(KED)模式针对已知铜和磷浓度的校准曲线进行分析，并以Ga(20μg/l，Inorganic Ventures)作为内标。每个实验进行两次，且每种条件重复至少三次。

CTR1 siRNA转染

四种不同的小干扰RNA(siRNA)用于靶向人CTR1转录物。在无核酸酶的水中将单个siRNA重构，以获得10μM溶液。当细胞约70％汇合时，使用siRNA-Oligofectamine(Invitrogen)转染siRNA。将Ctrl_AllStars_1siRNA重构为10μM，并用作阴性对照。简而言之，将7500个细胞接种在完全生长培养基中在96孔板中。接种细胞后约24h，将oligofectamine(0.5％)和siRNA(50nM)在室温下于200μl无血清培养基中温育15分钟，然后每孔添加100μl siRNA-oligofectamine络合物。在37℃下5％CO₂中温育6h后，将培养基从细胞移出并替换为常规生长培养基。每12小时通过MTT测定法在不存在和存在DPM-1001(2μM)的情况下测量细胞密度。

鉴定受铜调节的激酶

将三阴性乳腺癌(TNBC)细胞(1×10⁶)铺在生长培养基中在10-cm培养皿中。接种后约24h，用冷PBS洗涤细胞两次。之后，将细胞重悬于100μl 50mM HEPES、pH 6.5、100mMNaCl、0.05％吐温-20中，并通过超声处理(15s脉冲开启和45s脉冲关闭(2个循环))在冰上裂解。将总裂解物以3000xg离心10分钟，并收集上清液，并使用Bradford蛋白定量测定法进行定量。将约1mg的裂解物与生物素化的ATP探针(Pierce)在不断振荡下于4C温育90分钟。向反应物中加入50μl(50％浆液)的链霉亲和素珠，并在4℃下温育30分钟。将珠离心并洗涤(50mM HEPES、pH 6.5、100mM NaCl、0.05％吐温-20)3次。使用250mM磷酸盐溶液洗脱结合到珠上的激酶。将其与Cu-五齿树脂(Affiland)在4C下进一步温育90分钟。离心树脂，并用50mM HEPES、pH 6.5、100mM NaCl、25mM咪唑洗涤两次。通过质谱分析与树脂结合的蛋白质。

激酶活性测定

简而言之，在存在或不存在CuSO₄(5μM)的情况下，将重组PAK1(20nM)或重组MEK1(20nM)在180μl激酶缓冲液中温育30min。根据用户手册，通过ADP-Glow测定法(Promega)使用MBP作为底物来监测激酶的活性。

铜结合测定

使用放射性标记的铜(64Cu²⁺)进行直接结合测定。将不同浓度的放射性标记的铜(0-10uM)与重组PAK1(100nM)温育。通过使样品通过脱盐柱除去过量的铜。通过闪烁计数直接定量与蛋白质结合的金属量。

异种移植研究

将在15μl的DMEM和生长因子降低的基质胶(BD Biosciences)的1:1混合物中的MDA-MB-231细胞(2×10⁶)原位注入SCID-beige小鼠的乳腺脂肪垫(Tectonic lab)。将动物随机分为三组，以在一旦肿瘤达到约200mm³时，每天腹膜内接受盐水(对照)、DPM-1001(5mg/kg)或DPM-1003(5mg/kg)。每三天监测一次肿瘤生长，并使用公式：体积＝宽度²×长度/2，通过触诊每周测量以mm³为单位的体积三次。在盐水处理的小鼠中，一旦肿瘤体积达到大于500mm³，就终止研究。从所有小鼠中取出肿瘤进行生化分析。

免疫印迹

从指定的细胞系中分离出等量的裂解物，然后通过SDS-PAGE分离，并用以下一抗中的一种进行免疫印迹：小鼠抗MEK1/2、兔抗p-PAK1、兔抗PAK1、兔抗ERK1/2、兔抗磷酸(Ser217/221)-MEK1/2、兔抗磷酸(Thr 202/Tyr 204)-ERK1/2、兔抗磷酸(Ser 338)-c-RAF、兔抗-RAF、兔抗磷酸(Ser112)-BAD和兔抗BAD(细胞信号转导技术)、小鼠抗β-肌动蛋白(Sigma)，然后用下列辣根过氧化物酶缀合的二抗中的一种：山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG(Invitrogen)、小鼠抗兔轻链特异性IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories)，使用增强的化学发光(ECL；GE Healthcare)或SuperSignal West Femto化学发光底物(Pierce)检测试剂来进行检测。

结果

如图31-39所示，DPM-1001在DPM-1003不影响以下这些癌细胞系的存活的剂量下抑制不表达HER2、雌激素受体或孕激素受体(相关领域的技术人员称为三阴性乳腺癌，TNBC)的许多不同的乳腺癌细胞系的存活。相反，DPM-1001和DPM-1003对几种非TNBC细胞系存活的影响没有彼此不同。图40-42和图46.

如图43所示，如通过电感耦合等离子体质谱法评估的，对包括TNBC细胞系在内的许多癌细胞系的处理消耗了细胞铜水平。

如图44和45所示，DPM-1001减少了接受移植TNBC细胞的小鼠的肿瘤体积，而相当剂量的DPM-1003没有效果。DPM-1001对抑制TNBC细胞系MDA-MB-231存活率的作用也显示在图46中。膜联蛋白V和碘化丙啶染色证实DPM-1001使TNBC细胞的细胞存活率减少是由于促进了这些细胞的死亡。

TNBC细胞系MDA-MB-231和SUM159的处理也导致磷酸化Erk水平降低，表明抑制了MEK/ERK信号转导。其他铜螯合剂也具有这种作用，但是其剂量远高于DPM-1001所需的剂量。例如，用1-2μM的DPM-1001可以实现磷酸化Erk的高水平的降低，并且这种抑制作用要比使用50μM的浴铜素二磺酸盐(bathocuproine disulfonate)或25μM的TTM更好。

还在对MEK抑制剂AZD6244对细胞存活的影响敏感和不敏感的TNBC细胞中测试了响应于DPM-1001处理的TNBC细胞的存活率。在几种细胞系(MDA-MB-231、MCF-7和SUM159)中，用AZD6244处理抑制了细胞存活率，而AZD6244对其他几种细胞(HCC70、MDA-MB-468和SUM149)的存活率没有影响。在AZD6244敏感的细胞中，1-2μM的AZD6244减少了磷酸化MEK和磷酸化Erk，但在AZD6244不敏感细胞中没有影响。此外，如图47-49所示，用AZD6244与DPM-1001组合处理AZD6244抗性细胞抑制了细胞存活率。这种组合处理还降低了这些细胞中的磷酸化MEK和磷酸化Erk水平。

对来自几种TNBC细胞系(包括MDA-MB-231、CAL-120、SUM-159、HCC-70、SUM-149和HS578T细胞)的铜结合蛋白进行分析，识别了许多铜结合蛋白，包括丙酮酸激酶M(PKM)、线粒体腺苷酸激酶2(AK2)、肌酸激酶B(CKB)、p21活化激酶(PAK)、TP53调节激酶(TP53RK)、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)、吡哆醛激酶(PDXK)、U型线粒体肌酸激酶(CKMT1B)、丝裂原活化蛋白激酶(MEK)、酪氨酸激酶CSK。在铜结合测定中，进一步证实了MEK1和PAK1与铜的结合(分别为Kd＝5nM和15nM)，并且在铜存在下PAK1激酶的活性更高(V_max和K_m在Cu(II)不存在的情况下分别＝361.8和36.21，并且在Cu(II)存在的情况下分别＝834.4和35.08)。将铜添加到培养基中还增加了TNBC细胞中磷酸化PAK1的水平，而通过与DPM-1001共同施用该效应被阻断。

TNBC细胞中CTR1表达也上调。此外，向细胞培养基中添加5-10μM铜会导致一些TNBC系中pS338-RAF1和pS112-BAD水平增加，而与DPM-1001的共同施用降低或阻断这种效应。这些结果表明，铜可以诸如通过激活PAK、MEK和促进细胞存活的信号转导通路来增强TNBC细胞的细胞存活，并且式I化合物(诸如DPM-1001)可以促进TNBC细胞死亡，诸如通过阻断铜诱导的此类信号转导通路和功能的刺激。

DPM-1001对细胞存活的抑制作用不限于TNBC癌细胞。DPM-1001还抑制几种胃癌细胞系的存活，包括SNU116、KATOIII、SNU5、AGS、SNU1和N87细胞。图50-55.相比之下，DPM-1001对NIH 3T3细胞的存活没有影响，表明DPM-1001不是一般或通用的细胞毒素。

还证实了与DPM-1001不同的式I化合物的结合。在ESI-MS测试中，在测试前即刻将盐酸盐形式的化合物DPM-1013溶解在蒸馏水中，浓度为2mM。然后将其与等体积的硫酸铜(16mM)或氯化铜溶液(16mM)混合2h，使DPM-1013的浓度为1mM，且铜盐的浓度为8mM。然后将混合物进一步稀释100倍，然后注入ESI-MS，使得测试中DPM-1013的最终浓度为10μM，且Cu的最终浓度为80μM。

与CuSO₄混合，DPM-1013与游离的Cu、CuSO₄和其他加合物诸如CuCl₂(DPM-1013氯化物盐中的Cl)和Cu(OH)₂形成络合物，如图56A中的峰所示。在该浓度比率(DPM-1013:Cu＝1:8)下的结合百分比如下计算：

结合百分比＝所有DPM-1013-Cu络合物的峰强度/(所有DPM-1013-Cu络合物的峰强度+游离DPM-1013的峰强度)。

与CuCl₂混合，DPM-1013与游离Cu、CuCl₂和其他加合物诸如Cu(OH)2形成络合物，如图56B峰所示。在该浓度比率(DPM-1013:Cu＝1:8)下的结合百分比以如CuSO₄相同的方式计算。

来自图56A和56B的数据可以根据下表1来总结：

表I：DPM-1013的铜结合

不限于任何特定的结合机制或结构，DPM-1013，类似于DPM-1001(参见图8A)，可以充当三齿配体，形成一个七元和一个五元螯合环，而铜(II)周围的环境最有可能是五配位，显示四方锥体或三角双锥体几何形状(图8B)。方形平面几何形状虽然对于Cu(II)来说是很典型的，但由于DPM-1013配体的性质，在这种情况下是没有优势的，而四面体几何形状则非常少见(结构通常通过溶剂/抗衡离子配位或配体重排提供具有更高配位数的热力学更稳定的化合物)。

Claims

1.一种形成含铜络合物的方法，包括使含铜样品与式I化合物接触：

其中R是-OH或-O-CH₃。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述含铜样品是非生物溶液或悬浮液。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述含铜样品是生物溶液、悬浮液、组织或生物体。

4.根据权利要求3所述的方法，其中接触样品包括向受试者施用所述化合物。

5.根据权利要求4所述的方法，其中施用所述化合物降低铜的细胞毒性作用。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述受试者是被诊断患有与铜的生理水平升高相关的疾患的人。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述疾患是威尔逊氏病。

8.根据权利要求1所述的方法，包括通过形成所述含铜络合物来抑制酶的催化活性，并且所述酶选自由以下组成的组：丙酮酸激酶M(PKM)、线粒体腺苷酸激酶2(AK2)、肌酸激酶B(CKB)、p21活化的激酶(PAK)、TP53调节激酶(TP53RK)、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)、吡哆醛激酶(PDXK)、U型线粒体肌酸激酶(CKMT1B)、丝裂原活化蛋白激酶(MEK)、酪氨酸激酶CSK、蛋白质酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)以及上述两种或多种的任意组合。

9.一种抑制样品中激酶的酶活性的方法，包括使所述样品与式I化合物接触：

其中R是-OH或-O-CH₃，以及

其中所述激酶选自由以下组成的组：丙酮酸激酶M(PKM)、线粒体腺苷酸激酶2(AK2)、肌酸激酶B(CKB)、p21活化的激酶(PAK)、TP53调节激酶(TP53RK)、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)、吡哆醛激酶(PDXK)、U型线粒体肌酸激酶(CKMT1B)、丝裂原活化蛋白激酶(MEK)、酪氨酸激酶CSK以及上述两种或多种的任意组合。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述样品包括需要药物治疗的受试者，并且接触样品包括向所述受试者施用所述化合物。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述受试者患有胃癌。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述受试者患有HER2阴性乳腺癌。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述HER2阴性癌症是雌激素受体阴性癌症、孕激素受体阴性癌症或三阴性乳腺癌。

14.根据权利要求10所述的方法，其中所述受试者患有三阴性乳腺癌。

15.根据权利要求11、12、13或14中任一项所述的方法，还包括向所述受试者施用AZD6244。

16.根据权利要求15所述的方法，其中向所述受试者施用所述化合物和AZD6244具有治疗效果，并且所述治疗效果大于向所述受试者施用所述化合物但不施用AZD6244的治疗效果以及向所述受试者施用AZD6244但不施用所述化合物的治疗效果。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述治疗效果包括抑制肿瘤生长、抑制癌细胞转移、刺激癌细胞死亡或前述中的两种或更多种的任意组合。

18.根据权利要求11、12、13或14中任一项所述的方法，其中所述受试者先前被施用AZD6244。

19.根据权利要求18所述的方法，其中使所述样品与所述化合物接触包括抑制肿瘤生长、抑制癌细胞转移、刺激癌细胞死亡或前述中的两种或更多种的任意组合。

20.一种向受试者施用药物组合物的方法，所述药物组合物包括与式I化合物络合的铜：

其中R是-OH或-O-CH₃。

21.根据权利要求20所述的方法，其中施用所述药物组合物包括降低所述受试者的体重指数。

22.根据权利要求20所述的方法，其中施用所述药物组合物包括增强对一种或多种激素的生理反应，并且所述一种或多种激素是胰岛素、瘦素或两者。

23.根据权利要求20所述的方法，其中所述受试者患有癌症，并且所述癌症是胃癌或HER2阴性乳腺癌，并且施用所述药物组合物包括抑制肿瘤生长、抑制癌细胞转移、刺激癌细胞死亡或前述中的两种或更多种的任意组合。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述癌症是HER2阴性乳腺癌，其中所述HER2阴性乳腺癌是雌激素受体阴性、孕激素受体阴性或三阴性乳腺癌。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述癌症是三阴性乳腺癌。

26.根据权利要求23、24或25中任一项所述的方法，还包括向所述受试者施用AZD6244。

27.根据权利要求26所述的方法，其中向所述受试者施用所述化合物和AZD6244具有治疗效果，并且所述治疗效果大于向所述受试者施用所述化合物但不施用AZD6244的治疗效果以及向所述受试者施用AZD6244但不施用所述化合物的治疗效果。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述治疗效果包括抑制肿瘤生长、抑制癌细胞转移、刺激癌细胞死亡或前述中的两种或更多种的任意组合。

29.根据权利要求23、24或25中任一项所述的方法，其中所述受试者先前被施用AZD6244。

30.根据权利要求29所述的方法，其中施用所述药物组合物包括抑制肿瘤生长、抑制癌细胞转移、刺激癌细胞死亡或前述中的两种或更多种的任意组合。

31.根据权利要求20所述的方法，其中施用所述化合物包括抑制所述受试者中蛋白质酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的活性。

32.一种药物组合物，包括与式I化合物络合的铜：

其中R是-OH或-O-CH₃。

33.根据权利要求32所述的药物组合物，还包括药学上可接受的赋形剂。