CN111793648B - Etar基因人源化改造的非人动物的构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种ETAR基因人源化改造的非人动物的构建方法、一种人源化ETAR基因人源化改造的细胞、一种人源化ETAR基因、一种ETAR基因的靶向载体和其在生物医药领域的应用，利用同源重组的方式将编码人ETAR蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该非人动物体内能正常表达人源化ETAR蛋白，可以用于人ETAR信号机理研究、心血管疾病、肿瘤或炎症相关疾病药物筛选，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。

Description

ETAR基因人源化改造的非人动物的构建方法及其应用
技术领域
本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种ETAR基因人源化改造的非人动物的构建方法及其在生物医药领域的应用。
背景技术
内皮素（Endothlin）系统是调节血管舒缩的关键系统之一。内皮素有三种异构体：内皮素1（ET1）、内皮素2（ET2）、内皮素3（ET3）。ET1是目前已知的活性最强的内源性血管收缩肽。在血管系统中，ET1与其受体内皮素受体A（ETAR）、内皮素受体B（ETBR）相互作用介导血管的收缩与舒张，维持基础血管张力与心血管系统稳态。ETAR基因参与颅面和心脏外流结构胚胎神经嵴发育、血管收缩、细胞生长及炎症等生理或病理过程。在大多数血管的平滑肌细胞、气道平滑肌、心肌细胞、肝星状细胞、肝细胞、神经元、成骨细胞、黑素细胞、角质形成细胞、脂肪细胞和生殖系统均有表达。
生理条件下，ETAR引起的血管收缩与生长会与内皮细胞ETBR介导的血管扩张维持精细平衡，但在病理情况下，ETAR的过度激活会导致血管收缩与血管平滑肌细胞肥大，引起高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病的发生。此外，有研究发现ETAR在结直肠癌、卵巢癌、前列腺癌等的原发肿瘤和转移灶中均有表达量的增加。
实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。
随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战。
鉴于ETAR在高血压、肺动脉高压等心脑血管疾病和肿瘤等治疗领域的巨大应用价值，为进一步探索其相关生物学特性，提高临床前期药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发ETAR相关信号通路的非人动物模型。
发明内容
本发明的第一方面，提供了一种ETAR基因人源化改造的非人动物的构建方法，所述的非人动物的基因组中包含人ETAR核苷酸序列的2号外显子的部分、3号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，进一步优选的，包含2-3号内含子和/或7-8号内含子，更优选的，包含2-8号外显子之间的任一内含子；其中，所述人ETAR核苷酸序列的2号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸为止，8号外显子的部分至少包含从8号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子为止，优选的，包含人ETAR的CDS序列。
优选的，所述的非人动物的基因组中包括编码SEQ ID NO.2所示氨基酸的核苷酸序列。
进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包括SEQ ID NO.5所示核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物的基因组中还包括非人动物3’UTR序列和Poly A序列。
优选的，所述的构建方法包括插入、翻转、敲除或替换。优选为插入。
优选的，所述的构建方法包括用包含人ETAR核苷酸序列的2号至8号外显子的全部或部分核苷酸序列插入或替换到非人动物ETAR基因座上，进一步优选的，用包含人ETAR核苷酸序列的2号外显子的部分、3号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，更优选的，包含2-3号内含子和/或7-8号内含子，更进一步优选的，包含2-8号外显子之间的任一内含子，插入或替换到非人动物ETAR基因座上；其中，所述人ETAR基因的2号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸为止，8号外显子的部分至少包含从8号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子为止。
优选的，所述的构建方法包括用包含人ETAR的CDS序列插入至非人动物ETAR基因座，进一步优选的，用包含编码SEQ ID NO.2所示氨基酸的核苷酸序列或者包含SEQ IDNO.5或SEQ ID NO.10所示核苷酸序列插入至非人动物ETAR基因座。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人ETAR的CDS序列插入至非人动物ETAR基因的相应区域，进一步优选的，用包含编码SEQ ID NO.2所示氨基酸的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.10所示核苷酸序列插入至非人动物ETAR基因的相应区域。
优选的，所述的构建方法包括用包含人ETAR核苷酸序列的2号至8号外显子全部或部分插入非人动物ETAR核苷酸序列中或替换非人动物ETAR核苷酸序列的2号至8号外显子的全部或部分；其中，所述非人动物ETAR核苷酸序列包含编码非人动物2号外显子的部分、3号至7号外显子的全部、8号外显子的部分核苷酸序列，优选的，包含2-3号内含子和/或7-8号内含子，进一步优选的，包含2-8号外显子之间的任一内含子，其中，所述非人动物ETAR核苷酸序列的2号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸为止，8号外显子的部分至少包含从8号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子为止。
优选的，所述的构建方法包括用包含所述人源化ETAR基因的核苷酸序列插入或替换到非人动物ETAR基因座上。
优选的，所述的构建方法包括用包含编码所述人源化ETAR蛋白的核苷酸序列插入或替换到非人动物ETAR基因座上。
优选的，所述的插入或替换位点为ETAR基因的内源调控元件之后，进一步优选的，插入位点位于起始密码子处，更优选的，插入位点位于起始密码子之前，5’UTR之后。
优选的，所述的插入为首先破坏非人动物内源ETAR基因的编码框，随后进行插入操作，或者所述的插入步骤既可在内源ETAR基因处造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。
优选的，所述的非人动物中人源化ETAR基因是纯合或杂合的。
优选的，所述非人动物的基因组中至少一个染色体上包含人源化ETAR基因。
优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达人或人源化ETAR蛋白。
优选的，使用基因编辑技术进行ETAR基因人源化改造的非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
本发明所述的非人动物为啮齿类动物；优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，使用靶向载体进行ETAR基因人源化改造的非人动物的构建，其中，所述的靶向载体包含人ETAR的2号至8号外显子的全部或部分核苷酸序列；进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，更进一步优选的，包含2-3号内含子和/或7-8号内含子，更进一步优选的，包含2-8号外显子之间的任一内含子，其中，所述人ETAR的核苷酸序列的2号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸为止，8号外显子的部分至少包含从8号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子为止，更进一步优选的，所述靶向载体包含编码SEQ ID NO.2所示氨基酸的核苷酸序列或SEQID NO.5所示核苷酸序列。
优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自非人动物ETAR基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000074.6至少具有90%同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO.3至少具有90%同源性，或者如SEQ ID NO.3所示。
优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，即3’臂，其选自非人动物ETAR基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000074.6至少具有90%同源性的核苷酸；进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO.4至少具有90%同源性，或者如SEQ ID NO.4所示。
优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物ETAR基因座上。进一步优选的，位于非人动物ETAR基因的2号外显子至8号外显子上。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞中，培养该细胞（优选为胚胎干细胞），然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得非人动物模型。
优选的，所述的非人动物体内表达人或人源化ETAR蛋白,同时内源ETAR蛋白的表达降低或缺失。
优选的，所述的人ETAR蛋白包含与SEQ ID NO.2具有至少70%、80%、85%、90%、95%或至少99%同一性的氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列一致的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人ETAR蛋白包含下列组中的一种：
a）SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的部分或全部；
b）与SEQ ID NO.2所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%；
c）与SEQ ID NO.2所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
d）具有SEQ ID NO.2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含人源化ETAR基因，所述的人源化ETAR基因编码人源化ETAR蛋白。
优选的，所述的人源化ETAR基因包含人ETAR的CDS序列，进一步优选的，包含SEQID NO.5所示的核苷酸序列,更优选的，所述的非人动物中包含的ETAR基因转录的mRNA序列包含SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化ETAR基因包含下列组中的一种：
a）人源化ETAR基因的mRNA序列为SEQ ID NO.10所示的序列的部分或全部；
b）人源化ETAR基因的mRNA序列与SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性程度为至少大约为90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%；
c）人源化ETAR基因的mRNA序列与SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
d）人源化ETAR基因的mRNA序列具有SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
本发明的第二方面，提供了一种ETAR基因人源化改造的非人动物，所述的非人动物采用上述构建方法获得。
本发明的第三方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含人ETAR核苷酸序列的部分。
优选的，所述的人ETAR核苷酸序列的部分包含人ETAR的2号至8号外显子的全部或部分核苷酸序列；进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号至7号外显子的全部和8号外显子的部分，更优选的，包含2-3号内含子和/或7-8号内含子，更进一步优选的，包含2-8号外显子之间的任一内含子，其中，所述人ETAR的核苷酸序列的2号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸为止，8号外显子的部分至少包含从8号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子为止。
优选的，所述的靶向载体包含编码SEQ ID NO.2所示氨基酸的核苷酸序列或者SEQID NO.5所示核苷酸序列。
优选的，所述的靶向载体还包含非人动物3’UTR序列和Poly A序列。
优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自非人动物ETAR基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000074.6至少具有90%同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO.3至少具有90%同源性，或者如SEQ ID NO.3所示。
优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，即3’臂，其选自非人动物ETAR基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000074.6至少具有90%同源性的核苷酸；进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO.4至少具有90%同源性，或者如SEQ ID NO.4所示。
优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物ETAR基因座上，进一步优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物ETAR基因2号至8号外显子上。
本发明所述的非人动物为啮齿类动物；优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
优选的，所述的靶向载体还包含标记基因，进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因，更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因（DTA）。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因，进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统，进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)，所述的特异性重组系统为具有两个Frt重组位点，分别连接在抗性基因的两侧。
优选的，所述的靶向载体中还包含辅助序列，进一步优选的，所述的辅助序列包括PolyA序列。
本发明的第四方面，提供了一种包含上述靶向载体的细胞。
本发明的第五方面，提供了上述靶向载体，或者上述的细胞在ETAR基因修饰中的应用，优选的，所述的应用包括但不限于翻转、敲除、插入或替换。
本发明的第六方面，涉及一种ETAR基因人源化改造的细胞，所述的ETAR基因人源化改造细胞的基因组中包括人ETAR基因的2号外显子至8号外显子。
优选的，所述的ETAR基因人源化改造的细胞包含编码SEQ ID NO.2所示氨基酸的核苷酸序列或包含SEQ ID NO.5所示核苷酸序列，其通过内源性ETAR调控元件调控；该ETAR基因人源化改造细胞体内表达人或人源化ETAR蛋白，同时内源ETAR蛋白的表达降低或缺失。
优选的，所述的ETAR基因人源化改造的细胞中还包含非人动物3’UTR序列和PolyA序列。
优选的，所述的人ETAR基因通过内源性ETAR调控元件调控。
本发明的第七方面，涉及一种ETAR基因缺失的细胞，所述的ETAR基因缺失的细胞缺失内源ETAR基因的2号外显子至8号外显子。
本发明的第八方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，包括如下步骤：
（a）应用上述的构建方法制备获得非人动物；
（b）将步骤（a）制备获得的非人动物与除ETAR外的人源化动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因人源化改造动物。
优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括但不限于基因PD-1、PD-L1、IL6、HLA人源化的非人动物。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。
优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中人源化的多个基因中的每一个基因均可以是纯合或杂合的。
优选的，所述的其他基因优选为PD-1、PD-L1、IL6、HLA。
本发明的第九方面，涉及上述的制备多基因人源化改造动物的方法制备获得的多基因修饰非人动物或其后代。
本发明的第十方面，涉及一种疾病动物模型，所述的动物模型的制备方法包括通过上述的人源化ETAR基因改造非人动物或上述的制备多基因人源化改造动物的方法制备动物的步骤，优选的，所述的疾病包括心脑血管疾病、肿瘤或炎症。
优选的，所述的疾病动物模型的制备方法还包括在上述方法制备的人源化基因改造动物或其后代植入肿瘤细胞的步骤。
本发明的第十一方面，提供了一种上述的构建方法获得的非人动物或者上述的构建方法获得的多基因修饰非人动物在制备疾病动物模型中的应用，优选的，所述的疾病包括心血管疾病、肿瘤或炎症。
本发明的第十二方面，涉及一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的构建方法获得的ETAR基因人源化改造的非人动物、上述的ETAR基因人源化改造的非人动物、上述的构建方法制备获得的多基因修饰非人动物、上述的多基因修饰非人动物或其后代或上述的疾病动物模型。
本发明的第十三方面，涉及一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的构建方法获得的ETAR基因人源化改造的非人动物、上述的ETAR基因人源化改造的非人动物、上述的构建方法制备获得的多基因修饰非人动物、上述的多基因修饰非人动物或其后代或上述的疾病动物模型。
优选的，所述的组织或器官或其培养物为脾脏、肿瘤或其培养物。
本发明的第十四方面，提供了一种人源化ETAR蛋白，所述的人源化ETAR蛋白包含人ETAR基因的2号外显子至8号外显子编码的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化ETAR蛋白包含与SEQ ID NO.2具有至少70%、80%、85%、90%、95%或至少99%同一性的氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列一致的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化ETAR蛋白包含人ETAR基因的2号外显子至8号外显子编码的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化ETAR蛋白包含下列组中的一种：
a）SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的部分或全部；
b）与SEQ ID NO.2所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%；
c）与SEQ ID NO.2所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
d）具有SEQ ID NO.2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
本发明的第十五方面，提供了一种编码上述人源化ETAR蛋白的人源化ETAR基因，所述的人源化ETAR基因包含人ETAR基因的2号外显子至8号外显子，和非人动物ETAR基因的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化ETAR基因包含人ETAR的CDS序列，进一步优选的，包含SEQID NO.5所示的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化ETAR基因转录的mRNA序列包含SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化ETAR基因中包含的人ETAR核苷酸序列的部分选自下列组中的一种：
（A）包含SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的全部或部分；
（B）包含与SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的同一性至少为75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%的核苷酸序列；
（C）包含与SEQ ID NO.5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；
（D）具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化ETAR基因的核苷酸序列转录的mRNA选自下列组中的一种：
（a）包含SEQ ID NO.10所示核苷酸序列的全部或部分；
（b）包含与SEQ ID NO.10所示核苷酸序列的同一性至少为75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%的核苷酸序列；
（c）包含与SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或
（d）包含SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化ETAR基因还包含非人动物3’UTR序列和Poly A序列。
本发明的第十六方面，涉及一种表达上述的人源化ETAR蛋白的构建体。
本发明的第十七方面，涉及一种包含上述构建体的细胞。
本发明的第十八方面，涉及一种包含上述细胞的组织。
本发明的第十九方面，涉及了一种上述的构建方法获得的非人动物、上述的构建方法获得的多基因修饰非人动物、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的人源化ETAR蛋白或上述的人源化ETAR基因在制备治疗或预防心血管疾病、肿瘤或炎症的药物中的应用。
本发明的第二十方面，涉及一种上述的构建方法获得的非人动物、上述的构建方法获得的多基因修饰非人动物、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的人源化ETAR蛋白或上述的人源化ETAR基因在ETAR基因或蛋白中相关研究中的应用，所述的应用包括：
A）涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造或筛选人类抗体中的应用；
B）作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用；
C）涉及人类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究、用于开发诊断策略或用于开发治疗策略中的应用；
D）在体内研究人ETAR信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价；或者，
E）研究ETAR基因功能，研究人ETAR抗体，研究针对人ETAR靶位点的药物、药效，研究心血管疾病、肿瘤或炎症相关疾病药物方面的用途。
优选的，所述应用包括在制备药物组合物或者检测试剂盒中的用途。
优选的，所述应用不是疾病的诊断和治疗方法。
本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、脑癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、食道癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性（成淋巴细胞性）白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤为宫颈癌、食道癌、肾癌、脑癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌。
本发明所述的“炎症”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症（浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎）、增生性炎症、特异性炎症（结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等）。
本发明所述的“心血管疾病”包括但不限于高血压、肺动脉高压、冠状动脉症候群、中风、高血压性心脏病、风湿性心脏病、动脉瘤、心肌病变、心房颤动、先天性心脏病、心内膜炎、以及周边动脉阻塞性疾病等。
本发明所述的ETAR基因人源化的非人动物体内可以正常表达人或人源化ETAR蛋白。可用于针对人ETAR靶位点的药物筛选、药效评估、心血管疾病、肿瘤或炎症相关疾病治疗，可以加快新药研发过程、节约时间和成本。对于研究ETAR蛋白功能及相关疾病药物筛选提供了有效的保障。
本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。
本发明所述的“人源化ETAR蛋白”，包含来源于人ETAR蛋白的部分和非人ETAR蛋白的部分。其中，所述的“人ETAR蛋白”同“人ETAR蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人ETAR蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人ETAR蛋白的部分”，为连续或间隔的5-427个（优选为10-427个）氨基酸序列与人ETAR蛋白的氨基酸序列一致或与人ETAR蛋白的氨基酸序列具有70%以上同源性。
本发明所述的“人源化ETAR基因”，包含来源于人ETAR核苷酸序列的部分和非人ETAR基因的部分。其中，所述的“人ETAR核苷酸序列”同“人ETAR核苷酸序列的全部”，即其核苷酸序列与人ETAR核苷酸序列的全长核苷酸序列一致。所述的“人ETAR核苷酸序列的部分”为连续或间隔的20-63858bp（优选为20-1284bp）核苷酸序列与人ETAR核苷酸序列一致或与人ETAR核苷酸序列具有70%以上同源性。
本发明所述的“x号外显子至xx号外显子”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列。例如“2号外显子至8号外显子”包含2号外显子、2-3号内含子、3号外显子、3-4号内含子、4号外显子、4-5号内含子、5号外显子、5-6号内含子、6号外显子、6-7号内含子、7号外显子、7-8内含子和8号外显子的核苷酸序列。
本发明所述的“x-xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如所述的“2-3号内含子”表示2号外显子与3号外显子之间的内含子。
本发明所述的“外显子的部分”表示连续或间隔几个、几十个或几百个核苷酸序列与全部的外显子核苷酸序列一致。例如人ETAR核苷酸序列的2号外显子的部分，包含连续或间隔的5-490bp个，优选10-420bp个核苷酸序列与人ETAR核苷酸序列的2号外显子核苷酸序列一致。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的“人源化ETAR基因”中包含的“2号外显子的部分”至少包括起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸为止。
本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“ETAR基因座”表示ETAR基因上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的ETAR基因座可以是ETAR基因2号外显子至8号外显子上的任选一段的DNA片段。
本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。
本发明所述“治疗（treating）”（或“治疗（treat）”或“治疗（treatment）”）表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗（treating）”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
本发明所述“同源性”，是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员在保证与已知序列相似结构或功能的前提下，可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有（包括但不限于）1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%，11%，12%，13%，14%，15%，16%，17%，18%，19%，20%，21%，22%，23%，24%，25%，26%，27%，28%，29%，30%，31%，32%，33%，34%，35%，36%，37%，38%，39%，40%，41%，42%，43%，44%，45%，46%，47%，48%，49%，50%，51%，52%，53%，54%，55%，56%，57%，58%，59%，60%，70%，80%，81%，82%，83%，84%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，99.9%的同一性。
本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述基因人源化的非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自丽仓鼠科（例如小鼠样仓鼠）、仓鼠科（例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠）、鼠总科（真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科（登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠）、刺睡鼠科（例如多刺睡鼠）和鼹形鼠科（例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠）家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠（鼠总科）、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、 C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠。
除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed. By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II (D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal. U.S. Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames& S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation (B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells (R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY (J.Abelsonand M.Simon，eds.-in-chief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154 and 155 (Wuetal.eds.) and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology (Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V (D.M.Weir andC.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。
下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：小鼠ETAR基因和人ETAR基因座对比示意图（非按比例）；
图2：小鼠ETAR基因人源化改造示意图（非按比例）；
图3：ETAR基因打靶策略及靶向载体设计示意图（非按比例）；
图4：Southern blot检测结果，其中WT为野生型对照；
图5：F1代基因型鉴定结果，其中PC为阳性对照，WT为野生型对照，H2O为水对照；
图6：C57BL/6小鼠和ETAR基因人源化纯合子小鼠体内ETAR RT-PCR检测结果，图6A为采用mETAR-F和mETAR-R引物对的检测结果，图6B为采用mETAR-F和hETAR-R引物对的检测结果，图6C为采用GAPDH-F和GAPDH-R引物对的检测结果,其中+/+为C57BL/6野生型小鼠，H/H为ETAR基因人源化纯合子小鼠，H2O为水对照，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶内参。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
EcoRI、XmnI、SpeI酶购自NEB，货号分别为R0101M、R0194L、R0133M；
C57BL/6小鼠和Flp工具鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；
PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit购自TAKARA，货号6110A；
TRIzol™ Reagent购自Invitrogen，货号15596018；
Zombie NIR™ Fixable Viability Kit购自Biolegend，货号B245952；
RNAprep pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，货号DP430；
PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser购自TAKARA，货号RR047A；
Attune Nxt Acoustic Focusing Cytometer购自Thermo Fisher，型号AttuneNxt；
Heraeus™ Fresco™ 21 Microcentrifuge购自Thermo Fisher，型号Fresco 21。
实施例1 ETAR基因人源化小鼠
小鼠ETAR基因（NCBI Gene ID：13617，Primary source：MGI：105923，UniProt：Q61614，位于8号染色体NC_000074.6的第77663029-77724452位，基于转录本NM_010332.2及其编码蛋白NP_034462.1（SEQ ID NO.1））和人ETAR基因（NCBI Gene ID：1909，Primarysource：HGNC: 3179，UniProt ID：P25101，位于4号染色体NC_000004.12的第147481097-147544954位，基于转录本NM_001957.4及其编码蛋白NP_001948.1（SEQ ID NO.2））对比示意图如图1所示。
为了达到本发明的目的，可在小鼠内源ETAR基因座引入编码人ETAR蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化ETAR蛋白。具体来说，用基因编辑技术，在小鼠ETAR基因调节元件的控制下，插入包含人ETAR基因的2号外显子部分序列至8号外显子部分序列，得到人源化ETAR基因座示意图如图2所示，实现对小鼠ETAR基因的人源化改造。
进一步设计如图3所示的打靶策略，图中显示了靶向载体上含有小鼠ETAR基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人ETAR核苷酸序列的A片段。其中，上游同源臂序列（5’同源臂，SEQ ID NO.3）与NCBI登录号为NC_000074.6的第77724657至77720448位核苷酸序列相同，下游同源臂序列（3’同源臂，SEQ ID NO.4）与NCBI登录号为NC_000074.6的第77720444至77715934位核苷酸序列相同；A片段中包含的人ETAR核苷酸序列、鼠3’UTR序列、Poly A序列按照5’-3’的顺序依次排列，其中人ETAR核苷酸序列（SEQ ID NO.5）与NCBI登录号为NM_001957.4的第351至1634位核苷酸序列相同；人ETAR核苷酸序列与鼠3’UTR的连接设计为5’-CAACACAGACCGGAGCAGCCATAAGGACAGCATGAACTGACTCGAGCCCTCCGCAGAAACACCGAGACGtgtgccttcaagtccta-3’（SEQ ID NO.6），其中序列“ACTGA”中的最后一个“A”是人的最后一个核苷酸，序列“CCCTC”中的第一个 “C”是鼠3’UTR的第一个核苷酸；鼠3’UTR与Poly A的连接设计为5’-tatataaatatataaataaTTGTACATTTCTTTTAGCCAAAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCA-3’（SEQ ID NO.7），其中序列“GCCAA”中的最后一个“A”是鼠3’UTR的最后一个核苷酸，序列“AACTT”中的第一个 “A”是Poly A的第一个核苷酸。
靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒（Neo cassette）。其中Neo盒5’端与Poly A的连接设计为5’-ATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAAAGCTTGATATCGAATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAA-3’（SEQ ID NO.8）内，其中序列“TCTTA”中的“A”是Poly A的最后一个核苷酸，序列“AAGCT”中的第一个 “A”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与小鼠的连接设计为5’-GTATAGGAACTTCATCAGTCAGGTACATAATGGTGGATCCGAAACTGTTCAGTATCTTTTGCCTTGCGGCATACttttggctgaccatgg-3’（SEQ ID NO.9）内，其中序列“TGTTC”中的“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“AGTAT”的第一个“A”是小鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因（白喉毒素A亚基的编码基因（DTA））。改造后的人源化小鼠ETAR的mRNA序列如SEQ ID NO.10所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。
鉴于人ETAR具有多种亚型或转录本，本文所述的方法可应用于其它亚型或转录本。
靶向构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入野生型小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经PCR鉴定为阳性的克隆再进行Southern Blot（分别用EcoRI或XmnI或SpeI消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交，具体探针及目的片段的长度如表1所示）检测，Southern Blot结果如图4所示。检测结果表明，经PCR鉴定为阳性的6个克隆中，经测序进一步验证，编号为2-A01、2-C08、2-G08、4-G07的4个克隆为阳性杂合且无随机插入。
表1：具体探针及目的片段长度
Figure 366055DEST_PATH_IMAGE001
PCR测定包括下述引物：
CL-F1：5’-CAGGACATAGCGTTGGCTAC-3’（SEQ ID NO.11），
CL-R1：5’-ACAAACAGGATAGCAAGCACCGT-3’（SEQ ID NO.12）；
CL-F2：5’-GACCCCTGTCAAGTAGGGTCTCTGT-3’（SEQ ID NO.13），
CL-R2：5’-GCTCTGTGCCACGAAAAGTGGTGAA-3’（SEQ ID NO.14）。
Southern Blot检测包括如下探针引物：
5’探针（5’Probe）：
5’Probe-F：5’-TTGCCTCAGTAGTCAGGAGTTTGCC-3’（SEQ ID NO.15），
5’Probe-R：5’-TCTCAGTCAGCTCTGAAGGGGTACG-3’（SEQ ID NO.16）；
3’探针（3’Probe）：
3’Probe-F：5’-ATGATGTAGACTGAGCTATGGCAGC-3’（SEQ ID NO.17），
3’Probe-R：5’-ATGTGTGGCGAGTAAGCGTAGGTG-3’（SEQ ID NO.18）；
Neo 探针（Neo 5’Probe、Neo 3’Probe）：
Neo Probe-F：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGAT-3’（SEQ ID NO.19），
Neo Probe-R：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3’（SEQ ID NO.20）。
将筛选出的正确阳性克隆细胞（黑色鼠）按照本领域已知的技术（《小鼠胚胎操作实验手册（第三版）》）导入已分离好的囊胚中（白色鼠），得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠（白色鼠）的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠（黑白相间）。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因后，再通过互相交配即可得到人源化ETAR基因纯合子小鼠。可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型（引物如表2所示），示例性的F1代小鼠（已去除Neo标记基因）的鉴定结果见图5，其中，编号为F1-01到F1-07的7只小鼠均为阳性杂合小鼠。
表2：引物名称及具体序列
Figure 407829DEST_PATH_IMAGE003
这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的ETAR人源化基因工程小鼠。
通过常规检测方法可确认小鼠体内人源化ETAR的mRNA或蛋白的表达情况，例如可以使用RT-PCR检测ETAR人源化小鼠体内ETAR mRNA的表达。具体来说，分别选取7周龄野生型C57BL/6小鼠和本方法制备的8周龄ETAR基因人源化纯合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取肺部组织，设计如表3所示引物序列对C57BL/6小鼠和ETAR基因人源化纯合子小鼠肺部细胞的mRNA表达情况进行检测，其中，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参进行检测。结果显示，结合GAPDH作为内参的检测结果（图6C），在C57BL/6小鼠肺部细胞中仅检测到鼠ETARmRNA的表达（图6A）；在ETAR基因人源化纯合子小鼠肺部细胞中只能检测到人ETAR mRNA的表达（图6B），未检测到鼠ETAR mRNA的表达。
表3 RT-PCR检测引物序列及目的片段长度
Figure DEST_PATH_IMAGE005
实施例2 双重人源化或多重双人源化小鼠的制备
利用本方法或制得的ETAR小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有PD-1、PD-L1、IL6、HLA相关基因等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化ETAR小鼠的基础上，利用分离小鼠ES胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得ETAR与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的ETAR小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到人源化ETAR与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子，利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人ETAR和其它基因调节剂的体内药效验证等。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
序列表
<110> 北京百奥赛图基因生物技术有限公司
<120> ETAR基因人源化改造的非人动物的构建方法及其应用
<130> 1
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 427
<212> PRT
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 1
Met Ser Ile Phe Cys Leu Ala Ala Tyr Phe Trp Leu Thr Met Val Gly
1 5 10 15
Gly Val Met Ala Asp Asn Pro Glu Arg Tyr Ser Ala Asn Leu Ser Ser
20 25 30
His Met Glu Asp Phe Thr Pro Phe Pro Gly Thr Glu Ile Asn Phe Leu
35 40 45
Gly Thr Thr His Arg Pro Pro Asn Leu Ala Leu Pro Ser Asn Gly Ser
50 55 60
Met His Gly Tyr Cys Pro Gln Gln Thr Lys Ile Thr Thr Ala Phe Lys
65 70 75 80
Tyr Ile Asn Thr Val Ile Ser Cys Thr Ile Phe Ile Val Gly Met Val
85 90 95
Gly Asn Ala Thr Leu Leu Arg Ile Ile Tyr Gln Asn Lys Cys Met Arg
100 105 110
Asn Gly Pro Asn Ala Leu Ile Ala Ser Leu Ala Leu Gly Asp Leu Ile
115 120 125
Tyr Val Val Ile Asp Leu Pro Ile Asn Val Phe Lys Leu Leu Ala Gly
130 135 140
Arg Trp Pro Phe Asp His Asn Asp Phe Gly Val Phe Leu Cys Lys Leu
145 150 155 160
Phe Pro Phe Leu Gln Lys Ser Ser Val Gly Ile Thr Val Leu Asn Leu
165 170 175
Cys Ala Leu Ser Val Asp Arg Tyr Arg Ala Val Ala Ser Trp Ser Arg
180 185 190
Val Gln Gly Ile Gly Ile Pro Leu Ile Thr Ala Ile Glu Ile Val Ser
195 200 205
Ile Trp Ile Leu Ser Phe Ile Leu Ala Ile Pro Glu Ala Ile Gly Phe
210 215 220
Val Met Val Pro Phe Glu Tyr Lys Gly Glu Leu His Arg Thr Cys Met
225 230 235 240
Leu Asn Ala Thr Ser Lys Phe Met Glu Phe Tyr Gln Asp Val Lys Asp
245 250 255
Trp Trp Leu Phe Gly Phe Tyr Phe Cys Met Pro Leu Val Cys Thr Ala
260 265 270
Ile Phe Tyr Thr Leu Met Thr Cys Glu Met Leu Asn Arg Arg Asn Gly
275 280 285
Ser Leu Arg Ile Ala Leu Ser Glu His Leu Lys Gln Arg Arg Glu Val
290 295 300
Ala Lys Thr Val Phe Cys Leu Val Val Ile Phe Ala Leu Cys Trp Phe
305 310 315 320
Pro Leu His Leu Ser Arg Ile Leu Lys Lys Thr Val Tyr Asp Glu Met
325 330 335
Asp Lys Asn Arg Cys Glu Leu Leu Ser Phe Leu Leu Leu Met Asp Tyr
340 345 350
Ile Gly Ile Asn Leu Ala Thr Met Asn Ser Cys Ile Asn Pro Ile Ala
355 360 365
Leu Tyr Phe Val Ser Lys Lys Phe Lys Asn Cys Phe Gln Ser Cys Leu
370 375 380
Cys Cys Cys Cys His Gln Ser Lys Ser Leu Met Thr Ser Val Pro Met
385 390 395 400
Asn Gly Thr Ser Ile Gln Trp Lys Asn Gln Glu Gln Asn Asn His Asn
405 410 415
Thr Glu Arg Ser Ser His Lys Asp Ser Met Asn
420 425
<210> 2
<211> 427
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 2
Met Glu Thr Leu Cys Leu Arg Ala Ser Phe Trp Leu Ala Leu Val Gly
1 5 10 15
Cys Val Ile Ser Asp Asn Pro Glu Arg Tyr Ser Thr Asn Leu Ser Asn
20 25 30
His Val Asp Asp Phe Thr Thr Phe Arg Gly Thr Glu Leu Ser Phe Leu
35 40 45
Val Thr Thr His Gln Pro Thr Asn Leu Val Leu Pro Ser Asn Gly Ser
50 55 60
Met His Asn Tyr Cys Pro Gln Gln Thr Lys Ile Thr Ser Ala Phe Lys
65 70 75 80
Tyr Ile Asn Thr Val Ile Ser Cys Thr Ile Phe Ile Val Gly Met Val
85 90 95
Gly Asn Ala Thr Leu Leu Arg Ile Ile Tyr Gln Asn Lys Cys Met Arg
100 105 110
Asn Gly Pro Asn Ala Leu Ile Ala Ser Leu Ala Leu Gly Asp Leu Ile
115 120 125
Tyr Val Val Ile Asp Leu Pro Ile Asn Val Phe Lys Leu Leu Ala Gly
130 135 140
Arg Trp Pro Phe Asp His Asn Asp Phe Gly Val Phe Leu Cys Lys Leu
145 150 155 160
Phe Pro Phe Leu Gln Lys Ser Ser Val Gly Ile Thr Val Leu Asn Leu
165 170 175
Cys Ala Leu Ser Val Asp Arg Tyr Arg Ala Val Ala Ser Trp Ser Arg
180 185 190
Val Gln Gly Ile Gly Ile Pro Leu Val Thr Ala Ile Glu Ile Val Ser
195 200 205
Ile Trp Ile Leu Ser Phe Ile Leu Ala Ile Pro Glu Ala Ile Gly Phe
210 215 220
Val Met Val Pro Phe Glu Tyr Arg Gly Glu Gln His Lys Thr Cys Met
225 230 235 240
Leu Asn Ala Thr Ser Lys Phe Met Glu Phe Tyr Gln Asp Val Lys Asp
245 250 255
Trp Trp Leu Phe Gly Phe Tyr Phe Cys Met Pro Leu Val Cys Thr Ala
260 265 270
Ile Phe Tyr Thr Leu Met Thr Cys Glu Met Leu Asn Arg Arg Asn Gly
275 280 285
Ser Leu Arg Ile Ala Leu Ser Glu His Leu Lys Gln Arg Arg Glu Val
290 295 300
Ala Lys Thr Val Phe Cys Leu Val Val Ile Phe Ala Leu Cys Trp Phe
305 310 315 320
Pro Leu His Leu Ser Arg Ile Leu Lys Lys Thr Val Tyr Asn Glu Met
325 330 335
Asp Lys Asn Arg Cys Glu Leu Leu Ser Phe Leu Leu Leu Met Asp Tyr
340 345 350
Ile Gly Ile Asn Leu Ala Thr Met Asn Ser Cys Ile Asn Pro Ile Ala
355 360 365
Leu Tyr Phe Val Ser Lys Lys Phe Lys Asn Cys Phe Gln Ser Cys Leu
370 375 380
Cys Cys Cys Cys Tyr Gln Ser Lys Ser Leu Met Thr Ser Val Pro Met
385 390 395 400
Asn Gly Thr Ser Ile Gln Trp Lys Asn His Asp Gln Asn Asn His Asn
405 410 415
Thr Asp Arg Ser Ser His Lys Asp Ser Met Asn
420 425
<210> 3
<211> 4210
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgagtttctt cctaaaacag ggcacaacct tgagtctggt ctgttgctct ctactttcaa 60
tcctacccat cctagactaa ccaacttctc aggaaggaaa tagttaaaga tccctgccct 120
tcagggcctg gcgggggcag cagctttgca gcttggtggc tgctccctgg agggcaggcg 180
ggatagcgct cttgcagtta ggtcccagag tagagaggaa ggtctaggag cctgtggagt 240
ctaaggaaga tcgcgggagg cgtgttcctc cggagtttgc ttttccttgg gagcctcgcg 300
cgcacaccca tcccttctag tctggcaact gtgtctagga ggtggggagc ctctctctga 360
tccaccggac catcgctgga gcttgcaggc tgagcaagat ctccccctag agaagcctgg 420
ctgtccgggg aagtttcccc gagctgagac tgtgctgcag ccctggtcac ccgccaccct 480
gcgcgccacc ctcgttctcc agctcaggct ccggctggcc cgtgcgcgga cctggagctg 540
tctgcttccg aggagctcta aggtcggtgc aagtctttct ttttggaacc agggctggaa 600
ctagggatag ggtcgctgcc ggggcaatct gctgggagga gcaggggtgt ctcgcagctc 660
cagggaaacg caacagaccg gcctggcact tacctcccgg gacgcccagt gtggggcgct 720
ttcctgggag acgaacactg gggggagtgg gggtggacac cggacaagac cattgagctt 780
tgtctcggat ttttaggaaa ggggagccgg gagtgggagg atctttttct ccacacaagc 840
tttcaggcgc atcaaggccc agggcgcttg ctccaaagcc tcctggtgaa gttggtctct 900
tcctatcctg caccctgagt gccaaggaca cttactgtga agaaccaacc tctgtggagc 960
cctcctcaca ccacgatggc agctggggtt ggaaatctgc ctgctggtgg aggtctgggc 1020
gatttgctca gtgctgtcct gtcctttaaa gggcacttct tgtctttcat gtgcagaacc 1080
ctggaactgt ttgtagataa gccacctctg attacaccac ccttagtggc ctcaccccag 1140
cagacctggg gcgaaagcat atgaaagtca gaggatgtgt ccaaggagag tggataattt 1200
gtcttctcca gagaacaaaa ccacagagaa cttgaaaaaa aaaaagttct tggtttaatt 1260
ttttttttct tcttgtagtt gtttctgatt cccacacagc catcaactca tctgttttta 1320
aagattggct atgaaacacc ttggcaacca taccatgtaa attacctgcc ctaagtatgt 1380
gtgcggtttg ggcgccgttg gattttccaa attactaatg gcaagtggac atttgctctg 1440
agaatctgat gtattaacta gggaaagcac taaggggtca gcttttgtat gccaccaaac 1500
tctagaccca caaaaggaaa gatgctgact ccatagacat gtccttctgg tctgaatgtg 1560
agttgcttct ctagagctct ggctctagag ccagatgccc ggcaaagctt gactgaaata 1620
taccaaaatg agctacagat ccgtccttgg gaaagcatgg attcgaaaga ggtttctttt 1680
atttggtttt gtgtttttca ctctgtaaca atatggcatc cacatgtttt tgacagatgt 1740
cccttagatg tggtgagctg acaagaggtg tcaagagaaa tgagttcttg gtagtgtctt 1800
tgctggaggg aagcaaggaa ggaaggaaag gaaggaagga agaaagggag ggagggaggg 1860
aaggagggag gaaggaagga gggagggagg gagggaggga gggagggagg gagggaggga 1920
gggagggagg gagggaggga gggagggagg aaggaaggaa ggaaagaggt tttactggca 1980
gctggctcac accctgatag gaagccatga ctgtagcttt ctcagtacct gtggcaatga 2040
ggaccactga gctctacgtg agctgtgcag tgcctgtgac acccaaatgg ctcatgaact 2100
cccctcctgg atgattctaa tagaccatga agccattttg tttatgggaa agacctctgt 2160
ctctcatttt taagataact attactaaat attccattcc cattgggaaa ccaggaacca 2220
taaatcataa agcaatcaag gaattgaaag acttgtgcct cccctcacta tcctgagagg 2280
gaggcagatc gtaaaaagct ttgtacttgg cattctggtc tacatgtggg aaatggaaag 2340
atgatatttg tagacctact aataattcag ccagttattc cggactatta gagacgggag 2400
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cccatcactt tgaaatcaca gcagcgggtg aacacctata gcccagccgt gagacaggat 2520
gacatccagc agccttttgg ctgtgaaaac acagtcactt cactcattca agactcctga 2580
tgtgttacag atgttgttct gtctgtataa attgtgatgc ccaagtcaag aaccagttgg 2640
tgcctgtgag atgcgatgta tattgctgtt tggcaaggca aaagcatgtg ggactgacag 2700
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aagcctaaac ttaataatgt cccatgacaa ctgtcaaaaa tccctaaatg tggtcaccct 2820
tgagcagact caaaaagatt gagtcttaaa atttaggatt aggtgtatac gccatagata 2880
cacagaccac tgcccataaa tgaagttact gtcctcattt acagattaat gaaagaaaag 2940
tacaaaatac ccaaagggga ggagcaattg acttttggtt gctattttct cagcaccagc 3000
cttccttttg ttttctaagt gtcttaaagt ataagaggag aaatctagat ttactgagca 3060
ccagggacca cccgcccttt gaaggcgata taacataaga actctttgat aatacctgaa 3120
cactccttcc aatgttctgc tgcgtcatcc aaattctgga gacatcttaa gtatgttgtt 3180
gatgcaaata aagcatggaa ataagagaga caggatgacc tggtggttaa agctcgggtg 3240
tggagtcaga tcaggctgcc tcagggttgt aggctcgtca ccacctttga ccttcctctc 3300
agcttccctg tcttcctgga gaacctgtgg atgacttgat tgttatcatt atactagaca 3360
gcagcagcat gtgatgtgtt cggcacagtg cctgtcctgt cctagctaga taggatgctt 3420
gcacgatact aagaaaccag atagcccatg gcaaaccaaa cggtgtggcg gcctgggata 3480
acctgtcact cacagaacac cattgacaag tatcatggtg gtttctgatg ggtagaagtg 3540
tggagactta aaaatatgtg ggttttgcag ggtttcaagc atttcaaact aaacctcttg 3600
tctccatcag tgatcttttc tttctctctg tggtgctgga gatggaacca gtgtgagtgc 3660
acaaagcaga gaaaagcaga catttggctt taaatgaaca ctttaacgca ttagacagcg 3720
ttgctgcccg ttcctgccat gtgcaacccc tcactcactc gggcatgctc aagtttttag 3780
tcagagaatt agattcttgt attttgtgcc tcagtctgaa gcaatgtttc ctcttttacc 3840
acagaatttt ctgtgtcatg tctggaagat ttgggctatc attaacctga ataaagagga 3900
aaaaacactg ctatttttaa ggaacactga aatatcttta tccatatcat ggtctataca 3960
gatatagctg tggatacagc cagggctggg gagatttctt gctataatag agttttggtc 4020
tttcctattt tgatctgatt gacctatatt ttcattaaat caataaacat tcattaacca 4080
ccatcttttg gggacagcta gattttgtag caaaataata ataataataa tttttcctac 4140
ttttttttct tccaggtgaa aaaaagaaag gcgtgagacc aacataagaa gacttaaaat 4200
ccaggttaag 4210
<210> 4
<211> 4511
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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aatccggaga gatacagcgc taatctaagc agccacatgg aagacttcac cccttttccg 120
gggacggaga tcaactttct gggcaccacc catcgacccc ctaatttggc cctgcctagc 180
aatggctcaa tgcacggcta ttgcccacag cagactaaaa tcacgacagc tttcaaatat 240
attaacactg tgatatcctg caccattttc atcgtgggaa tggtggggaa cgcaactcta 300
ctacgaatca tttaccaaaa caagtgtatg aggaacggcc ccaatgcgct catagccagc 360
ctggcccttg gagaccttat ctacgtggtc attgacctcc ccatcaacgt gtttaaggta 420
ggaaagtcct gagggctctg ctgacgcttg ctctgatgtg ctctgcctag gaggtttact 480
tctgctttca gctcactgac gtgttgtgtt ttgttttgtt ttgttttgtt ttgttttgtt 540
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agtattagca ggatgaccct taagatgctc ctatttccca aagtaggttc ccaggacagc 660
actcggcttc ctgcctccat ggggagtctt ggggcaatcg atgactgaag attgtttgag 720
atacagtttt tagggtgagc catgccaagc tcccaaagaa tgtaaggtaa atccacatgc 780
aatatcagtt atctttccat gagatgctgt tcaaagtaga tagccacagc agaactcaca 840
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cctcagtatc agtgacttgg agataatgaa atccatcgat agcaggccag gaccgaaata 960
ctgactaaaa ccattccaaa tagacctgat aaccccttct ctctttgagc tgtaatatgt 1020
gcccagccct gaactaggcc ataggaccct aaagacaaag aagaaaagtc ggtgttttca 1080
tgggaaaaga caagtgtcga aacgcggccg gaattgcctt gcctcagaga ctctttaacc 1140
aaaataaact aaatctagtg gaaacaaaat attccatatt tgctgtagtc attgtgaagg 1200
gaaagattcc tgagagaaat ttaagtacag taagagtcga acaaaattgg cttatgtgtg 1260
ccacatttta agaaatgtct tcaccctaaa ccggaaattg cttttctcag gctttcctct 1320
ccccacctcc ttctcctctc ccctccccct gtccctcctc ttttttctcc ctctctctct 1380
ctccctcctc ctccctcttc tcctctcccc ctctctctcc tctccctttc ccctctccct 1440
catttttctc ctctttctct ctttcctttt cttcccccac ctcctctagt ctgaactcag 1500
gctcctctcc ttcctcctcc ccatcttctt ctttctctcc tcctcttctt tctcttcctc 1560
tctctttctt ttcctcctcc cttgccacag gaacaaatta ttctaggtca gtggttctca 1620
atctatgggc cttagtgtct cataacatat atcctgaata tcagatattt acattacaat 1680
tcattgcagt agcaaaacta cacctatgaa gtaaccacaa aataatttta tggttgggga 1740
tcaccacaac gtgggaatct gtattaaagg gtcgcagtat taggaaggct gagaacctct 1800
gttgtaagta acacaattct gaaatattac tttaaactac tttcgccagt ttaattatga 1860
gatgcagagc agcctggcat agcctcccct gtttcagtca tggtgaaatc acatgaagtt 1920
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ttgagactga gtctctgtgt aactctggtt ctccaggagc tccctgtgta gaccaggctg 2040
gccttgaacc cacagaaatc ctcctgtctc tgcctcttga gtgttgggat taaaggcatg 2100
caccactaca catggctgat aattttttga atgttaaaaa tctttcaaaa tcataccatg 2160
tactttttgg aaagctagag aaagatgagg aataatcaaa agatgagata gtatgtcttt 2220
ctttggaata agtatgaatg cacaggattt cagtttgaac ataaaaacag aattttggaa 2280
ccaaactgtg aagcagaatt gaaaatgcat aattaattta aactgtttag catactctat 2340
aaaattcacc ccttttctct taaaaagtcc ttaatttttc gtttatgagt tgtcatgagt 2400
gcttaacact tcattttctc atggtttcct tctttaatga gagagcttaa aagattttta 2460
tggcttttgg tcaaacaaaa tttgactctt tagtttcaat tgactattat tattaattct 2520
tgattatcca tgcttaggca ctggttaact agctcatctt aattcaaaag aataactgac 2580
catctctgaa caaactttct gcttctgttc caactgaagc atgctatgta cactcagccc 2640
tgtgcaaagc agtttcttgt caaaccaata gtgcagctga gtgagggggt tgagggtggg 2700
ggatggggtg gggagttggg ggcagggtgg gggctggctg tctttgcgta agtcctgcca 2760
atcaccactc taggtttcat ttctactcca tggttgagtc acgttagctg agagacttct 2820
gagtactgta gaaatccaaa tataatttat atttcattca catagcacta ggtagacatt 2880
catacatggt gatccaactc tgtagttctt cactttcgag actctcatgt ttgacaagct 2940
tgttatagtt tgaagtaatg tggacatttg atcatggtac tttcatatca cgtgactatg 3000
gttgttcaat tcctgttttt taaatgtcat gagccactgg actaatatga gttttagaaa 3060
ttaaaccttt taaactattt aaatttaagt acgtgtctca gtcctcttca aaggagagca 3120
agcagcactg ttctgagctc agaggccaca gcagagaaga gtgatatccc tgtttgcctg 3180
ccacactctc tttaggtcag aatccatgac ctctggctgt tcctctgaaa tcctacccag 3240
gctagtcagg agaaacactg ccagacagtg tgaggctggg cccctgctgc tcttccccaa 3300
gctacctcct gccagaagat cccaaggcat tcagattttc tcccatatcg aacctggatg 3360
cctctagcca cagccagttc actaggtcag tactgtgtgt ttctcttcat cgctgcattt 3420
acgtagccaa gaaaatggca tacaggtttc actgaggttg gatcccagcg ctcttcctca 3480
tcctcactac tggaagaatg aggttgagag aagaatcctg acagatctgc caggctcttt 3540
aaatagatga gtttttcagg gctggggata tggctctgta gatgaagtgc caggacctgt 3600
gttcaaatcc ccagcccctg agcaaaaagc caggcctggc agcatatgtc tgctctgtga 3660
agtgagatgg gtggaccctg ggcactcgat agtcagtcag gcgacacccc ccccccacac 3720
acacacacac aaaacataaa gttcagtgaa agatcctgtg tccaaaaaga gttagagatt 3780
caattgagga agacaaccta atatcaacct ttgatcttcc cttgtacctg ttatgggcaa 3840
gcttacctac acacacactt acatacgtgt atttattaca cacacacaca tatacacaca 3900
cttacacaca cagtcacaca cacatattct gtttagcagt catagcagat atatattttt 3960
aatccaccac ccatgtttca ttaaacaaac aaattttaag ttgtaggatt ctttaaatgt 4020
tttctgttac ttaaaagtta gtcaaatgct cttataactt cagtttcact acatatgttt 4080
aaggtaggga ccacacatgt atggggtaat cagtgtatgt cttcatccag gaaacacatg 4140
cttcaaaccc ttgtacccca aagtccgctg cacctggcct aacgtccagt caagggccag 4200
ctgcctcaga cactccacac atatgtgtgg gactcagtaa ccgtcctcca gggaaggaaa 4260
cactgtgtaa atattccttt gatccataca ttttatgttt tgttcttagg actttcaatc 4320
cagcatcctc tgcaccagaa agtttcttct gcagaaagct ggcattgctt agatcacaac 4380
ctgccttgag gcaccaaccc ttaattggag gctactgctt gaattaagac tgtgtacttc 4440
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<210> 5
<211> 1284
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggaaaccc tttgcctcag ggcatccttt tggctggcac tggttggatg tgtaatcagt 60
gataatcctg agagatacag cacaaatcta agcaatcatg tggatgattt caccactttt 120
cgtggcacag agctcagctt cctggttacc actcatcaac ccactaattt ggtcctaccc 180
agcaatggct caatgcacaa ctattgccca cagcagacta aaattacttc agctttcaaa 240
tacattaaca ctgtgatatc ttgtactatt ttcatcgtgg gaatggtggg gaatgcaact 300
ctgctcagga tcatttacca gaacaaatgt atgaggaatg gccccaacgc gctgatagcc 360
agtcttgccc ttggagacct tatctatgtg gtcattgatc tccctatcaa tgtatttaag 420
ctgctggctg ggcgctggcc ttttgatcac aatgactttg gcgtatttct ttgcaagctg 480
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gttgacaggt acagagcagt tgcctcctgg agtcgtgttc agggaattgg gattcctttg 600
gtaactgcca ttgaaattgt ctccatctgg atcctgtcct ttatcctggc cattcctgaa 660
gcgattggct tcgtcatggt accctttgaa tataggggtg aacagcataa aacctgtatg 720
ctcaatgcca catcaaaatt catggagttc taccaagatg taaaggactg gtggctcttc 780
gggttctatt tctgtatgcc cttggtgtgc actgcgatct tctacaccct catgacttgt 840
gagatgttga acagaaggaa tggcagcttg agaattgccc tcagtgaaca tcttaagcag 900
cgtcgagaag tggcaaaaac agttttctgc ttggttgtaa tttttgctct ttgctggttc 960
cctcttcatt taagccgtat attgaagaaa actgtgtata acgagatgga caagaaccga 1020
tgtgaattac ttagtttctt actgctcatg gattacatcg gtattaactt ggcaaccatg 1080
aattcatgta taaaccccat agctctgtat tttgtgagca agaaatttaa aaattgtttc 1140
cagtcatgcc tctgctgctg ctgttaccag tccaaaagtc tgatgacctc ggtccccatg 1200
aacggaacaa gcatccagtg gaagaaccac gatcaaaaca accacaacac agaccggagc 1260
agccataagg acagcatgaa ctga 1284
<210> 6
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caacacagac cggagcagcc ataaggacag catgaactga ctcgagccct ccgcagaaac 60
accgagacgt gtgccttcaa gtccta 86
<210> 7
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tatataaata tataaataat tgtacatttc ttttagccaa aacttgttta ttgcagctta 60
taatggttac aaataaagca 80
<210> 8
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta aagcttgata tcgaattccg 60
aagttcctat tctctagaaa 80
<210> 9
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtataggaac ttcatcagtc aggtacataa tggtggatcc gaaactgttc agtatctttt 60
gccttgcggc atacttttgg ctgaccatgg 90
<210> 10
<211> 2769
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acacagaaga cttcttgact tcaggagaca ctgctgtatg aaacagtgct tgctatcagt 60
ggctgctgga agaggctgtg gtggaaagaa aacctcaact gcaggccaga gttggttccc 120
caaaagaggc aaactcccag tgctagccag aggctaggaa gctctaagca acccacttat 180
ctgcaaggag agttacgccc aaagagcatc aagtccaacc tcctgaactg tttccagaga 240
tggaaaccct ttgcctcagg gcatcctttt ggctggcact ggttggatgt gtaatcagtg 300
ataatcctga gagatacagc acaaatctaa gcaatcatgt ggatgatttc accacttttc 360
gtggcacaga gctcagcttc ctggttacca ctcatcaacc cactaatttg gtcctaccca 420
gcaatggctc aatgcacaac tattgcccac agcagactaa aattacttca gctttcaaat 480
acattaacac tgtgatatct tgtactattt tcatcgtggg aatggtgggg aatgcaactc 540
tgctcaggat catttaccag aacaaatgta tgaggaatgg ccccaacgcg ctgatagcca 600
gtcttgccct tggagacctt atctatgtgg tcattgatct ccctatcaat gtatttaagc 660
tgctggctgg gcgctggcct tttgatcaca atgactttgg cgtatttctt tgcaagctgt 720
tccccttttt gcagaagtcc tcggtgggga tcaccgtcct caacctctgc gctcttagtg 780
ttgacaggta cagagcagtt gcctcctgga gtcgtgttca gggaattggg attcctttgg 840
taactgccat tgaaattgtc tccatctgga tcctgtcctt tatcctggcc attcctgaag 900
cgattggctt cgtcatggta ccctttgaat ataggggtga acagcataaa acctgtatgc 960
tcaatgccac atcaaaattc atggagttct accaagatgt aaaggactgg tggctcttcg 1020
ggttctattt ctgtatgccc ttggtgtgca ctgcgatctt ctacaccctc atgacttgtg 1080
agatgttgaa cagaaggaat ggcagcttga gaattgccct cagtgaacat cttaagcagc 1140
gtcgagaagt ggcaaaaaca gttttctgct tggttgtaat ttttgctctt tgctggttcc 1200
ctcttcattt aagccgtata ttgaagaaaa ctgtgtataa cgagatggac aagaaccgat 1260
gtgaattact tagtttctta ctgctcatgg attacatcgg tattaacttg gcaaccatga 1320
attcatgtat aaaccccata gctctgtatt ttgtgagcaa gaaatttaaa aattgtttcc 1380
agtcatgcct ctgctgctgc tgttaccagt ccaaaagtct gatgacctcg gtccccatga 1440
acggaacaag catccagtgg aagaaccacg atcaaaacaa ccacaacaca gaccggagca 1500
gccataagga cagcatgaac tgagctgctc ttttggcctg aacacattag tgatgacttc 1560
tatggcatgg aattttaccc atgatttcct taccactagg atctacattg ataaaaaaaa 1620
ttgattaaat ttatttcatc tcatatatag aagtacttta ttacctggaa acattcttaa 1680
tagagattca ttagaaaacc caaatctaat gttcatgtgt tcaaggaacc ttcttccatt 1740
atgtaacaga acagtctaga gaagattaag gaccacatgg ctttcttgct ctacttgaaa 1800
ttaattgtga gcataagctt gtttctggag tcttcttaca ttgttggttc tacttacata 1860
ctactggtcc aactctcatg ctgtttctct cagatgttcc catgatggtt gccaaggaca 1920
cttgatagaa agactactgg ttaaacacaa taaacaaagt tcattattca cttattagca 1980
agaaggtagc attatcataa aggattagat gacttaagtt agctataggt tcaagacctg 2040
gactaaagta ttacttggaa attctgagta ttgctaaaaa ggaggatgaa agggacctag 2100
aagttgagtt attactaaaa actttgagtg cgaagatatt actcattaac cagataacaa 2160
gtgaatatgc tgtagcatca acataattca aaagagtaaa gaaatggcta ggaatgaggt 2220
agttgtgtaa ttatttcttc tcttactagt ttcaaataaa ttcatctcta attctataga 2280
gaattcttgc ctcccattca ggactggcct tctatacagt gagatggtcc agtaagaaat 2340
aatttttatt agtgtttttt ctattttgag aattatttta atatatattt taatatataa 2400
acttgtgagt taaatttttt ttttgcaaaa ttagcacatg aaaagagatt gatggtttta 2460
agtagtagaa cacagtagtg taggaatctg agagcagaga gtttgggagg gggtgaagag 2520
aaaacaacat caccaaatag tgatatataa gagaaaatct gtgcttcaga gtttgatcag 2580
ggccatctct cccaactctg ctggaactga gagaatgcac ctgatgttgt ctccatttta 2640
gatagagaaa aaaaaaaccc gaatatttat aaaactaaat aaaactatag ttacctcaaa 2700
actatgggga tcactataac atagaataga atagaataga atagaataga atagaataga 2760
atagaatag 2769
<210> 11
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caggacatag cgttggctac 20
<210> 12
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acaaacagga tagcaagcac cgt 23
<210> 13
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gacccctgtc aagtagggtc tctgt 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gctctgtgcc acgaaaagtg gtgaa 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttgcctcagt agtcaggagt ttgcc 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tctcagtcag ctctgaaggg gtacg 25
<210> 17
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atgatgtaga ctgagctatg gcagc 25
<210> 18
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atgtgtggcg agtaagcgta ggtg 24
<210> 19
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggatcggcca ttgaacaaga t 21
<210> 20
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cagaagaact cgtcaagaag gc 22
<210> 21
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cagggctggg gagatttctt gctat 25
<210> 22
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ttagtctgct gtgggcaata gccgt 25
<210> 23
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gctctgtgcc acgaaaagtg gtgaa 25
<210> 24
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
caaagggccc tggtaactct actgg 25
<210> 25
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ccggaaaagg ggtgaagtct tccat 25
<210> 26
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gacaagcgtt agtaggcaca tatac 25
<210> 27
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gctccaattt cccacaacat tagt 24
<210> 28
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
agcaagatct ccccctagag aagcc 25
<210> 29
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gtctgtgttg tggttgtttt gatcg 25
<210> 30
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
agtgccactt ctaggtcagc ag 22
<210> 31
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tcaccatctt ccaggagcga ga 22
<210> 32
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gaaggccatg ccagtgagct t 21

Claims (2)

1.一种ETAR基因人源化改造的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的基因组中包含编码SEQ ID NO.2所示氨基酸的核苷酸序列，或者所述的非人动物的基因组中包含SEQ ID NO.5所示核苷酸序列，所述的非人动物的基因组中还包括非人动物3’UTR序列和Poly A序列，所述的非人动物的基因组中还包括人源化ETAR基因，所述的构建方法包括用编码SEQ ID NO.2所示氨基酸的核苷酸序列或者SEQ ID NO.5所示核苷酸序列插入至非人动物ETAR基因座上，所述的非人动物体内表达人ETAR蛋白，所述的人ETAR蛋白如SEQID NO.2所示的氨基酸序列，所述的非人动物为大鼠或小鼠，所述的构建方法包括使用靶向载体进行非人动物的构建，其中，所述的靶向载体包含编码SEQ ID NO.2所示氨基酸的核苷酸序列或包含SEQ ID NO.5所示核苷酸序列，所述的靶向载体还包含5’臂、3’臂，所述的5’臂如SEQ ID NO.3所示，所述的3’臂如SEQ ID NO.4所示，所述的靶向载体还包含人ETAR核苷酸序列、鼠3’UTR序列、Poly A序列按照5’-3’的顺序依次排列，所述的人ETAR核苷酸序列与鼠3’UTR的连接设计为5’-CAACACAGACCGGAGCAGCCATAAGGACAGCATGAACTGACTCGAGCCCTCCGCAGAAACACCGAGACGtgtgccttcaagtccta-3’（SEQ ID NO.6），其中序列“ACTGA”中的最后一个“A”是人的最后一个核苷酸，序列“CCCTC”中的第一个 “C”是鼠3’UTR的第一个核苷酸；鼠3’UTR与Poly A的连接设计为5’-tatataaatatataaataaTTGTACATTTCTTTTAGCCAAAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCA-3’（SEQ ID NO.7），其中序列“GCCAA”中的最后一个“A”是鼠3’UTR的最后一个核苷酸，序列“AACTT”中的第一个 “A”是Poly A的第一个核苷酸，所述的靶向载体还包含Neo盒，所述的Neo盒5’端与Poly A的连接设计为5’-ATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAAAGCTTGATATCGAATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAA-3’（SEQID NO.8）内，其中序列“TCTTA”中的“A”是Poly A的最后一个核苷酸，序列“AAGCT”中的第一个 “A”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与小鼠的连接设计为5’-GTATAGGAACTTCATCAGTCAGGTACATAATGGTGGATCCGAAACTGTTCAGTATCTTTTGCCTTGCGGCATACttttggctgaccatgg-3’（SEQ ID NO.9）内，其中序列“TGTTC”中的“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“AGTAT”的第一个“A”是小鼠的第一个核苷酸。
2.权利要求1构建方法构建的非人动物在ETAR基因或蛋白相关研究中的应用，所述应用不是疾病的诊断和治疗方法，所述的应用包括：
A）涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造或筛选人类抗体中的应用；
B）作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用；
C）涉及人类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究的应用；
D）在体内研究人ETAR信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价；或者，
E）研究ETAR基因功能，研究人ETAR抗体，研究针对人ETAR靶位点的药物、药效，研究心血管疾病、肿瘤或炎症相关疾病药物方面的用途。
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