CN111793564A - 一种盐胁迫下强化污泥脱水液中小球藻油脂积累的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种盐胁迫下强化污泥脱水液中小球藻油脂积累的方法，属于微藻培养技术领域。本发明以污泥脱水液作为培养液，减轻污泥脱水液回流对污水处理的负荷；利用生物柴油副产物‑粗甘油作为外加碳源，在补充了COD的同时，有效解决因粗甘油废液不能及时有效地利用和处理而成为新的污染源这一问题。本发明以外加粗甘油的污泥脱水液为培养液，通过外加NaCl的盐胁迫处理，可在利用废水中营养物质的同时，在短时间内实现油脂产量的大幅度提升，在优选的方案中，油脂产率可达到17.33mg·L‑1·h‑1。

Description

一种盐胁迫下强化污泥脱水液中小球藻油脂积累的方法
技术领域
本发明涉及一种盐胁迫下强化污泥脱水液中小球藻油脂积累的方法，属于微藻培养技术领域。
背景技术
生物柴油，当今世界公认为理想的可再生能源，也是目前最常用的生物燃料之一。目前，生物柴油主要以植物和动物脂肪酸为原料进行生产。微藻，作为生产生物柴油的良好原料之一，能利用阳光、水、CO2合成自身生长所需物质。微藻种类繁多，并且其中相当部分含油量极高，在适宜的培养条件下，这些微藻可获得干藻质量的50％～70％的含油率。同时，高光合作用效率、可适应恶劣生长环境、短生长周期、高生物产量等特点，更使微藻成为生产生物柴油的优势原料。
目前，限制微藻生物能源产业化的因素亟待解决。首先微藻培养需要消耗大量水资源和无机营养盐，这是影响其产业化效益的瓶颈之一。据此已有大量的研究在寻求适宜微藻培养的不同废水。尤其在市政废水和畜禽养殖废水中的藻类培养更为广泛，因为这些废水量大、可用性强。但养殖废水氨浓度高，需要稀释后用于微藻培养。市政污水处理厂不同工段会产生不同的废水流，Wang等研究了初沉池进水、初沉池出水、好氧出水和污泥脱水液培养小球藻的可行性。此外，微源生物柴油规模化还取决于藻细胞的产油效率。国内外学者围绕微藻细胞高密度培养和油脂积累特性方面进行了大量研究，表明营养条件和培养模式对微藻生物量和油脂含量有显著影响。尤其在不利的营养条件(如贫营养、高光、高盐、低温)胁迫下，藻细胞中的生物碳流会倾向高能产物储存的方向流动，从而提高油脂含量，有些藻种油脂含量甚至高达80％以上。但是，不利营养条件下，往往会造成微藻生物量的锐减，所以在提高油脂含量的同时，保持生物量的稳定，是目前主要的研究方向。
污泥脱水液是市政废水经二级处理后产生的污泥脱水后所形成的废水。污水处理过程中，污泥脱水液多被循环到前面的污水流进行处理，加大了处理负荷，影响系统的稳定运行。前期研究表明利用污泥脱水液可培养富油微藻，在实现废水深度处理的同时，产生的微藻生物质可作为生物能源的原料。然而，以自养为主的微藻高密度培养时的光限制，以及废水中可利用的碳源限制等，导致微藻的生物产量和油脂含量有限。发明人此前研究了污泥脱水液中加入粗甘油培养小球藻的方法(CN107177506A)，发现通过在污泥脱水液中补加粗甘油能够提高微藻的生物产量。
发明内容
[技术问题]
污水处理过程中，污泥脱水液多被循环到前面的污水流进行处理，加大了处理负荷，影响系统的稳定运行。前期研究表明利用污泥脱水液可培养富油微藻。然而，以自养为主的微藻高密度培养时的光限制，以及废水中可利用的碳源限制等，导致微藻的生物产量和油脂含量有限。在不利的营养条件(如贫营养、高光、高盐、低温)胁迫下，藻细胞中的生物碳流会倾向高能产物储存的方向流动，从而提高油脂含量。但是，不利营养条件下，往往会造成微藻生物量的锐减。
[技术方案]
针对上述问题，本发明提供了一种盐胁迫下强化污泥脱水液中小球藻油脂积累的方法，所述油脂积累是指使细胞中的生物碳流倾向高能产物储存的方向流动。本发明利用污泥脱水液培养小球藻，并外加甘油作为有机碳源，污泥脱水液中小球藻细胞在盐胁迫下可促使细胞中的生物碳流倾向高能产物储存的方向流动，从而提高油脂含量，最终实现生物柴油的生产。目前并没有利用盐胁迫，在外加粗甘油的污泥脱水液中培养普通小球藻，进而大量产生和积累高能产物即油脂的方法公开。
本发明提供了一种盐胁迫下强化小球藻油脂积累的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)预培养小球藻藻种溶液，得到藻种接种溶液；
(2)将藻种接种溶液接种至添加粗甘油的污泥脱水液，培养小球藻进行生物量的积累；
(3)向步骤(2)中已经接种小球藻的污泥脱水液中加入NaCl，并开始培养，培养结束后收获小球藻。
在本发明的一种实施方式中，所述小球藻为小球藻UTEX2714，购于德克萨斯大学微藻种库(Texas,USA)。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述预培养小球藻的培养基为TAP培养基。
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中预培养小球藻步骤如下：取用TAP培养基保存的小球藻藻种溶液50mL，接于装有500mL TAP培养基的1000mL三角烧瓶中，置于27℃、光强6000LUX、光/暗12h:12h、转速150r/min的恒温摇床内培养，培养至对数生长期，待藻液在稀释后的OD680为0.7～0.8时作为藻种接种溶液。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述的粗甘油取自某生物柴油生产过程中的副产物，经纯化后，其含质量分数为50％的甘油，5％的甲醇。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述粗甘油的浓度为0.5～2.0g·L-1。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述粗甘油的浓度为1.0g·L-1。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)接种的步骤如下：取藻种接种溶液离心，弃去悬浮液，再利用污泥脱水液经漩涡振荡使其悬浮，将悬浮的藻细胞接种至添加粗甘油的污泥脱水液。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述培养小球藻的方法为：取三角烧瓶，装入500mL且已补加1.0g·L-1粗甘油的新鲜污泥脱水液。取步骤(1)中的藻种接种溶液于4000r/min条件下离心5min，弃去悬浮液，再用上述污泥脱水液悬浮接种藻细胞，使接种初始密度在1.0-1.5g·L-1，将接种微藻的三角烧瓶放置在27℃，150r/min，光暗比12h:12h，光照强度6000Lux的恒温光照摇床内培养，培养至生物量为2.0～2.5g/L。
在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中接种的小球藻培养至生物量为2.0～2.5g/L。相比CN107177506A中的技术方案本发明调整了接种密度，因此小球藻的生物量能达到2.0～2.5g·L-1。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中所述污泥脱水液取自无锡新城污水处理厂，污泥采用带式压滤机脱水，静置后上清液为污泥脱水液，水质指标为COD 278mg·L-1，TN44.59mg·L-1，TP 4.05mg·L-1，氨氮28.15mg·L-1，pH为7.54。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中加入NaCl调节体系的盐浓度为10～30g·L-1。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中加入NaCl调节体系的盐浓度为20g·L-1。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中置于恒温光照摇床内进行培养。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中所述小球藻的培养条件为：温度27±1℃，摇床转速150r/min，光暗比12h:12h，光照强度6000Lux。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中所述小球藻的培养时间为12～48h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中所述小球藻的培养时间为48h。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中通过离心、沉降等方式收获小球藻。
本发明提供了上述方法在生产生物柴油领域的应用。
[有益效果]：
(1)本发明以污泥脱水液作为培养液，减轻污泥脱水液回流对污水处理的负荷；利用生物柴油副产物-粗甘油作为外加碳源，在补充了COD的同时，有效解决因粗甘油废液不能及时有效地利用和处理而成为新的污染源这一问题。
(2)本发明以外加粗甘油的污泥脱水液为培养液，提高了小球藻的生物量；在此基础上通过外加NaCl的盐胁迫处理，可在利用废水中营养物质的同时，能够在短时间内(48h)实现油脂产量的大幅度提升，在优选的方案中，油脂产率可达到17.33mg·L-1·h-1。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但本发明的实施方式不限于这些实例。
1、以下实施例和对比例中使用的球藻为小球藻UTEX2714，购于德克萨斯大学微藻种库(Texas,USA)。
2、TAP培养基的成分：
表1 TAP培养基配方
Figure BDA0002611994270000041
表2表1中的微量元素的组成
Figure BDA0002611994270000042
3、以下实施例和对比例中，所述的污泥脱水液、进水、初沉池出水均来自无锡新城污水处理厂。污泥采用带式压滤机脱水得到污泥脱水液，所述污泥脱水液、进水、初沉池出水静置后上清液的水质指标如表3。
表3不同工段污水的水质特征
Figure BDA0002611994270000043
4、采用光密度法测定生物量：通过已知干重的小球藻液在680nm下的光密度值，作细胞生物量(干重)与OD680的相关性曲线。通过每天测定的藻液OD680，计算藻细胞生物量M(g·L-1)。
5、采用采用氯仿/甲醇提取法测定油脂含量：将藻培养液于4000rpm转速离心5min，弃去上清液，蒸馏水冲洗藻泥，离心，重复3次，置于-80℃冷冻24h，-50℃真空冷冻干燥24h。冷冻干燥的藻磨成细粉，然后取0.05克粉末与5毫升氯仿/甲醇(2:1)混合，然后在室温条件下搅拌20分钟，溶剂通过7000rpm离心10分钟，同样的过程重复一次，收集溶剂相于已干燥恒重的称量杯(w1)中，将称量杯放入105℃烘箱进行烘干恒重(w2)
6、下述实施例和对比例中所用计算公式：
(1)生物量产率(Px，g/L/d)：
Figure BDA0002611994270000051
式中：M为对应的培养t(h)获得的生物量(g/L)。
(2)油脂含量(L，％)：
Figure BDA0002611994270000052
式中：w1为已干燥恒重的称量杯质量(g)，w2为收集溶剂相后干燥恒重的称量杯质量(g)。
(3)油脂产量(C，g/L)：
C＝M×L
式中：M为生物量(g/L)，L为油脂含量(％)。
(4)油脂产率(Pc，mg/(L·d))：
Figure BDA0002611994270000053
式中：C为对应的培养t(d)获得的油脂产量(g/L)。
【实施例1】
(1)小球藻的预培养
取用适量TAP培养基保存的小球藻藻种溶液，接于装有500mL TAP培养基的1000mL三角烧瓶中，置于27℃、光强6000LUX、光/暗12h:12h、转速150r/min的恒温摇床内培养，待藻液在稀释后的OD680为0.7～0.8时作为藻种接种溶液。
(2)微藻在外加粗甘油的污泥脱水液中生长
取5个1000ml三角烧瓶，三角烧瓶内装入500mL已补加0、0.5、1.0、1.5、2.0g·L-1粗甘油的新鲜污泥脱水液。取步骤(1)中的藻种接种溶液于4000r/min条件下离心5min，弃去悬浮液，再用上述污泥脱水液悬浮接种藻细胞于装有500mL污泥脱水液的三角烧瓶中，将接种微藻的三角烧瓶放置在27℃，150r/min，光暗比12h:12h，光照强度6000Lux的恒温光照摇床内培养，每隔12h测定生物量，收获后测定生物量和油脂含量，生物量采用光密度法测定，油脂含量采用氯仿/甲醇提取法测定。
培养48h后进入稳定期，结束培养，离心收获藻细胞。收获的藻细胞在-50℃条件真空冷冻干燥至恒重。计算各生长指标。实验数据汇入表4。
表4不同甘油浓度下小球藻的生长指标情况
Figure BDA0002611994270000061
根据表格内所示生长情况，选定1.0g·L-1为最适合的粗甘油添加浓度。
(3)20g·L-1NaCl下小球藻在外加粗甘油的污泥脱水液中生长情况
取1个1000ml三角烧瓶，三角烧瓶内装入500mL已补加1g·L-1粗甘油的新鲜污泥脱水液。取步骤(1)藻种接种溶液于4000r/min条件下离心5min，弃去悬浮液，再用上述污泥脱水液悬浮接种藻细胞于三角烧瓶中，培养至生物量达2.0g·L-1。再将此三角烧瓶中培养液更换为已补加1g·L-1粗甘油的新鲜污泥脱水液，加入NaCl至污泥脱水液中，NaCl浓度为20g·L-1。接种微藻的三角烧瓶均放置在27℃，150r/min，光暗比12h:12h，光照强度6000Lux的恒温光照摇床内培养。盐胁迫期间每隔12h测定生物量和油脂含量，生物量采用光密度法测定，油脂含量采用氯仿/甲醇提取法测定。
培养48h后进入稳定期，结束培养，离心收获藻细胞。收获的藻细胞在-50℃条件真空冷冻干燥至恒重。计算各生长指标。实验数据汇入表5。
表5生长指标情况
Figure BDA0002611994270000062
【实施例2】
(1)小球藻的预培养：和实施例步骤(1)相同；
(2)5g·L-1NaCl下小球藻在外加粗甘油的污泥脱水液中生长情况
取1个1000ml三角烧瓶，三角烧瓶内装入500mL已补加1g·L-1粗甘油的新鲜污泥脱水液。取步骤(1)藻种接种溶液于4000r/min条件下离心5min，弃去悬浮液，再用上述污泥脱水液悬浮接种藻细胞于三角烧瓶中，培养至生物量达2.0g·L-1。再将此三角烧瓶中培养液更换为已补加1g·L-1粗甘油的新鲜污泥脱水液，加入NaCl至污泥脱水液中，NaCl浓度为5g·L-1。接种微藻的三角烧瓶均放置在27℃，150r/min，光暗比12h:12h，光照强度6000Lux的恒温光照摇床内培养。盐胁迫期间每隔12h测定生物量和油脂含量，生物量采用光密度法测定，油脂含量采用氯仿/甲醇提取法测定。
培养48h后进入稳定期，结束培养，离心收获藻细胞。收获的藻细胞在-50℃条件真空冷冻干燥至恒重。计算各生长指标。实验数据汇入表6。
表6生长指标情况
Figure BDA0002611994270000071
【实施例3】
(1)小球藻的预培养：和实施例步骤(1)相同；
(2)10g·L-1NaCl下小球藻在外加粗甘油的污泥脱水液中生长情况
取1个1000ml三角烧瓶，三角烧瓶内装入500mL已补加1g·L-1粗甘油的新鲜污泥脱水液。取步骤(1)中适量藻种接种溶液于4000r/min条件下离心5min，弃去悬浮液，再用上述污泥脱水液悬浮接种藻细胞于三角烧瓶中，培养至生物量达2.0g·L-1。再将此三角烧瓶中培养液更换为已补加1g·L-1粗甘油的新鲜污泥脱水液，加入NaCl至污泥脱水液中，NaCl浓度为10g·L-1。接种微藻的三角烧瓶均放置在27℃，150r/min，光暗比12h:12h，光照强度6000Lux的恒温光照摇床内培养。盐胁迫期间每隔12h测定生物量和油脂含量，生物量采用光密度法测定，油脂含量采用氯仿/甲醇提取法测定。
培养48h后进入稳定期，结束培养，离心收获藻细胞。收获的藻细胞在-50℃条件真空冷冻干燥至恒重。计算各生长指标。实验数据汇入表7。
表7生长指标情况
Figure BDA0002611994270000072
Figure BDA0002611994270000081
【实施例4】
(1)小球藻的预培养：和实施例步骤(1)相同；
(2)30g·L-1NaCl下小球藻在外加粗甘油的污泥脱水液中生长情况
取1个1000ml三角烧瓶，三角烧瓶内装入500mL已补加1g·L-1粗甘油的新鲜污泥脱水液。取步骤(1)中适量藻种接种溶液于4000r/min条件下离心5min，弃去悬浮液，再用上述污泥脱水液悬浮接种藻细胞于三角烧瓶中，培养至生物量达2.0g·L-1。再将此三角烧瓶中培养液更换为已补加1g·L-1粗甘油的新鲜污泥脱水液，加入NaCl至污泥脱水液中，NaCl浓度为30g·L-1。接种微藻的三角烧瓶均放置在27℃，150r/min，光暗比12h:12h，光照强度6000Lux的恒温光照摇床内培养。盐胁迫期间每隔12h测定生物量和油脂含量，生物量采用光密度法测定，油脂含量采用氯仿/甲醇提取法测定。
培养48h后进入稳定期，结束培养，离心收获藻细胞。收获的藻细胞在-50℃条件真空冷冻干燥至恒重。计算各生长指标。实验数据汇入表8。
表8生长指标情况
Figure BDA0002611994270000082
综合比较后，20g·L-1NaCl浓度以及胁迫48h后普通小球藻油脂含量和油脂产量均优于其他浓度，油脂产率也为较高水准。由此可见，在外加1g·L-1粗甘油的污泥脱水液中对微藻实施20g·L-1NaCl的盐胁迫处理48h，可在利用废水中营养物质的同时，实现油脂产量的大幅度提升。
【对比例1】
不同盐浓度下小球藻在外加粗甘油的进水中生长情况，所述进水水质指标见上文表3。
(1)小球藻的预培养：和实施例步骤(1)相同；
(2)取5个1000ml三角烧瓶，三角烧瓶内装入500mL已补加1g·L-1粗甘油的新鲜进水。取步骤(1)中适量藻种接种溶液于4000r/min条件下离心5min，弃去悬浮液，再分别用上述进水悬浮接种藻细胞于三角烧瓶中，每瓶中起始生物量保持一致，培养至生物量达2.0g·L-1。再将这些三角烧瓶中培养液更换为已补加1g·L-1粗甘油的新鲜进水，加入NaCl至进水中，NaCl浓度为0、5、10、20、30g·L-1。接种微藻的三角烧瓶均放置在27℃，150r/min，光暗比12h:12h，光照强度6000Lux的恒温光照摇床内培养。盐胁迫期间每隔12h测定生物量，收获后测定油脂含量，生物量采用光密度法测定，油脂含量采用氯仿/甲醇提取法测定。
培养48h后进入稳定期，结束培养，离心收获藻细胞。收获的藻细胞在-50℃条件真空冷冻干燥至恒重。计算各生长指标。实验数据汇入表9。
表9生长指标情况
Figure BDA0002611994270000091
【对比例2】
不同盐浓度下小球藻在外加粗甘油的初沉池出水中生长情况，所述初沉池出水水质指标见上文表3。
(1)小球藻的预培养：和实施例步骤(1)相同；
(2)取5个1000ml三角烧瓶，三角烧瓶内装入500mL已补加1g/L粗甘油的新鲜初沉池出水。取步骤(1)中适量藻种接种溶液于4000r/min条件下离心5min，弃去悬浮液，再分别用上述污泥脱水液悬浮接种藻细胞于三角烧瓶中，每瓶中起始生物量保持一致，培养至生物量达2.0g·L-1。再将这些三角烧瓶中培养液更换为已补加1g·L-1粗甘油的新鲜初沉池出水，加入NaCl至出水中，NaCl浓度为0、5、10、20、30g·L-1。接种微藻的三角烧瓶均放置在27℃，150r/min，光暗比12h:12h，光照强度6000Lux的恒温光照摇床内培养。盐胁迫期间每隔12h测定生物量，收获后测定油脂含量，生物量采用光密度法测定，油脂含量采用氯仿/甲醇提取法测定。
培养48h后进入稳定期，结束培养，离心收获藻细胞。收获的藻细胞在-50℃条件真空冷冻干燥至恒重。计算生物量产量。实验数据汇入表10。
表10生长指标情况
Figure BDA0002611994270000092
Figure BDA0002611994270000101
比较污泥脱水液、进水和初沉池出水培养普通小球藻生长指标情况，污泥脱水液均优于其他两种废水；比较不同NaCl浓度下微藻在外加粗甘油的污泥脱水液中生长情况，20g·L-1NaCl浓度胁迫48h后油脂含量和油脂产量均优于其他浓度，油脂产率也较高。由此可见，在外加1g·L-1粗甘油的污泥脱水液中对微藻实施20g·L-1NaCl的盐胁迫处理48h，可在利用废水中营养物质的同时，实现油脂产量的大幅度提升。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种培养小球藻积累油脂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)预培养小球藻藻种溶液，得到藻种接种溶液；
(2)将藻种接种溶液接种至添加粗甘油的污泥脱水液；
(3)向步骤(2)中已经接种小球藻的污泥脱水液中加入NaCl，并开始培养，培养结束后收获小球藻。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述小球藻为小球藻UTEX2714。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述预培养小球藻的培养基为TAP培养基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述粗甘油含质量分数为50％的甘油，质量分数5％的甲醇，添加粗甘油的污泥脱水液中粗甘油的浓度为0.5～2.0g·L-1。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中接种的小球藻的密度为2.0～2.5g/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中加入NaCl调节体系中NaCl的浓度为10～30g·L-1。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中加入NaCl调节体系中NaCl的浓度为20g·L-1。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述小球藻的培养条件为：温度27±1℃，摇床转速150r/min，光暗比12h:12h。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述小球藻的培养时间为12～48h。
10.权利要求1～9中任一项所述的方法在生产生物柴油领域的应用。
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